CN101607985B

CN101607985B - 抗人cea的单克隆抗体，包含其的组合物，及其用途

Info

Publication number: CN101607985B
Application number: CN2008102409506A
Authority: CN
Inventors: 冯静; 阎锡蕴; 郑超固; 杨东玲; 卢迪
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-12-24
Also published as: CN101607985A

Abstract

本发明是利用生物技术研制出的一株具有抗结直肠肿瘤活性的抗人CEA蛋白的鼠单克隆抗体。本发明包括：抗人CEA鼠单克隆抗体CC4，利用其抗原结合能力特异性检测CEA家族蛋白的方法，及利用其抗结直肠肿瘤活性的肿瘤治疗方法。这株抗体能够在分子、细胞和组织水平特异性识别人CEA，并识别一个广泛分布于CEA家族蛋白中的特殊抗原表位。CC4在组织水平特异性结合结直肠癌组织，在动物模型及细胞水平上表现出很强的抑制肿瘤生长、迁移及侵袭的能力。这株抗体及以其为基础的检测和治疗手段将成为基础研究或临床应用中有效的肿瘤诊断和治疗的工具。

Description

抗人CEA的单克隆抗体,包含其的组合物,及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域。具体地说，本发明涉及一株抗人CEA的鼠单克隆抗体CC4，这株抗体能够特异地结合结直肠癌组织，并在动物模型和细胞水平有效抑制结直肠肿瘤细胞生长、迁移及侵袭。CC4能够在生化、细胞和组织水平特异性识别人源CEA蛋白，并结合一个保守存在于CEA家族蛋白中的抗原表位。利用这些特性，此抗体能够广泛应用于针对于表达CEA或CEA家族蛋白的肿瘤的临床诊断和治疗。

背景技术

癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是最早被人们发现的肿瘤相关抗原之一。它是由Gold P和Freedman SO在1965年首次在结肠癌组织提取物中发现并报道(Gold and Freedman 1965；Gold and Freedman1965)。1966年，Gold P和Freedman SO又与其同事Thomson DM和Krupey J一起报道了可以利用敏感的放射性免疫分析的方法在结肠癌病人和其他肿瘤病人的血清中检测到CEA，而在健康人或其他疾病患者血清中CEA的含量极低(Thomson，Krupey et al.1969)。这一报道之后，CEA检测开始逐渐应用于肿瘤的诊断、分期、监控和预后等。目前，CEA已成为应用最广泛的肿瘤标志物之一，其最主要的临床应用是通过检测血清中CEA的水平监控结肠癌切除手术后的复发和结肠癌的肝转移(Hammarstrom 1999；Duffy 2001)。

CEA基因家族包括29个成员，分为三个亚群，即：CEA亚群，PSG(Pregnancy-specific β1 glycoprotein)亚群和未命名的第三亚群(Hammarstrom 1999)。

CEA属于免疫球蛋白超家族(Thomas and Toth 1990；Thompson，Grunert et al.1991)，含有两类免疫球蛋白的结构域，即N-端一段长108个氨基酸的与免疫球蛋白可变区同源的序列(IgV-like)和六个与免疫球蛋白恒定区C-2同源的结构域(Thompson，Grunert et al.1991；Hammarstrom1999)。

CEA家族成员在结构上有两个共同特点：(1)都包含一个类IgV的N-端结构域，该结构域缺少二硫键，是重要的功能性结构域。(2)糖基化程度高。糖基化位点位于天冬氨酸残基，糖基含量占总分子量的50％～60％。

CEA在健康成人组织中表达量稳定，而在结肠癌组织中高表达。在正常结肠中，CEA表达于呈极性的柱状上皮细胞的顶端细胞膜上，即朝向肠腔的一面，通过糖基化的磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上。在特定的生理条件下，CEA可通过囊泡释放和酶解破坏两种可能的机制释放到肠腔中，最终成为粪便的组分。因此，在健康成人的血液中CEA含量极低。而在结肠癌组织中，肿瘤细胞失去极性，CEA分布于细胞膜四周，而且肿瘤组织缺少基底层，被覆着CEA的囊泡可通过对淋巴和血管的浸润而进入血液，并随着肿瘤体积的增长而在血液中累积(Hammarstrom 1999；Duffy2001；Hammarstrom and Baranov 2001)。血清中CEA水平与结肠癌的相关性使CEA成为结肠癌的诊断、分期、监控和预后的标志。

CEA家族属于免疫球蛋白超家族，与某些黏附分子结构相似，具有介导细胞黏附的功能。表达于肿瘤细胞表面的CEA亚群成员，特别是BGP，CEA和NCA，可作为细胞黏附分子在同型黏附(CEA-CEA)和异型黏附(CEA-非CEA的黏附分子)中起作用(Zhou，Stanners et al.1993；Maxwell 1999)。而肿瘤细胞的黏附功能与肿瘤的转移相关。研究表明，细胞表面高表达CEA的结肠癌细胞更容易产生肝脏转移(Hashino，Fukudaet al.1994；Kim，Roh et al.1997；Solimene，Carneiro et al.2001)。除此之外，CEA在细胞信号传导(Beauchemin，Kunath et al.1997；Kharitonenkov，Chen et al.1997)和对微生物的天然免疫(Hammarstrom and Baranov 2001)中也发挥着作用。

虽然至今还没有靶向CEA的抗体被FDA批准上市，但大量的抗CEA抗体药物处于临床及临床前研究之中。

利用抗CEA抗体治疗CEA阳性肿瘤是基于CEA的肿瘤靶向治疗的另一个策略。随着抗体工程技术的发展，抗CEA治疗性抗体的发展也经历了一个从鼠源单克隆抗体到人鼠嵌合抗体，直到全人抗体的过程。人源化抗CEA抗体Labetuzumab在荷人瘤小鼠体内表现出了对CEA阳性的甲状腺肿瘤生长的抑制作用(Stein and Goldenberg 2004)；一株利用转基因鼠制备的全人抗CEA抗体也被证明具有抑制肿瘤生长的作用(Imakiire，Kuroki et al.2004)。另外，也有报道表明，抗CEA抗体还具有抗肿瘤转移的作用(Blumenthal，Osorio et al.2005)。抗CEA抗体形式也多种多样，包括完整抗体、scFv及其二聚体、F(ab′)2及其二聚体和三聚体以及人鼠嵌合Fab等形式(Mayer，Chester et al.1999)。

发明内容

在基于蛋白质组学筛选肿瘤抗原的基础上，本发明利用专利ZL01136092.5中介绍的抗体差异筛选和鉴定肿瘤靶抗原的策略，将抗原/抗体的筛选进行二位一体整合。通过用结直肠癌细胞LS 174T免疫小鼠，利用细胞ELISA方法和免疫组化筛选出肿瘤特异抗体，并通过抗体“钓取”肿瘤抗原，获得了本发明中的具有很强抗肿瘤活性的抗人CEA小鼠单克隆抗体CC4。

本发明用结直肠癌细胞LS 174T免疫BALB/c小鼠，获得杂交瘤细胞。用细胞ELISA方法筛选与LS 174T细胞有强结合的抗体，获得一株肿瘤特异性抗体，命名为CC4，同时分泌该抗体的杂交瘤细胞系命名为cc4。这株抗体属于IgG2a，κ亚型。通过免疫荧光证实了CC4与LS 174T细胞的结合，并发现CC4在免疫印迹实验中能够识别细胞裂解液中130kD的蛋白。

利用免疫组化鉴定了抗体CC4的肿瘤组织结合谱(如表1)，发现CC4能够特异性识别肿瘤组织，主要为胃癌、结肠癌、肝癌、子宫内膜癌、肺癌、食管癌、卵巢癌及乳腺癌等，而不结合或弱结合正常消化道组织。利用细胞免疫荧光鉴定了抗体CC4对肿瘤细胞的结合谱(如表2)，发现CC4对结直肠癌和胰腺癌细胞都有强烈结合。

利用免疫沉淀从LS 174T细胞裂解液中捕获CC4抗原，用SDS-PAGE分离富集的抗原，并利用胰酶进行胶内酶解，通过LC-MS(液相色谱-质谱)的方法鉴定出CC4抗体识别的特异性抗原为CEA蛋白(即CEACAM5)。通过在CC4不结合的细胞(如黑色素瘤细胞A375，膀胱癌细胞T2-4和293T细胞等)中转染CEACAM5的cDNA，并检测CC4与转染细胞的结合，证实了CC4与CEA的相互结合。

利用重组表达的CEA蛋白不同结构域和不同缺失突变片段以及免疫印迹的实验方法，发现了CC4识别的抗原表位为CEA蛋白上的氨基酸42-61区域(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置42-61，即SEQID NO：2)。而这段抗原表位保守存在于CEA蛋白家族各成员中，如CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8等。其中CC4与CEACAM1的结合得到证实，而且CC4结合的抗原表位也是此段抗原表位氨基酸42-61区域。

抗体功能研究发现，CC4抗体能够在体外显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、聚集及侵袭等。体内裸鼠荷瘤实验也证实CC4抗体显著抑制肿瘤生长。同时CC4在活体荧光影像中特异性靶向并积累于荷瘤鼠肿瘤部位，体现出很强的肿瘤特异性。此外CC4还具有细胞毒活性，能引起明显的ADCC(抗体介导的细胞毒)反应。由于CC4抗体具有较强的抗肿瘤活性，CC4极有潜力发展成为针对于表达CEA的肿瘤，特别是结直肠癌，的诊断工具及治疗药物。

具体地，本发明涉及一种人CEA抗原表位，其氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示。

本发明涉及一种抗人CEA抗体，命名为CC4，其特征在于其能够特异性识别上述人CEA抗原表位。

优选地，所述抗人CEA抗体特征在于包括抗体重链和抗体轻链，

其中所述抗体重链包括作为CDR的由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQID NO：5的氨基酸序列组成的CDR3，

所述抗体轻链包括作为CDR的由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ IDNO：8的氨基酸序列组成的CDR3。

更优选地，所述抗体的重链可变区由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成，轻链可变区由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成。

在本发明的另一个方面，还涉及上述抗人CEA的抗体在制备用于靶向CEA的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用。优选地，这种诊断可以是应用实施例中所述的活体荧光影像技术为基础的肿瘤诊断手段。

在本发明的另一方面，还涉及上述抗人CEA的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。优选地，所述肿瘤是结直肠癌，肝癌，肺癌。

在另一个方面，本发明还涉及一种组合物，例如用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含上述任一方面的抗人CEA抗体，和药用载体。

用于本文时，“药用载体”包括生理适合的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通过注射或灌输)。

通过许多本领域已知的方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。

为了通过某些施用路径来施用本发明化合物，用一种材料来包被化合物，或与一种材料共同施用化合物以预防其失活可能是必需的。例如，可以以适当载体，例如脂质体或稀释剂来给受试者施用所述化合物。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。

药用载体包括用于即时制备灭菌的可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。将这些介质和试剂用于药用活性物质的应用为本领域所知。

在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的、胸骨内的注射和灌输。

无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药用剂型。

对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所用的特定化合物结合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史和医学领域众所周知的类似因素。

所述组合物必须是无菌且流体的，以到达组合物可以通过注射器进行传递的程度。除了水之外，载体优选是等渗缓冲盐溶液。

在另一个方面，本发明还涉及分泌抗人CEA抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC NO：2504。

在另一个方面，本发明还涉及编码能与下面定义的各个另外抗体链一起装配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一种

a)抗体重链，其为上述所定义的抗体重链之一；

b)抗体轻链，其为上述所定义的抗体轻链之一。

同时，本发明还涉及包括上述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。以及包括所述表达载体的原核或真核宿主细胞。

在本发明的另一个方面，还涉及一种制备结合人CEA的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达上述编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。

在本发明的另一个方面，还涉及所述抗人CEA的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物(如生物素、HRP、碱性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5等常规荧光染料、纳米磁珠等纳米材料)、抗肿瘤药物(如现有技术已知的卡铂、顺铂、五氟尿嘧啶等)、毒素(如蓖麻毒素、淋巴毒素等)、放射活性剂(如¹³¹碘、⁹⁰钇、放射性铜等)偶联的产物。

本领域的普通技术人员基于说明书关于抗人CEA抗体的教导，结合现有技术的知识，完全可以毫无困难地获得上述衍生物，进而确定衍生物的效果。

本发明的创新点在于：(1)研制了一株针对人CEA蛋白的鼠单克隆抗体；(2)揭示了这株抗CEA抗体识别的抗原表位，并发现这个抗原表位保守存在于包括CEACAM1在内的CEA家族其他蛋白成员中，同时证实了CC4在分子、细胞及组织水平上对于CEA蛋白的结合有显著差别；(3)发现了CC4能够通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移、聚集和侵袭，以及抗体介导的细胞毒作用，来抑制肿瘤生长。

附图说明

图1：单克隆抗体CC4的亚型鉴定。

图2：单克隆抗体CC4对于结直肠肿瘤及正常组织的免疫组化染色，箭头指示组化染色部位。

图3：单克隆抗体CC4对于结直肠肿瘤细胞LS 174T的免疫荧光染色，绿色萤光染色部位如箭头所指。

图4：单克隆抗体CC4对于结直肠肿瘤及正常组织裂解液和结直肠癌细胞LS 174T及SW948的免疫印迹结合。

图5：单克隆抗体CC4在免疫沉淀实验中结合存在于LS 174T细胞裂解液中的抗原。泳道1和2是免疫沉淀前的样品，泳道3和4分别是应用CC4和IgG免疫沉淀之后的样品，泳道5和6是用CC4和IgG沉淀下来的目的抗原蛋白。

图6：CC4与CEACAM5蛋白的结合。左图是转染pcDNA3.1空载体的T2-4细胞，右图是转染pcDNA3.1-CEACAM5的T2-4细胞。阴影是用IgG染色细胞，黑线是用CC4染色细胞。

图7：CEACAM5蛋白的重组片段示意图。

图8：CEACAM5重组结构域1-3在免疫印迹实验中与抗体CC4及anti-His抗体的结合。左图为蛋白凝胶电泳，右图为免疫印迹实验。

图9：CEACAM5蛋白重组片段在免疫印迹实验中与抗体CC4及anti-His抗体的结合。左图为蛋白凝胶电泳，右图为免疫印迹实验。

图10：单克隆抗体CC4结合CEACAM5蛋白上位于aa 42-61的一段抗原表位。A图是CEACAM5全长及缺失突变的示意图。B图是CC4抗体和RACEA多抗分别对表达CEACAM5或缺失突变CEACAM5-Δ42-61的293T细胞。阴影是用IgG染色细胞，黑线是用CC4染色细胞，而绿线是用抗CEA兔多抗RACEA染色细胞。

图11：不同CEA蛋白家族成员的位于aa 42-61的保守表位比较。

图12：单克隆抗体CC4结合CEACAM1蛋白上位于aa 42-61的一段抗原表位。A图是CEACAM1全长及缺失突变的示意图。B图是CC4抗体和RACEA多抗分别对表达CEACAM1或缺失突变CEACAM1-Δ42-61的293T细胞。阴影是用IgG染色细胞，黑线是用CC4染色细胞，而绿线是用抗CEA兔多抗RACEA染色细胞。

图13：单克隆抗体CC4与CEACAM6和CEACAM8蛋白分子的结合。左图是转染了CEACAM8 cDNA的293T细胞，右图是转染了CEACAM6 cDNA的293T细胞。阴影是用IgG染色细胞，黑线是用CC4染色细胞，而绿线是用抗CEA兔多抗RACEA染色细胞，蓝线是用9A6抗体染色细胞。

图14：单克隆抗体CC4与小鼠CEACAM1蛋白分子的结合。

图15：单克隆抗体CC4在荷瘤鼠活体内靶向肿瘤部位的荧光影像。图A是Cy5-CC4对于肺癌细胞A549的免疫荧光染色。图B是Cy5-CC4在荷人肺癌细胞A549成瘤的裸鼠上的荧光影像。图C是Cy5-IgG在荷瘤鼠内的分布情况。

图16：单克隆抗体CC4对于裸鼠荷瘤生长的抑制作用。上图是肿瘤体积随注射抗体时间变化的曲线图。下图是肿瘤大小的照片示意。

图17：单克隆抗体CC4对于结直肠癌细胞LS 174T增殖的抑制作用。CFSE标记的第一代细胞所占比例标注于图上。

图18：单克隆抗体CC4对于结直肠癌细胞LS 174T细胞周期进程的影响。不同时期的细胞所占比例标注于图上。

图19：单克隆抗体CC4对于结直肠癌细胞LS 174T迁移的影响。每个视野下穿过微孔膜的细胞数以柱状图显示于图上。

图20：单克隆抗体CC4对于结直肠癌细胞LS 174T黏附的影响。单细胞所占比例以柱状图显示于图上。

图21：单克隆抗体CC4引起的ADCC作用。特异性细胞杀伤与抗体浓度的关系以线图的形式显示于图中。

杂交瘤细胞株cc4(其分泌抗体CC4)于2008年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京，海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.2504。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的。本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。

实施例1：单克隆抗体CC4的制备及鉴定。

应用杂交瘤技术(Kohler and Milstein 1975；Yeh，Hellstrom et al.1979；Yeh，Hellstrom et al.1982)产生并筛选获得抗体CC4。简述如下：以人结直肠癌细胞LS 174T活细胞(ATCC)为抗原免疫BALB/c小鼠(北京实验动物中心)，经4次加强免疫后将小鼠杀死，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和SP2/0-Ag14鼠骨髓瘤细胞(ATCC)进行融合，并用HAT选择性培养基对杂交瘤进行筛选。具体方法见参考文献(Kohler and Milstein 1975)。

用培养于96孔细胞培养板内并经固定的LS 174T细胞作为抗原，ELISA法筛选各杂交瘤细胞培养上清。细胞ELISA方法简介如下：(1)将LS 174T细胞接种于96孔细胞培养板，培养至近于汇片(sub-confluence)；

(2)吸去96孔细胞培养板中的培养基，PBS洗涤细胞，用-20℃预冷的丙酮/甲醇(1∶1)固定孔内的细胞，1min；吸去固定剂，PBS洗涤；

(3)用PBS配制的5％脱脂牛奶加入各孔至满，室温孵育1h封闭，PBS洗涤；

(4)将收集的各个杂交瘤细胞克隆的培养上清50μl分别加入各孔中，室温孵育1h，PBS洗涤三次；

(5)各孔内加入PBS稀释(1∶5000稀释)的HRP-羊抗鼠IgG(SantaCruz)50μl，室温孵育1h，PBS洗涤三次；

(6)各孔内加入底物(200ng/ml TMB(Ameresco)，0.03％H₂O₂(北京化学试剂公司)，pH4.5)显色，用酶标仪测定各孔在450nm处的光吸收值。选择读数高的克隆进行进一步的鉴定实验。

在细胞ELISA实验中，杂交瘤克隆cc4分泌的抗体CC4表现出与靶细胞强烈而稳定的结合。将单克隆抗体杂交瘤细胞株cc4(其分泌抗体CC4)于2008年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京，朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2504。

大量培养扩增杂交瘤细胞cc4，收集含有CC4抗体的培养上清；同时将杂交瘤细胞cc4用无血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液，用于制备抗体腹水。腹水制备方法如下：取6-8周周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷(Pristane)，10天后腹腔注射5×10⁶个杂交瘤细胞，两周后处死小鼠，抽取小鼠腹水，保存于-70℃。

用Protein A Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia)从杂交瘤培养上清或小鼠腹水中纯化小鼠抗体，纯化方法参见产品说明书。

应用BD Pharmingen公司鼠抗体亚型鉴定试剂盒(目录号550487)，ELISA方法鉴定出抗体CC4属于IgG1，κ亚型，如图1所示。

实施例2：单克隆抗体CC4对肿瘤组织及肿瘤细胞的特异性研究。

为系统研究本发明所述单克隆抗体CC4对人体正常和肿瘤组织的结合特异性，应用免疫组化的方法筛选了29例人正常组织和24例人肿瘤组织的冰冻切片标本。

具体实验方法如下：将人正常组织或肿瘤组织用OCT(冰冻组织包埋液，Sakura提供)包埋，进行冰冻切片。切片在预冷的丙酮里固定5分钟，然后在含有0.3％H₂O₂的甲醇中室温闭光孵育30分钟去除内源性过氧化物酶的干扰。PBS洗涤三次之后，用5％马血清(北京中杉金桥，PBS稀释马血清)封闭切片，然后分别在含有CC4和不含有CC4(阴性对照)的一抗稀释液(1∶2000封闭液稀释)中4℃孵育过夜。之后用生物素标记的二抗(生物素偶联的羊抗鼠IgG，Vector公司，1∶1000封闭液稀释)和辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白作为三抗(Vector， 1∶1000PBS稀释)，37℃孵育组织切片，最后用新鲜配置的DAB显色试剂盒(北京中杉金桥，产品编号：ZLI-9033)显色。显色完毕之后用苏木素复染细胞核。

如表1所示，CC4在正常组织中的分布主要包括胃粘膜上皮细胞、小肠和大肠等的腺上皮细胞、肝细胞、宫颈鳞状上皮及前列腺的腺上皮等，在所有检测过的正常组织标本中的阳性率为11/29，胃、肠、肝和子宫的阳性率为7/16。CC4与所测试的绝大多数肿瘤组织有结合，阳性率为22/24，主要集中于消化道肿瘤以及生殖系统肿瘤，其中，胃癌、结肠癌、肝癌和子宫内膜癌的阳性率为15/16；而且，CC4与肿瘤组织的结合信号强度普遍高于与相应正常组织的结合信号，证实了CC4与肿瘤组织的特异性结合。

表1单克隆抗体CC4对肿瘤组织特异性的免疫组化分析

正常组织	阳性例数/总例数	肿瘤组织	阳性例数/总例数
				胃	1/3	胃癌	2/2
肠	2/8	结肠癌	7/7
				肝	1/1	肝癌	3/3
子宫	3/7	子宫内膜癌	3/4
				大脑	0/1	肺癌	1/2
心脏	0/2	食管癌	1/1
				脾	2/2	卵巢癌	4/4
胰	0/2	乳腺癌	1/1
				肾	1/2
甲状腺	0/1
				睾丸	0/1
前列腺	1/1
				膀胱	0/1

CC4与肝癌和结肠癌肿瘤组织表现出尤为强烈的结合。以结直肠癌为例，如图2所示，CC4对于结直肠癌组织的典型着色可以看出，CC4主要结合在腺上皮细胞胞浆内(如图2的箭头所示)，同时在上皮围成的腔内和基底膜外也有弥漫的信号存在(如图2的箭头所示)。除此之外，CC4还与肝癌组织癌细胞、胃癌组织的胃粘膜，子宫内膜癌组织的内膜等上皮组织有结合(结果未显示)。

用细胞免疫荧光等实验手段，以CC4为一抗，以FITC-羊抗鼠IgG为二抗，检测了单克隆抗体CC4与人肿瘤细胞系的结合。

简单方法如下：

(1)培养在盖玻片上的单层细胞用-20℃预冷的丙酮/甲醇(1∶1)或4％甲醛固定1min，PBS洗涤；

(2)5％(v/v)羊血清(北京中杉金桥)封闭，室温，30min；

(3)稀释1000倍的单抗CC4腹水与样本孵育，室温，1h，PBS洗涤三次；

(4)400倍稀释的FITC-羊抗鼠IgG(Sigma)与样本孵育，室温，30min，PBS洗涤三次；

(5)用普通荧光显微镜或激光共聚焦激光扫描显微镜观察样本，拍照。

如表2所示，在检验的16株肿瘤细胞中，CC4与其中的8株有特异性结合。这8株细胞分别属于结直肠癌、肝癌和胰腺癌。可以看出大部分的结直肠癌细胞都表达CC4抗原，能够被CC4识别。

表2免疫荧光分析单克隆抗体CC4对人肿瘤细胞的特异性

*上列所有癌细胞系均来自ATCC。

图3显示了免疫荧光实验中，CC4与两株结直肠癌细胞LS 174T和SW1116的结合。可以看出，CC4抗原分布在细胞膜上，在细胞的接触面上有更显著的表达(如图3的箭头所示)。这一结果提示，CC4抗原可能与细胞间黏附有关。

实施例3：单克隆抗体CC4的抗原鉴定。

应用免疫印迹的实验方法发现CC4识别存在于LS 174T细胞及结直肠癌组织中的大小为130kD的蛋白。具体操作如下：收集与CC4强烈结合的人源结直肠癌细胞LS 174T(ATCC)，用预冷的PBS洗涤细胞两遍，4℃800rpm离心5分钟，细胞沉淀用裂解液(Tris-HCl 50mM pH 8.0，NaCl150mM，EDTA 1mM，NP-40 1％，Glycerol 10％，PMSF 100μg/ml)裂解细胞，4℃12000g离心15分钟，收集上清，分别加入含有DTT(终浓度100mM)(二硫苏糖醇)和不含有DTT的上样缓冲液(5x上样缓冲液：0.313MTris-HCl，pH6.8，10％SDS，0.05％溴酚蓝，50％甘油)，100℃煮样。10％SDS-PAGE分离全细胞蛋白，之后半干电转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂牛奶封闭后，用CC4腹水作为一抗(1∶10000用封闭液5％脱脂牛奶/TBST稀释)4℃孵育膜过夜，然后用辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗(Pierce，1∶2000封闭液5％脱脂牛奶/TBST稀释)室温孵育1小时，用Pierce公司提供的显色底物(产品编号：34076，400μl 3％H₂O₂+400μlLuminol溶液/miniblot)检测。如图4所示，CC4在还原和非还原状态下结合LS 174T细胞裂解液中130kD左右的蛋白。证明CC4结合的抗原表位是一个不依赖于二硫键的线性表位。而且CC4识别条带呈现弥散状，结合CC4靶抗原的细胞膜分布形式，提示CC4靶抗原可能存在较高程度的糖基化。

接着利用免疫沉淀的办法在LS 174T细胞裂解液中富集CC4靶抗原，并进行胶内酶解和液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定该靶抗原。

免疫沉淀的具体方法简述如下：5×10⁷LS 174T(同上)细胞在2mL冰预冷的上述裂解液中裂解30分钟，4℃12000g离心15分钟，收集上清。先加入20μl 50％slurry(50％与PBS或TE混合)的protein A-Agarose(SantaCruz)，进行预清除。然后分别加入5μg CC4和正常鼠IgG(Sigma)，4℃孵育过夜。之后加入50μl 50％slurry的protein A-Agarose捕获抗原-抗体复合物，用PBS洗涤沉淀三次，加入80μl 1x上样缓冲液(将上述5x上样缓冲液稀释5倍)，100℃加热煮样10分钟。蛋白沉淀用免疫印迹的方法检测(实验方法同上所述)，CC4作为检测一抗。

如图5所示，用CC4免疫沉淀富集了CC4靶抗原，而阴性对照小鼠IgG不能捕获CC4靶抗原(泳道5和6)。并且经过CC4免疫沉淀之后的细胞裂解液中，CC4靶抗原含量下降明显(泳道3)也反映了CC4抗体富集靶抗原的效率。

用SDS-PAGE分离CC4靶抗原之后，银染色，切取胶上130kD条带，利用胰酶进行胶内酶解，用LC-MS方法鉴定抗原蛋白。

具体操作如下：

(1).将所选择的胶条带用1.5mm切胶笔切下，并切成1mm³大小的碎块，置于eppendorf(EP)管或96孔PCR板中；

(2).加50μL DD.H₂O洗两次，10min/次；

(3).加100mmol硫代硫酸钠和30mmol铁氰化钾(1∶1)溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

(4).重复步骤3，直至颜色褪去；

(5).加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；

(6).加10mM DTT(10μL 1M DTT，990μL 25mM NH₄HCO₃配制)20μL，56℃水浴1hr；

(7).冷却到室温后，吸干，快速加55mM IAM(55μL 1M IAM，945μL 25mM NH₄HCO₃配制)20μL，置于暗室45min；

(8).依次用25mM NH₄HCO₃、50％乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min；

(9).将0.1μg/μL的酶储液以25mM NH₄HCO₃稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH₄HCO₃ 10-15μL置37℃，消化过夜；

(10).加入2％FA(甲酸)终止反应，使FA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。

(11).将上清吸取20μl，上机检测。(中国科学院生物物理所质谱平台，LC-MS蛋白鉴定服务)。

(12).通过在线工具及在线软件可以鉴定蛋白序列。

Masco(http:∥www.matrixscience.com/search_form_select.html)

蛋白鉴定结果如表3所示，符合理论预测的4个肽段被鉴定出来，蛋白则被鉴定为CEACAM5，得分40.34，分子量76,795。

表3LC-MS鉴定的CC4抗原肽段列表

进一步的实验证实了CC4的靶抗原就是CEA蛋白(即CEACAM5)。从武汉三鹰生物技术有限公司购买CEACAM5的cDNA(克隆在pCMV-SPORTS6载体上)，序列为SEQ ID NO：11所示，将CEACAM5亚克隆至pcDNA3.1(-)b(Invitrogen)，利用限制性内切酶NotI和HindIII(NEB提供)及引物5’-AAA TAT GCG GCC GCA TGG AGT CTC CCTCGG CCC-3’(SEQ ID NO：12)和5’-CCC AAG CTT GGC TGC TAT ATCAGA GCAAC-3’(SEQ ID NO：13)。

将构建好的pcDNA3.1(-)b-CEACAM5质粒以Lipofectamine 2000(Invitrogen)介导转染至CC4不结合的人膀胱癌细胞T2-4(ATCC)中。方法简介如下：

(1).以1-3×10⁵细胞/孔的密度接种T2-4细胞至六孔板，37℃培养过夜，细胞生长至70-80％汇片。

(2).将5μl Lipofectamine2000(Invitrogen)稀释到125μl的Opti-MEM(Gibco)中，混合均匀。

(3).将2μg质粒DNA稀释到另一125μl的DMEM(Gibco)中混合均匀，室温孵育5分钟。

(4).将上述两种稀释液混合均匀，室温孵育20分钟。

(5).将混合液逐滴滴加到细胞培养板各孔中，摇动培养板使其均匀混合。48小时后收集细胞进行流式细胞术检测。

用CC4抗体分别对转染CEACAM5 cDNA及空载体的T2-4细胞进行流式细胞术检测。方法简述如下：

(1)用0.03％EDTA消化细胞，用含有0.1％BSA的PBS(PBSB)洗涤，重悬，细胞浓度约10⁶/ml；

(2)加入1000倍稀释的CC4腹水做一抗，以加入正常小鼠IgG(Sigma)的细胞作为空白对照；4℃孵育45分钟；PBSB洗涤；

(3)加入400倍稀释的FITC-羊抗鼠IgG(Sigma)，4℃避光孵育30分钟；PBSB洗涤；

(4)将细胞重悬于PBS，FACS检测。

结果如图6所示，转染空载体的T2-4/Control不能被CC4抗体所识别，但转染T2-4/CEACAM5的细胞却能够被CC4强烈结合。这一实验证实了CC4对CEACAM5蛋白的特异性结合。

实施例4：抗体CC4的抗原表位鉴定

运用分别重组表达的人CEA蛋白(即CEACAM5)胞外区段的不同缺失突变体，以及免疫印迹的实验方法鉴定了本发明所述的抗体CC4识别的抗原表位。

如图7所示，结构域1-3分别表示CEA最靠近胞外N端的三个结构域。重叠的序列被设计来防止可能的表位丢失。结构域1(序列为SEQ IDNO：1的人CEA序列中的位置35-155的氨基酸，如SEQ ID NO：14所示)、结构域2(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置139-273的氨基酸，如SEQ ID NO：15所示)以及结构域3(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置230-355的氨基酸，如SEQ ID NO：16所示)分别克隆在pET32a(Novagen)上，表达出来的分别是Trx-His6-S tag融合的Trx-His6-S-D1，Trx-His6-S-D2和Trx-His6-S-D3。

克隆过程简述如下：用相应的一对引物D1S和D1A(用于结构域1)，D2S和D2A(用于结构域2)，D3S和D3A(用于结构域3)，及模板pcDNA3.1(-)b-CEA(如前实施例3所述)作PCR反应，条件为95℃5分钟；95℃45秒，56℃40秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟。分别扩增出编码结构域1-3的核苷酸序列。

引物列表如下，正义链引物带有Nco I酶切位点(如下划线所示)，反义链引物带有Hind III酶切位点(如下划线所示)：

引物名称引物序列5’至3’

D1S 5’catgCCATGGctAAGCTCACTATTGAATCCAC 3’(SEQ IDNO：17)

D1A 5’cccAAGCTTttaTTTGGAGTTGTTGCTGGAGA 3’(SEQID NO：18)

D2S 5’catgCCATGGctCGGGTATACCCGGAGCTGC 3’(SEQ IDNO：19)

D2A 5’cccAAGCTTttaGACAAACCAAGAGTACTGTG 3’(SEQID NO：20)

D3S 5’catgCCATGGctATCCTGAATGTCCTCTATGG 3’(SEQ IDNO：21)

D3A 5’cccAAGCTTttaCAGGTAGGTTGTGTTCTGAA 3’(SEQID NO：22)

PCR产物用2％琼脂糖凝胶(Biowest Agarose)分离，用Tiangen公司提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(产品编号：DP209-03)回收PCR产物，然后用Takara公司提供的pMD18 T-simple kit将片段连接到T载体(试剂盒内提供了载体和酶)上，并转化Top10感受态细胞(Tiangen提供)。加有氨苄青霉素的LB培养板上长出来的单克隆D1-T(插入了结构域1的核苷酸序列)，D2-T(插入了结构域2的核苷酸序列)和D3-T(插入了结构域3的核苷酸序列)，用带有氨苄青霉素的LB培养基培养37℃过夜，并用Tiangen提供的质粒小提试剂盒(产品编号：DP103-03)抽提质粒，用Nco I和Hind III(NEB)双酶切pET32a、提取的质粒(即分别插入了结构域1-3的核苷酸序列的T载体)。之后用2％琼脂糖凝胶(Biowest Agarose)分离，用Tiangen公司提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(产品编号：DP209-03)回收T载体的酶切小片段(即结构域1-3的核苷酸序列)及pET32a酶切开的质粒片段。D1-T，D2-T及D3-T的酶切小片段与pET32a酶切开的质粒片段连接，用NEB公司提供的T4DNA连接酶建立连接反应，16℃连接过夜。转化Top10感受态细胞(Tiangen)，pET32a-D1，pET32a-D2和pET32a-D3用含氨苄霉素(100ng/ml)的半固体LB培养板筛选。过夜培养获得的单克隆分别用含有抗生素的LB培养基培养，并抽提质粒，获得的质粒用于转化Bl21(DE3)感受态细胞(Tiangen)。

重组蛋白Trx-His6-S-D1(简称D1)，Trx-His6-S-D2(简称D2)和Trx-His6-S-D3(简称D3)的诱导表达：转化了pET32a-D1，pET32a-D2和pET32a-D3的Bl21(DE3)单克隆，在含有相应抗生素的5ml LB培养液中37℃培养过夜。过夜菌1∶100接种至相应新鲜的培养基中37℃培养，待细菌生长至OD600为0.6时，加入1mM IPTG(Ameresco)37℃诱导表达6小时或者0.2mM IPTG 16℃诱导过夜。图8的左图显示了重组表达的D1-3蛋白。

D1，D2和D3由IPTG诱导表达之后，大部分呈现可溶状态，用Ni柱纯化。具体方法如下：菌体重悬于25mM Tris-HCl(pH7.4)，300W超声2×99个循环，每个循环超声4秒，暂停8秒，共12秒。4℃12000g离心30分钟，收集上清，过0.45mm滤膜去除杂质。Ni-NTA sepharose 6 Fast Flow(GE Health Care)填柱，用超纯水洗涤后，在50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl的平衡溶液中平衡。然后将含有His6-tag的蛋白的离心可溶上清上样挂柱，用洗涤溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，50mM咪唑)洗柱。最后洗脱溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，300mM咪唑)洗脱柱上的蛋白。

利用免疫印迹实验鉴定CC4所识别的结构域。简单过程如下：用15％SDS-PAGE分离原核表达纯化的D1-D3蛋白，然后用Bio-rad半干转印仪将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用溶解在PBST中的5％脱脂牛奶室温封闭2小时，然后用上述5％脱脂牛奶/PBST稀释(1∶5000)的一抗溶液(CC4)4℃孵育过夜。接着PBST洗5遍，用上述5％脱脂牛奶/PBST稀释(1∶2000)的二抗(辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体，Pierce)溶液室温孵育1小时。PBST洗5遍之后，用Pierce公司的显色底物(产品编号：34076，400μl 3％H₂O₂+400μl Luminol溶液/miniblot)显色。如图8右图所示，D1-3因为都带有His-tag，都能够被anti-His-tag的抗体所识别。然而CC4只结合D1，不结合相邻的D2，证实了其抗原表位处于结构域1中，即CEA蛋白氨基酸35-138的一段蛋白区段中。

进一步的研究利用四个重组表达的不同蛋白片段更细化的鉴定CC4结合的抗原表位。

如图7所示，片段42-273，片段62-273，片段80-273以及片段101-273分别表示四个针对于结构域1的CEA蛋白截短体。用于找出CC4抗体所识别的抗原表位序列。片段42-273(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置42-273的氨基酸，如SEQ ID NO：23所示)、片段62-273(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置62-273的氨基酸，如SEQ IDNO：24所示)、片段80-273(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置80-273的氨基酸，如SEQ ID NO：25所示)以及片段101-273(序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置101-273的氨基酸，如SEQ IDNO：26所示)分别克隆在pET32a(Novagen)上，表达出来的分别是Trx-His6-S tag融合的Trx-His6-S-F42-273，Trx-His6-S-F62-273，Trx-His6-S-F80-273和Trx-His6-S-F101-273。

克隆过程同结构域1-3克隆过程相同。用相应的一对引物42S和D2A(用于片段42-273)，62S和D2A(用于片段62-273)，80S和D2A(用于片段80-273)，101S和D2A(用于片段101-273)及模板pcDNA3.1(-)b-CEA(如前实施例3所述)作PCR反应，条件为95℃5分钟；95℃45秒，55℃40秒，72℃50秒，30个循环；72℃5分钟。分别扩增出编码上述四个片段的核苷酸序列。

引物列表如下，带有Nco I酶切位点(如下划线所示)：

引物名称引物序列5’至3’

42S 5’catgCCATGGctCCGTTCAATGTCGCAGAGG 3’(SEQ IDNO：27)

62S 5’catgCCATGGctCTTTTTGGCTACAGCTGGT 3’(SEQ IDNO：28)

80S 5’catgCCATGGctATAGGATATGTAATAGGAAC 3’(SEQID NO：29)

101S 5’catgCCATGGctATATACCCCAATGCATCCC 3’(SEQ IDNO：30)

克隆和表达过程与前述结构域1-3的克隆表达过程完全相同。图9左图显示了重组表达的四个蛋白片段。

重组蛋白Trx-His6-S-F42-273(简称F42-273)，Trx-His6-S-F62-273(简称F62-273)，Trx-His6-S-F80-273(简称F80-273)和Trx-His6-S-F101-273(简称F101-273)诱导表达之后大部分呈不可溶的包涵体状态。包涵体纯化和洗涤方法如下：菌体重悬于25mM Tris-HCl(pH7.4)，300W超声2×99个循环，每个循环超声4秒，暂停8秒，共12秒。4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液1(2.5M NaCl)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液2(0.5％Triton X-100，10mM EDTA，pH8.0)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。包涵体沉淀重悬于溶液3(2M Urea，50mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中，4℃搅拌30分钟，4℃12000g离心30分钟。随后，包涵体溶解在溶液4(8M Urea，25mM Tris，150mM NaCl，25mM DTT，pH 8.0)中。

利用免疫印迹实验鉴定CC4抗体所识别的蛋白片段以及抗原表位。实验方法同验证CC4与D1-3结合的免疫印迹方法完全相同。如图9右图所示，F42-273，F62-273，F80-273及F101-273都带有His-tag，都能够被anti-His-tag的抗体所识别。但只有F42-273能够被CC4所识别，而其他三个蛋白片段均不结合CC4，说明CC4的识别位点位于CEA氨基酸序列aa 42-61中。

接着，发明者利用标准的重叠PCR法构建了缺失aa42-61一段氨基酸序列的全长CEA突变体(如图10A所示)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，DNA序列如SEQ ID NO：32所示。方法简单描述如下：先用引物C5-EcoRI-sense和C5-Antisense-splicer，PCR扩增得到C5-Δ42-61-F1片段，用引物C5-Sense-splicer和C5-BglII-antisense，PCR扩增获得C5-Δ42-61-F2；接着利用C5-Δ42-61-F1和C5-Δ42-61-F2互为模板和引物，以54℃为退火温度，PCR扩增5个循环，之后加入引物C5-EcoRI-sense和C5-BglII-antisense，以56℃为退火温度，PCR扩增25个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，用Tiangen公司提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(产品编号：DP209-03)回收PCR产物，用NEB公司提供的EcoRI和BglII双酶切pcDNA3.1(-)b-CEACAM5(前述构建)和PCR产物，再用琼脂糖凝胶电泳分离，并回收DNA片段(同上)。将酶切过的载体和PCR产物连接，用NEB公司提供的T4DNA连接酶建立连接反应，16℃连接过夜。转化Top10感受态细胞(Tiangen)，含有质粒pcDNA3.1(-)b-CEACAM5-Δ42-61的阳性克隆用含氨苄霉素(100ng/ml)的半固体LB培养板筛选。过夜培养获得的单克隆分别用含有抗生素的LB培养基培养，并抽提质粒。

C5-EcoRI-sense：5’-CCGGAATTCATGGAGTCTCCCTCGGCCC-3’(SEQ ID NO：33)

C5-Antisense-splicer：5’-GCCAAAAAGCGTGGATTCAATAGTGAGC-3’(SEQ IDNO：34)

C5-Sense-splicer：5’-TGAATCCACGCTTTTTGGCTACAGCTGGT-3’(SEQ ID NO：35)

C5-BglII-antisense：5’-GGAAGATCTGACTTTATGACGTG-3’(SEQ ID NO：36)

获得的pcDNA3.1(-)b-CEACAM5-Δ42-61质粒用于转染293T细胞。同时转染pcDNA3.1(-)b-CEACAM5质粒作为阳性对照(转染方法同前)。将转染的细胞用CC4或者RACEA(抗人CEA家族蛋白兔多抗，DakoCytomation公司提供)染色，并进行流式细胞术检测(FACS方法同前，FITC标记抗兔二抗由Sigma公司提供)。结果显示未转染的293T细胞不能被CC4或者RACEA识别，转染了CEACAM5野生型cDNA的细胞能够同时被CC4和RACEA识别，但是转染了CEACAM5-Δ42-61突变体的293T细胞只能被RACEA识别，但不能被CC4结合(如图10B所示)。

上述实验结果说明CC4的抗原表位存在于序列为SEQ ID NO：1的人CEA序列中的位置42-61之间，具体序列如SEQ ID NO：2所示。

对比鉴定出的抗原表位在CEA家族蛋白中的相似程度，发现该抗原表位保守地存在于CEA家族蛋白各成员当中。如图11所示，斜体表示与CEA蛋白同源序列。分析发现CEA蛋白(即CEACAM5)中位于氨基酸序列42-61的CC4所识别的抗原表位，除少数几的氨基酸存在变异外，保守地存在于CEA家族蛋白其他成员中，如CEACAM1、CEACAM3、CEACAM6、CEACAM7及CEACAM8。

因此，发明者以CEACAM1为例，验证了CC4与CEA蛋白家族其他成员的结合，及CC4识别的抗原表位是否同时存在于CEA蛋白家族其他成员相应的氨基酸序列中。

CEACAM1的cDNA购自武汉三鹰生物技术有限公司，序列为SEQ IDNO：37，亚克隆至pcDNA3.1(-)b，利用限制性内切酶EcoRI和HindIII(NEB提供)及引物5’-CCG GAA TTC ATG GGG CAC CTC TCA GCC C-3’(SEQID NO：38)和5’-CCC AAG CTT GGT CTT GTT AGG TGG GTC ATT-3’(SEQ ID NO：39)。同时发明者利用前述重叠PCR的方法，在CEACAM1野生型的基础上，构建了缺乏aa42-61这一段氨基酸片段的CEACAM1突变体，CEACAM1-Δ42-61，其氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，DNA序列如SEQ ID NO：41所示(如图12A)。利用的引物如下：

C1-EcoR I-Sense：5’-CCGGAATTCATGGGGCACCTCTCAGCC-3’(SEQ ID NO：42)

C1-BamH I-antisense：5’-CGCGGATCCACTATTATTCACA-3’(SEQ ID NO：43)

C1-Sense-splicer：5’-TGAATCCATGCTTTTTGGCTACAGCTGGT-3’(SEQ ID NO：44)

C1-antisense-splicer：5’-GCCAAAAAGCATGGATTCAGTAGTGAGC-3’(SEQ IDNO：45)

同样，将获得的质粒pcDNA3.1(-)b-CEACAM1及pcDNA3.1(-)b-CEACAM1-Δ42-61转染293T细胞，用CC4和RACEA染色细胞，进行流式细胞术检测(方法同前述)。结果显示转染CEACAM1的293T细胞能够被CC4和RACEA结合，但是转染突变体CEACAM1-Δ42-61的293T细胞只能被RACEA识别，而无法与CC4结合(如图12B)。因此，CC4 能够识别CEA家族成员CEACAM1，而且识别位点位于，处在同一位置的，序列为SEQ ID NO：46的人CEACAM1氨基酸序列中的位置42-61之间，具体序列如SEQ ID NO：47所示。

针对，CC4所识别氨基酸序列保守的存在于CEA家族不同成员蛋白之中这一现象，发明者又研究了CC4抗体与另外两个具有代表意义的CEA家族蛋白成员，CEACAM6和CEACAM8，的结合情况。

CEACAM6 cDNA购自武汉三鹰生物技术有限公司，序列为SEQ IDNO：48，亚克隆至pcDNA3.1(-)b质粒，利用NEB公司提供的EcoRI和HindIII，及引物5’-CCG GAA TTC ATG GGA CCC CCC TCA GCCCCT-3’(SEQ ID NO：49)和5’-CCC AAG CTT CTA TAT CAG AGC CACCCT GGC-3’(SEQ ID NO：50)。CEACAM8 cDNA购自武汉三鹰生物技术有限公司，序列为SEQ ID NO：51，亚克隆至pcDNA3.1(-)b质粒，利用NEB公司提供的EcoRI和HindIII，及引物5’-CCG GAA TTC CGC AGGCAG CAG AGA CCA TG-3’(SEQ ID NO：52)和5’-CCC AAG CTT ACACCA GAG CTA CTA TAT CAG-3’(SEQ ID NO：53)。

将pcDNA3.1(-)b-CEACAM6及pcDNA3.1(-)b-CEACAM8质粒分别转染293T细胞，用CC4和RACEA分别染色细胞，进行流式细胞术检测。如图13所示，CC4能够与表达CEACAM6及表达CEACAM8的293T细胞结合，说明了CC4能够与CEACAM6分子结合，结合位点基本可以确定存在于序列为SEQ ID NO：54的人CEACAM6序列中的位置42-61之间，具体序列如SEQ ID NO：55所示；CC4能够与CEACAM8分子结合，结合位点基本可以确定存在于序列为SEQ ID NO：56的人CEACAM8序列中的位置42-61之间，具体序列如SEQ ID NO：57所示。

此外，发明者还检测了与人CEA家族蛋白具有同源性的小鼠CEACAM1蛋白与单克隆抗体CC4的结合情况。

含有小鼠CEACAM1 cDNA，序列为SEQ ID NO：58，的真核细胞表达质粒pERFP-N1-mCEACAM1，购自武汉三鹰生物技术有限公司。将pERFP-N1-mCEACAM1质粒转染293T细胞，用CC4和RACEA分别染色细胞，进行流式细胞术检测。如图14所示，RACEA能够与表达mCEACAM1的细胞结合，但是CC4却不能结合转染的细胞。说明CC4 不结合存在于氨基酸序列为SEQ ID NO：59的小鼠CEACAM1序列中的位置42-61之间的抗原表位(如图11所示)，其具体氨基酸序列为SEQ IDNO：60.

综上所述，经过一系列的实验，发明者证实了CC4与CEA家族蛋白许多成员之间的结合，并鉴定出了CC4结合的是一段广泛存在于不同CEA家族蛋白成员之间的保守的抗原表位。这段保守序列存在于人CEACAM1，CEACAM5，CEACAM6及CEACAM8的氨基酸序列中的位置42-61之间。通过分析小鼠CEACAM1的氨基酸序列及CC4的结合情况，发明者发现CC4不与小鼠CEACAM1结合的原因在于，存在于小鼠CEACAM1氨基酸序列位置46-53的一段表位，具体为SEQ ID NO：61，与完全保守存在于人CEA家族蛋白中的表位不一致，具体可以用存在于序列为SEQ ID NO：1的人CEACAM5氨基酸序列位置46-53的表位来表示，具体为SEQ ID NO：62。

因此，发明者基于CC4与共同存在于人CEACAM1，CEACAM5，CEACAM6及CEACAM8中的以SEQ ID NO：62所示的抗原表位结合，而不与存在于小鼠CEACAM1中的以SEQ ID NO：61所示的抗原表位结合这一现象，得出结论：CC4结合的抗原表位是由SEQ ID NO：2，47，55和57共同含有的保守的序列为SEQ ID NO：62的一段氨基酸序列。

实施例5：CC4在活体荧光影像中特异性靶向小鼠荷瘤部位。

利用参考文献(Jin，Josserand et al.2006；Jin，Razkin et al.2007)中所述的活体荧光影像的方法，检测CC4特异性靶向肿瘤能力。

实验方法简单描述如下：

发明者首先用免疫荧光的方法检测了CC4与人肺癌细胞系A549(ATCC)的结合(免疫荧光的方法同前)，结果证实了A549表达CC4的抗原，CC4能够结合A549细胞，如图15A所示。

将2×10⁷A549细胞皮下注射于6-8周裸鼠(Janvier，Le Genest SaintIsle，France)，4-6周形成6-8mm直径的荷瘤。将Cy5标记的CC4抗体20μg/200μl静脉注射于荷瘤鼠，对照荷瘤鼠注射Cy5标记的小鼠IgG(Sigma)，注射了抗体的荷瘤鼠直接应用活体荧光影像观察。利用基于 Hamamatsu光学成像系统的活体荧光反射成像技术，发明者观察了荧光标记抗体在荷瘤鼠体内的活体分布情况。简单的说，小鼠被麻醉后置于一个黑盒子中，用633nm波长的激光(50μW·cm^-2)激发，激发出来的荧光透过RG 665的滤光片，并用一个-70℃制冷的数码CCD镜头(Hamamatsu digitalcamera C4742-98-26LWGS，Hamamatsu Photonics K.K.，Japan)收集荧光。所有的荧光影像收集的曝光时间均为100ms，其他参数在实验中保持不变。图像以16-bit的TIFF文件获得，并用Wasabi软件(Hamamatsu)分析。对于肿瘤/背景对比度的计算，现分别计算肿瘤区域的荧光强度(记为T)，然后计算较远距离之外的皮肤背景荧光强度(记为S)，T/S就被认为是肿瘤组织和背景的荧光水平差异。

结果如图15B所示，注射Cy5标记的CC4 50个小时之后肿瘤/背景比就接近4，达到最大值。而注射Cy5标记IgG的对照鼠，肿瘤/背景比直低于2(如图15C)。IgG只在肝脏代谢，而抗体CC4能够靶向积累于荷瘤部位。实验说明了抗体CC4在动物模型上有很好的肿瘤靶向作用。

实施例6：CC4的体内及体外抑瘤活性研究。

CC4在荷瘤裸鼠模型中抑制肿瘤生长。将结直肠癌细胞LS 174T接种裸鼠，荷瘤部位局部注射单克隆抗体CC4，观察其对肿瘤生长的影响。具体做法如下：

(1)收集培养的LS 174T细胞，无血清培养基洗涤，以2×107个/ml的密度重悬于无血清培养基中；

(2)皮下注射1×10⁷个LS 174T细胞于裸鼠(购自中国医学科学院动物繁育中心)肩胛部位，并在接种部位局部多点注射纯化的单克隆抗体，100μg/只；设置对照组，以相同体积PBS代替抗体注射该组裸鼠；之后每周两次按照同样方法注射；

(3)待肿瘤长至明显可见时，于注射当天用游标卡尺测量肿瘤长径和短径；按照公式：肿瘤体积＝长径×短径2/2计算肿瘤体积；

(4)实验至裸鼠开始出现死亡时结束。

结果如图16所示，注射单克隆抗体CC4的裸鼠荷瘤生长明显抑制，肿瘤大小与注射PBS的对照组相比明显较小。利用体内荷瘤模型证明了单克隆抗体CC4能够显著抑制肿瘤的生长。

基于CC4在体内实验中显示的抑瘤活性，发明者进一步研究了CC4在体外的抗肿瘤活性，即对体外培养的肿瘤细胞的增殖、迁移、粘附及侵袭的影响。

利用CFSE染色研究CC4对于结直肠肿瘤细胞LS 174T增殖的影响。方法简介如下：

(1)将LS 174T细胞重悬于预热的PBS/0.1％BSA溶液中，终浓度为1×10⁶个/ml。CFSE固体粉末购自Molecular Probes，用DMSO溶解配制成5mM储存液。

(2)每毫升细胞悬液加入2μl 5mM的CFSE溶液，CFSE终浓度为10μM。37℃孵育10分钟。

(3)加入5倍体积冰预冷的细胞培养液，淬灭未进入细胞的CFSE染色剂。冰上孵育5分钟。离心收集细胞。

(4)将细胞沉淀重悬在新鲜的培养液中洗涤细胞，然后离心收集细胞。重复重悬和离心过程至少三次以洗涤细胞。

(5)将CFSE标记的细胞接种到6孔板，每孔2×10⁶个细胞。

(6)24小时后收集细胞，用流式细胞仪检测。

结果如图17所示，25μg/ml CC4抗体就足以抑制超过10％的LS 174T细胞分裂增殖，说明CC4抗体能够显著抑制肿瘤细胞增殖。

接下来的研究用PI染色细胞测定细胞内DNA含量，分析了CC4对肿瘤细胞细胞周期产生的影响。方法简介如下：

(1)接种2×10⁶LS 174T细胞(ATCC)到10cm细胞培养皿中，培养过夜。更换成无血清培养液。进行血清饥饿24小时。

(2)更换成10％血清的培养液，培养12h。用PBS洗涤细胞一次。

(3)加入1ml胰酶溶液消化细胞，吹打均匀，转移至离心管中，加入10ml PBS。离心收集细胞，800rpm离心10min。

(4)弃去上清，加入1ml PBS，重悬沉淀并吹打混匀细胞。加入10ml冰预冷的70％乙醇，吹打混匀细胞，固定过夜。800rpm 4℃离心10分钟，收集细胞。

(5)弃去上清，加入1ml PBS，重悬沉淀并吹打混匀细胞。再加入9mlPBS，混匀。800rpm 4℃离心10分钟，收集细胞。

(6)弃去上清，用1ml PBS重悬细胞沉淀，混匀，4C自然沉降5分钟。

(7)转移上相800μl至新管，2500rpm 4℃离心10分钟，收集细胞。

(8)加入新配制的PI溶液[0.1％(v/v)TritonX-100；200μg/mlDNase-free RNase A(BBI)；20μg/ml PI(sigma)]重悬细胞沉淀，37℃孵育30分钟，上机检测。

检测结果如图18所示25μg/ml CC4抗体就可以抑制近20％的细胞由S期向G2期转变，这证明了CC4抗体对于细胞周期的抑制作用，解释了CC4抑制肿瘤细胞增殖的作用。

利用Transwell系统(Corning HTS Transwell-96 Cell MigrationProducts)研究CC4抗体对于细胞迁移的影响。方法简述如下：

(1)LS 174T细胞(ATCC)以无血清培养基制成单细胞悬液(10⁵/ml)，按不同浓度向培养细胞中加入抗体与对照。

(2)Transwell下室加入含10％胎牛血清的培养液(200μl/孔)，上室加入细胞悬液(50μl/孔，每个浓度设三个平行孔)，在37℃二氧化碳培养箱中孵育12小时。

(3)将膜上层的细胞用棉签擦掉，下层细胞以4％多聚甲醛固定后，用1％结晶紫染色，镜检计数。

实验结果如图19所示，CC4处理的实验组每孔穿过的细胞数明显减少，说明CC4能够显著抑制LS 174T细胞的迁移，而且这种抑制呈现浓度依赖。

同时发明者也研究了CC4对于细胞的粘附和聚集的影响。方法主要如参考文献(Takeichi 1977)所述，简述如下：

(1)为了增强粘附效率，LS 174T细胞培养在低钙(0.1mM Ca²⁺)的含5％FCS的MEM培养液中培养过夜。

(2)用不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS洗涤细胞两次，然后用含1mM EDTA 的HBSS缓冲液37℃消化细胞10到20分钟。

(3)将消化好的细胞吹起，800rpm离心10分钟收集细胞。将细胞用含有1％BSA的HBSS洗涤两次，并重悬于1％BSA/HBSS中，将细胞通过18-gauge针头，制成单细胞悬液(5×10⁵cells/ml)。

(4)将细胞悬液接种在24孔板中(0.5ml/孔)，24孔培养板事先用2％BSA/HBSS包被。在37℃摇床上孵育3小时。加入的CaCl₂和EGTA终浓度均为1mM。

(5)每孔加入0.5ml 5％的戊二醛终止反应。镜检。

(6)至少三个细胞聚集在一起作为聚集的细胞，计算单细胞比率％单细胞＝[1-(N₀-N_t)/N₀]×100。其中N₀为总细胞数，N_t为聚集在一起的细胞数。

实验结果如20所示，上图显示加入抗体CC4后单细胞比率明显降低，且呈现浓度依赖，说明CC4抗体能够抑制肿瘤细胞相互聚集和粘附。下图显示，假如EGTA或者Ca²⁺均不会影响CC4抗体的作用，说明CC4抗体靶向的CEA蛋白介导的细胞-细胞相互粘附是Ca²⁺非依赖的。

由于CC4抗体的亚型是IgG2a，κ亚型，这一亚型的抗体理论上具有抗体介导的细胞毒活性，即ADCC活性。发明者利用LDH释放的方法研究了CC4抗体介导的免疫细胞对肿瘤细胞杀伤活性。具体方法如试剂盒(CytoTox-ONE^TM Homogeneous Membrane Integrity Assay，Promega，货号G7890)中所介绍。效应细胞选择BALB/c小鼠的脾脏细胞，用注射器活塞磨碎后，用红细胞裂解液[144mM NH₄Cl，1mMNaHCO3，1mMEDAT(pH8.0)]破碎红细胞，重悬于PBS中即制得脾细胞悬液。在96孔板中接种5000个LS 174T或A375细胞(ATCC)(靶细胞)培养过夜，加入不同浓度抗体CC4及5×10⁵个小鼠脾细胞(E：T＝100)，37℃杀伤4小时。用前述试剂盒测定释放的LDH，计算杀伤率。

杀伤率由以下公式计算：

％细胞毒性＝(Exp-T.spon.-Effe.spon.)/(Tmax.-T.spon)

Exp表示的实验组读值，T.spon表示的是只有靶细胞的对照组读值，Effe.spon表示的是只有效应细胞的对照组读值，Tmax表示的是将靶细胞裂解后得到的全细胞LDH最大释放组读值。

实验结果如图21所示，CC4能够对表达CEA的LS 174T细胞引起较强的ADCC反应，而不对CC4不结合的A375细胞引起特异性杀伤。而且ADCC的效果是随着CC4抗体浓度的增加而变强的。此项实验证明了CC4能够引起抗体介导的特异性免疫反应，从而部分解释了在裸鼠模型上的抑瘤活性。

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SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院生物物理研究所

<120>抗人CEA的单克隆抗体CC4，包含其的组合物，及其用途

<130>IB085940

<160>62

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>702

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile

100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu

325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr

340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser

385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp

405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser

435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile

450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val

485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro

500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln

515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser

530 535 540

Pro Arg Leu Glu Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn

545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser

565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly

580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly

595 600 605

Ala Asu Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln

610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

625 630 635 640

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

660 665 670

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile

690 695 700

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Gln His

20

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile

1 5

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Ala Thr Ser Tyr Gly Asn Ser Pro Met Asp Tyr

1 5 10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Glu Ser Val Asp Thr Tyr Ala Val Ser Phe

1 5 10

<210>7

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Thr Ala Ser

1

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr

1 5

<210>9

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Asp Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Gln Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser Tyr Gly Asn Ser Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210>10

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr

20 25 30

Ala Val Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Lys Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gln Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210>11

<211>2109

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120

acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180

catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240

ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300

atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360

accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540

aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600

actctattca atgtcacaag aaatgactca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660

gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720

accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780

gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840

acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900

gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960

gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020

gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080

cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140

ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200

gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260

tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320

tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380

gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440

aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500

cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560

ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620

ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680

gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740

cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800

ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860

ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920

tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980

gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040

cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100

ctgatatag 2109

<210>12

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aaatatgcgg ccgcatggag tctccctcgg ccc 33

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

cccaagcttg gctgctatat cagagcaac 29

<210>14

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<400>14

Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser

20 25 30

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr

35 40 45

Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg

50 55 60

Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln

65 70 75 80

Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys

100 105 110

Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys

115 120

<210>15

<211>135

<212>PRT

<213>人工序列

<400>15

Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser

1 5 10 15

Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu

20 25 30

Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro

35 40 45

Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu

50 55 60

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln

65 70 75 80

Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu

85 90 95

Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg

100 105 110

Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro

115 120 125

Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val

130 135

<210>16

<211>126

<212>PRT

<213>人工序列

<400>16

Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu

1 5 10 15

Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala

20 25 30

Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe

35 40 45

Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn

50 55 60

Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro Pro Lys Pro

85 90 95

Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala Val

100 105 110

Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr Leu

115 120 125

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

catgccatgg ctaagctcac tattgaatcc ac 32

<210>18

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cccaagcttt tatttggagt tgttgctgga ga 32

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

catgccatgg ctcgggtata cccggagctg c 31

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

cccaagcttt tagacaaacc aagagtactg tg 32

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

catgccatgg ctatcctgaa tgtcctctat gg 32

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cccaagcttt tacaggtagg ttgtgttctg aa 32

<210>23

<211>232

<212>PRT

<213>人工序列

<400>23

Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Gln His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val

20 25 30

Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala

35 40 45

Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala

50 55 60

Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr

65 70 75 80

Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln

85 90 95

Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn

100 105 110

Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro

115 120 125

Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu

130 135 140

Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr

145 150 155 160

Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr

165 170 175

Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val

180 185 190

Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr

195 200 205

Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro

210 215 220

Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val

225 230

<210>24

<211>212

<212>PRT

<213>人工序列

<400>24

Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg

1 5 10 15

Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro

20 25 30

Ala Tyr Ser Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile

35 40 45

Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile

50 55 60

Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr

65 70 75 80

Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val

85 90 95

Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp

100 105 110

Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro

115 120 125

Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val

130 135 140

Thr Arg Asn Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val

145 150 155 160

Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro

165 170 175

Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu

180 185 190

Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr

195 200 205

Ser Trp Phe Val

210

<210>25

<211>194

<212>PRT

<213>人工序列

<400>25

Ile Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn

20 25 30

Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser

35 40 45

Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu

50 55 60

Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp

65 70 75 80

Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr

85 90 95

Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu

100 105 110

Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg

115 120 125

Asn Asp Ser Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala

130 135 140

Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala

145 150 155 160

Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu

165 170 175

Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp

180 185 190

Phe Val

<210>26

<211>173

<212>PRT

<213>人工序列

<400>26

Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp

1 5 10 15

Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu

20 25 30

Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala

50 55 60

Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val

65 70 75 80

Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly

85 90 95

Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ser Ala Ser

100 105 110

Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser

115 120 125

Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro

130 135 140

Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

145 150 155 160

Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val

165 170

<210>27

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

catgccatgg ctccgttcaa tgtcgcagag gr 32

<210>28

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

catgccatgg ctctttttgg ctacagctgg t 31

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

catgccatgg ctataggata tgtaatagga ac 32

<210>30

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

catgccatgg ctatataccc caatgcatcc c 31

<210>31

<211>682

<212>PRT

<213>人工序列

<400>31

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr

35 40 45

Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile Gly Tyr Val Ile

50 55 60

Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg Glu Ile

65 70 75 80

Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp

85 90 95

Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu

100 105 110

Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser

115 120 125

Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala

130 135 140

Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val

145 150 155 160

Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly

165 170 175

Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ser Ala Ser

180 185 190

Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser

195 200 205

Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro

210 215 220

Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

225 230 235 240

Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr

245 250 255

Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn

260 265 270

Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu

275 280 285

Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Glu Pro Pro Lys

290 295 300

Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu Asp Ala

305 310 315 320

Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp

325 330 335

Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser

340 345 350

Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Val

355 360 365

Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp His Ser

370 375 380

Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro Thr Ile

385 390 395 400

Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser

405 410 415

Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asp

420 425 430

Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile Ser Asn Ile Thr

435 440 445

Glu Lys Asn Ser Gly Leu Ty rThr Cys Gln Ala Asn Asn Ser Ala Ser

450 455 460

Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala Glu Leu

465 470 475 480

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

485 490 495

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr

500 505 510

Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

515 520 525

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

530 535 540

Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn

545 550 555 560

Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp Thr Pro

565 570 575

Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn

580 585 590

Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg

595 600 605

Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys

610 615 620

Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu

625 630 635 640

Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala

645 650 655

Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr Val Gly Ile Met

660 665 670

Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile

675 680

<210>32

<211>2049

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120

acgctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 180

ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 240

atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 300

accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 360

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 420

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 480

aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 540

actctattca atgtcacaag aaatgactca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 600

gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 660

accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 720

gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 780

acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 840

gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 900

gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 960

gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1020

cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1080

ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1140

gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1200

tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1260

tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1320

gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1380

aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1440

cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1500

ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1560

ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1620

gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1680

cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1740

ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1800

ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1860

tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1920

gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 1980

cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2040

ctgatatag 2049

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

ccggaattca tggagtctcc ctcggccc 28

<210>34

<211>28

<211>DNA

<213>人工序列

<400>34

gccaaaaagc gtggattcaa tagtgagc 28

<210>35

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

tgaatccacg ctttttggct acagctggt 29

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

ggaagatctg actttatgac gtg 23

<210>37

<211>1407

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

atggggcacc tctcagcccc acttcacaga gtgcgtgtac cctggcaggg gcttctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg cccagctcac tactgaatcc 120

atgccattca atgttgcaga ggggaaggag gttcttctcc ttgtccacaa tctgccccag 180

caactttttg gctacagctg gtacaaaggg gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattgta 240

ggatatgcaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg caaacagcgg tcgagagaca 300

atatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctac 360

accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggaca gttccatgta 420

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccctgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggaca caacctacct gtggtggata 540

aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600

actctactca gtgtcacaag gaatgacaca ggaccctatg agtgtgaaat acagaaccca 660

gtgagtgcga accgcagtga cccagtcacc ttgaatgtca cctatggccc ggacaccccc 720

accatttccc cttcagacac ctattaccgt ccaggggcaa acctcagcct ctcctgctat 780

gcagcctcta acccacctgc acagtactcc tggcttatca atggaacatt ccagcaaagc 840

acacaagagc tctttatccc taacatcact gtgaataata gtggatccta tacctgccac 900

gccaataatt cagtcactgg ctgcaacagg accacagtca agacgatcat agtcactgag 960

ctaagtccag tagtagcaaa gccccaaatc aaagccagca agaccacagt cacaggagat 1020

aaggactctg tgaacctgac ctgctccaca aatgacactg gaatctccat ccgttggttc 1080

ttcaaaaacc agagtctccc gtcctcggag aggatgaagc tgtcccaggg caacaccacc 1140

ctcagcataa accctgtcaa gagggaggat gctgggacgt attggtgtga ggtcttcaac 1200

ccaatcagta agaaccaaag cgaccccatc atgctgaacg taaactataa tgctctacca 1260

caagaaaatg gcctctcacc tggggccatt gctggcattg tgattggagt agtggccctg 1320

gttgctctga tagcagtagc cctggcatgt tttctgcatt tcgggaagac cggcaggacc 1380

actccaatga cccacctaac aagatga 1407

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

ccggaattca tggggcacct ctcagccc 28

<210>39

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

cccaagcttg gtcttgttag gtgggtcatt 30

<210>40

<211>448

<212>PRT

<213>人工序列

<400>40

Met Gly His Leu Ser Ala Pro Leu His Arg Val Arg Val Pro Trp Gln

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr

35 40 45

Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr Ala Ile

50 55 60

Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg Glu Thr

65 70 75 80

Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln Asn Asp

85 90 95

Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu

100 105 110

Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser

115 120 125

Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala

130 135 140

Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Ile

145 150 155 160

Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly

165 170 175

Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr Gly Pro

180 185 190

Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro

195 200 205

Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile Ser Pro

210 215 220

Ser Asp Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ser Cys Tyr

225 230 235 240

Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asn Gly Thr

245 250 255

Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn

260 265 270

Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys His Ala Asn Asn Ser Val Thr Gly Cys

275 280 285

Asn Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Ile Val Thr Glu Leu Ser Pro Val

290 295 300

Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr Gly Asp

305 310 315 320

Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly Ile Ser

325 330 335

Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu Arg Met

340 345 350

Lys Leu Ser Gln Gly Asn Thr Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val Lys Arg

355 360 365

Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile Ser Lys

370 375 380

Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala Leu Pro

385 390 395 400

Gln Glu Asn Gly Leu Ser Pro Gly Ala Ile Ala Gly Ile Val Ile Gly

405 410 415

Val Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Leu Ala Cys Phe Leu

420 425 430

His Phe Gly Lys Thr Gly Arg Thr Thr Pro Met Thr His Leu Thr Arg

435 440 445

<210>41

<211>1347

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

atggggcacc tctcagcccc acttcacaga gtgcgtgtac cctggcaggg gcttctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg cccagctcac tactgaatcc 120

atgctttttg gctacagctg gtacaaaggg gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattgta 180

ggatatgcaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg caaacagcgg tcgagagaca 240

atatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctac 300

accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggaca gttccatgta 360

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccctgt ggaggacaag 420

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggaca caacctacct gtggtggata 480

aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 540

actctactca gtgtcacaag gaatgacaca ggaccctatg agtgtgaaat acagaaccca 600

gtgagtgcga accgcagtga cccagtcacc ttgaatgtca cctatggccc ggacaccccc 660

accatttccc cttcagacac ctattaccgt ccaggggcaa acctcagcct ctcctgctat 720

gcagcctcta acccacctgc acagtactcc tggcttatca atggaacatt ccagcaaagc 780

acacaagagc tctttatccc taacatcact gtgaataata gtggatccta tacctgccac 840

gccaataact cagtcactgg ctgcaacagg accacagtca agacgatcat agtcactgag 900

ctaagtccag tagtagcaaa gccccaaatc aaagccagca agaccacagt cacaggagat 960

aaggactctg tgaacctgac ctgctccaca aatgacactg gaatctccat ccgttggttc 1020

ttcaaaaacc agagtctccc gtcctcggag aggatgaagc tgtcccaggg caacaccacc 1080

ctcagcataa accctgtcaa gagggaggat gctgggacgt attggtgtga ggtcttcaac 1140

ccaatcagta agaaccaaag cgaccccatc atgctgaacg taaactataa tgctctacca 1200

caagaaaatg gcctctcacc tggggccatt gctggcattg tgattggagt agtggccctg 1260

gttgctctga tagcagtagc cctggcatgt tttctgcatt tcgggaagac cggcaggacc 1320

actccaatga cccacctaac aagatga 1347

<210>42

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

ccggaattca tggggcacct ctcagcc 27

<210>43

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

cgcggatcca ctattattca ca 22

<210>44

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

tgaatccatg ctttttggct acagctggt 29

<210>45

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

gccaaaaagc atggattcag tagtgagc 28

<210>46

<211>468

<212>PRT

<213>人工序列

<400>46

Met Gly His Leu Ser Ala Pro Leu His Arg Val Arg Val Pro Trp Gln

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val

65 70 75 80

Gly Tyr Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val

100 105 110

Thr Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn

210 215 220

Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Ala Asn Leu Ser

245 250 255

Leu Ser Cys Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu

260 265 270

Ile Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys His Ala Asn Asn Ser

290 295 300

Val Thr Gly Cys Asn Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Ile Val Thr Glu

305 310 315 320

Leu Ser Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr

325 330 335

Val Thr Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp

340 345 350

Thr Gly Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser

355 360 365

Ser Glu Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Thr Thr Leu Ser Ile Asn

370 375 380

Pro Val Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn

385 390 395 400

Pro Ile Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr

405 410 415

Asn Ala Leu Pro Gln Glu Asn Gly Leu Ser Pro Gly Ala Ile Ala Gly

420 425 430

Ile Val Ile Gly Val Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Leu

435 440 445

Ala Cys Phe Leu His Phe Gly Lys Thr Gly Arg Thr Thr Pro Met Thr

450 455 460

His Leu Thr Arg

465

<210>47

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>47

Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Gln Gln

20

<210>48

<211>1035

<212>DNA

<213>人工序列

<400>48

atgggacccc cctcagcccc tccctgcaga ttgcatgtcc cctggaagga ggtcctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaaccca cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120

acgccattca atgtcgcaga ggggaaggag gttcttctac tcgcccacaa cctgccccag 180

aatcgtattg gttacagctg gtacaaaggc gaaagagtgg atggcaacag tctaattgta 240

ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagaca 300

ctatacccca atgcatccct gctgatccag aacgtcaccc agaatgacac aggattctat 360

accctacaag tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caaccggaca gttccatgta 420

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccccgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag gttcagaaca caacctacct gtggtgggta 540

aatggtcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa catgaccctc 600

actctactca gcgtcaaaag gaacgatgca ggatcctatg aatgtgaaat acagaaccca 660

gcgagtgcca accgcagtga cccagtcacc ctgaatgtcc tctatggccc agatggcccc 720

accatttccc cctcaaaggc caattaccgt ccaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780

gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttatca atgggacgtt ccagcaatcc 840

acacaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gcggatccta tatgtgccaa 900

gcccataact cagccactgg cctcaatagg accacagtca cgatgatcac agtctctgga 960

agtgctcctg tcctctcagc tgtggccacc gtcggcatca cgattggagt gctggccagg 1020

gtcgctctga tatag 1035

<210>49

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49

ccggaattca tgggaccccc ctcagcccct 30

<210>50

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50

cccaagcttc tatatcagag ccaccctggc 30

<210>51

<211>1050

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51

atggggccca tctcagcccc ttcctgcaga tggcgcatcc cctggcaggg gctcctgctc 60

acagcctcac ttttcacctt ctggaacccg cccaccactg ctcagctcac tattgaagct 120

gtgccatcca atgctgcaga ggggaaggag gttcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180

gaccctcgtg gctacaactg gtacaaaggg gaaacagtgg atgccaaccg tcgaattata 240

ggatatgtaa tatcaaatca acagattacc ccagggcctg catacagcaa tcgagagaca 300

atatacccca atgcatccct gctgatgcgg aacgtcacca gaaatgacac aggatcctac 360

accctacaag tcataaagct aaatcttatg agtgaagaag taactggcca gttcagcgta 420

catccggaga ctcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccccgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcagaaca caacctacct gtggtgggta 540

aatggtcaga gtctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600

actctactca gtgtcacaag gaatgacgta ggaccctatg aatgtgaaat acagaaccca 660

gcgagtgcaa acttcagtga cccagtcacc ctgaatgtcc tctatggccc agatgccccc 720

accatttccc cttcagacac ctattaccat gcaggggtaa atctcaacct ctcctgccat 780

gcggcctcta atccaccctc acagtattct tggtctgtca atggcacatt ccagcaatac 840

acacaaaagc tctttatccc caacatcact acaaagaaca gcggatccta tgcctgccac 900

accactaact cagccactgg ccgcaacagg accacagtca ggatgatcac agtctctgat 960

gctttagtac aaggaagttc tcctggcctc tcagctagag ccactgtcag catcatgatt 1020

ggagtactgg ccagggtggc tctgatatag 1050

<210>52

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>52

ccggaattcc gcaggcagca gagaccatg 29

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>53

cccaagctta caccagagct actatatcag 30

<210>54

<211>344

<212>PRT

<213>人工序列

<400>54

Met Gly Pro Pro Ser Ala Pro Pro Cys Arg Leu His Val Pro Trp Lys

1 5 10 15

Glu Val Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn Leu Pro Gln Asn Arg Ile Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Ser Leu Ile Val

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val

100 105 110

Thr Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Val Gln Asn Thr Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Met Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Lys Arg Asn

195 200 205

Asp Ala Gly Ser Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn

210 215 220

Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Gly Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Ser Lys Ala Asn Tyr Arg Pro Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Ile Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Ala Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Met Ile Thr Val Ser Gly

305 310 315 320

Ser Ala Pro Val Leu Ser Ala Val Ala Thr Val Gly Ile Thr Ile Gly

325 330 335

Val Leu Ala Arg Val Ala Leu Ile

340

<210>55

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>55

Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Gln Asn

20

<210>56

<211>349

<212>PRT

<213>人工序列

<400>56

Met Gly Pro Ile Ser Ala Pro Ser Cys Arg Trp Arg Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Gln Leu Thr Ile Glu Ala Val Pro Ser Asn Ala Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asp Pro Arg Gly

50 55 60

Tyr Asn Trp Tyr Lys Gly Glu Thr Val Asp Ala Asn Arg Arg Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Ser Asn Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Asn Arg Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Met Arg Asn Val

100 105 110

Thr Arg Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Leu Asn

115 120 125

Leu Met Ser Glu Glu Val Thr Gly Gln Phe Ser Val His Pro Glu Thr

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asn Thr Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn

210 215 220

Phe Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr His Ala Gly Val Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ser Gln Tyr Ser Trp Ser

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Tyr Thr Gln Lys Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Thr Lys Asn Ser Gly Ser Tyr Ala Cys His Thr Thr Asn Ser

290 295 300

Ala Thr Gly Arg Asn Arg Thr Thr Val Arg Met Ile Thr Val Ser Asp

305 310 315 320

Ala Leu Val Gln Gly Ser Ser Pro Gly Leu Ser Ala Arg Ala Thr Val

325 330 335

Ser Ile Met Ile Gly Val Leu Ala Arg Val Ala Leu Ile

340 345

<210>57

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>57

Pro Ser Asn Ala Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Gln Asp

20

<210>58

<211>1566

<212>DNA

<213>人工序列

<400>58

atggagctgg cctcagcaca tctccacaaa gggcaggttc cctggggagg actactgctc 60

acagcctcac ttttagcctc ctggagccct gccaccactg ctgaagtcac cattgaggct 120

gtgccgcccc aggttgctga agacaacaat gttcttctac ttgttcacaa tctgcccctg 180

gcgcttggag cctttgcctg gtacaaggga aacactacgg ctatagacaa agaaattgca 240

cgatttgtac caaatagtaa tatgaatttc acggggcaag catacagcgg cagagagata 300

atatacagca atggatccct gctcttccaa atgatcacca tgaaggatat gggagtctac 360

acactagata tgacagatga aaactatcgt cgtactcagg cgactgtgcg atttcatgta 420

caccccatat tattaaagcc caacatcaca agcaacaact ccaatcccgt ggagggtgac 480

gactccgtat cattaacctg tgactcttac actgaccctg ataatataaa ctacctgtgg 540

agcagaaatg gtgaaagcct ttcagaaggt gacaggctga agctgtctga gggcaacagg 600

actctcactt tactcaatgt cacgaggaat gacacaggac cctatgtgtg tgaaacccgg 660

aatccagtga gtgtcaaccg aagtgaccca ttcagcctga acattatcta tggtccggac 720

accccgatta tatccccctc agatatttat ttgcatccag ggtcaaacct caacctctcc 780

tgccatgcag cctctaaccc acctgcacag tacttttggc ttatcaatga gaagccccat 840

gcatcctccc aagagctctt tatccccaac atcactacta ataatagcgg aacctatacc 900

tgcttcgtca ataactctgt cactggcctc agtaggacca cagtcaagaa cattacagtc 960

cttgagccag tgactcagcc cttcctccaa gtcaccaaca ccacagtcaa agaactagac 1020

tctgtgaccc tgacctgctt gtcgaatgac attggagcca acatccagtg gctcttcaat 1080

agccagagtc ttcagctcac agagagaatg acactctccc agaacaacag catcctcaga 1140

atagacccta ttaagaggga agatgccggc gagtatcagt gtgaaatctc gaatccagtc 1200

agcgtcagga ggagcaactc aatcaagctg gacataatat ttgacccaac acaaggaggc 1260

ctctcagatg gcgccattgc tggcatcgtg attggagttg tggctggggt ggctctaata 1320

gcagggctgg catatttcct ctattccagg aagtctggcg ggggaagtga ccagcgagat 1380

ctcacagagc acaaaccctc agcctccaac cacaatctgg ctccttctga caactctcct 1440

aacaaggtgg atgacgtcgc atacactgtc ctgaacttca attcccagca acccaaccgg 1500

ccaacttcag ccccttcttc tccaagagcc acagaaacag tttattcaga agtaaaaaag 1560

aagtga 1566

<210>59

<211>521

<212>PRT

<213>人工序列

<400>59

Met Glu Leu Ala Ser Ala His Leu His Lys Gly Gln Val Pro Trp Gly

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Ala Ser Trp Ser Pro Ala Thr

20 25 30

Thr Ala Glu Val Thr Ile Glu Ala Val Pro Pro Gln Val Ala Glu Asp

35 40 45

Asn Asn Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ala

50 55 60

Phe Ala Trp Tyr Lys Gly Asn Thr Thr Ala Ile Asp Lys Glu Ile Ala

65 70 75 80

Arg Phe Val Pro Asn Ser Asn Met Asn Phe Thr Gly Gln Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Ser Asn Gly Ser Leu Leu Phe Gln Met Ile

100 105 110

Thr Met Lys Asp Met Gly Val Tyr Thr Leu Asp Met Thr Asp Glu Asn

115 120 125

Tyr Arg Arg Thr Gln Ala Thr Val Arg Phe His Val His Pro Ile Leu

130 135 140

Leu Lys Pro Asn Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Gly Asp

145 150 155 160

Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Asp Ser Tyr Thr Asp Pro Asp Asn Ile

165 170 175

Asn Tyr Leu Trp Ser Arg Asn Gly Glu Ser Leu Ser Glu Gly Asp Arg

180 185 190

Leu Lys Leu Ser Glu Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Asn Val Thr

195 200 205

Arg Asn Asp Thr Gly Pro Tyr Val Cys Glu Thr Arg Asn Pro Val Ser

210 215 220

Val Asn Arg Ser Asp Pro Phe Ser Leu Asn Ile Ile Tyr Gly Pro Asp

225 230 235 240

Thr Pro Ile Ile Ser Pro Ser Asp Ile Tyr Leu His Pro Gly Ser Asn

245 250 255

Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Phe

260 265 270

Trp Leu Ile Asn Glu Lys Pro His Ala Ser Ser Gln Glu Leu Phe Ile

275 280 285

Pro Asn Ile Thr Thr Asn Asn Ser Gly Thr Tyr Thr Cys Phe Val Asn

290 295 300

Asn Ser Val Thr Gly Leu Ser Arg Thr Thr Val Lys Asn Ile Thr Val

305 310 315 320

Leu Glu Pro Val Thr Gln Pro Phe Leu Gln Val Thr Asn Thr Thr Val

325 330 335

Lys Glu Leu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Leu Ser Asn Asp Ile Gly

340 345 350

Ala Asn Ile Gln Trp Leu Phe Asn Ser Gln Ser Leu Gln Leu Thr Glu

355 360 365

Arg Met Thr Leu Ser Gln Asn Asn Ser Ile Leu Arg Ile Asp Pro Ile

370 375 380

Lys Arg Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Gln Cys Glu Ile Ser Asn Pro Val

385 390 395 400

Ser Val Arg Arg Ser Asn Ser Ile Lys Leu Asp Ile Ile Phe Asp Pro

405 410 415

Thr Gln Gly Gly Leu Ser Asp Gly Ala Ile Ala Gly Ile Val Ile Gly

420 425 430

Val Val Ala Gly Val Ala Leu Ile Ala Gly Leu Ala Tyr Phe Leu Tyr

435 440 445

Ser Arg Lys Ser Gly Gly Gly Ser Asp Gln Arg Asp Leu Thr Glu His

450 455 460

Lys Pro Ser Ala Ser Asn His Asn Leu Ala Pro Ser Asp Asn Ser Pro

465 470 475 480

Asn Lys Val Asp Asp Val Ala Tyr Thr Val Leu Asn Phe Asn Ser Gln

485 490 495

Gln Pro Asn Arg Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser Pro Arg Ala Thr Glu

500 505 510

Thr Val Tyr Ser Glu Val Lys Lys Lys

515 520

<210>60

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>60

Pro Pro Gln Val Ala Glu Asp Asn Asn Val Leu Leu Leu Val His Asn

1 5 10 15

Leu Pro Leu Ala

20

<210>61

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>61

Ala Glu Asp Asn Asn Val Leu Leu Leu

1 5

<210>62

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>62

Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu

1 5

Claims

1.人癌胚抗原家族蛋白的抗原表位，其氨基酸序列选自由SEQ IDNO：2，47，55和57共同含有的保守的SEQ ID NO：62的氨基酸序列。

2.人癌胚抗原家族蛋白的抗原表位，其氨基酸序列选自SEQ ID NO：2，47，55或57表示的序列。

3.一种抗人癌胚抗原家族蛋白的抗体，其特征在于能够特异性识别权利要求1或2的抗原表位。

4.权利要求3的抗体，其特征在于所述抗体包括抗体重链和抗体轻链，

其中所述抗体重链包括作为CDR的由SEQ ID NO：3氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的CDR3，

所述抗体轻链包括作为CDR的由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的CDR3。

5.权利要求4的抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区由SEQ IDNO：9的氨基酸序列组成，轻链可变区由SEQ ID NO：10的氮基酸序列组成。

6.权利要求3-5任一项的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述肿瘤是胃癌，结肠癌，肝癌，子宫内膜癌，肺癌，食管癌，卵巢癌或乳腺癌。

7.权利要求3-5任一项的抗体在制备用于靶向癌胚抗原的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用，其中所述肿瘤是胃癌，结肠癌，肝癌，子宫内膜癌，肺癌，食管癌，卵巢癌或乳腺癌。

8.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求3-5任一项的抗体和药用载体，其中所述肿瘤是胃癌，结肠癌，肝癌，子宫内膜癌，肺癌，食管癌，卵巢癌或乳腺癌。

9.分泌抗人癌胚抗原抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC NO：2504。

10.编码下面多肽的核酸，

a)抗体重链，其选自权利要求4或5所定义的抗体重链；或

b)抗体轻链，其选自权利要求4或5所定义的抗体轻链。

11.一种包括按照权利要求10的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

12.一种原核或真核宿主细胞，其包括按照权利要求11的载体。

13.一种制备结合人癌胚抗原家族蛋白的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达按照权利要求11的编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。

14.权利要求3-5任一项的抗体在制备用于检测人癌胚抗原家族蛋白的试剂中的应用。

15.权利要求3-5任一项的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物、抗肿瘤药物、毒素、放射活性剂偶联的产物，其中所述生物标记物是生物素、HRP、碱性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5或纳米磁珠，所述抗肿瘤药物是卡铂、顺铂、五氟尿嘧啶，所述毒素是蓖麻毒素、淋巴毒素，所述放射活性剂是¹³¹碘、⁹⁰钇、放射性铜。