CN101784302A - 用于治疗呼吸疾病的nrg1调节物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经调节蛋白(NRG)家族的调节物，特别地涉及NRG1的调节物和更特别地涉及NRG1β的调节物，以及最特别地涉及NRG1β1的调节物。本发明也涉及此类调节物抑制杯形细胞增生的用途，并因此也涉及此类调节物在治疗或预防特征为病理学黏液产生的人疾病和病症如COPD、CF、慢性支气管炎和哮喘中的用途。

Description

用于治疗呼吸疾病的NRG1调节物

1.发明领域

本发明涉及在治疗疾病和病症中用于中和神经调节蛋白(NRG)家族成员的生物学活性的化合物、组合物和方法。本发明尤其涉及在治疗人疾病和病症中，与神经调节蛋白-1(NRG1)和其同工型结合并中和神经调节蛋白-1(NRG1)和其同工型生物学活性的拮抗物。本发明的其它方面、目的和优点从以下描述将是显而易见的。

2.发明背景

已将气道黏液分泌过多与几种呼吸疾病的病理学特征联系了起来，其中所述几种呼吸疾病如哮喘[Aikawa等人，1992]、慢性阻塞性肺病(COPD)[Vestbo，2002]和囊性纤维化(CF)[Boucher，2002]。事实上，已将黏液分泌过多与呼吸疾病中感染的频率和持续时间的增加、肺功能的下降以及发病率和死亡率的增加联系了起来[Vestbo，2002；Prescott等人，1995；Vestbo等人，1996]。虽然在大的气道中，黏液由杯形细胞和黏膜下腺体产生，但是在小的气道中，黏液的唯一来源是杯形细胞[Rogers，2003]。

黏蛋白MUC5AC和MUC5B是呼吸疾病如哮喘、COPD和CF中气道黏液分泌物的主要组分[Williams等人，2006；Rose和Voynow，2006；Rogers，2003]。黏液分泌过多是哮喘的特征，其中对死于严重急性哮喘发作患者的肺的形态测量分析显示了增加的杯形细胞数量和气道腔中黏液[Aikawa等人，1992]。已经报道了气道腔的黏液堵塞是引起大多数患者致死性哮喘的主要原因[Kuyper等人，2003；Hays和Fahay，2003]。与正常个体比较，MUC5AC表达在哮喘持续状态中是增加的，且MUC5AC表达定位于表面上皮、管腔和杯形细胞[Gronenberg等人，2002a]。也已经报道了与健康个体比较，患轻度到中度哮喘的受试者具有增加的杯形细胞数量，且报道了分泌的黏蛋白水平在患有中度哮喘患者的气道中的水平更高[Ordonez等人，2001]。此外，已经报道了与健康个体比较，患哮喘的受试者的杯形细胞增加的MUC5AC黏蛋白染色[Ordonez等人，2001]。在哮喘中，黏蛋白MUC5B也由一些气道表面杯形细胞产生[Gronenberg等人，2002a]。已报道了COPD的发展与小气道腔中黏液的积聚强烈相关[Hogg等人，2004]。已经描述了患COPD的个体在支气管上皮细胞中MUC5AC的增加表达和在支气管腔中MUC5B的增加水平[Caramori等人，2004]。在另一研究中也已经报道了MUC5B是患COPD患者的痰中主要的黏蛋白[Kirkham等人，2002]。已经建议了在COPD患者的细支气管腔中观察到的增加的黏液在COPD中对阻碍外周气道有作用[Caramori等人，2004]。也已经描述了在患COPD和慢性支气管炎的患者的细支气管上皮中杯形细胞的增加数量[Saetta等人，2000]。

在CF中，黏液分泌过多与气流阻塞和致死病例中小气道的闭塞有关[Williams等人，2006]。过多的黏液也似乎可以通过增加肺部感染的频率和严重程度来促成CF的发病[Williams等人，2006]。尽管已经报道了与正常人相比，在CF受试者中分泌的黏蛋白MUC5AC和MUC5B的浓度是下降的[Henke等人，2004]，但是MUC5AC和MUC5B在恶化期间的CF患者的痰中是增加的[Henke等人，2007]。已经报道了由MUC5AC阳性细胞数量的增加导致的杯形细胞增生在囊性纤维化肺中是增加的[Gronenberg等人，2002b]。

尽管IL-13已经显示出影响MUC5AC基因和蛋白质在体外和体内的表达[Wills-Karp等人，1998；Zhu等人，1999；Kuperman等人，2002；Atherton，Jones和Danahay，2003]，但是它对黏蛋白MUC5B没有影响。MUC5B产生的介质没有很好地表征。

神经调节蛋白是信号蛋白质，所述信号蛋白质通过ERB家族的受体酪氨酸激酶来介导多种细胞-细胞之间的相互作用。作为选择性剪接的结果，存在至少15种不同的神经调节蛋白-1(NRG1)的同工型[Falls，2003]。这些同工型中的两种，NRG1α和NRG1β1，在EGF样结构域的C末端部分不同[Holmes等，1992]。认为NRG1与ErbB3或ERRB4结合，所述ErbB3或ERRB4与ErbB2形成异二聚体[Falls，2003]。NRG1β1以比NRG1α高100倍的亲和力与ErbB3结合。NRG1β1也对ErbB2/ErbB3异二聚体具有比与ErbB3同型二聚体大100倍的亲和力[Jones等人，1999]。ErbB3缺少酪氨酸激酶活性，但是与ErbB2的二聚化作用导致能介导下游信号的活性异二聚体的形成[Citri，Skaria和Yarden，2003]。通过对胎儿肺组织的免疫组织化学和功能研究，以前已经建议了NRG1和ErbB2受体以及ErbB3受体在人肺发育中的作用[Patel等人，2000]。NRG1β1分泌自胎儿肺成纤维细胞并刺激II型细胞表面活性物质合成，并因此提出NRG1β1通过间质的-上皮的相互作用来控制胎儿肺成熟[Dammann等人，2003]。最近，已经提出了NRG1α同工型在上皮的创伤修复和气道重塑中起作用[Vermeer等人，2003]。该研究中显示ErbB2受体表达于已分化的上皮细胞的基底外侧的表面，且NRG1α配体表达于顶端表面。因而，认为直到上皮损伤发生时配体受体相互作用才会发生。NRG(有时称为Heuregulin，“HRG”)的表达已经在来自COPD患者的支气管组织中检测到，且与那些未患COPD的受试者相比，在患COPD的受试者的完整上皮中观察到了NRG的更高表达[de Boer等人，2006]。然而，在de Boer等人的研究中，没有说明研究的NRG1的特定同工型。

在本说明书中引用的所有出版物(包括专利申请)和本申请要求优先权的任一说明书在此处明确地以其整体引入作为参考。

3.发明概述

本发明基于(至少部分基于)NGR-1，以及特别是同工型NRG1β1促进MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质表达的研究，并因此提出了在杯形细胞形成中的作用。

因此，本发明的第一个方面提供了抑制杯形细胞形成的方法，所述方法包括提供中和NRG-1，如NRG1β同工型，特别是NRG1β1(和特别是人NRG1β1)的生物学活性的结合化合物。

本发明的第二个方面提供了筛选能中和NRG-1如NRG1β1的生物学活性的结合化合物的方法。

本发明的第三个方面提供了包含结合化合物(或基本上由结合化合物组成)的药物组合物，其中所述结合化合物中和NRG-1如NRG1β1(特别是人NRG1β1)的生物学活性。

本发明的第四个方面提供了在哺乳动物患者中抑制杯形细胞形成的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的中和NRG-1如NRG1β1的生物学活性的结合化合物。

本发明的第五个方面提供了在临床需要其的哺乳动物患者中抑制有害的黏液产生的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的中和NRG-1如NRG1β1的生物学活性的结合化合物。

第六个方面提供了治疗人患者中选自COPD、CF、慢性支气管炎和哮喘(特别是中度到重度哮喘)的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的人或人源化的中和NRG1β1的生物学活性(如通过与NRG1β1结合并抑制NRG1β1和ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用)的抗体(如IgG同种型，例如IgG1或IgG4)。

本发明的这些和其它方面将在下文进行更详细的描述。

4.发明详述

在本说明书随后的第4部分中，提及的多种蛋白质、其同工型和疾病/病症的治疗与人蛋白质、其同工型以及人疾病和病症有关。因此，“NRG-1”、“NRG1α”和“NRG1β1”理解为指人NRG-1等。在以下所述的实施方案中，提及的“NRG1”和“NRG1β1”可用于指各种蛋白质的所有形式，以及另外地和分别地指可溶性和膜结合形式，且本说明书的读者可认为每一实施方案应如此理解。因此，除非特别说明，以下所述的每一实施方案指三个实施方案，第一指各种蛋白质的所有形式，第二指任何膜结合形式和第三指各种蛋白质的可溶性形式。

4.1结合化合物

在本发明的一个方面中，提供了中和NRG1蛋白质的生物学活性的结合化合物。

在一些实施方案中，结合化合物与NRG1β1结合并中和NRG1β1促进MUC5AC和MUC5B在上皮细胞(如杯形细胞)上表达的能力。这类结合化合物可与NRG1β1结合并抑制NRG1β1与其相关受体如ErbB2和/或ErbB3，优选地ErbB2/ErbB3异二聚体结合。在此类实施方案中，结合化合物可以是能与NRG-1蛋白质如NRG-1β1结合并因此中和其生物学活性，如通过抑制蛋白质和其相关受体例如ErbB2和/或ErbB3之间的相互作用的低分子量化学实体。在其它此类实施方案中，结合化合物可以是能与NRG-1蛋白质(如NRG-1β1)结合并抑制NRG-1蛋白质(如NRG-1β1)与其相关受体(如ErbB2和/或ErbB3)之间相互作用的治疗性蛋白质如抗体。这些实施方案将在下文进行更详细的描述。在另一实施方案中，结合化合物可与ADAM-17结合并抑制其活性，转而抑制可溶性NRG1β1从其膜结合前体形式的形成。

在另一实施方案中，结合化合物可抑制NRG-1如NRG-1β1的表达并因此中和NRG1促进MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质在上皮细胞上表达的能力。在这些实施方案中，结合化合物可在转录和/或翻译水平上抑制NRG-1(如NRG-1β1)的表达。例如，结合化合物可以是能与NRG-1基因的互补区域结合并因此抑制其转录的反义寡核苷酸。在其它这类实施方案中，结合化合物可以是能抑制能够编码NRG-1(如NRG-1β1)蛋白质的RNA化合物翻译的短干扰RNA(siRNA)。这些实施方案将在下文进行更详细的描述。

4.1-治疗性蛋白质

本发明的治疗性蛋白质可是抗体、Adnectin、Ankyrin、Maxybody/Avimer、Affibody、anticalin或Affilin。

4.1.1-抗体

本发明的抗体可以是技术人员熟知的许多形式中的一种形式。这些形式包括如下所述的完整抗体、多种抗体片段和其它工程化形式。在优选的形式中，本发明的抗体提供为单克隆群体。

4.1.1.1-完整抗体

完整抗体包括含至少两条重链和两条轻链的异源多聚体糖蛋白。除IgM外，完整抗体通常是大约150Kda、由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异源四聚体糖蛋白。一般来说，每一轻链与重链通过一个共价二硫键连接，但是不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目不同。每一重链和轻链也具有链内二硫桥接。每一重链在一个末端具有接着许多恒定区的可变结构域(VH)。每一轻链具有在其另一末端的可变结构域(VL)和恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区整列，且轻链的可变结构域与重链的可变结构域整列。来自大多数脊椎动物物种的抗体的轻链可指定为两类基于恒定区的氨基酸序列命名的κ或λ中的一类。根据人抗体重链恒定区的氨基酸序列，人抗体可指定为5种不同的类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可进一步细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类；以及IgA1和IgA2亚类。存在于小鼠和大鼠中的物种变体至少具有IgG2a、IgG2b。抗体的可变结构域以展示特定可变性的、称为互补决定区(CDR)的某些区域来赋予抗体结合特异性。可变区的较保守部分称为构架区(FR)。每一完整重链和完整轻链的可变结构域都包含由3个CDR连接的4个FR。每一链中的CDR通过FR区密切接近地保持在一起，并且与来自其它链的CDR一起对抗体的抗原结合位点的形成起作用。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、通过与Fcγr受体结合的吞噬作用、通过新生Fc受体(FcRn)的半寿期/清除率和通过补体级联的C1q组分的补体依赖的细胞毒性。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了能结合NRG1(如NRG1β1)并中和其生物学活性的完整治疗性抗体。具体而言，所述完整治疗性抗体与NRG1(如NRG1β1)结合并抑制NRG1(或NRG1β1)与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在一般的实施方案中，抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区，且所述抗体是如下所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在另一实施方案中，提供了能优先地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整治疗性抗体。具体而言，所述完整治疗性抗体优先地与NRG1β1结合并抑制NRG1β1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在优选的形式中，所述完整治疗性抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区，且所述抗体是如下所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。使用于整个说明书的术语“优先地结合”和其语法变化指治疗性蛋白质(如抗体)以比其结合NRG1α更高的亲和力(至少2倍)结合NRG1β1的能力。然而，优先地结合的蛋白质能中和NRG1β1和NRG1α二者的同样共有的生物学活性到显著的程度。

在另一实施方案中，提供了能特异地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整治疗性抗体。具体而言，所述完整治疗性抗体特异地与NRG1β1结合并抑制NRG1β1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在优选的形式中，所述完整治疗性抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区，且所述抗体是如下所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。使用于整个本说明书的术语“特异地结合”和其语法变化指治疗性蛋白质(如抗体)以比其与NRG1α结合更高的结合亲和力(至少5倍)与NRG1β1结合的能力。特异结合的治疗性蛋白质能中和NRG1β1的生物学活性，但是不能中和NRG1α的同样共有的生物学活性到任何显著的程度。

在本发明的一个实施方案中，提供了能结合膜结合NRG1(如NRG1β1)并中和其生物学活性的完整治疗性抗体。具体而言，所述完整治疗性抗体与膜NRG1(如NRG1β1)结合并抑制NRG1(或NRG1β1)与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。完整治疗性抗体可例如与膜结合NRG1(如NRG1β1)结合并通过如抑制膜结合NRG1(如NRG1β1)的切割或通过促进膜NRG1(如NRG1β1)的再循环来抑制由其形成可溶性NRG1(如NRG1β1)。在一般的实施方案中，抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区，且所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在本发明的另一实施方案中，提供了能结合可溶性NRG1(如NRG1β1)并中和其生物学活性的完整治疗性抗体。具体而言，所述完整治疗性抗体与可溶性NRG1(如NRG1β1)结合并抑制NRG1(或NRG1β1)与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在一般的实施方案中，抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区，且所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

4.1.1.1.1人抗体

人抗体可通过本领域技术人员已知的许多方法来产生。人抗体可通过使用人骨髓瘤细胞系或小鼠-人异骨髓瘤细胞系来制备，参见Kozbor J.Immunol 133，3001，(1984)和Brodeur，单克隆抗体产生技术和应用，51-63页(Marcel Dekker公司，1987)。备选的方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，所述二者都利用了人V区所有组成成分(参见Winter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol.12，433-455，Green LL(1999)，J.Immunol.Methods231，11-23)。

转基因小鼠的几个株系目前是可得到的，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已由人免疫球蛋白基因区段替代(参见Tomizuka K，(2000)PNAS97，722-727；Fishwild DM(1996)Nature Biotechnol.14，845-851.MendezMJ，1997，Nature Genetics，15，146-156)。用抗原攻击后，这类小鼠能产生人抗体的所有组成成分，目标抗体可从这些人抗体的所有组成成分中选择。值得特别注意的是Trimera^TM系统(参见Eren R等人，(1988)Immunology 93：154-161)，其中将人淋巴细胞移植到经辐射的小鼠中；选择的淋巴细胞抗体系统(Selected Lymphocyte Antibody System)(SLAM，参见Babcook等人，PNAS(1996)93：7843-7848)，其中将人(或其它物种)淋巴细胞有效地完成大规模集中的体外抗体产生过程，然后进行去卷曲(deconvulated)、有限稀释和选择过程；以及Xenomouse^TM(Abgenix公司)。备选的方法是从Morphotek公司可获得的使用Morphodoma^TM技术。

噬菌体展示技术可用于产生人抗体(和其片段)，参见McCafferty；Nature，348，552-553(1990)和Griffiths AD等人(1994)EMBO 13：3245-3260。根据该技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要外壳蛋白质基因中，并作为功能抗体片段(通常借助于辅助噬菌体)展示于噬菌体颗粒的表面。基于抗体的功能特性的选择导致编码展示这些特性的抗体基因的选择。噬菌体展示技术能够用于从由人B细胞制备的文库选择抗原特异性抗体，所述人B细胞取自患上述疾病和病症的个体或备选地取自未经免疫的人供体(参见Marks；JMol Bio 222，581-591，1991)。当期望完整人抗体包含Fc结构域时，必须将噬菌体展示的衍生片段再克隆到包含想要的恒定区的哺乳动物表达载体中，并建立稳定表达细胞系。

亲和力成熟技术(Marks；Bio/teehnol 10，779-783(1992))可用于提供结合亲和力，其中初级人抗体的亲和力通过用天然存在的变体来顺序替代H链和L链的V区以及基于改善的结合亲和力的选择来改善。目前，这种技术的变型如‘表位印记’是可获得的，参见WO 93/06213。也参见Waterhouse；Nucl Acids Res 21，2265-2266(1993)。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了能结合NRG1(如NRG1β1)并中和其生物学活性的完整的治疗性人抗体。具体而言，所述完整的治疗性人抗体与NRG1β1结合并抑制NRG1β1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在一般的实施方案中，完整的治疗性人抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的恒定区。

在另一实施方案中，提供了能优先地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整的治疗性人抗体。具体而言，所述完整的治疗性人抗体与NRG1β1优先地结合并抑制NRG1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间，尤其是与ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用。在优选的形式中，完整的治疗性人抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的恒定区。

在另一实施方案中，提供了能特异地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整的治疗性人抗体。具体而言，所述完整的治疗性人抗体与NRG1β1特异地结合并抑制NRG1β1和其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间的相互作用。在优选的形式中，完整的治疗性人抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的恒定区。

4.1.1.1.2嵌合抗体和人源化抗体

在治疗人疾病或病症中使用完整的非人抗体可能具有目前已非常明确的免疫原性问题，也就是患者的免疫系统可能将非人完整抗体作为异己来识别并发动中和反应。这在对人患者进行非人抗体的多次施用后尤为明显。多年来已经研发了多种技术来克服这些困难，且通常涉及在完整抗体中降低非人氨基酸序列组成的同时保留从免疫动物如小鼠、大鼠或兔中获取非人抗体的相对容易。从广义上讲，已有两种方法用于达到这一目标。第一种是嵌合抗体，所述嵌合抗体通常包含非人(例如啮齿类动物如小鼠)可变结构域与人恒定区的融合。因为抗体的抗原结合位点定位于可变区中，所以嵌合抗体保留了其对抗原的结合亲和力，但是由于所述嵌合抗体获得了人恒定区的效应子功能，因此所述嵌合抗体能执行如前所述的效应子功能。嵌合抗体一般使用重组DNA方法来制备。编码抗体的DNA(如cDNA)使用常规方法(如通过使用能与编码本发明抗体的H链和L链的基因，例如编码如上所述的SEQ ID NO 1、2、3、4、5、和6的DNA特异结合的寡核苷酸探针)来进行分离并测序。杂交瘤细胞作为此种DNA的一般来源。一旦将DNA分离，将所述DNA置入表达载体中，然后将所述表达载体转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌(E.Coli)、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中以得到抗体的合成。DNA可通过用人L链和H链的编码序列替换相应的非人(如鼠)H和L恒定区来修饰，参见如Morrison；PNAS 81，6851(1984)。

第二种方法涉及人源化抗体的产生，其中抗体的非人含量通过人源化可变区来减少。两种人源化的技术已经得到了通用。第一种是通过CDR移植来人源化。CDR建立靠近抗体N端的环，在所述环处它们形成位于由构架区提供的支架的表面。抗体的抗原结合特异性主要由其CDR表面的拓扑图和化学特征来定义。这些特征本身又由单个CDR的构象、CDR的相对排列以及包含CDR的残基的侧链的性质和排列来决定。可通过仅移植非人(如鼠)抗体(‘供体’抗体)的CDR到人构架区(‘受体构架区’)和恒定区上来实现免疫原性的大幅度减低(参见Jones等人(1986)Nature321,522-525和Verhoeyen M等人(1988)Science 239，1534-1536)。然而，CDR移植本身可不导致抗原结合特性的完整保留，且通常发现，如果欲恢复显著的抗原结合亲和力，那么需要将供体抗体的一些构架区残基(有时称为‘回复突变’)保留于人源化的化合物中(参见Queen C等人(1989)PNAS 86，10，029-10，033，Co，M等人(1991)Nature 351，501-502)。在这种情况下，为了提供人构架区(FR)，将表现出与非人供体抗体显示最大序列同源性的人V区从数据库中挑选出来。可从人共有序列或单个的人抗体来选择人FR。根据需要，将来自供体抗体的关键残基替代入人受体构架区中以保留CDR构象。抗体的计算机建模可用于帮助鉴定这些结构重要的残基，参见WO99/48523。

备选地，人源化可通过‘镶嵌术(veneering)’的方法来实现。独特的人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计学分析揭示了被暴露残基的精确模式在人抗体和鼠抗体中不同，并且大多数单个的表面位置具有强的对少数不同残基的偏好性(参见Padlan EA等人；(1991)Mol Immunol 28，489-498和Pedersen JT等人(1994)J Mol Biol 235；959-973)。因此，通过替代抗体构架区中的不同于通常在人抗体中发现的那些被暴露残基来降低非人Fv的免疫原性是可能的。由于蛋白质抗原性可能与表面可接近性相关，所以表面残基的替代可能对于使得人免疫系统对小鼠可变区‘不可见的’是足够的(也参见Mark GE等人(1994)在Handbook of ExperimentalPharmacology vol 113：单克隆抗体的药理学，Springer-Verlag，105-134页)。这种人源化的方法称为‘镶嵌术’，因为仅仅改变了抗体的表面，而支持残基维持原状。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了能结合NRG1(如NRG1β1)并中和其生物学活性的完整的治疗性人源化抗体。具体而言，所述完整的治疗性人源化抗体与NRG1β1结合并抑制NRG1β1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间的相互作用。在一般的实施方案中，完整的治疗性人源化抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的恒定区。

在另一实施方案中，提供了能优先地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整的治疗性人源化抗体。具体而言，所述完整的治疗性人源化抗体与NRG1β1优先地结合并抑制NRG1β1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间的相互作用。在优选的形式中，完整的治疗性人抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的恒定区。

在另一实施方案中，提供了能特异地结合NRG1β1(与NRG1α比较)并中和其生物学活性的完整的治疗性人源化抗体。具体而言，所述完整的治疗性人源化抗体与NRG1β1特异地结合并抑制NRG1与其相关受体ErbB2和/或ErbB3之间的相互作用。在优选的形式中，完整的治疗性人源化抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类、并尤其是人的恒定区。

4.1.1.1.3双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。制备此类抗体的方法是本领域已知的。通常地，基于两对免疫球蛋白H链-L链对的共表达来重组产生双特异性抗体，其中两个H链具有不同的结合特异性(参见Millstein等人，Nature 305，537-539(1983)，WO93/08829和Traunecker等人，EMBO，10，1991，3655-3659)。由于H链和L链的随机组合，产生了10种不同抗体结构的潜在混合物，在所述混合物中只有一种具有想要的结合特异性。备选的方法涉及将具有想要的结合特异性的可变结构域与包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的重链恒定区融合。优选地将含有对轻链结合必需位点的CH1区存在于至少一种融合中。可将编码这些融合的和根据需要地将编码L链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。但可以将两条链或所有三条链的编码序列都插入到一个表达载体中。在一个优选的方法中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的H链和在另一臂中提供第二结合特异性的H-L链对组成，参见WO94/04690。也参见Suresh等人，Methods inEnzymology 121，210，1986。

在本发明的一个实施方案中，提供了双特异的治疗性抗体，其中所述抗体的至少一个结合特异性是针对NRG1，特别是针对NRG1β1，其中所述抗体与NRG1(如NRG1β1)结合并中和NRG1(如NRG1β1)的生物学活性。在优选的形式中，双特异性抗体包含IgG同种型如IgG1或IgG4的灵长类抗体如人抗体。

4.1.1.1.4抗体片段

在本发明的某些实施方案中，提供了调节(如抑制)NRG1与其相关受体如ErbB2和/或ErbB3例如ErbB2/ErbB3异二聚体之间相互作用的治疗性抗体片段。此类片段可是完整抗体和/或人源化的嵌合抗体的功能性抗原结合片段例如如前所述的抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、ScFv片段。

通常来说，此类片段通过完整抗体的蛋白水解消化如木瓜蛋白酶消化(参见如WO 94/29348)来产生，但是可直接产生自重组转化的宿主细胞。对于ScFv的产生，参见Bird等人；(1988)Science，242，423-426。此外，抗体片段可使用以下描述的多种工程技术来产生。

FV片段的两条链比Fab片段似乎具有更低的相互作用能量。为了稳定VH结构域和VL结构域的结合，已将它们用肽(Bird等人，(1988)Science，242，423-426，Huston等人，PNAS，85，5879-5883)、二硫桥(Glockshuber等人，(1990)Biochemistry，29，1362-1367)和‘knob in hole’突变(Zhu等人(1997)，Protein Sci.，6，781-788)连接。ScFv片段可通过本领域技术人员熟知的方法产生(参见Whitlow等人(1991)，Methodscompanion Methods Enzymol，2，97-105和Huston等人(1993)Int RevImmunol 10，195-217)。ScFv可在细菌细胞如大肠杆菌中产生，但更优选地是在真核细胞中产生。ScFv的一个缺点是产物的单价，所述产物的单价排除了由于多价结合而增加的亲合力，以及ScFv的短半寿期。克服这些困难的尝试包括通过化学偶联含额外的C端半胱氨酸的ScFv(Adams等人(1993)Can Res 53，4026-4034和McCartney等人(1995)Protein Eng，8，301-314)或通过含未配对的C端半胱氨酸残基的ScFv的自发的位点特异性二聚化(参见Kipriyanov等人(1995)Cell.Biophys 26，187-204)来产生二价(ScFv’)₂。备选地，ScFv可通过将肽接头缩短至3个残基和12个残基以形成‘二体(diabodies)’来强制形成多聚体(参见Holliger等人PNAS(1993)，90，6444-6448)。此外，减少接头还可导致ScFV三聚体(‘三体(triabodies)’，参见Kortt等人(1997)Protein Eng，10，423-433)和ScFV四聚体(‘四体(tetrabodies)’，参见Le Gall等人(1999)FEBS Lett，453，164-168)。二价ScFV化合物的构建也可通过与蛋白质二聚化基序的基因融合以形成‘微型抗体(miniantibodies)’(参见Pack等人(1992)Biochemistry 31，1579-1584)和‘微型体(minibodies)’(参见Hu等人(1996)，Cancer Res.56，3055-3061)来达到。ScFv-Sc-Fv串联体((ScFV)2)也可通过利用第三肽接头连接两个ScFV单元来产生(参见Kurucz等人(1995)J Immunol，154，4576-4582)。双特异的二体可通过非共价结合的两条单链融合产物来产生，其中所述两条单链融合产物由一种抗体的VH结构域与另一种抗体的VL结构域通过短接头连接组成(参见Kipriyanov等人(1998)，Int J Can 77，763-772)。此类双特异性二体的稳定性可通过引入如前所述的二硫桥或‘knob in hole’突变或者通过单链二体(ScDb)的形成来增强，其中二个杂化ScFv片段通过肽接头来连接(参见Kontermann等人(1999)J Immunol Methods 226，179-188)。四价的双特异性化合物通过如ScFv片段与IgG化合物的CH3结构域或者经铰链区与Fab片段的融合来得到(参见Coloma等人(1997)Nature Biotechnol，15，159-163)。备选地，四价双特异性化合物已经通过双特异性单链二体的融合产生(参见Alt等人(1999)FEBS Lett 454，90-94)。更小的四价双特异性化合物也可通过二聚化具有含螺旋-环-螺旋基序的接头的ScFv-ScFv串联体(DiBi微型抗体，参见Mulle等人(1998)FEBS Lett 432，45-49)或者二聚化以阻止分子内配对的方向包含四个抗体可变结构域(VH和VL)的单链化合物(串联二体，参见Kipriyanov等人，(1999)J Mol Biol 293，41-56)来形成。双特异性F(ab’)₂片段可通过Fab’片段的化学偶联或通过经亮氨酸拉链的异源二聚化来产生(参见Shalaby等人(1992)J Exp Med 175，217-225和Kostelny等人(1992)，J Immunol 1481547-1553)。也可得到的是分离的VH结构域和分离的VL结构域(Domantis plc)，参见US 6,248,516；US 6,291,158；US 6,172,197，以及分离的VHH结构域抗体(纳米抗体(Nanobodies))。这些结构域和纳米抗体可以是双重特异性，其中具有一种针对半寿期延长的蛋白质如人血清白蛋白(HSA)的特异性。该类结构域和纳米抗体对本发明的NRG1蛋白质都是单特异性的，因此，本发明也特别考虑了针对半寿期延长的蛋白质如HSA的双重特异性。

在一个实施方案中，提供了如前所述的治疗性抗体片段(如ScFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂)或工程抗体片段，所述治疗性抗体片段或工程抗体片段与NRG1如NRG1β1结合(如优先地或特异地结合)并通过如抑制NRG1与其相关受体如ErbB2和/或ErbB3例如ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用来中和其生物学活性。

4.1.1.1.5异源缀合抗体(Heteroconjugate antibodies)

异源缀合抗体也构成本发明的一个实施方案。异源缀合抗体包含使用任意合适的交联方法形成的二价共价连接的抗体。参见如US 4,676,980。

4.1.1.1.6其它修饰

认为抗体的Fc区与多种Fc受体(F cγR)之间的相互作用介导了抗体的效应子功能，所述抗体的效应子功能包括抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、补体固定、吞噬作用和抗体的半寿期/清除率。对本发明抗体的Fc区的多种修饰可依据想要的特性进行实施。例如，EP 0629 240B1和Ep 0307 434B2中详述了Fc区中的特定突变产生了另外的溶解性抗体、另外的非溶解性抗体，或者可掺入补救受体结合表位到抗体中以增加血清半寿期，参见US 5,739,277。目前存在5种公认的人Fcγ、FcγR(I)、FCγRIIb、FcγRIIIa和新生FcRn。Shields等人，(2001)J Biol Chem 276，6591-6604证明了IgG1残基的共有集合参与结合所有的FcγR，但是FCγRII和FcγRIII使用在该共有集合外的独特位点。当将一组IgG1残基：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239改变为丙氨酸时，所述一组IgG1残基降低了与所有FcγR的结合。所有这一组IgG1残基都在IgG CH2结构域中并成簇分布在连接CH1和CH2的铰链附近。虽然FcγRI仅使用IgG1残基的共有集合来结合，但FcγRII和FcγRIII(如Glu-293)不是如此。一些变体显示出改善的与FcγRII或FcγRIII的结合，但不影响与其它受体的结合(如Ser-267Ala改善了与FcγRII的结合但不影响与FcγRIII的结合)。其它变体显示出改善的与DcγRII或FcγRIII的结合，同时降低与其它受体的结合(例如，Ser298Ala提高了与FcγRIII的结合，而降低了与FcγRII结合)。对于FcγRIIIa来说，最佳的结合IgG1变体具有在Ser-298、Glu-333和Lys-334位点处组合的丙氨酸替代。认为新生FcRn受体参与抗体清除和跨组织的胞吞转运作用二者(参见Junghans RP(1997)ImmunolRes 16，2957和Ghetie等人(2000)Annu Rev Immunol 18，739-766)。确定了与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。描述于本部分的在任意这些位点处的转换可使血清半寿期增加和/或使本发明抗体的效应子特性改变，并因此构成本发明的实施方案。

其它修饰包括本发明抗体的糖基化变体。已知在抗体的恒定区中保守位点的糖基化对抗体功能，尤其是如上述的那些效应子功能具有意义深远的影响，参见如Boyd等人(1996)，Mol Immunol 32，1311-1318。考虑了下述的本发明的治疗性抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，其中添加、替换、缺失或修饰了一个或多个糖类部分。引入天冬酰胺-X-丝氨酸基序或天冬酰胺-X-苏氨酸基序产生用于糖类部分酶促附着的潜在侧面，并因此可用于操纵抗体的糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry 40，8868-8876中，TNFR-IgG免疫黏附素的末端唾液酸化通过使用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α，2，3唾液酸转移酶的再半乳糖基化过程和/或再唾液酸化过程来增加。认为增加末端唾液酸化增加了免疫球蛋白的半寿期。同大多数糖蛋白一样，抗体一般产生为糖形的混合物。当抗体在真核细胞中产生时，特别是在哺乳动物细胞中产生时，这种混合物尤其明显。已经研发了多种方法来生产所定义的糖形，参见Zhang等人，Science(2004)，303，371；Sears等人，Science(2001)，291，2344；Wacker等人(2002)，Science 298，1790；Davis等人(2002)，Chem Rev 102，579；Hang等人(2001)，Acc Chem Res 34，727。因此，本发明考虑了如本文所述的多种治疗性(单克隆)抗体(其可是IgG同种型如IgG1)，其包含所述抗体或者所述抗体的抗原结合片段的所定义数量(如7个或更少，例如5个或更少如2个或单个)的糖形。

本发明进一步的实施方案包括与非蛋白质聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯偶联的本发明的治疗性抗体或其抗原结合片段。蛋白质与聚乙二醇的缀合是已建立的用于增加蛋白质的半寿期、以及降低蛋白质的抗原性和免疫原性的技术。已经使用完整抗体以及Fab’片段研究了具有不同分子量和种类(直线的或分枝的)的聚乙二醇化的用途(参见Koumenis IL等人(2000)Int J Pharmaceut 198；83-95)。

4.2Adnectin-化合物治疗剂

adnectin支架基于纤连蛋白III型结构域(如纤连蛋白III型的第十组件(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布于两个β片层之间的7个或8个β链，所述7个或8个β链相互自身包装以形成蛋白质的核心，并还含有将β链相互连接的环(类似于CDR)，且是溶剂暴露的。在β片层多层结构的每一边缘存在至少3个此类环，其中所述边缘是蛋白质垂直于β链的方向的界限。(US 6,818,418)。

这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，但是总体的折叠与最小的功能抗体片段(重链的可变区)的折叠密切相关，所述最小的功能抗体片段包含骆驼(camel)IgG和美洲驼(llama)IgG中的整个抗原识别单位。因为这种结构，非免疫球蛋白抗体模仿类似于天然的抗原结合特性和对抗体的亲和性。这些支架可用于与体内的抗体亲和力成熟过程相似的体外环随机化和改组策略。这些基于纤连蛋白的化合物可用作支架，其中化合物的环区可使用标准的克隆技术用本发明的CDR替代。因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的adnectin化合物。

4.3Ankyrin-分子配偶体

这种技术是基于使用具有ankyrin衍生的重复组件的蛋白质作为用于支撑可变区的支架，所述可变区可用于结合不同目标。Ankyrin重复组件是33个氨基酸多肽，由两个反平行α-螺旋和一个β-转角组成。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来最优化。因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的Ankyrin化合物。

4.4 Maxybodies/Avimers-Avidia

Avimers衍生自天然的含有A-结构域的蛋白质如LRP-1。这些结构域本质上用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中，超过250个蛋白质是结构地基于A-结构域的。Avimers由许多通过氨基酸接头连接的不同“A-结构域”单体(2-10)组成。使用描述于如US20040175756；US20050053973；US20050048512；和US20060008844中的方法，可产生能与目标抗原结合的Avimers。因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的Maxybody化合物。

4.5 A蛋白-Affibody

亲和配体是包含基于A蛋白的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束的小的简单蛋白质。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。这种支架结构域由58个氨基酸组成，其中将13个氨基酸随机地产生具大量配体变体的

文库(参见如US 5,831,012)。

化合物模仿抗体，与150kDa分子量的抗体比较，它们具有6kDa的分子量。尽管其小型，但是

化合物的结合位点与抗体的结合位点相似。因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的A蛋白-affibody化合物。

4.6 Anticalins-Pieris

是由Pieris ProteoLab AG公司研发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，一类广泛分布的小且坚固的蛋白质，所述脂笼蛋白通常参与生理转运或化学敏感的或者不溶的化合物的存储。几种天然的脂笼蛋白存在于人组织或体液中。

蛋白质结构暗示为免疫球蛋白，在刚性构架顶部具有高变环。然而，与抗体或其重组片段相反，脂笼蛋白包含具有160个至180个氨基酸残基的单一多肽链，这仅比单一的免疫球蛋白结构域略大。

构成结合袋的4个环的集合显示出意义深远的结构可塑性并耐受多种侧链。因此，为了高亲和力和高特异性地识别不同形状的指定目标化合物，结合部位可用专利方法进行重塑。

通过诱变处理4个环的集合，已将脂笼蛋白家族的一种蛋白质，即Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)用于研发anticalins。描述“anticalins”的专利申请的一个例子是PCT WO 199916873。

因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的anticalin化合物。

4.7 Affilin-Scil蛋白质

Affilin^TM化合物是经设计的对蛋白质和小化合物具有特异亲和力的小非免疫球蛋白蛋白质。新Affilin^TM化合物可非常快地选自两个文库，其中每一个文库基于不同的人来源的支架蛋白质。Affilin^TM化合物与免疫球蛋白蛋白质不显示出任何结构同源性。Scil蛋白质使用两种Affilin^TM支架，其中一种Affilin^TM支架是γ晶体蛋白(人结构性眼晶状体蛋白质)和另一种是“遍在蛋白质”超家族蛋白质。两种人支架都非常小，显示出高温稳定性且几乎耐pH变化和变性剂。这种高稳定性主要由于蛋白质的展开的β片层结构。γ晶体蛋白衍生的蛋白质的例子描述于WO200104144中，且“遍在蛋白样”蛋白质描述于WO2004106368中。因此，在一些实施方案中，提供了与NRG1且尤其是与NRG1β1结合并中和NRG1且尤其是中和NRG1β1的生物学活性的Affilin化合物。

4.7.1-其它治疗形式

如前所指，本发明的其它治疗形式包括NRG1且尤其是NRG1β1的调节物(尤其是抑制物)，所述调节物对它们的靶在蛋白质表达前发挥它们的作用。例子包括这样的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含(或基本上由以下组成)在生理条件下(a)能与NRG1(尤其是NRG1β1)基因的部分形成稳定三链体的序列，或者(b)能与NRG1(尤其是NRG1β1)基因的mRNA转录物的部分形成稳定双链体的序列。其它例子包括能参与“RNA干扰”现象的分子。RNA干扰(RNAi)特别用于特异地抑制特定蛋白质的产生。虽然不期望被理论所束缚，Waterhouse等人(1998)已经提供了机制的模型，通过所述机制，dsRNA(双链体RNA)可用于降低蛋白质产生。这种技术依赖于包含与目标基因的mRNA或其部分基本相同的序列的dsRNA分子的存在。方便地，dsRNA可产生自重组载体或宿主细胞中的单一启动子，其中有义序列和反义序列通过无关序列形成侧翼，所述无关序列使有义序列和反义序列杂交以形成具有无关序列形成的环状结构的dsRNA分子。本发明的合适dsRNA分子的设计和产生是本领域技术人员的能力所及的，尤其借鉴Waterhouse等人(1998)、Smith等人(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。

在一个例子中，导入DNA来指导至少部分与待失活的目标基因同源的双链RNA产物的合成。

因此，DNA包含有义序列和反义序列二者，当转录成RNA时，它们能杂交以形成双链RNA区。在一个优选的实施方案中，有义序列和反义序列由间隔区分开，所述间隔区包含在转录成RNA时剪除的内含子。这种排列已经显示出导致基因沉默的更高效率。双链区可包含转录自一个DNA区或两个DNA区的一个或两个RNA分子。认为双链分子的存在启动了来自内源哺乳动物系统的应答，所述来自内源哺乳动物系统的应答破坏了双链RNA和来自目标哺乳动物基因的同源RNA转录物二者，从而有效地降低或消除了目标基因的活性。

杂交的有义序列和反义序列的长度应是每一个至少19个连续的核苷酸、优选地至少30个或50个核苷酸、和更优选地至少100个、200个、500个或1000个核苷酸。可使用对应于整个基因转录物的全长序列。长度最优选地是100个-2000个核苷酸。有义序列和反义序列与靶向的转录物的同一性程度应是至少85％，优选地至少90％和更优选地95％-100％。当然，RNA分子可包含可能对稳定分子起作用的无关序列。RNA分子可在RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶HI启动子的控制下表达。后者的例子包括tRNA启动子或snRNA启动子。

优选的小干扰(“siRNA”)分子包含与目标mRNA的大约19个-21个连续核苷酸同一的核苷酸序列。优选地，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包含大约30％-70％的GC含量(优选地，30％-60％的GC含量，更优选地40％-60％的GC含量和更优选地大约45％-55％的GC含量)，且在它所导入的哺乳动物基因组中与不是目标的任意核苷酸序列不具有高的同一性百分数，例如这一点通过标准的BLAST搜索来确定。微RNA调节与常规RNAi/PTGS不同，所述微RNA调节是朝基因调节进化的RNA沉默途径的明确特定分支。

微RNA是编码于以特征性的反向重复序列组织的基因样元件中的小RNA的特定类型。当转录后，微RNA基因产生茎环前体RNA，随后由所述茎环前体RNA加工产生微RNA。微RNA一般大约21个核苷酸长度。释放的微RNA掺入含有发挥序列特异性基因抑制的Argonaute蛋白质的特定子集的RISC样复合物中(参见如Millar和Waterhouse，2005；Pasquinelli等人2005；Almeida和Allshire，2005)。

4.8 产生方法

本发明的治疗性蛋白质，且尤其是抗体可产生为多克隆群体，但更优选地产生为单克隆群体(为针对特定抗原结合位点的相同抗体的基本同源群体)。当然，群体隐含多于一种抗体实体是本领域技术人员显而易见的。本发明抗体可在转基因生物如山羊(参见Pollock等人(1999)，J.Immunol.Methods 231：147-157)、小鸡(参见Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News20：1-55)、小鼠(参见Pollock等人)或植物(参见Doran PM，(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11，199-204，Ma JK-C(1998)，Nat.Med.4；601-606，Baez J等人，BioPharm(2000)13：50-54，Stoger E等人；(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)中产生。抗体也可通过化学合成来产生。然而，本发明的抗体和其它治疗性蛋白质一般使用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术来产生。将编码抗体的多核苷酸分离并插入到可复制载体如质粒中用于进一步的克隆(扩增)或表达。一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(如由Lonza Biologies出售)，尤其是其中宿主细胞是CHO或NSO(见下文)。将编码抗体的多核苷酸使用常规方法(如寡核苷酸探针)来容易地分离并测序。可用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是一般的实施方案。一般来说，该类载体还包括与轻链多核苷酸和/或重链多核苷酸有效连接的信号序列、复制起点、一个或多个标志基因、增强子原件、启动子和转录终止序列以促进表达。编码轻链和重链的多核苷酸可插入到单独的载体中并转染到同一宿主细胞中，或者根据需要，可将重链和轻链二者插入到用于转染到宿主细胞中的同一载体中。因此，根据本发明的一个方面，提供了构建编码本发明治疗性抗体或者其抗原结合片段的轻链和/或重链的载体的方法，所述方法包括将编码本发明治疗性抗体的轻链和/或重链的多核苷酸插入到载体中。

4.8.1 信号序列

本发明抗体可产生为具有异源信号序列的融合蛋白质，其中在成熟蛋白质的N末端具有特定剪切位点。信号序列应被宿主细胞识别并加工。对于原核宿主细胞来说，信号序列可以是碱性磷酸酶的前导区、青霉素酶的前导区或热稳定肠毒素II的前导区。对于酵母分泌，信号序列可以是酵母转化酶的前导区、[α]因子的前导区或酸性磷酸化酶的前导区，参见如WO90/13646。在哺乳动物细胞系统中，可使用病毒分泌前导区如单纯疱疹病毒(herpes simplex)gD信号序列和天然免疫球蛋白信号序列。一般来说，信号序列是以阅读框的形式与编码本发明抗体的DNA连接的。

4.8.2 复制起点

pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌、2μ质粒的复制起点适合于大多数酵母和多种病毒的复制起点如SV40的复制起点、多瘤病毒的复制起点、腺病毒的复制起点、VSV的复制起点或BPV的复制起点适合于大多数哺乳动物细胞是本领域熟知的。一般来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点元件，但是可使用SV40，因为它含早期启动子。

4.8.3选择标记

一般的选择基因编码下述蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性或者(b)互补营养缺陷型缺失或提供在复杂培养基中不具备的营养物。选择方案可涉及停滞宿主细胞的生长。已成功转染了编码本发明治疗性抗体基因的细胞由于如借助选择标记赋予的药物抗性而存活。另一个例子是所谓的DHFR选择标记，其中将转化体在氨甲喋呤存在下培养。在一般的实施方案中，将细胞在增加量的氨甲喋呤存在下培养，以扩增外源目标基因的拷贝数。CHO细胞是尤其有用的用于DHFR选择的细胞系。另外的例子是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologies)。使用于酵母中的合适的选择基因是trp1基因，参见Stinchcomb等人Nature 282，38，1979。

4.8.4启动子

用于表达本发明抗体的合适的启动子与编码抗体的DNA/多核苷酸有效地连接。原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶启动子系统和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子和杂合启动子如Tac。适合于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子或其它糖酵解酶的启动子如烯醇化酶的启动子、甘油醛3磷酸脱氢酶的启动子、己糖激酶的启动子、丙酮酸脱羧酶的启动子、果糖磷酸激酶的启动子、葡萄糖6磷酸异构酶的启动子、3磷酸甘油酸变位酶的启动子和葡糖激酶的启动子。诱导型酵母启动子包括醇脱氢酶2的启动子、同类细胞色素C(isocytochrome C)的启动子、酸性磷酸酶的启动子、金属硫蛋白的启动子和负责氮代谢的酶的启动子或负责麦芽糖/半乳糖利用的酶的启动子。

用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒的启动子如多瘤病毒(polyoma)的启动子、禽痘病毒(fowlpox)的启动子和腺病毒(adenovirus)的启动子(如腺病毒2(adenovirus 2)的启动子)、牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)的启动子、禽肉瘤病毒(avian sarcomavirus)的启动子、巨细胞病毒(cytomegalovirus)的启动子(尤其是立即早期基因启动子)、逆转录病毒(retrovirus)的启动子、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)的启动子、肌动蛋白(actin)的启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的启动子和早期猿猴病毒40(early Simian virus 40)的启动子或晚期猿猴病毒40(late Simian virus 40)的启动子。当然，启动子的选择是基于与用于表达的宿主细胞之间的合适的兼容性。

4.8.5 增强子元件

根据需要，如用于在高等真核生物中表达，可使用在一个载体中将增强子元件与启动子元件有效地连接。合适的哺乳动物增强子序列包括来自珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。备选地，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件如SV40的增强子(在100-270bp处)、巨细胞病毒早期启动子的增强子、多瘤病毒的增强子、杆状病毒(baculoviral)的增强子或鼠lgG2a基因座(参见WO04/009823)。增强子优选地定位于载体启动子的上游位点。

4.8.6宿主细胞

用于克隆或表达编码本发明抗体的载体的合适宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌如肠杆菌科(enterobacteriaceae)例如埃希杆菌属(Escherichia)如大肠杆菌(E.Coli)(例如ATCC 31，446；31，537；27，325)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门菌属(Salmonella)如伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)和志贺杆菌属(Shigella)以及芽胞杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)(参见DD 266 710)、假单胞菌属(Pseudomonas)如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。在酵母宿主细胞中也考虑了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(如ATCC 16，045；12，424；24178；56，500)、耶罗威亚酵母(yarrowia)(EP402,226)、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)(EP183,070，也参见Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185-192)、假丝酵母属(Candida)、Thchoderma reesia(EP244,234J)、青霉属(Penicillin)、弯颈霉属(Tolypocladium)、以及曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

尽管本发明特别考虑了原核宿主细胞和酵母宿主细胞，然而优选地，本发明的宿主细胞是高等真核细胞。合适的高等真核宿主细胞包括哺乳动物细胞如COS-1(ATCC号CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、人胚肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC号：CRL 10314)、293(ATCC号CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(如CHO-K1、ATCC号：CCL 61、DHFR-CHO细胞系例如DG44(参见Urlaub等人，(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))，特别地是适合于悬浮培养的那些CHO细胞系、小鼠支持细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、HepG2和骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞如NSO(参见US 5,807,715)、Sp2/0、YO。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了稳定转化了包含编码本文所述的治疗性抗体或者其抗原结合片段的重链和/或轻链的载体的宿主细胞。优选地，该类宿主细胞包含编码轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。

4.6.1细菌发酵

细菌系统可用于上述非免疫球蛋白治疗性蛋白质的表达。细菌系统也尤其适合于抗体片段的表达。该类片段定位于细胞内或周质中。根据本领域技术人员已知的方法，可将不溶性周质蛋白质提取并重折叠以形成活性蛋白质，参见Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cu pit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol，29，273-277。

4.8.7细胞培养方法

用编码本发明的治疗性抗体或其抗原结合片段的载体转化的宿主细胞可通过本领域技术人员已知的任意方法来培养。宿主细胞可培养于转瓶、滚瓶或中空纤维系统中，但是对于大规模生产，优选的是将搅拌釜反应器特别地用于悬浮培养。优选地，搅拌釜反应器适合使用如喷头、活门或低剪切叶轮来通气。对于泡罩塔和空气提升反应器，可使用空气泡或氧气泡直接通气。当宿主细胞培养于无血清培养基中时，优选的是将培养基补充有细胞保护试剂如Pluronic F-68以帮助防止由于通气过程导致的细胞损伤。依据宿主细胞特性，可将微载体用作贴壁依赖细胞系的生长基质或者所述细胞可以适应于悬浮培养(这是一般情况)。宿主细胞的培养，尤其是无脊椎动物宿主细胞的培养可使用多种操作方式如补料分批培养、重复批处理培养(参见Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103-109)、扩展批处理培养或灌注培养。虽然经重组转化的哺乳动物宿主细胞可培养于含血清的培养基如含胎牛血清(FCS)的培养基中，优选的是将这类宿主细胞培养于合成的无血清培养基如公开于Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163中的合成的无血清培养基或商业可得的培养基例如ProCHO-CDM或UltraCHO(TM)(Cambrex NJ，美国)中，其中根据需要补充了能源如葡萄糖和合成生长因子如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能要求这些细胞适应于在无血清条件中生长。一种适应方法是在含血清的培养基中培养这类宿主细胞，并反复地交换80％的培养基为无血清培养基以使宿主细胞学会适应于无血清条件(参见如ScharfenbergK等人(1995)，Animal Cell technology：Developments towards the 21stcentury(Beuvery E.G.等人编辑)，619页-623页，Kluwer Academic出版公司)。

分泌到培养基中的本发明抗体或其它治疗性蛋白质可使用多种技术来回收并纯化以提供适合于预期用途的纯化程度。例如用于治疗人患者的本发明治疗性抗体的使用一般要求至少95％的纯度、更一般地98％的纯度或99％的纯度或者更高纯度(与粗培养基比较)。在第一个例子中，来自培养基的细胞碎片一般使用离心然后通过如微量过滤、超滤和/或深度过滤的上清澄清步骤来去除。多种其它技术如透析和凝胶电泳以及色谱技术例如羟磷灰石层析(HA)、亲和层析(任选地涉及亲和标签系统如多聚组氨酸)和/或疏水作用层析(HIC，参见US 5,429,746)是可用的。在一个实施方案中，本发明抗体在经过多个澄清步骤后，使用A蛋白或G蛋白亲和层析然后通过进一步的层析步骤如离子交换层析和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析和硫酸铵沉淀来捕获。一般地，也使用多个病毒去除步骤(如使用例如DV-20滤器的纳米过滤)。在经过这些多个步骤后，将提供包含至少75mg/ml或更多如100mg/ml或者更多的本发明抗体或其抗原结合片段的纯化(优选地单克隆的)制备物，并因此构成本发明的一个实施方案。合适的此类制备物是基本上无聚合形式的本发明抗体。

4.9-筛选方法

在其它实施方案中，提供了鉴定能调节NRG1(如NRG1β1)与其相关受体(如ErbB2/ErbB3异二聚体)之间相互作用的调节物(如拮抗物)的方法。在一些实施方案中，调节物中和NRG1的生物学活性。

因此，根据本发明，提供了通过如抑制NRG1(如NRG1β1)与相关受体如ErbB2/ErbB3异二聚体之间的相互作用来筛选具有中和NRG1(尤其是NRG1β1)的生物学活性的能力的候选化合物的方法，所述方法包括将所述NRG1(如NRG1β1)与所述候选化合物(如候选抗体)接触并检测在所述NRG1与其一个或所有两个相关受体之间相互作用中的调节。

因此，根据本发明，提供了筛选具有调节(如抑制)NRG1(如NRG1β1)与相关受体(如ErbB2/ErbB3异二聚体)之间相互作用的能力的候选化合物的方法，所述方法包括将所述NRG1(如NRG1β1)与所述候选化合物(如候选抗体)接触并检测NRG1β1的生物学活性的中和。

在一个实施方案中，所述方法包括检测MUC5AC和/或MUC5B在能表达MUC5AC和/或MUC5B的细胞上的表达的改变。这种细胞的例子是上皮细胞如杯形细胞。用于检测这种表达改变的方法对技术人员是显而易见的。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了筛选NRG1(如NRG1β1)与相关受体(如ErbB2和/或ErbB3)之间相互作用的候选抑制物的方法，所述方法包括在存在表达MUC5AC和/或MUC5B的细胞下将所述NRG1与所述候选化合物接触，并与存在所述NRG1、不存在所述候选化合物的所述细胞上所述MUC5AC和/或MUC5B的表达相比较来检测MUC5AC和/或MUC5B表达的改变(如降低)。

在另一实施方案中，所述方法包括在所述候选化合物存在下检测杯形细胞增生的改变。因此，本发明的一个方面提供了用于筛选NRG1(如NRG1β1)与相关受体(如ErbB2和/或ErbB3，例如ErbB2/ErbB3异二聚体)之间相互作用的候选抑制物的方法，所述方法包括在杯形细胞存在下将所述NRG1与所述候选化合物接触，并与所述候选化合物不存在下的杯形细胞分裂相比较来检测杯形细胞分裂的改变(如降低)。

4.10药物组合物

本发明提供了包含与可药用载体制剂的治疗性蛋白质或低分子量化学实体的药物组合物。所述组合物可额外地含有适用于治疗或预防下文所指的人疾病或病症的其它治疗剂。药物载体增强或稳定组合物，或者用于方便组合物的制备。可药用载体包括生理学相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

本发明的药物组合物可通过本领域已知的多种方法来施用。施用的途径和/或方式依据预期的结果来变化。优选的施用是静脉内的、肌内的、腹膜内的或皮下的或者近端地施用到目标部位。可药用载体应适合于静脉内的、肌内的、皮下的、胃肠外的、脊髓的或表皮的施用(如通过注射或输注)。依据施用的途径，活性化合物(尤其是低分子量化学实体)可包被入材料中以保护化合物免受酸和其它可失活化合物的自然条件的作用。

组合物应是无菌的且是流体。适当的流动性可例如通过使用包衣如磷脂酰胆碱、在分散情况下通过维持所需要的颗粒大小、和通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，组合物中优选地包括等渗剂如糖类、多元醇例如甘露醇或山梨糖醇、和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶来达到。

本发明的药物组合物可根据本领域熟知的和常规使用的方法来制备。参见如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack出版公司，第20版，2000；和Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，公司，纽约，1978。药物组合物优选地在GMP条件下生产。一般地，将治疗有效剂量或有效剂量的NRG1(如NRG1β1)的调节物例如本文所述的NRG1β1抗体应用于本发明的药物组合物中。它们一般通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用剂型。调整给药方案以提供最佳预期的应答(如治疗性应答)。例如，可施用单一的大丸剂、一段时间施用几次分开的剂量或者如由治疗情况的要求所指示可按比例地降低或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外应用的组合物对施用的便利性以及剂量的均一性都是特别有利的。此处所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单元剂量的物理上分离的单位；每一单位含有经计算与所需药物载体一起产生预期治疗效果的预定量的活性化合物。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以是不同的，以便在对患者无毒的情况下，获得有效达到对特定患者预期的治疗性反应的活性成分的量、组合物的量和施用方式。选择的剂量水平取决于多种药物动力学因素，所述药物动力学因素包括本发明使用的特定组合物的活性或其酯的活性、其盐的活性或者其酰胺化物的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与使用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、受治疗患者的年龄、性别、体重、疾病、一般健康和以前的病史等因素。

医师可以以低于达到预期治疗效果所需的剂量水平来起始药物组合物中使用的本发明抗体的剂量，并逐渐增加剂量直到达到预期效果。一般来说，用于治疗本文所述的过敏性炎性病症的本发明组合物的有效剂量依据许多不同因素变化，所述许多不同因素包括施用的手段、目标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物、和治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量需要进行滴定法测量以优化安全性和有效性。对于使用抗体的施用，剂量范围为大约0.0001mg/kg至100mg/kg，和更通常地0.01mg/kg至5mg/kg宿主体重。例如剂量可是每千克体重1毫克或每千克体重10毫克或在每千克体重1毫克至10毫克之间。示例性的治疗方案需要每两周施用一次或每一月施用一次或者每3个月至6个月施用一次。

抗体治疗和其它蛋白质治疗通常在多种场合中施用。单一剂量之间的间隔可是每周、每月或每年。如通过测量患者中治疗性蛋白质的血液水平所指示，间隔也可是不定期的。在一些方法中，调整剂量以达到1μg/ml-1000μg/ml的血浆抗体浓度和在一些方法中的25μg/ml-300μg/ml的血浆抗体浓度。备选地，抗体治疗或其它蛋白质治疗可施用为持续释放制剂，在这种情况下，需要较低频率的施用。剂量和频率依据患者中抗体或其它蛋白质治疗的半寿期来变化。一般来说，人源化抗体比嵌合抗体和非人抗体显示出更长的半寿期。施用的剂量和频率可依据治疗是预防性的还是治疗性的来变化。在预防性应用中，在长时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，在相对短的间隔有时需要相对高的剂量直到疾病的发展降低或终止，和优选地直到患者表现出疾病症状得到部分或完全的改善。此后，患者可施用预防性方案。

4.11临床用途

本发明至少部分基于神经调节蛋白家族成员(尤其是NRG1家族如NRG1β并特别是NRG1β1)促进杯形细胞形成的发现。因此，本发明的调节物(尤其是拮抗物)可用于治疗人疾病和病症，在所述人疾病和病症中异常杯形细胞形成起着病理学作用。因此，根据本发明，提供了治疗杯形细胞循环调节的疾病和病症的方法，所述方法包括向临床需要其的人患者施用治疗有效量的NRG1生物学活性的调节物。在一些实施方案中，调节物是与NRG1(如NRG1β1)和/或其相关受体(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是ErbB2/ErbB3异二聚体)结合并抑制它们之间相互作用的拮抗物(如抗体，尤其是IgG同种型的人抗体或人源化抗体或其抗体片段)。在其它实施方案中，提供了治疗杯形细胞循环调节的疾病和病症(如杯形细胞增生)的方法，所述方法包括向临床需要其的人患者施用治疗有效量的结合NRG1β1的治疗性蛋白质(如本文所述的优先地或特异地结合NRG1β1的人抗体或人源化抗体的IgG1同种型或IgG4同种型)。杯形细胞增生对疾病有贡献的临床疾病或病症的例子包括呼吸疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(CF)、慢性支气管炎、哮喘(尤其是其中度和重度形式)。

因此，在一些实施方案中，提供了治疗患呼吸疾病如COPD、CF、慢性支气管炎或哮喘(尤其是其中度和重度形式)的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用NRG1(如NRG1β1)生物学活性的治疗有效量的调节物。在这些实施方案的优选形式中，调节物是与NRG1(尤其是NRG1β1)结合(如优先地或特异地结合)并中和NRG1(尤其是NRG1β1)的生物学活性的抗体(尤其是人抗体或人源化抗体的IgG1同种型或IgG4同种型)或抗体片段。在此方面，使用于整个说明书的关于NRG1的“生物学活性”并尤其是关于NRG1β1的“生物学活性”指这些蛋白质在促进MUC5AC和/或MUC5B表达中的活性。因此，使用于整个说明书的“中和生物学活性”等指通过本发明的调节物抑制MUC5B和/或MUC5AC表达。

在一些实施方案中，提供了治疗患包含异常黏液产生的疾病或病症如COPD、CF、慢性支气管炎或哮喘(尤其是其中度或中度形式)或者患下呼吸道疾病和病症(如下呼吸道感染)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的、NRG1(尤其是NRG1β1)与其一个或多个相关受体(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是ErbB2/ErbB3异二聚体)之间相互作用的抑制物(如人抗体或人源化抗体的IgG1同种型或IgG4同种型)。在这些实施方案的优选形式中，调节物是本文所述的与NRG1β1优先地结合或更优选地特异地结合并抑制所述异常黏液分泌的人抗体或人源化抗体或者抗体片段。

在一些实施方案中，提供了治疗患呼吸疾病或病症如COPD、CF、支气管炎(尤其是慢性支气管炎)或哮喘(尤其是其重度或中度形式)或者下呼吸道疾病和病症(如下呼吸道感染)、肺炎、肺气肿的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的、NRG1(尤其是NRG1β1)与其一个或多个相关受体(如ErbB2和/或ErbB3，尤其是“ErbB”/ErbB3异二聚体)之间相互作用的抑制物(如人抗体或人源化抗体的IgG1同种型或IgG4同种型)。

在一些实施方案中，提供了治疗异常黏液产生方面的呼吸疾病如COPD、CF、慢性支气管炎或哮喘(尤其是其重度或中度形式)的方法，所述方法包括向所述人患者施用治疗有效量的中和NRG1的生物学活性，且尤其是中和NRG1β的生物学活性的调节物(如人抗体或人源化抗体)。

在其它实施方案中，提供了预防性治疗有患以异常黏液产生(如COPD、慢性支气管炎、囊性纤维化、哮喘)为特征的呼吸疾病和病症危险的人患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的调节NRG1(尤其是NRG1β且更尤其是NRG1β1)与其一个或多个相关受体(如ErbB2和/或ErbB3)之间相互作用的调节物(例如治疗性蛋白质，如人抗体或人源化抗体的IgG同种型例如本文所述的IgG1或IgG4)。在一些实施方案中，调节物中和NRG1的生物学活性。

在本发明的其它实施方案中，提供了治疗患呼吸疾病或病症如COPD、CF、慢性支气管炎的人患者的方法，所述方法包括共施用NRG1(尤其是NRG1β和更尤其是NRG1β1)生物学活性的抑制物(例如治疗性蛋白质如本文所述的人抗体或人源化抗体)和抗人IL-13剂(如IL-13抗体，尤其是人IL-13抗体或人源化IL-13抗体)和/或抗人IL-4剂(如IL-4抗体，尤其是人IL-4抗体或人源化IL-4抗体)和/或抗人IL-5剂(如IL-5抗体，尤其是人IL-5抗体或人源化IL-5抗体)和/或抗IgE剂(如人抗IgE抗体或人源化抗IgE抗体)和/或抗IL-17(尤其是IL-17A)抗体(例如人抗IL-17如IL-17A抗体或人源化抗IL-17如IL-17A抗体)。特别地并分别地考虑了这些组合中的每一种组合。

尽管已描述了本发明主要涉及人疾病或病症的治疗，技术人员可容易地理解，本文的教导可应用于非人哺乳动物中相似的疾病或病症的治疗。

5.实施例

本发明现仅以实施例的方式进行描述。

5.1附图简述

图1.NRG1β1和NRG1α对MUC5AC表达的影响

用浓度增加的NRG1β1(上左)或NRG1α(上右)处理人支气管上皮细胞(HBEC)7天并用抗MUC5AC(45M1)单克隆抗体染色。MUC5AC阳性细胞的比例通过图象分析来评估。(下)MUC5AC/爱茜蓝染色的运载体和NRG1β1(50nM)处理的HBEC的代表性组织学成像。箭头所指为用抗MUC5AC抗体未染色的爱茜蓝染色细胞。显示的结果是来自对3个独立供体实验的代表性结果。显示的结果是平均值±SEM(n＝3)。指出了与未处理对照相比的显著差异(＊P＜0.05)。

图2：NRG1α和NRG1β1对MUC5B蛋白质的影响

如通过免疫组织化学评估，浓度增加的NRG1β1(A)和NRG1α(B)对MUC5B蛋白质的影响。将细胞用NRG1处理7天。(C)MUC5B/爱茜蓝染色的运载体和NRG1β1(50nM)处理的HBEC的代表性组织学成像。显示的结果是平均值±SEM(n＝3)。指出了与未处理对照相比的显著差异(＊P＜0.05)。

图3：一段时间内NRG1β1对MUC5AC和MUC5B表达的影响

如通过组织学评估，NRG1β1(50nM)处理1至14天对MUC5AC蛋白质(A)和MUC5B蛋白质(B)的影响。经NRG1β1处理的样品显示为黑色和未处理样品显示为白色。显示的结果是平均值±SEM(n＝3)。指出了与未处理对照相比的显著差异(＊P＜0.05)。

图4：NRG1β1在原代细胞中的表达

通过RT-PCR分析了一组包括T细胞、嗜中性粒细胞、人支气管上皮细胞(HBEC)、支气管平滑肌细胞(BSMC)和肺成纤维细胞的原代细胞中NRG1β1的表达。也分析了管家基因运铁蛋白的表达。数据是用来自至少2个独立供体的细胞获得的数据的代表。

图5：MUC5AC和MUC5B在卵清蛋白攻击的小鼠肺中的表达

通过定量RT-PCR分析了在来自OVA攻击的Balb/c小鼠肺组织中MUC5AC(A)和MUC5B(B)的表达。结果显示为平均值±SEM(n＝每组8只)，且显示的是归一化为管家基因β肌动蛋白的数据。与盐水攻击的小鼠比较＊p＜0.05。

图6：在来自OVA攻击的小鼠BAL液中NRG1β1蛋白质的蛋白质印迹分析

通过蛋白质印迹，对来自OVA攻击的小鼠BAL液分析NRG1β1蛋白质。用优先识别NRG1β1同工型的抗体(sc-347)来探测印迹。每一处理分析来自4只动物的BAL液。显示的数据是用2个独立样品的集合获得的数据的代表。

图7：NRG1β1ELISA

在来自OVA攻击的小鼠BAL液中定量NRG1β1蛋白质。数据显示为平均值±SEM(n＝每组4只小鼠)。显示的数据是2个独立样品集合的代表。与盐水攻击的小鼠比较**p＜0.001。

图8：pan-ErbB受体抑制物对杯形细胞形成的影响

显示了pan-ErbB受体抑制物对NRG1β1诱导的杯形细胞形成的影响。通过组织学确定抑制物(1-10μM)对NRG1β1诱导的MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质的影响。如所标示，细胞未经NRG1β1(50nM)处理或者经NRG1β1(50nM)处理。＊与未处理对照相比存在显著差异(P＜0.05)；#与仅经NRG1β1处理组相比存在显著差异(P＜0.05)；##与仅经NRG1β1处理组相比显著差异(P＜0.001)。结果显示为平均值±SEM(n＝3)，且结果是2次独立实验的代表。

图9：ErB受体在人支气管上皮细胞中的表达分析

通过RT-PCR(左)和蛋白质印迹(右)分析了ErbB受体在原代人支气管上皮细胞中的表达。分别分析了3个或2个供体中ErbB受体的mRNA和蛋白质的表达。也显示了管家基因GAPDH的表达。

图10：ErbB受体中和抗体对NRG1β1诱导的杯形细胞形成的影响

通过组织学来定量抗ErbB受体抗体在HBEC中对NRG1β1诱导的MUC5AC蛋白质(A、C、E)和MUC5B蛋白质(B、D、F)的影响。显示了抗ErbB2受体抗体的数据(A、B)、抗ErbB3受体抗体的数据(C、D)和抗ErbB4受体抗体的数据(E、F)，且所用抗体的浓度标示于图上。＊与未处理对照相比显著差异(P＜0.05)；#与仅经NRG1β1处理组相比显著差异(P＜0.05)。结果显示为平均值±SEM(n＝3)，且结果是2次独立实验的代表。

5.2缩写列表

缩写	描述
		ALI	气液界面
BAL	支气管肺泡灌洗
		BSA	牛血清清蛋白
BSMC	支气管平滑肌细胞
		CF	囊性纤维化
COPD	慢性阻塞性肺病
		ELISA	酶联免疫吸附测定
HBEC	人支气管上皮细胞
		HRG	Heregulin
IL-13	白细胞介素13

缩写	描述
		MUC5AC	黏蛋白5AC
MUC5B	黏蛋白5B
		NRG1	神经调节蛋白-1
OVA	卵清蛋白
		PAS	高碘酸-希夫(Periodic Acid-Schiff)
RT-PCR	逆转录酶聚合酶链式反应
		TMB	3，3’，5，5’-四甲基联苯胺
EGFR	表皮生长因子受体
		ErbB2	v-erb-b2禽类成红细胞白血病病毒癌基因同系物2

5.3方法

5.3.1HBEC的培养

将人支气管上皮细胞(HBEC；Cambrex)培养于补充有提供了基本上如[Atherton等人，2003]中所述的单一配方的支气管上皮细胞生长培养基(BEGM；Cambrex)中。对于分化，将细胞在分化培养基中以8.25×10⁴个细胞/Insert的细胞密度生长于0.4μm孔大小、12mm的Transwell inserts(Costar)上。分化培养基含50％BEGM和50％Dulbeccos改良的Eagle培养基(DMEM)并补充有52μg/ml牛垂体提取物、5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml皮质醇、10μg/ml运铁蛋白、0.5μg/ml肾上腺素、0.5ng/ml人EGF、50μg/ml庆大霉素和50nM视黄酸。将细胞维持浸没7天，然后在气液界面(ALI)生长7-14天并每2-3天重新补充培养基。在ALI培养期间，将细胞用NRG1α或NRG1β1(R&D系统)处理，并加到Transwell inserts的基底外侧小室中。所有阶段都将细胞维持在37℃、存在5％CO₂的空气温箱中。

5.3.2.MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质的免疫组织化学检测

在ALI分化7天后(除非另外说明)，将HBEC的顶端表面用PBS温和地洗涤并用中性缓冲福尔马林固定并包埋。将Insert切片为3μm厚并按照DABMAP步骤使用抗MUC5AC抗体(45M1；Labvision)或者抗MUC5B单克隆抗体在Ventana XT免疫染色仪上染色，并用在3％乙酸中的1％爱茜蓝，pH 2.5复染。使用具有Imaging Associated KS400图象分析仪(Imaging Associates)的Zeiss Axioplan 2显微镜(×10放大)来评估染色区域。每一样品评分14个视野。数据表示为杯形细胞密度，其定义为染色区域(μm²)与评分的上皮的长度(μm)的比率。常规制备的抗MUC5B单克隆抗体获自佛罗里达大学Hybridoma Core Laboratory，并且所述抗体是针对肽SWYNGHRPEPGLG(SEQ.I.D.NO：11)产生的。

5.3.3RNA的制备和第一链cDNA合成

如前所述分离来自原代细胞的总RNA[Jones等人，2003]。依据厂商说明书使用RNeasy mini RNA分离试剂盒(Qiagen)从细胞中分离总RNA。RNA也分离自过敏原诱导的杯形细胞形成的小鼠卵清蛋白(OVA)模型的肺组织。已经将Balb/c小鼠用OVA致敏2周，并给予连续2天、每天一次的卵清蛋白(50mg/ml)攻击，如在[Trifilieff等人，2000]中所述。使用在Qiagen RNeasy小型制备试剂盒中提供的试剂和方法从小鼠肺组织中制备RNA。将冰冻的肺组织(20mg)在600μl的RLT缓冲液中使用polytron均化器(Kinematica AG)进行均化。裂解物根据生产商说明书使用Qiashredder柱(Qiagen)进行进一步的处理。

使用1μg的总RNA和提供于第一链cDNA合成试剂盒(RocheDiagnostics公司)中的试剂和方法来进行第一链cDNA合成。

5.3.4定量RT-PCR

通过定量RT-PCR，分析在来自小鼠OVA模型(第2-3部分)的肺组织中MUC5AC基因和MUC5B基因的表达。将PCR反应混合物制备成20μl的终体积并含10μl 2×SYBR Green PCR Master Mix(Sigma)、0.8μl的10μM各正向引物和反向引物(终浓度400nM)和4.4μl dH₂O。在96孔Optical Reaction Plate中放入16μl的这种主混合物并每孔加入4μl的cDNA模板(第2-3部分)。样品一式两份使用ABI7900 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems)进行分析。MUC5AC、MUC5B和β-肌动蛋白管家基因对照的引物序列显示于表1中。

使用具有cDNA浓度范围为66,666pg至274pg的混合的肺cDNA库，在每一板上包括标准曲线。包括含用无核酸酶水替代稀释的cDNA的无模板对照(NTC)。定量PCR程序如下：阶段1，50℃2分钟；阶段2，95℃10分钟；阶段3，40个循环的95℃15秒、60℃15秒和72℃30秒。数据通过相对方法解释(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System。UserBulletin#2，PE Applied Biosystems，1997)。显示了归一化为管家基因β肌动蛋白的表达值。

表1  RT-PCR引物

基因	引物序列(5’到3’)	引物名称	PCR产物的长度(bp)
				运铁蛋白	TTACAGTGGCTGTATTCTGCTGG(SEQ.I.D.NO：1)TGCTGTTCTCATGGAAGCTAT	TransForTransRev	401
基因	引物序列(5’到3’)	引物名称	PCR产物的长度(bp)

基因	引物序列(5’到3’)	引物名称	PCR产物的长度(bp)
					GG(SEQ.I.D.NO：2)
NRG1β1	CAAGCATCTTGGGATTGAA(SEQ.I.D.NO：3)TGTTTCGTTCTGACCGAAGG(SEQ.I.D.NO：4)	NRG1β1ForNRG1Rev	188
				Muc5ac	CAGCCGAGAGGAGGGTTTGATCT(SEQ.I.D.NO：5)AGTCTCTCTCCGCTCCTCTCAAT(SEQ.I.D.NO：6)	Muc5acForMuc5acRev	399
Muc5b	AGGAAGACCAGTGTGTTTGTC(SEQ.I.D.NO：7)GTCCTCATTGAAGAAGGGCTG(SEQ.I.D.NO：8)	Muc5bForMuc5bRev	615
				β-肌动蛋白	TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG(SEQ.I.D.NO：9)TTTGATGTCACGCACGATTTCC(SEQ.I.D.NO：10)	MmβactinForMmβactinRev	514

5.3.5RT-PCR

用于在制备自人原代细胞的cDNA中分析NRG1β1基因表达。将含10μl的2×HotStar Taq Master Mix(Qiagen)、20pmol的每一NRG1β1正向引物和NRGl反向引物(Sigma-Genosys；表1)、1μl的cDNA模板(50ng)的PCR反应物在0.2ml薄壁PCR管中补足20μl的终体积。对照PCR反应使用管家基因运铁蛋白特异的引物(使用引物TransFor和TransRev(表1))来进行。PCR循环条件如下：95℃变性15分钟，30个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒和72℃延伸45秒，然后72℃最终延伸5分钟。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分析并用溴化乙锭染色。

5.3.6蛋白质印迹

对来自小鼠OVA模型的支气管肺泡灌洗(BAL)样品进行蛋白质印迹分析。在使用NuPAGE MOPS运行缓冲液的4％-12％NuPAGE Bis-Tris丙烯酰胺凝胶上、200V分析前，将含25μl BAL液的样品在1×NuPAGELDS样品缓冲液、50mM DTT中70℃、变性10分钟。凝胶和缓冲液购自Invitrogen。使用NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)，将样品10V过夜转移到Immobilon-P PVDF膜(Millipore)上。将膜在PBS、0.1％(v/v)吐温-20、5％(w/v)Blotto奶粉(Santa Cruz)中室温封闭1小时。移去封闭缓冲液并将膜用1∶600稀释于封闭缓冲液中的抗NRG1β1(sc-347；Santz Cruz)第一抗体室温孵育3小时。将膜在洗涤缓冲液(PBS、0.1％(v/v)吐温-20)中室温振荡洗涤4次10分钟。将印迹用1∶2000稀释于0.5×PBS、0.05％(v/v)吐温-20、0.5×Odyssey封闭缓冲液、0.01％(w/v)SDS中的山羊抗兔IRDye800第二抗体(Tebu-bio)在暗处振荡孵育1小时。将膜如前所述进行洗涤并使用169μm分辨率、3.0mm的焦距设置和5.0的强度设置的LI-COR Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)进行分析。包括NRG1α对照蛋白质或NRG1β1对照蛋白质(Labvision)作为阳性对照。

5.3.7 NRG1β1 ELISA

使用NRG1β1 DuoSet ELISA试剂盒(R&D systems)和使用提供于试剂盒中的试剂来分析OVA攻击的小鼠BAL液中(第2-3部分)NRG1β1蛋白质水平。将免疫板(96孔；Nunc)用4μg/ml的小鼠抗人NRG1β1 100μl/孔室温包被过夜。将平板用400μl/孔的洗涤缓冲液(PBS，0.05％(v/v)吐温-20)洗涤4次。将平板用300μl/孔的缓冲液A(PBS，1％(w/v)BSA)室温封闭1小时，然后如前所述进行洗涤。向孔加入BAL液样品(100μl/孔)或稀释于缓冲液A中的NRG1β1蛋白质标准(0.0625ng/ml-4ng/ml)并室温孵育2小时。含缓冲液A的空白也包括在平板上。在添加100μl/孔的200ng/ml的检测抗体(生物素化的山羊抗人NRG1β1)室温2小时前，将平板如前所述进行洗涤。再次洗涤平板并加入100μl/孔的1∶200稀释于缓冲液A中的缀合辣根过氧化物酶的链亲和素(100μl/孔)室温30分钟。向平板加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma；100μl/孔)并室温孵育30分钟。通过添加50μl/孔的1M硫酸来终止反应。使用Spectramax 340平板读取器(Molecular Devices)来测量在450nm的吸光度(用在540nm测量的背景校正吸光度)。将样品一式两份进行分析。

5.3.8数据分析和统计学

数据显示为平均值±SEM，并代表来自2次独立实验的重复样品。使用两样本t-检验来测定对照组和处理组之间是否存在显著差异(＊P＜0.05，＊＊P＜0.001)。

5.4结果

5.4.1 NRG1α和NRG1β1对黏蛋白表达和杯形细胞形成的影响

如通过组织学评估，在生长于ALI的原代人支气管上皮细胞(HBEC)培养物中，NRG1β1处理引起了MUC5AC蛋白质(气道杯形细胞的标志)剂量依赖的增加(图1A)。在50nM NRG1β1时，获得了高于运载体水平3倍增加的MUC5AC蛋白质。密切相关的NRG1同工型NRG1α，在多达250nM的浓度时，对MUC5AC蛋白质不具有显著影响(图1B)。将用MUC5AC抗体染色的HBEC insert也用爱茜蓝复染。令人感兴趣地，在NRG1β1处理的样品中注意到了用MUC5AC(45M1)抗体未染色的几个爱茜蓝染色细胞(图1C)，这可能反映其它黏蛋白如MUC5B的存在。为了证实NRG1β1和NRG1α对MUC5B蛋白质的任何影响，细胞也用针对MUC5B的单克隆抗体进行染色。两种NRG1同工型直到50nM的浓度都引起MUC5B蛋白质的剂量依赖性增加(图2)。在50nM时，NRG1β1和NRG1α分别引起MUC5B蛋白质的9.8倍增加和6.4倍增加。由于NRG1β1同工型对MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质具有最显著的影响，因此进一步的研究致力于NRG1β1。

在一段时间内，NRG1β1对MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质表达的影响显示于图3中。NRG1β1处理7、10或14天后，与运载体处理对照比较，MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质的表达是显著的。(图3)。

在几种原代细胞中分析了NRG1β1的基因表达谱。发现NRG1β1表达于分化的原代人支气管上皮细胞(HBEC)、支气管平滑肌细胞(BSMC)和肺成纤维细胞中(图4)。在T细胞或嗜中性粒细胞中未检测到表达。

通过定量RT-PCR，对来自用OVA攻击或盐水攻击的小鼠肺组织进行MUC5AC基因和MUC5B基因表达的分析。与盐水对照比较，OVA攻击后观察到57倍增加的MUC5AC基因表达(图5)。OVA攻击后MUC5B基因表达也增加3倍(图5)。

通过蛋白质印迹，分析了来自OVA攻击的小鼠BAL液中的NRG1β1蛋白质表达。与盐水攻击的对照小鼠比较，在来自OVA攻击的小鼠BAL液中检测到NRG1β1蛋白质的增加(图6)。通过ELISA，对OVA攻击的小鼠BAL液中的NRG1β1蛋白质进行定量。与盐水攻击的对照小鼠比较，在OVA攻击的小鼠BAL液中检测到NRG1β1的9倍增加(图7)，这与蛋白质印迹数据一致。NRG1β1的浓度是大约0.9ng/ml。

5.4.2 讨论

黏蛋白MUC5AC和MUC5B是患哮喘和COPD的患者气道分泌物的主要成分[Rose和Voynow，2006；Rogers，2003]。已经报道了在哮喘、COPD和CF患者的气道中增加的杯形细胞数量[Aikawa等人，1992；Ordonez等人，2001；Saetta等人，2000；Gronenberg等人，2002b]。在气道中增加的杯形细胞数量可在抗原诱导炎症的小鼠OVA模型中模拟。OVA的单一或重复攻击导致气道中爱茜蓝/PAS染色的杯形细胞的增加[Trifilieff，El-Hasim和Bertrand，2000]。在这个报道中我们已经显示，在OVA攻击后的小鼠肺中，黏蛋白基因MUC5AC和MUC5B表达的显著增加。这些数据与已公开的数据一致，其中通过RNA印迹分析，检测到OVA模型中MUC5AC基因表达的增加[Zhudi Alimam等人，2000]。

我们已经显示，NRG1β1在分化的HBEC培养物中诱导MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质(二者都是气道杯形细胞的标志物)表达。NRG1β1而不是紧密相关的同工型NRG1α，在杯形细胞形成的体外模型中具有对MUC5AC和MUC5B最明显的影响。为了进一步了解NRG1β1在杯形细胞体内形成中的作用，在来自OVA攻击的小鼠BAL液中分析了NRG1β1蛋白质。通过蛋白质印迹检测到NRG1β1蛋白质的增加并通过ELISA进行定量，所述NRG1β1蛋白质的增加伴随着在OVA攻击的小鼠的肺中MUC5AC基因表达和MUC5B基因表达的增加。以前已经显示，NRG1刺激人气道上皮的分化，并在人气道上皮培养物中引起杯形细胞数量的增加[Vermeer等人，2006]。然而，在Vermeer等人的研究中没有研究NRG1β1同工型且没有报道对黏蛋白MUC5AC和MUC5B的影响。本研究中发现NRG1β1表达于包括支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞和肺成纤维细胞的肺衍生细胞中。

因此，我们已经显示黏蛋白基因MUC5AC和MUC5B在OVA攻击的小鼠的肺中是增加的，且这伴随着气道中NRG1β1蛋白质的增加。我们也已经显示NRG1β1是体外MUC5AC阳性杯形细胞和MUC5B阳性杯形细胞有效的介质，并因此NRG1β1可代表针对黏液分泌过多在其中起作用的呼吸疾病如哮喘、COPD和CF的潜在治疗目标。

5.5NRG1β1与ErbB之间的相互作用

5.5.1方法

5.5.1.1细胞的化合物和抗体处理

在添加NRG1β1前2小时，将化合物或抗体稀释于HBEC分化培养基中，并加到在Transwell inserts上生长有HBEC的基底外侧小室。将HBEC用与NRG1β1组合的化合物或抗体在ALI处理7天，每次重新补充培养基时(每2-3天)替换NRG1β1连同新鲜抗体或新鲜化合物。对于每一处理，至少准备3个相同的孔。ErbB2受体抗体(AF1129)和ErbB3受体抗体(MAB3841)来自R＆D系统和ErbB4受体抗体(MS-304-P1ABX)来自Lab Vision Corporation。

5.5.1.2ErbB受体表达的RT-PCR分析

对于在制备自分化的HBEC的cDNA中分析ErbB受体表达，PCR反应物制备如下：含12.5μl HotStar Taq Master mix(Qiagen)、50pmol的每一正向引物和反向引物(表2)、50ng cDNA和水至25μl终体积的PCR反应混合物于0.2ml薄壁PCR管中。对照PCR反应用对管家基因GAPDH特异的引物(使用引物GAPDHF和GAPDHR(表2))来进行。PCR循环条件如下：95℃变性15分钟，35个循环的94℃变性15秒、55℃退火15秒、和72℃延伸45秒，然后72℃最后延伸5分钟。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分析并用溴化乙锭染色。

表2 用于ErbB受体表达分析的RT-PCR引物

基因	引物序列(5’to 3’)	引物名称	PCR产物的长度(bp)
				ErbB1	gtcctcattgccctcaacacag(SEQ.I.D.NO：12)ccattgggacagcttggatcac(SEQ.I.D.NO：13)	ErbB1FErbB1R	326
ErbB2	cagttaccagtgccaatatcc(SEQ.I.D.NO：14)ttgtgcagaattcgtcccc(SEQ.I.D.NO：15)	ErbB2FErbB2R	250
				ErbB3	actctgaatggcctgagtg(SEQ.I.D.NO：16)caaacttcccatcgtagacc(SEQ.I.D.NO：17)	ErbB3FErbB3R	253
ErbB4	ACCAGCATTGAGCACAACC(SEQ.I.D.NO：18)CGTCCACATCCTGAACTACC(SEQ.I.D.NO：19)	ErbB4FErbB4R	368
				GAPDH	CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA(SEQ.I.D.NO：20)TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC(SEQ.I.D.NO：21)	GAPDHFGAPDHR	598

5.5.1.3 ErbB受体表达的蛋白质印迹分析

将细胞在补充有Complete protease inhibitor cocktail(Roche)的含50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.65％v/v NP-40的冰冷裂解液中裂解，并通过4℃、16000×g离心5分钟来澄清裂解物。根据制造商说明书使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Perbio)来确定蛋白质浓度。澄清的裂解物在1×NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen)中70℃变性10分钟，并用MOPS运行缓冲液使用Bis-Tris NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)解析来自样品的等量蛋白质。将蛋白质在NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen)中转移至Immobilon-P PVDF膜(Millipore)。第一抗体以1/1000稀释使用，且合适的第二抗体以1/2000或1/5000稀释。除以下指出的抗体外：EGFR(1005)；ErbB2(C-18)、ErbB3(C-17)、ErbB4(C-18)和GAPDH、小鼠单克隆第一抗体(6C5)，所有第一抗体都来自Santa Cruz Biotechnology且是兔多克隆抗体。第二抗体是缀合了AlexaFluor 680的抗兔第二抗体(Invitrogen)或缀合了IRDye 800的抗小鼠第二抗体(Tebu-bio)。将膜在封闭缓冲液(含0.1％v/v吐温-20和5％w/vBlotto(Santa Cruz)的PBS)中室温孵育4小时，然后用稀释于封闭缓冲液中的第一抗体4℃孵育过夜。在膜与各自稀释于补充有0.1％v/v吐温-20和0.01％w/v SDS的Odyssey封闭缓冲液(50％v/v PBS：50％v/vOdyssey缓冲液(LI-COR Biosciences UK Ltd))中的经红外染料缀合的第二抗体在室温暗处孵育1小时前，将膜用洗涤缓冲液(PBS，0.1％v/v吐温-20)洗涤。用第二抗体孵育后，在使用169μm分辨率、3.0mm的焦距设置和5.0的强度设置的LI-COR Odyssey红外成像系统进行成像前，将膜暗处再次洗涤。

5.6结果

5.6.1 pan-ErbB受体抑制物对杯形细胞形成的影响

分析了pan-ErbB受体抑制物对NRG1β1诱导的杯形细胞形成的影响。在添加NRG1β1前，将HBEC用抑制物预处理，并且然后将细胞在ALI生长7天。对杯形细胞标志物MUC5AC和MUC5B的影响通过组织学来分析。10μM的pan-ErbB受体抑制物显著地抑制了NRG1β1诱导的MUC5AC蛋白质和MUC5B蛋白质的增加(图8)。

5.6.2 抗ErbB受体抗体对NRG1β1诱导的杯形细胞形成的影响

在来自多个人供体的HBEC中分析了ErbB受体表达谱。所有4个ErbB受体家族成员EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4的蛋白质和mRNA可在来自多个原代人支气管上皮细胞供体的样品中检测到(图9)。

在杯形细胞形成的原代人支气管上皮细胞模型中，使用针对ErbB2受体、ErbB3受体或ErbB4受体的中和抗体来评估ErbB受体参与的NRG1β1诱导的杯形细胞形成。在ALI处理NRG1β1 7天前，将HBEC用抗体预处理。针对ErbB2受体和ErbB3受体的抗体抑制NRG1β1诱导的MUC5AC和MUC5B产生，然而针对ErbB4的抗体没有影响(图10)。

5.6.3 讨论

已经报道NRG1β1通过ErbB2/ErbB3异二聚体或ErbB2/ErbB4异二聚体来传导信号[Falls，2003；Citri等人，2003]。表达分析表明，所有的ErbB受体家族成员EGFR、ErbB2-ErbB4都表达于原代人支气管上皮细胞上。为了进一步阐述哪一个受体参与NRG1β1诱导的杯形细胞形成，将pan-ErbB受体酪氨酸激酶抑制物[Traxler等人，2004]进行了体外杯形细胞形成测定分析。pan-ErbB受体酪氨酸抑制物显著地降低了杯形细胞黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表达，表明ErbB受体参与这个过程。为了进一步研究哪一个ErbB受体负责NRG1β1诱导的杯形细胞形成，将针对ErbB2受体、ErbB3受体和ErbB4受体的中和抗体进行了测试。针对ErbB2和ErbB3的中和抗体显著地降低了NRG1β1诱导的杯形细胞形成，如由杯形细胞标志物MUC5AC和MUC5B所显示。相反，抗ErbB4受体中和抗体对NRG1β1诱导的杯形细胞形成没有影响。这些数据表明在人气道上皮细胞中ErbB2受体和ErbB3受体参与NRG1β1诱导的杯形细胞形成。

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Claims (26)

1.调节NRG1与相关受体(如ERB2/ERB3异二聚体)之间的相互作用以抑制杯形细胞增生的NRG1调节物。

2.权利要求1所述的调节物，其中所述NRG1是NRG1α或者是NRG1β家族的成员。

3.权利要求2所述的调节物，其中所述NRG1β是NRG1β1。

4.权利要求1至3所述的调节物，其中所述NRG1是NRG1的膜结合形式和/或可溶性形式。

5.任一前述权利要求所述的调节物，其中所述调节物是低分子量化学实体。

6.权利要求1至4中任意一项所述的调节物，其中所述调节物是抗体。

7.权利要求6所述的调节物，其中所述抗体是单克隆抗体。

8.权利要求7所述的调节物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

9.权利要求5至8中任意一项所述的抗体，其中所述抗体与权利要求1至4中任意一项所述的NRG1结合并调节(如抑制)NRG1与其一个或多个相关受体(如ERB2和/或ERb3)，尤其是ERB2/ERB3异二聚体之间的相互作用。

10.权利要求9所述的抗体，其中(与NRG1α比较)所述抗体优先地与NRG1β1结合。

11.权利要求9或10所述的抗体，其中(与NRG1α比较)所述抗体特异地与NRG1β1结合。

12.权利要求5至11中任意一项所述的抗体，其中所述抗体包含IgG1或IgG4的人恒定区。

13.任一前述权利要求所述的调节物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗特征为异常黏液产生的(尤其是人)疾病或病症。

14.权利要求13所述的用途，其中所述疾病或病症是呼吸疾病或病症。

15.权利要求14所述的用途，其中所述疾病或病症是COPD、囊性纤维化(CF)、慢性支气管炎、哮喘。

16.权利要求13至15中任意一项所述的用途，其中所述疾病或病症是人的疾病或病症。

17.权利要求1至12中任意一项所述的调节物用于生产药物的用途，所述药物用于预防(或放缓发病和/或改善症状)特征为异常黏液产生的疾病如COPD、CF、慢性支气管炎、哮喘。

18.治疗患有特征为异常黏液产生的疾病或病症如COPD、CF、慢性支气管炎、哮喘的人患者的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至12中任意一项所述的调节物。

19.用于鉴定权利要求1至4中任意一项所述的调节物的方法，其中所述方法包括：

(a)提供候选调节物；

(b)将所述调节物与权利要求1至3中任意一项所述的NRG1接触；

(c)确定所述候选调节物是否调节(如抑制)权利要求1至3中任意一项所述的NRG1与其相关受体(如ERB2和/或ERB3)之间的相互作用，例如与不存在所述候选调节物时的杯形细胞增生比较，确定所述候选调节物是否抑制杯形细胞增生。

20.药物组合物，其包含权利要求1至12中任意一项所述的调节物和可药用载体。

21.治疗患有特征为异常黏液产生的呼吸疾病或病症(如COPD、CF、慢性支气管炎)的人患者的方法，其中所述方法包括共施用与人NRG1结合、尤其是与人NRG1β1结合，并抑制NRG1(如NRG1β1)与ERB2/ERB3异二聚体之间的相互作用的抑制物(例如治疗性蛋白质，如人抗体或人源化抗体)和抑制人IL-13与其相关人受体之间相互作用的抗人IL-13剂(例如IL-13抗体，尤其是人IL-13抗体或人源化IL-13抗体)和/或抑制人IL-45与其人IL-4受体之间相互作用的抗人IL-4剂(例如IL-4抗体，尤其是人IL-4抗体或人源化IL-4抗体)和/或抑制人IL-5与其相关受体之间相互作用的抗人IL-5剂(例如IL-5抗体，尤其是人IL-5抗体或人源化IL-5抗体)和/或抑制人IgE与其相关受体之间相互作用的抗IgE剂(例如人抗IgE抗体或人源化抗IgE抗体)。

22.权利要求21所述的方法，其中所述抗人NRG1β1抗体与抗人IL-13抗体共施用。

23.权利要求21或22所述的方法，其中所述抗人NRG1β1抗体与抗人IL-4抗体共施用。

24.权利要求21或22或23所述的方法，其中所述抗人NRG1β1抗体与抗人IL-5抗体共施用。

25.权利要求21或22或23或24所述的方法，其中所述抗人NRG1β1抗体与抗人IgE抗体共施用。

26.药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至12中任意一项所述的调节物和可药用载体，用于治疗COPD、CF、哮喘(尤其是其中度形式和重度形式)、慢性支气管炎、下呼吸道疾病如呼吸性感染、肺气肿、肺炎。

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