CN106967727B

CN106967727B - 油菜光合效率相关基因perg及制备方法和应用

Info

Publication number: CN106967727B
Application number: CN201710223164.4A
Authority: CN
Inventors: 华玮; 刘静; 杨红丽; 邓林彬
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Wuhan Zhongyou Seed Technology Co., Ltd
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2020-03-20
Anticipated expiration: 2037-04-07
Also published as: CN106967727A

Abstract

本发明公开了一种油菜光合效率相关基因perg（photosynthesis efficiency related gene）及制备方法和应用。该基因的cDNA序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，扩增的正向引物为5′‑atgggaaacagagagcaag‑3′，反向引物为5′‑tcatccatggaattggtag‑3′。利用拟南芥作为受体的转基因实验证实，与野生型对照相比，转油菜光合效率相关基因perg的拟南芥株系的光合效率可提高47%。因此，可利用油菜光合效率相关基因perg的过量表达来增强植物光合效率，用于作物的产量选育。

Description

油菜光合效率相关基因perg及制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与油菜光合效率相关的基因perg及其制备方法，该基因可提高叶片的光合效率，通过转基因技术证实基因perg的过量表达增强了拟南芥叶片的光合效率。

背景技术

油料作物生产不仅在国民经济和社会发展中占有重要地位，也是促进中国农业可持续发展的主要因素之一。目前中国的植物油生产量仅能满足国内1/2－2/3的消费需求，大量依赖进口，是世界上最大的油料进口国。油菜是中国最主要的油料作物之一，菜籽油在中国的食用油约占40％。中国油菜年种植面积700万公顷，菜籽产量超过1000万吨，面积和总产均为世界第一位，分别占全世界的1/3。目前经过几代育种学家的努力，通过传统育种途径已经使油菜单产提高了许多，进一步通过传统育种途径大幅度提高产量的难度很大。

光合作用是植物生长的基础，并支撑着地球上绝大部分生物的生命活动。伴随着环境的恶化和资源的日益匮乏，现代农业亟需提供更高的农作物产量以养活不断增长的庞大数量人口。通过光合作用性状改良来提高农作物的产量对现代农业的绿色与可持续发展有着至关重要的意义(Murchie et al.,2009；Janssen et al.,2014)。光能为植物提供持续而纯净的能源，植物干物质含量的90％～95％来自光合作用的能量供给，光能利用效率的强弱决定了农作物产量的高低。研究表明增强农作物的光合效率理论上可以提高其50％的产量潜力(Zhu et al.,2010；Covshoff and Hibberd,2012)。然而主要的农作物如水稻，小麦、油菜和大豆等C3作物光能利用效率很低，因而研究光合作用进行高光效改良将能从根本上大幅提高农作物的产量。

油菜是最重要的油料作物之一，其生产的菜籽油占我国食用植物油供给的一半。我国油菜种植面积和产量均居世界第一，然而2012-2013年统计我国食用植物油自给率已严重不足，仅为35.3％，由于严重依赖进口，已对我国食用植物油的供给安全造成了威胁(王汉中和殷燕，2014)。目前水稻等主要粮食作物的光合作用方面已经投入了大量的研究和尝试，而油菜等油料作物相关研究则较为滞后，目前为止尚未有油菜光合作用相关基因的报道。因而深入研究光合性状提高光合效率对促进油菜高油高产和油菜生产的可持续发展有着重要意义，有利于解决我国食用油供给安全方面所处的困境。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种油菜光合效率相关基因perg，其序列为SEQ IDNO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供一对油菜光合效率相关基因perg的扩增引物，用于perg基因的克隆，方法简便易操作。

本发明的再一个目的在于提供了基因perg在提高植物叶片(如拟南芥)光合效率中的应用，通过转基因技术证实基因perg的过量表达增强了拟南芥叶片的光合效率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

油菜光合效率相关基因perg的克隆，其步骤是：

1)自一对光合效率存在差异的油菜品系中转录组数据分析得到基因perg，利用油菜基因组序列以及拟南芥数据库中该基因序列设计基因扩增cDNA编码区引物，其序列为正向引物5′-atgggaaacagagagcaag-3′，反向引物5′-tcatccatggaattggtag-3′；

2)以油菜cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得油菜perg基因序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

油菜基因perg在提高植物叶片光合效率中的应用，其方法是：

1)将克隆得到的油菜基因perg分别与质粒连接，命名为pCAMBIA3301-perg；

2)将载体pCAMBIA3301-perg转入根癌农杆菌GV3101，再导入拟南芥植株中；

3)种植拟南芥T0代所收获的种子，提取叶片DNA后进行PCR鉴定用于筛选阳性植株，最终确认基因已导入的阳性植株；

4)对拟南芥突变体、野生型对照及转基因株系的光合效率进行测定，结果表明，过量表达perg的转基因株系叶片光合效率提高，与野生型对照相比增加幅度在20％-47％。

perg基因编码定位于细胞核和细胞质膜的蛋白，目前在所有植物中功能尚未有被报道。本研究发现利用叶片特异启动子驱动perg在拟南芥中的表达，可以提高拟南芥叶片的光合速率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明是国内外首次公开油菜光合效率相关基因perg序列，目前该类基因可调控植物叶片光合作用的功能没有相关报道。利用拟南芥作为受体的转基因实验证实，perg基因的过量表达提高了植物的光合效率，本发明实验结果表明，与野生型对照相比，转perg基因拟南芥的光合效率最高可提高47％，拟南芥种子的产量也相应得到提高。因此，本发明提出可利用油菜光合效率相关基因perg的过量表达来增强植物光合效率以便用于作物的产量选育。

附图说明

图1为表达载体pCAMBIA3301-perg构建示意图。

图2为油菜perg转基因株系与野生型对照对比，WT为野生型拟南芥，Bnperg为转油菜光合效率相关基因perg的拟南芥株系。

具体实施方式

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。

克隆本发明中所述的获得油菜光合效率相关基因perg的方法是本领域中所常采用的方法。提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(TRIzol Reagent)可从商业途径获得(Invitrogen公司)，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体构建和将载体转染入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pCAMBIA3301)，转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101和所用试剂成分如蔗糖、6-BA等)可从商业途径获得。

实施例1：油菜光合效率相关基因perg的克隆

1、设计cDNA编码区引物

利用一对高低光合效率油菜材料zy036和51070的转录组数据分析，发现perg基因表达存在显著差异，因此将其筛选出作为影响光合效率的候选基因。在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥perg基因序列(At1g01840)，并以此编码区序列BLAST油菜数据库，寻找与之同源的油菜perg基因序列，并设计基因编码序列的两侧引物：perg正向引物5′-atgggaaacagagagcaag-3′，反向引物5′-tcatccatggaattggtag-3′，用于从油菜中扩增perg的对应序列。

2、基因序列扩增

(1)提取油菜mRNA

采用TRIZOL TM Kit提取RNA：液氮研磨100mg油菜材料，加1mL TRIZOL，室温(20-25℃，下同)放置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min；4℃条件下12000×g离心15min，取上清至新管中，加入500μL异丙醇，混匀后室温放置15min；4℃条件下12000×g离心15min，去上清，加入1mL 70％(无水酒精与H₂O的体积比)乙醇；4℃条件下7500×g离心7min，去上清，空气干燥；DEPC－H₂O溶解；

(2)cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行；

(3)以cDNA为模板进行PCR扩增并测序，扩增体系及条件如下：

PCR反应混合液的配比为(25μL体系)：cDNA模板1μL，dNTP(10mM)0.5μL，上下游引物(5μm/μL)各1μL，buffer 2.5μL，taq酶(1U)1μL，ddH₂O18μL；反应的时间和温度如下：94℃3min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30个循环；72℃5min。由此得到了油菜光合效率相关基因perg的cDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，对应该核酸序列的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：油菜基因perg在提高拟南芥叶片光合效率中的应用

1、perg表达载体的构建及拟南芥的转化

perg表达载体的构建：设计带载体接头的引物，扩增与载体一步融合的基因序列(perg正向引物：5′-gggggactcttgaccatggtaatgggaaacagagagcaag-3′，反向引物：5′-gtcacctgtaattcacacgtgtcatccatggaattggtag-3′)，将PCR扩增得到的基因序列与pCAMBIA3301载体(CAMBIA公司)用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)连接重组，转化到感受态细胞DH5α(invitrogen公司)中，示意图见图1。

拟南芥的转化步骤：

(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌(根癌农杆菌GV3101)菌液10mL，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌菌液OD600在1.2到1.6之间；

(2)室温5000rpm离心15分钟；

(3)弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右；

(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液30s；

(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。

渗透培养基(1L)：1/2×Murashige-Skoog；5％(质量比)蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/mL的6-BA母液；200微升Silwet L-77。

2、转基因拟南芥的筛选和验证

将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上；两天后人工模拟自然条件光照(光照16小时，暗8小时)，三天后揭膜。人工培养室条件：相对湿度80％，恒温20-24℃，光照强度80-200μmol/m²·s，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。一周左右，喷除草剂筛选阳性植株。具体步骤如下：

(1)提取转化植株总DNA

A.70％(体积比，下同)乙醇擦洗叶片，称取大约100mg；

B.加入600μL抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室温快速研磨；

C.Ependorff管中涡旋混匀5-10s；

D.室温下12000rpm离心25min，取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜；

E.室温下12000rpm离心15min，加入70％乙醇200μL泡洗DNA沉淀；

F.室温下12000rpm离心15min，去乙醇，倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净；

G.加无菌水100μL溶解粗提DNA沉淀，用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

(2)筛选转基因阳性植株

叶片DNA提取后进行PCR鉴定，引物序列为：上游引物：5′-atgggaaacagagagcaag-3′，下游引物：5′-cccatctcataaataacgtcat-3′；PCR反应混合液的配比为(25μL体系)：DNA模板1μL，dNTP(10mM)0.5μL，上下游引物(5μm/μL)各1μL，buffer 2.5μL，taq酶(1U)1μL，ddH₂O 18μL；反应的时间和温度作如下：94℃3min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30个循环；72℃5min。检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小(500bp左右)的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因拟南芥基因组中已经含有外源基因DNA片段。

3、拟南芥转基因株系表型分析

叶片光合效率分析：利用野生型拟南芥为受体进行转基因，油菜光合效率相关基因perg过量表达叶片颜色变成深绿色(见图2)。对野生型对照(WT)及转基因株系(Bnperg)的光合效率进行测定(The BnGRF2 gene(GRF2-like gene from Brassica napus)enhances seed oil production through regulating cell number and plantphotosynthesis.Journal of Experimental Botany,2012,63,10:3727–3740)，结果表明，过量表达油菜光合效率perg的转基因株系的叶片光合效率提高(见表1)，与野生型对照相比增加幅度在20％-47％。

表1.转油菜和拟南芥perg基因的拟南芥株系叶片光合效率测定结果

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 油菜光合效率相关基因perg及制备方法和应用

<130> 油菜光合效率相关基因perg及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 465

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 1

atgggaaaca gagagcaagt agctgagctg atagcatcgc tggagcaagc aacactcatg 60

tctcatcaaa tcggaaccgc cgtggaacga aaccagctcc ttcaaatctc ctcctctctc 120

cgcacagccc accaccgcct ctccaccttg ctcctgtcca ccgttccatc gccggcatct 180

gataactctg tctcctccgt cgctccgatg caattagggg agggcgaggc tgaagcgatg 240

gaagatgaga gagactcggc ggtggagaag gtggaggaga agatgagaga gtgttttata 300

aggaacaaga gagccaagaa gcggccactg tctccgtcgt ctgcggtggt ggagacttcg 360

gcgacagaag agaggagtag ccgtgattat tatgggcagt tcgatttgga cccaaatgcc 420

tccaagttga gagctttgga tcttatctac caattccatg gatga 465

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 油菜

<400> 2

Met Gly Asn Arg Glu Gln Val Ala Glu Leu Ile Ala Ser Leu Glu Gln

1 5 10 15

Ala Thr Leu Met Ser His Gln Ile Gly Thr Ala Val Glu Arg Asn Gln

20 25 30

Leu Leu Gln Ile Ser Ser Ser Leu Arg Thr Ala His His Arg Leu Ser

35 40 45

Thr Leu Leu Leu Ser Thr Val Pro Ser Pro Ala Ser Asp Asn Ser Val

50 55 60

Ser Ser Val Ala Pro Met Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ala Glu Ala Met

65 70 75 80

Glu Asp Glu Arg Asp Ser Ala Val Glu Lys Val Glu Glu Lys Met Arg

85 90 95

Glu Cys Phe Ile Arg Asn Lys Arg Ala Lys Lys Arg Pro Leu Ser Pro

100 105 110

Ser Ser Ala Val Val Glu Thr Ser Ala Thr Glu Glu Arg Ser Ser Arg

115 120 125

Asp Tyr Tyr Gly Gln Phe Asp Leu Asp Pro Asn Ala Ser Lys Leu Arg

130 135 140

Ala Leu Asp Leu Ile Tyr Gln Phe His Gly

145 150

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因在提高植物叶片光合效率中的应用，所述的植物为拟南芥。

2.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质在提高植物叶片光合效率中的应用，所述的植物为拟南芥。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因的扩增引物如下：正向引物为5′-atgggaaacagagagcaag-3′，反向引物为5′-tcatccatggaattggtag-3′。