CN101805728A - 一种活性胰酶的简易制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活性胰酶的简易制备方法，涉及胰蛋白酶的制作方法技术领域。具有以下步骤：取胰脏制成胰浆，预冷并用常用酸进行酸化；加入CaCl2和/或MgCl2作为活化离子，搅拌并保温活化一段时间即得胰酶；调低pH值后保存待用或冷冻干燥成固体胰酶粗品。本发明原理独特、操作简便、成本低廉，可减少环境污染，具有较好的经济效益和社会效益；可满足食品加工业、农业及皮革加工业对蛋白酶的需求，活化的胰酶又可作为纯化制备其他胰脏活性物质的原料。
Description
技术领域
本发明涉及胰酶的制作方法技术领域，主要是利用动物胰脏制备胰酶，使我国丰富的胰脏资源得到充分利用。
背景技术
胰脏是动物体的“酶库”，兼有内分泌和外分泌功能，含有胰岛素、胰高血糖素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰脂酶、胰胶原蛋白酶、胰激肽原酶、胆碱酯酶、弹性蛋白酶、血管舒缓素、胰抗脂肝素、胰降压素等多种生物活性物质。胰酶是这些活性物质的混合物。胰酶中的胰蛋白酶含量较高，是消化食物中蛋白质的主要酶类，广泛应用于生物制药(例如用于提取胰岛素、胰蛋白酶、胰激肽原酶、胰弹性蛋白酶、脑蛋白水解物的提取、基因工程中重组胰岛素的生产过程等)、农业(例如用于角蛋白、血液蛋白、鱼粉等蛋白质的水解)、食品加工业(例如用于去除啤酒雾和肉类嫩化等)、皮革加工业(例如用于皮革软化、脱脂)等领域，所以胰酶具有重大商业价值。
胰蛋白酶是胰脏中的一种主要蛋白水解酶，也是最常用的蛋白酶之一。胰蛋白酶属于外切酶，催化蛋白质中具有赖氨酸及精氨酸残基羧基端的肽键的水解生成的小分子肽，而无论该肽链的长短及其他氨基酸序列，在小肠粘膜分泌的其他蛋白酶的作用下，进一步水解生成氨基酸。在胰脏中的胰蛋白酶以胰蛋白酶原(分子量约为24000D，其等电点为pH8.9)的形式存在，没有水解活性。在生理条件下，通过十二指肠粘膜中的肠激酶及胰蛋白酶自身的作用，从N端到第6位置之间的肽链(H-val-Asp4-Lys-OH)切断并使其分子构象发生改变后转变为有活性的胰蛋白酶(分子量为23300D，等电点为pH 10.8，最适pH 7.6～8.0)。由于胰蛋白酶自身也很容易发生自溶为胰蛋白酶片断，活力因此也逐步下降直至完全丧失，所以如何激活胰脏中的胰酶，同时尽量减少胰蛋白酶引起的自溶一直是生物化学研究的重要课题之一。本专利以胰蛋白酶的活性作为活化的依据。
胰酶制备的传统方法是采用胰脏粉碎后的胰浆进行活化后，经脱脂、硫酸铵沉淀、结晶、重结晶等得到各种产物的纯品，活化过程中一般需加入乙醇(25％)进行活化。传统的胰酶生产方法存在生产过程复杂、生产成本高昂、生产周期长、大量使用硫酸铵或乙醇易导致污染等缺点。为此，不断有人对此进行改进。例如，傅渝滨等(重庆医科大学学报，1995：20(4)：305-307)等公开了一种从胰脏中提取胰酶的工艺，将冰冻胰脏活新鲜胰脏与十二指肠一起绞碎，与乙醇水溶液混合后加入CaCl2，在低温下搅拌激活胰酶。刘军(中国生化药物杂志，1993(2)：40-41)及赵小兰(青海医药杂志，2000，30(4)：56-57)分别采用十二指肠及苦胆进行胰酶激活。
一些专利技术的基本特征在于：在绞碎的胰浆中先加入1-5倍重量的酒精溶液后在0-30℃进行活化，然后采用色谱技术、超滤技术、冷冻干燥技术等得到纯的产品(例如：汪诚天及颜东阳：CN85104582；吴世斌等：CN200510030396.5；蔡克周等：申请号200910067954.3；陈锦俊等：申请号200910102575.3)。这些工艺不仅耗用大量乙醇、丙酮等有机溶剂会提高生产成本，而且还需要复杂的色谱技术、超滤技术、冷冻干燥技术等得到酶产品，耗时长且成本高。余蓉等(申请号：200410081389.3)在胰酶的活化中加入PEG，尝试简化胰酶的活化工艺，降低生产成本。
随着农业及食品加工业等行业的发展，对蛋白酶类的需求越来越多。这些行业虽然产业规模很大，但单位重量产品的附加值较低，所以这些行业并不需要高纯度的胰蛋白酶，但是酶的用量很大，也就迫切需要操作简便且成本低廉的胰酶制备方法。
目前，动物胰脏资源在国内外都比较匮乏，所以改进胰酶的生产工艺、降低生产成本、提高酶活回收率，开发出满足这些行业的胰酶生产工艺具有重要商业价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性胰酶的简易制备方法，其原理独特、操作简便、成本低廉，可减少环境污染，具有较好的经济效益和社会效益。本工艺产品可满足食品加工业、农业及皮革加工业对蛋白酶的需求，活化的胰酶又可作为纯化制备胰脏酶类的原料。
本发明是这样实现的：一种活性胰酶的简易制备方法，特征在于具有以下步骤：
a、取胰脏制成胰浆，用常用酸进行酸化；
b、升温后，加入CaCl2和/或MgCl2作为活化离子，保温活化一段时间后即制得活性胰酶；
c、调低pH值，保存待用。
所述的特征在于所用的胰脏为所有动物的胰脏，如猪、羊、牛等的胰脏。胰脏取刚屠宰动物的新鲜胰脏或屠宰后立即低温冷冻的胰脏较好。
所述的常用酸为常用的矿物酸：HCl、H2SO4或H2PO4等，或有机酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸或柠檬酸等。
Ca2+和/或Mg2+活化离子的浓度为溶液中最终含有0.01～0.1mol/LCa2+和/或Mg2+较好。
所述的酸化pH3.5～5.5较好。
所述的活化温度为15℃～35℃较好。
可根据活化温度不同，所述的活化时间为8～48小时较好。
本发明的积极效果是：本发明解决了已有技术中长期存在人们一直想解决而又一直未能解决的问题；其原理独特、操作简便、成本低廉，可减少环境污染。本发明与现有技术相比：(1)简化了工艺环节，改变了传统工艺中胰蛋白酶原的分离与胰蛋白酶活化分开进行的两部活化工艺，采用胰浆直接活化成胰酶的一步活化工艺；(2)胰酶的活化过程中选用成本很低的CaCl2、乙酸或盐酸，生产过程中避免使用乙醇等有机溶剂、或硫酸铵等无机盐，降低了生产成本。在保证胰脏中胰酶活性回收的同时，显著降低生产成本，减少环境污染，具有较好的经济效益和社会效益。本工艺产品胰酶可满足食品加工业、农业及皮革加工业对蛋白酶的需求，活化的胰酶又可作为纯化制备其他胰脏酶类的原料。
以下结合实例作详述，但不作为对本发明的限定。
具体实施方式
实施例1：
取新鲜屠宰的或屠宰后立即冷藏的猪胰脏，除去脂肪和结缔组织后共1Kg的胰脏绞碎成胰浆，加入1倍体积预冷至4℃的乙酸酸化即将至pH5.0，将液体的温度调整至18℃±2℃后，将5克研细的固体无水CaCl2慢慢加入胰浆溶液中，边加边搅拌，混匀的溶液中最终含有大约0.02mol/L CaCl2，保温并间隙搅拌12小时后用2.5mol/L HCl调pH至3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤或离心得黄色透明滤液(约1.5升)，此为活化的猪胰酶粗品。冷冻干燥后得固体胰酶粗品。
在加入CaCl2后开始检测胰蛋白酶的活性，每2小时取样一次，并用0.001mol/L HCl稀释后按照《中华人民共和国药典》(2000年版)进行胰蛋白酶活性测定，胰蛋白酶的比活最高时为活化的终点。
表1为上述工艺中胰蛋白酶活性的检测结果。
表1
| 活化时间 | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 |
| 酶比活 | 121 | 267 | 350 | 652 | 1032 | 2278 | 2106 | 1830 |
表中的时间指实施例一中的活化时间(小时)，活化时间从20℃的胰浆加入CaCl2并混匀后开始计时；表中的活性单位为BAEE活性单位(指以BAEE为底物反应液，在pH8.0，25℃条件下，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下测定253nm处的吸光度，每分钟使253吸光度增加0.001时，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位)。
胰蛋白酶活力的测定方法参照《中华人民共和国药典》(2000年版)进行。水解试验的底物为N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)。先将底物配成吸光度为0.575-0.585的溶液，底物溶液需在两小时内使用，反应体系为0.067mol/L磷酸缓冲液(pH为7.6)反应温度为25℃±0.5℃。在3.0ml底物溶液中加入0.001mol/L盐酸溶液200微升作为空白，然后在3.0ml底物溶液中加入200微升酶液并摇匀，在253nm处测定溶液吸光度的增值，每30S读数一次，5min内吸光度呈线性则测定有效。
实施例2：
取屠宰后立即冷藏的牛胰脏，除去脂肪和结缔组织后共10Kg的胰脏用胶体磨制成胰浆，加入1倍体积预冷至4℃的盐酸酸化至pH5.0，将液体的温度调整至18℃±2℃后，将500克研细的固体无水CaCl2慢慢加入胰浆溶液中，边加边缓慢搅拌，混匀的溶液中最终含有大约0.02mol/LCaCl2，保温并间隙搅拌10小时后用2.5mol/L HCl调pH至3.0，放置4小时后离心过滤得黄色透明滤液(约15升)，即得到活化的牛胰蛋白酶制品，冷冻干燥后得到固体胰酶粗品。
实施例3～10工艺条件及活化结果见表2。
表2
注：1、溶液中最终含有的活化离子Ca2+或Mg2+的浓度为0.02mol/L，比活指在上述条件下比活达到的最大值。2、在所述参数范围内，其他实施例效果亦较好(略)。
Claims (7)
1.一种活性胰酶的简易制备方法，特征在于具有以下步骤：
a、取胰脏制成胰浆，并用常用酸进行酸化。
b、升温后加入CaCl2和/或MgCl2作为活化离子，保温并搅拌一段时间，即制得活性胰酶；
c、调低pH值，保存待用。
2.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，其特征在于所述的特征在于所用的胰脏为所有动物的胰脏。
3.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，其特征在于所述的酸为矿物酸：HCl、H2SO4或H2PO4，或有机酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸或柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，其特征在于所述的酸化pH3.5～5.5。
5.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，其特征在于Ca2+和/或Mg2+活化离子的浓度为溶液中最终含有0.01～0.1mol/L Ca2+和/或Mg2+。
6.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，其特征在于所述的活化温度为15℃～35℃。
7.根据权利要求1所述的活性胰酶的简易制备方法，可根据胰浆的温度7等的变化，所述的活化时间为8～48小时。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101805728A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102630957A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-08-15 | 余群力 | 一种牛肉快速成熟嫩化的方法 |
| CN103060297A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-24 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 一种分离纯化胰蛋白酶的方法 |
| CN103382499A (zh) * | 2012-05-04 | 2013-11-06 | 长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院 | 用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法及其试剂套组 |
| CN103571817A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-12 | 马忠仁 | 一种胰酶粉的制备方法 |
| CN103756974A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-04-30 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 |
| CN107338235A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-11-10 | 淮安麦德森制药有限公司 | 胰酶的制备方法 |
| WO2018040008A1 (zh) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 广州市利士诺丹生物科技有限公司 | 一种用于治疗糖尿病的生物中药内服药及其制备方法 |
| CN111413172A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-14 | 山东省分析测试中心 | 一种原位酶解-直接质谱分析系统及分析方法 |
| RU2731803C1 (ru) * | 2020-01-09 | 2020-09-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Способ профилактики и лечения дуоденальной ацедификации при остром панкреатите |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1092465A (zh) * | 1993-03-19 | 1994-09-21 | 郑州粮食学院 | 试剂级高活性胰脂酶粉剂提取和保存方法 |
| CN1948473A (zh) * | 2005-10-11 | 2007-04-18 | 江苏万邦生化医药股份有限公司 | 从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法 |
-
2010
- 2010-04-01 CN CN 201010137076 patent/CN101805728A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1092465A (zh) * | 1993-03-19 | 1994-09-21 | 郑州粮食学院 | 试剂级高活性胰脂酶粉剂提取和保存方法 |
| CN1948473A (zh) * | 2005-10-11 | 2007-04-18 | 江苏万邦生化医药股份有限公司 | 从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《生化制药学》 19911031 李良铸等 胰酶 155-156 1-7 , 1 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103382499B (zh) * | 2012-05-04 | 2015-07-01 | 长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院 | 用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法及其试剂套组 |
| CN103382499A (zh) * | 2012-05-04 | 2013-11-06 | 长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院 | 用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法及其试剂套组 |
| CN102630957A (zh) * | 2012-05-10 | 2012-08-15 | 余群力 | 一种牛肉快速成熟嫩化的方法 |
| CN102630957B (zh) * | 2012-05-10 | 2013-06-26 | 余群力 | 一种牛肉快速成熟嫩化的方法 |
| CN103060297B (zh) * | 2012-12-28 | 2014-06-25 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 一种分离纯化胰蛋白酶的方法 |
| CN103060297A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-24 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 一种分离纯化胰蛋白酶的方法 |
| CN103756974A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-04-30 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 |
| CN103756974B (zh) * | 2013-09-29 | 2016-08-10 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 |
| CN103571817A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-12 | 马忠仁 | 一种胰酶粉的制备方法 |
| WO2018040008A1 (zh) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 广州市利士诺丹生物科技有限公司 | 一种用于治疗糖尿病的生物中药内服药及其制备方法 |
| CN107338235A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-11-10 | 淮安麦德森制药有限公司 | 胰酶的制备方法 |
| CN107338235B (zh) * | 2017-08-03 | 2019-12-13 | 淮安麦德森制药有限公司 | 胰酶的制备方法 |
| RU2731803C1 (ru) * | 2020-01-09 | 2020-09-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Способ профилактики и лечения дуоденальной ацедификации при остром панкреатите |
| CN111413172A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-14 | 山东省分析测试中心 | 一种原位酶解-直接质谱分析系统及分析方法 |
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