CN101747417B

CN101747417B - 调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用

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Publication number: CN101747417B
Application number: CN 200810163654
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 黄锐之; 吴学龙; 邢梅青; 胡张华; 许永汉; 何海燕; 柯丽萍
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2028-12-22
Also published as: CN101747417A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及到一种AP2/EREBP类转录因子BnWRI1基因及其在调节植物种子光合作用及油脂合成代谢中的应用。本发明所提供的调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子，来源于芸薹属甘蓝型油菜，其为下述多肽之一：具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽；将上述的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有上述的氨基酸序列的多肽的功能由上述的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。本发明的转录因子及其编码基因对于植物培植领域具有广泛的应用价值，其能使植物对光合作用和脂肪酸合成代谢可以协同调控，并提高种子光合作用和油脂积累能力，从而提高植物产量和含油量、改良相关性状。

Description

调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及到一种AP2/EREBP类转录因子BnWRI1基因及其在调节植物种子光合作用及油脂合成代谢中的应用。

背景技术

除了对人类重要的营养价值外，植物油脂还作为广泛的非食用产品的原料，特别是全球能源日趋紧张，利用植物油生产可再生能源已成为世界各国应对能源危机的重要战略选择。提高单位面积油脂产出量是油料作物育种始终追求的目标，含油量与单产作为单位面积油脂产出量的两个组成因素，也是油料作物生产效益的重要决定因素(李云昌等，中国油料作物学报。28：92-96，2006)。

种子含油量这个经济性状是受遗传控制的，属于数量性状遗传，并有较高的遗传力(王贵春等，安徽农业科学，35：5373-5375，5411，2007)。对调控这一性状功能基因的了解，是运用转基因或常规杂交育种途径培育高油品种的基础。

油脂合成代谢涉及众多酶系，实践证明，对单一结构基因的表达调控，难以充分发挥油脂高效积累的潜能(Roesler K.et al..Plant Physiology.113：75-81，1997)。利用转录因子提高脂肪酸合成整体代谢水平，提供了高油育种的新途径。目前已知的影响种子油脂积累的转录因子主要有拟南芥WRI1、GLABRA2Cernac A.et al.Plant Physiology，141：745-757，2006.Shen B.et al.Plant Mol Biol.60：377-87，2006)，大豆GmDof4和GmDof11(Wang HW et al.Plant Jo52：716-29.2007).，控制种子发育的转录因子LEC1、L1L、LEC2也对种子含油量具有调控作用。WRI1是拟南芥脂肪酸合成关键调控基因，该基因突变导致种子含油量下降80％。该基因在拟南芥中组成型超表达可提高种子油脂含量，但会导致在含糖培养上幼苗生长异常。

光合作用是指绿色植物利用太阳能将二氧化碳和水转化为碳水化合物并放出氧气的过程，是作物产量形成的基础。提高光合作用光能利用效率将使作物单产有极大提高，也是作物达到高产的必要条件。

光照对作物产量的贡献以前主要着重于叶片等光合器官，近年来才逐渐开始重视光照在油菜、大豆等“绿色种子”中的作用。已有的研究表明，虽然有荚壳包被，到达种子的较低水平的光照仍能实质性地提高光合作用相关酶的活性、增加脂肪酸合成量(Willms JR et al.，Plant Physiology，120：1117-1127，1999；Ruuska，SA.et al.Plant Physiology，136：2700-2709，2004)。Goffmant等(GoffmantFD et al.Plant Physiology，138：2269-2279，2005)发现，光照不仅可促进油菜种子光合产物转化成贮藏物质的合成代谢效率，同时也提高了胚的生长速度。Li等(Li YH et al.Phytochemistry，67：904-915，2006)发现，拟南芥在600lmol m-²s-¹光照强度下生长较在100lmol m-² s-¹生长其单粒种子重量和单粒种子积累的油脂含量都有所增加。这些研究结果都显示，光照对油菜、大豆等油料作物种子油脂等贮藏物质积累、产量形成具有重要作用。Ruuska等发现，在拟南芥种子发育过程中，许多与光合作用相关的功能基因与脂肪酸合成酶系(FAS)编码基因的表达模式相类似(Ruuska SA et al.Plant Cell.14：1191-1206，2002)，显示其可能存在某种协同调控机制。

中国发明专利(申请号为200610058763.7)公开了一个与油脂代调控相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于大豆的与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofA及其编码基因与其在调控植物油脂代谢中的应用。该转录因子是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物油脂代谢的蛋白质。该专利基因的克隆及功能鉴定对提高和改良作物油脂成分、特别是对于提高大豆油脂成分，培育高油脂大豆品种具有重要的理论和现实意义。

虽然植物光合作用、油脂合成的研究一直备受关注，分别与这两个重要生物学过程相关的功能基因也不断相继被克隆，但至今仍未有发现可同时调控油料作物种子光合作用和油脂积累的基因报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子、其编码基因及其用途。

本发明所提供的调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子，名称为Brassica napus WRINKLED1(BnWRI1)，来源于芸薹属甘蓝型油菜(Brassicanapus)，其为下述多肽之一：

①具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽；

②将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的功能由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。

本发明还提供了编码上述多肽的基因BnWRI1，(Brassica napusWRINKLED1)，其为下述核苷酸序列之一：

①序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

②编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

③与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢功能的核苷酸序列；

④在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有上述的基因BnWRI1的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增上述的基因BnWRI1中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了编码上述多肽的基因组基因，是下述核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO：3所示的DNA序列；

(2)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢功能的核苷酸序列；

(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了一种调控植物种子光合作用和脂肪酸含量的方法，是利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码调控植物光合作用和脂肪酸合成代谢转录因子的基因BnWRI1或与BnWRI1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，再将转化的植物组织、细胞或器官培育成植株，植物种子光合作用能力和油脂含量获得调控。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，如加入植物可选择性标记或对抗生素、除草剂的抗性标记。

使用BnWRI1或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、增强型、组织特异型或诱导型启动子。作为优选，所述的组织特异型启动子可为种子特异表达启动子。

本发明所述的转录因子可用于提高植物种子光合作用能力和种子油脂含量。

作为优选，所述的植物选自(但不限于)：十字花科、豆科、禾本科。作为再优选，所述的植物包括(但不限于)：油菜、拟南芥、大豆、水稻、向日葵、橄榄树、花生、棉花、蓖麻、烟草等。

通过将转化有本发明编码调控植物光合作用和脂肪酸合成代谢转录因子的基因BnWRI1或与BnWRI1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。转基因植株种子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高。

另一方面，通过将转化有本发明编码调控植物光合作用和脂肪酸合成代谢转录因子的基因BnWRI1或与BnWRI1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株与其他品种的植物进行杂交、并对获得的杂交后代植株进行培养和检测，可从中进一步筛选出种子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高的植株。

本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明由于采用了上述的技术方案，转录因子及其编码基因对于植物培植领域具有广泛的应用价值，其能使植物对光合作用和脂肪酸合成代谢可以协同调控，并提高种子光合作用和油脂积累能力，从而提高植物产量和含油量、改良相关性状。

附图说明

图1为BnWRI1与已知其它物种间的同源基因的进化关系。

图2为BnWRI1基因组基因结构示意。

图3为BnWRI1种子特异超表达载体NAPIN Pr::BnWRI1结构示意。

图4为拟南芥NAPIN Pr::BnWRI1T4代转基因株系和Col0野生型荚果基因表达水平比较。T-15和T-45是两个拟南芥独立转化株系，拟南芥转化植株和野生型对照在相同条件下培养，在进行基因表达水平的半定量分析时，以Actin2基因为内参。

图5为拟南芥NAPIN Pr::BnWRI1 T3代转基因株系和Col 0野生型种子含油量比较。A为油脂含量占籽粒干重的百分比。B为单粒种子油脂含量。虚线所示为Col0野生型种子含油量值。

图6为油菜NAPIN Pr::BnWRI1 T2代转化株系和非转化受体材料种子含油量比较。图中所示为各株系10个单株成熟种子含油量的平均值及标准差。OBnW-368和OBnW-369为两个NAPIN Pr::BnWRI1油菜转化株系。N-CON为未转化的受体品种对照。

图7为拟南芥NAPIN Pr::BnWRI1 T3代转基因株系和Col 0野生型种子千粒重比较。虚线所示为Col 0野生型种子千粒重值。

图8为油菜NAPIN Pr::BnWRI1 T2代转基因植株和未转基因油菜种子大小比较。A为当地推广品种的成熟种子；B、C为两个NAPIN Pr::BnWRI1 T2代转基因植株的成熟种子。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中如无特别说明均按常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、调控植物光能利用及油脂积累转录因子基因BnWRI1的克隆

1.1用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取甘蓝型油菜(Brassica napus)未成熟种子的总RNA，以oligo-d(T)₁₈为引物，用M-MLV反转录酶(Promega公司)将获得的RNA反转录为cDNA，以所合成的cDNA为模板，以引物对BnWRI1-1(5′-ATGAAGAGACCCTTAACCACTTC-3′)和BnWRI1-2(5′-CCTTCAGACAGAATAGTTCCAAG-3′)进行PCR扩增。

以LA-Taq(大连TaKaRa公司)扩增所述的cDNA，PCR反应条件为：

94℃，5min，1次循环；94℃，30sec，58℃，40sec，72℃，90sec，33次循环；72℃，10min。

PCR扩增产物连接到载体pMD 18-T(大连TaKaRa公司)，得到含有扩增片段的重组质粒，命名为pMD-BnWRI1经测序，获得的PCR产物序列如SEQ ID NO：1所示，由1242个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1242位，其编码蛋白质的氨基酸序列表如SEQ ID NO：2所示。将上述核苷酸序列和氨基酸序列采用Blastn程序在GenBank中进行同源性比对，该基因与拟南芥WRI1基因及WRI1所编码的蛋白质的同源性分别为84％和79％，与其它AP2/EREBP家族转录因序列同源性均较低，说明BnWRI1是拟南芥WRI1在甘蓝型油菜中的同源基因(图1)。

1.2以甘蓝型油菜DNA为模板，以引物对BnWRI1-1和BnWRI1-2进行PCR扩增。以LA-Taq(大连TaKaRa公司)扩增所述的DNA，PCR反应条件为：

94℃，5min，1次循环；94℃，30sec，58℃，40sec，72℃，4min，33次循环；72℃，10min。PCR扩增产物经测序，获得BnWRI1基因组全长，其序列如SEQ ID NO：3所示，由3609个碱基组成。BnWRI1 cDNA和DNA序列比较显示该基因包含7个外显子和6个内含子(图2)。

实施例2、Bn WRI1种子特异表达载体NAPIN Pr::BnWRI1的构建

2.1首先以油菜基因组DNA为模板，用引物对napin5(5’-AAGCTTTCTTCATCGGTGATTGA-3’)和napin3(5’-TCGTGTATGTTTTTAATCTTGTTTG-3’)进行PCR扩增，获得油菜napin启动子(AF420598)，用该启动子片段置换植物表达载体pFGC5941中酶切位点EcoRI-BamHI间包含35S启动子的DNA片段，获得中间载体pFGC-NAPIN。用BamHI和EcoRV双酶切将编码BnWRI1的DNA片段从质粒pMD-BnWRI1中切出，与经BamHI和SmaI双酶切后回收的pFGC-NAPIN载体片段相连接。

2.2连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，阳性克隆用引物对BnWRI1-1和BnWRI1-2进行PCR扩增。挑取PCR阳性的克隆，用碱裂解法(参见《分子克隆》)提取质粒DNA进行酶切鉴定，选取酶切正确的克隆进行测序验证，构建成BnWRI1种子特异表达载体NAPIN Pr::BnWRI1，载体结构如图3所示。

实施例3、BnWRI1转基因拟南芥的获得

3.1将实施例2构建的种子特异表达载体NAPIN Pr::BnWRI1用热激法转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，在含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB抗性平板上28℃进行培养。挑取单克隆经PCR验证后用于植物转化。

挑取含质粒NAPIN Pr::BnWRI1的农杆菌单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液，28℃150rpm振荡培养2d。按1∶50的比例在新鲜的YEP液体培养基中扩大培养至对数生长期(菌液OD₆₀₀≈1.5)。3000rmp离心10min，弃上清。将沉淀重新悬浮于渗透培养液，(组成为含5％蔗糖，44mM 6-苄氨基嘌呤和0.05％SilwetL-77的1/2MS液体培养基)，调OD₆₀₀＝0.8。用Floral dip法(Clough SJ et al，1998.Plant J 16：735-43)进行转化，即将拟南芥(Arabidopsis thaliana Col-0)的花序全部在转化液中浸泡1-2min，并轻轻摇晃，转化后的拟南芥植株保鲜膜覆盖保湿1～2天。隔4-5天后按上述方法重复转化，共转化3-4次。收获成熟种子(T1代)。

3.2拟南芥抗性植株筛选。将实施例3.1中收获的拟南芥T1代种子播种于盆钵中，播种后7-10天，喷1∶3000体积比稀释的有效浓度18.5％的除草剂Bastar，每周2次，喷3-4次。筛选出的抗性植株用引物对napin52(5′-GATCGCCATGCAAATCTC-3′)和BnWRI1-2(5′-CCTTCAGACAGAATAGTTCCAAG-3′)进行PCR检测，分单株收获成熟种子(T2代)，获得了30个NAPINPr::BnWRI1基因拟南芥转化植株。各单株继续按上述方法种植，获得30个NAPIN Pr::BnWRI1基因转化株系(T3代)。

实施例4、RT-PCR检测BnWRI1转基因拟南芥脂肪酸合成、光合作用相关基因表达水平的检测

4.1将实施例3所获得的拟南芥T3代转化植株和哥伦比亚野生型(Col-0)的种子悬浮于0.1％的琼脂溶液中，4℃春化2天后播种于土壤(蛭石、草炭和珍珠岩按体积比6∶2∶1混合)，在温度22℃、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。

4.2对主花序开花时期进行标记，荚果分开花后1-6天和7-12天两个时期分别取样，在液氮中研磨，按说明书所述方法用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以oligo-d(T)₁₈为引物，用M-MLV逆转录酶(Promega公司)合成cDNA第一链。

4.3以实施例4.2中获得的cDNA为模板，用拟南芥actin2基因为内参进行RT-PCR，调整各cDNA样品浓度。用半定量RT-PCR方法分析拟南芥NAPINPr::BnWRI1转化株系和野生型对照在不同发育期荚果基因表达水平，所用引物对见表1，结果如图4所示。BnWRI1在拟南芥荚果中的表达在1-6天较弱，7-12天表达水平显著增强，这样的表达模式与napin启动子的表达特性相一致。BnWRI1在拟南芥种子中的超表达可同时提高脂肪酸合成关键酶ACCase的BCCP亚基编码基因BCCP2和光合作用关键基因捕光叶绿素a/b结合蛋白LHCII基因的表达水平，而且这些基因表达提高程度与导入的油菜BnWRI1基因表达水平具有相同的趋势，证明转录因子BnWRI1对荚果发育过程中脂肪酸合成和光能吸收相关基因具有协同调控的功能。

表1.NAPIN Pr::BnWRI1转化株系基因表达分析

实施例5、BnWRI1转基因拟南芥荚果叶绿素含量的变化

叶绿素含量是光合作用强度的重要生理指标。按实施例4的方法，拟南芥BnWRI1转基因植株及野生型对照荚果分开花后1-6天和7-12天两个时期分别取样。按每一样品约0.2克取样后准确称重，分别放入研钵，加入少量石英砂及2-3ml 95％乙醇，研成匀浆，转移至10ml容量瓶，用少量乙醇冲洗研钵、研棒数次，连同残渣一起倒入容量瓶中，最后用乙醇定容至10ml。样品4℃黑暗放置1小时，期间将容量瓶中倒转混合数次。提取液6000g、4℃离心2分钟，吸取上清即为各样品叶绿素提取液。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定叶绿素提取液吸光度。按下列公式计算叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb：mg/L)，二者之和为总叶绿素的浓度：Ca＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉，Cb＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅。最后根据下式求出各植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量(mg/g)＝[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重。每一处理设3个重复，每一样品重复测定2次。

表2拟南芥NAPIN Pr::BnWRI1 T4代转基因植株和Col 0野生型荚果叶绿素含量比较

从表2可以看出，在拟南芥中转入BnWRI1种子特异超表达载体可提高转化株系荚果叶绿素含量，显示光能吸收能力增强。特别是开花后7-12天转入的BnWRI1基因表达水平较高时，叶绿素含量提高也更显著。

实施例6、BnWRI1种子特异超表达转基因拟南芥种子含油量的测定

拟南芥种子含油量的测定采用种子直接甲酯化后气相色谱分析的方法(LiYH.et al.2006.Oil content of Arabidopsis seeds：The influence of seed anatomy，light and plant-to-plant variaion.Phytochemistry，67：904-915)，以C17:0脂肪酸(Sigma)作为内标。对30个转化株系和野生型对照的种子含油量测定结果如图5所示，不论是以油脂占种子干重百分比还是单粒种子含油量计，NAPINPr::BnWRI1结构转化株系的种子含油量总体均较野生型明显提高。

实施例7、BnWRI1种子特异超表达转基因油菜的获得

7.1油菜种子用0.1％HgCl₂消毒8min，无菌水冲洗5～6次，置于MS固体培养基上，25℃条件下发芽，生成无菌苗。将5～6天苗龄无菌苗下胚轴切成0.5～1.0cm的切段，置于MS+1mg/L6-BA+1mg/L2，4-D预培养基上进行预培养后作为转基因受体材料。

7.2将实施例3.1中获得的含种子特异表达载体NAPIN Pr::BnWRI1的农杆菌EHA105菌株培养至对数期，将预培养过的下胚轴切段浸于制备好的菌液中5min。取出外植体并吸干多余的菌液，置于MS+2mg/L6-BA培养基上共培养。

7.3共培养2天后，将外植体在含有300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗2次，转入分化培养基1：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20μmol/LAgNO₃+500mg/L羧苄青霉素上培养。4天后转入分化培养基2：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+20μmol/LAgNO₃+20mg/L PPT+500mg/L羧苄青霉素上培养。外植体在上述分化培养基上每隔21天用原培养基继代培养1次。待分化出绿色小芽后转入新鲜分化培养基继续培养14～21d。

7.4待分化出的绿芽长到3cm左右时，移入生根培养基MS+0.2mg/LNAA+20mg/L PPT+500mg/L羧苄青霉素中生根，2周后出根长成完整小植株，经过逐步炼苗后，移栽入土中，植株可进一步生长发育并产生种子。所有的油菜转化过程均在25℃，光照强度3000lx，光照时间16小时光照/8小时黑暗的条件下进行。

7.5油菜抗性植株的PCR检测：用CTAB法提取油菜叶片DNA，用引物对napin52(5′-GATCGCCATGCAAATCTC-3′)和BnWRI1-2(5′-CCTTCAGACACAGAATAGTTCCAAG-3′)进行PCR检测，PCR阳性的转化植株分单株收获种子。

实施例8、BnWRI1种子特异超表达转基因油菜种子含油量的测定

BnWRI1转基因油菜和未转化受体对照种子含油量测定采用索氏提取法(魏红等。中国油脂，2004，29(6)：52-54.)，每一株系各取10个单株的种子分别测定含油量。其基本步骤如下：把滤纸包放入(105±2)℃烘箱中干燥2小时，取出放入干燥器中冷却至室温称重(A)；将1g油菜种子粉碎，过40目筛后装入上述称重过的纸包，封好包口放入(105±2)℃烘箱中干燥3小时，移至干燥器中冷却至室温称重(B)；包有样品的纸包在乙醚中浸泡过夜后抽提8小时。抽提完毕，移去上部冷凝管，取出滤纸包，在通风橱内晾干。抽提后的滤纸包置于烘箱105℃干燥3小时，移至干燥器中冷却至室温称重(C)。含油量(％)＝(B-C)/(B-A)×100％。

未转化受体对照和两个BnWRI1转基因油菜种子含油量测定结果如图6所示。两个转化株系的平均含油量从未转化材料的50.553％分别提高到了52.073％和52.4％，方差分析证明OBnW-2与对照的含油量提高达极显著水平，OBnW-1与对照含油量提高也达显著水平，并且获得了一些种子含油量达54％左右的油菜种质资源。

实施例9、BnWRI1种子特异超表达转基因拟南芥、油菜种子千粒重的测定

9.1BnWRI1种子特异超表达转基因拟南芥种子千粒重的测定：BnWRI1种子特异超表达转基因拟南芥T3代和野生型对照在相同条件下种植，每盆3株，待种子成熟后按株系分别收获。各株系用分析天平分别精确称量3×200粒成熟种子的重量。30个拟南芥株系的种子千粒重测定结果如图7所示，NAPINPr::BnWRI1结构转化株系的种子千粒重总体较野生型提高。

9.2BnWRI1种子特异超表达转基因油菜种子千粒重的测定：BnWRI1种子特异超表达转基因油菜T2代和受体品种及当地推广品种对照在相同条件下种植，各转化株系及对照分别收获10个以上单株的种子，按单株分开收获。各单株用分析天平分别精确称量3×100粒成熟种子的重量。对各转化株系及受体品种千粒重比较，差异未达显著水平。但有些转化单株种子千粒重提高显著，有些单株千粒重＞6.5克，最高达7.1克，而一般推广品种的千粒重约在4.0～4.5克，表明通过BnWRI1基因在油菜种子特异表达可培育出千粒重增加明显的油菜育种材料。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用

<160>3

<210>1

<211>1242

<212>DNA

<213>芸薹属甘蓝型油菜

<400>1

atgaagagac ccttaaccac ttctccttct tcctcctctt ctacttcttc ttcggcctgt 60

atacttccga ctcaatcaga gactccaagg cccaaacgag ccaaaagggc taagaaatct 120

tctctgcgtt ctgatgttaa accacagaat cccaccagtc ctgcctccac cagacgcagc 180

tctatctaca gaggagtcac tagacataga tggacaggga gatacgaagc tcatctatgg 240

gacaaaagct cgtggaattc gattcagaac aagaaaggca aacaagttta tctgggagca 300

tatgacagcg aggaagcagc agcacatacg tacgatctag ctgctctcaa gtactggggt 360

cccaacacca tcttgaactt tccggttgag acgtacacaa aggagctgga ggagatgcag 420

agatgtacaa aggaagagta tttggcttct ctccgccgcc agagcagtgg tttctctaga 480

ggcgtctcta aatatcgcgg cgtcgccagg catcaccata atggaagatg ggaagctcgg 540

attggaaggg tgtttggaaa caagtacttg tacctcggca cctataatac gcaggaggaa 600

gctgcagctg catatgacat ggcggctata gagtacagag gtgcaaacgc agtgaccaac 660

ttcgacattg gtaactacat cgaccggtta aagaaaaaag gtgtcttccc gttccccgtg 720

agccaagcta atcatcaaga agctgttctt gctgaaacca aacaagaagt ggaagctaaa 780

gaagagccta cagaagaagt gaagcagtgt gtcgaaaaag aagaagctaa agaagagaag 840

actgagaaaa aacaacaaca agaagtggag gaggcggtga tcacttgctg cattgattct 900

tcagagagca atgagctggc ttgggacttc tgtatgatgg attcagggtt tgctccgttt 960

ttgactgatt caaatctctc gagtgagaat cccattgagt atcctgagct tttcaatgag 1020

atgggttttg aggataacat tgacttcatg ttcgaggaag ggaagcaaga ctgcttgagc 1080

ttggagaatc ttgattgttg cgatggtgtt gttgtggtgg gaagagagag cccaacttca 1140

ttgtcgtctt ctccgttgtc ctgcttgtct actgactctg cttcatcaac aacaacaaca 1200

gcaacaacag taacctctgt ttcttggaac tattctgtct ga 1242

<210>2

<211>413

<212>PRT

<213>芸薹属甘蓝型油菜

<400>2

Met Lys Arg Pro Leu Thr Thr Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser

5 10 15

Ala Cys Ile Leu Pro Thr Gln Ser Glu Thr Pro Arg Pro Lys Arg Ala Lys Arg

20 25 30 35

Ala Lys Lys Ser Ser Leu Arg Ser Asp Val Lys Pro Gln Asn Pro Thr Ser Pro

40 45 50

Ala Ser Thr Arg Arg Ser Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr

55 60 65 70

Gly Arg Tyr Glu Ala His Leu Trp Asp Lys Ser Ser Trp Asn Ser Ile Gln Asn

75 80 85 90

Lys Lys Gly Lys Gln Val Tyr Leu Gly Ala Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ala

95 100 105

His Thr Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Pro Asn Thr Ile Leu Asn

110 120 125 130

Phe Pro Val Glu Thr Tyr Thr Lys Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg Cys Thr Lys

135 140 145

Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Arg Arg Gln Ser Ser Gly Phe Ser Arg Gly Val

150 155 160 165

Ser Lys Tyr Arg Gly Val Ala Arg His His His Asn Gly Arg Trp Glu Ala Arg

170 175 180 185

Ile Gly Arg Val Phe Gly Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu Gly Thr Tyr Asn Thr Gln

190 195 200

Glu Glu Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Met Ala Ala Ile Glu Tyr Arg Gly Ala Asn

210 215 220 225

Ala Val Thr Asn Phe Asp Ile Gly Asn Tyr Ile Asp Arg Leu Lys Lys Lys Gly

230 235 240

Val Phe Pro Phe Pro Val Ser Gln Ala Asn His Gln Glu Ala Val Leu Ala Glu

245 250 255 260

Thr Lys Gln Glu Val Glu Ala Lys Glu Glu Pro Thr Glu Glu Val Lys Gln Cys

265 270 275 280

Val Glu Lys Glu Glu Ala Lys Glu Glu Lys Thr Glu Lys Lys Gln Gln Gln Glu

285 290 295

Val Glu Glu Ala Val Ile Thr Cys Cys Ile Asp Ser Ser Glu Ser Asn Glu Leu

300 305 310 315

Ala Trp Asp Phe Cys Met Met Asp Ser Gly Phe Ala Pro Phe Leu Thr Asp Ser

320 325 330

Asn Leu Ser Ser Glu Asn Pro Ile Glu Tyr Pro Glu Leu Phe Asn Glu Met Gly

335 340 345 350

Phe Glu Asp Asn Ile Asp Phe Met Phe Glu Glu Gly Lys Gln Asp Cys Leu Ser

355 360 365 370

Leu Glu Asn Leu Asp Cys Cys Asp Gly Val Val Val Val Gly Arg Glu Ser Pro

375 380 385

Thr Ser Leu Ser Ser Ser Pro Leu Ser Cys Leu Ser Thr Asp Ser Ala Ser Ser

390 395 400 405

Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Val Thr Ser Val Ser Trp Asn Tyr Ser Val

410 415 420

<210>2

<211>3609

<212>DNA

<213>芸薹属甘蓝型油菜

<400>3

atgaagagac ccttaaccac ttctccttct tcctcctctt ctacttcttc ttcggcctgt 60

atacttccga ctcaatcaga gactccaagg cccaaacgag ccaaaagggc taagaaatct 120

tctctgcgtt ctgatgttaa accacagaat cccaccagtc ctgcctccac cagacgcagc 180

tctatctaca gaggagtcac taggttgaga aaaataaaat aaaatgattg attcttttag 240

atttgatttg ggttatgttt tttttttttt tttttctaaa ctgcatttcg attgcatgtt 300

acagacatag atggacaggg agatacgaag ctcatctatg ggacaaaagc tcgtggaatt 360

cgattcagaa caagaaaggc aaacaaggtt cttaattttt acaaaaaacc catcttgatt 420

ctgtaataaa gatctggcct tttttttgtt ttgttttaat ctgattttgg tttctgttgt 480

ttgatctcaa cctcactgcc tcactctgcg ccttgttctt ctactcatca gtttatctgg 540

gtaatttttt taattgagaa attaaaaaga gtttgatttg gtcaagagga tgaacgaatg 600

gaatctcaac tgctctgacg ccgtaattgc aggagcatat gacagcgagg aagcagcagc 660

acatacgtac gatctagctg ctctcaagta ctggggtccc aacaccatct tgaactttcc 720

ggtaagaaaa aataacttga ttgattgatt gatgcatgtt tgttcttgtt gaattaatta 780

aaaaaaatga tccaaacagg ttgagacgta cacaaaggag ctggaggaga tgcagagatg 840

tacaaaggaa gagtatttgg cttctctccg ccgccagagc agtggtttct ctagaggcgt 900

ctctaaatat cgcggcgtcg ccaggttctc tcttttttct ttttctttaa ttacgtgttt 960

gtttttaatt tgatttggta aattaattac accaaaatca ggaattaaat tttccttttc 1020

cgcatttttt gaaaaattaa ttaatagggt ggtgactaag aaaaagaaaa caaaatagga 1080

aatgtgattt tttggaaatt aaaaaagctg gactttttca taagatttgc ttttagaatt 1140

tttatctctc tctctctctc tatcataatt aacttttgtt taagtacttg tcctgcaatt 1200

gagatgttta ttgtaatttg taaatatgtg atagctatag cttgattttc gcaaatgatt 1260

catttatcaa acattttttg ttatttcttt cccattttat attctgaaaa aaacaagaaa 1320

gtaataaaaa ttgcaaatta tgggaaaaca ggcatcacca taatggaaga tgggaagctc 1380

ggattggaag ggtgtttgga aacaagtact tgtacctcgg cacctatagt acgtacatcc 1440

ttgactcttt attcttaaat aataaattgt ttaaaataat atcagattaa tttttaaaaa 1500

aatttaagaa tcattatcgt aatcgaatat ttacaagggc ataacggatc ctttaaaaac 1560

aaaaactact ctggtatttg atttgaaaat agatattaca atgttttgag ttagtttata 1620

ctttatacta ctattttcta cgagttttat attatacttg tgattaagca aataattatt 1680

tgtttagttg gtcaattaga ataaacataa tggggaggca gtgagtgggg gtttacacac 1740

tcacgtgaga cgagagtttt gacatcatgt cccctcactt catactaatt gatttttatc 1800

tttaatatca gcattttcag agtattattt aactatctga cccctgcata attacctttt 1860

aaattctgca ttttgtggat ccaatactct gaacacgaaa attaaaaact ctgcagaagg 1920

gaatattaac accaactctt tactgaaaag taatactacc ctttttcaat tcttttgatc 1980

gggtccttag gttattaatg gatcttactt ttgaaaaaaa aaacaagtta caaaaaattc 2040

aagatgtttt tagagtttct cggattcagt tttgcaaaaa tataggcagt gttataacaa 2100

aagggcacat attattcaga ttttattttt ttaaaagaaa aaaataggag agccaggagc 2160

ataataacaa aaaaatgaaa gtagtagatg tgaataaatg tatagaataa tgtaacgtta 2220

caagtgtaaa ggcgcgtgta gcgcgtagct cacgtggtaa cactctcctc tcacttcata 2280

aaaaggacaa attagttcag aagggctagg accaaacccg aggtcgatct ggtctacttt 2340

tttttgtttg ggtggtggtt cattaaagaa tggttttaag agttgagtct gttctcagta 2400

gcagtcacga gccctcacgt gcatgtttca tctctctctc tctctaccat atctttcatc 2460

ttgtcctcag gaacaaaatc tggtctgctt tatttttaaa tgcaaattat tgtcttcata 2520

tttattatgt aaactatgaa gttaatagtg atagttatta cgtattagga gcttagagtt 2580

gacactaggt tggtattttt atttgctaac tagtcagtaa ttgtacgttc gtgtaattat 2640

ttatatattg ttgcatttgt ttaagctaca aacttggact ctttttagcg tttagagcgg 2700

cggagagtgg agtagaaatg gtctcgtcca cgcctcaact ctatacgcat ctcacacacc 2760

tatagtgtaa ccctagttgt ccccactaac acgtcaccta attccctttg gttttttgtc 2820

tttattaggc atcttaaaat tctaaaaata aaatattaaa atacatactg aaacacatgt 2880

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tttggttgtg cagatacgca ggaggaagct gcagctgcat atgacatggc ggctatagag 3000

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aaaaaaggtg tcttcccgtt ccccgtgagc caagctaatc atcaagaagc tgttcttgct 3120

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gaaaaagaag aagctaaaga agagaagact gagaaaaaac aacaacaaga agtggaggag 3240

gcggtgatca cttgctgcat tgattcttca gagagcaatg agctggcttg ggacttctgt 3300

atgatggatt cagggtttgc tccgtttttg actgattcaa atctctcgag tgagaatccc 3360

attgagtatc ctgagctttt caatgagatg ggttttgagg ataacattga cttcatgttc 3420

gaggaaggga agcaagactg cttgagcttg gagaatcttg attgttgcga tggtgttgtt 3480

gtggtgggaa gagagagccc aacttcattg tcgtcttctc cgttgtcctg cttgtctact 3540

gactctgctt catcaacaac aacaacagca acaacagtaa cctctgtttc ttggaactat 3600

tctgtctga 3609

Claims

1.提高油菜或拟南芥种子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于该方法是利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子的基因导入植物组织、细胞或器官，再将转化的植物组织、细胞或器官培育成植株，植物种子光合作用能力和油脂含量获得调控，所述的调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；进一步将所述转基因的植株进行继代培养后，从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株；或者，进一步将所述转基因的植株与其他品种的植物进行杂交，对获得的杂交后代植株进行培养和检测，从中进一步筛选出种子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高的植株。

2.根据权利要求1所述的提高油菜或拟南芥种子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于：对所使用的植物表达载体进行加工，加入植物可选择性标记或对抗生素、除草剂的抗性标记。

3.根据权利要求1所述的提高油菜或拟南芥种子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于：使用所述的调控植物种子光合作用和脂肪酸合成代谢的转录因子的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种组成型、增强型、组织特异型或诱导型启动子。