[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

EA031043B1 - Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo - Google Patents

Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo Download PDF

Info

Publication number
EA031043B1
EA031043B1 EA201291260A EA201291260A EA031043B1 EA 031043 B1 EA031043 B1 EA 031043B1 EA 201291260 A EA201291260 A EA 201291260A EA 201291260 A EA201291260 A EA 201291260A EA 031043 B1 EA031043 B1 EA 031043B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
human
tumor
htrop
ser
Prior art date
Application number
EA201291260A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201291260A1 (ru
Inventor
Кодзи Накамура
Кентаро Окамура
Маки Тамура
Хироюки Янаи
Тору Канке
Original Assignee
Ливтех, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ливтех, Инк. filed Critical Ливтех, Инк.
Publication of EA201291260A1 publication Critical patent/EA201291260A1/ru
Publication of EA031043B1 publication Critical patent/EA031043B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитело, которое специфично связывается с TROP-2 человека и обладает противоопухолевой активностью in vivo, a также его антигенсвязывающий фрагмент; гибридома, которая продуцирует упомянутое выше антитело; конъюгат упомянутого выше антитела и лекарственного средства; фармацевтическая композиция для лечения опухоли и средство для диагностики опухоли, содержащие антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат по настоящему изобретению. Изобретение позволяет получить антитело против TROP-2 человека, которое обладает противоопухолевой активностью.

Description

031043 В1
031043 Bl
Область техники
Изобретение относится к антителу против TROP-2 человека, обладающему противоопухолевой активностью, и, в частности, к антителу против TROP-2 человека, обладающему противоопухолевой активностью in vivo. Кроме того, настоящее изобретение относится к гибридоме, которая продуцирует указанное выше антитело, и к применению указанного выше антитела.
Уровень техники
TROP-2 человека (Tacstd2, GA733-1 и EGP-1) (далее также обозначаемый как hTROP-2) представляет собой однократно проходящий через мембрану белок клеточной мембраны типа 1, состоящий из 323 аминокислотных остатков (см. SEQ ID NO: 2), и известно, что этот белок сверхэкспрессируется в различных типах карцином эпидермальных клеток. Давно было сделано предположение о наличии белка клеточной мембраны, связанного с иммунологической устойчивостью, который обычно экспрессируется как в трофобластах человека, так и в злокачественных опухолях (непатентный документ 1). Была идентифицирована антигенная молекула, распознаваемая моноклональными антителами мыши (162-25.3, 162-46.2), реагирующими с белком клеточной мембраны клеточной линии хориокарциномы человека BeWo. Эта антигенная молекула рассматривалась в качестве одной из молекул, экспрессируемых в трофобластах человека, и она была названа Trop-2 (непатентый документ 2). После этого та же молекула была обнаружена другими исследователями. Таким образом, опухолевый антиген, распознаваемый моноклональным антителом мыши GA733, полученным иммунизацией клетками рака желудка SW948, был назван GA733-1 (непатентный документ 3), и гликопротеин эпителия, распознаваемый моноклональным антителом мыши RS7-3G11, полученным иммунизацией клетками немелкоклеточного рака легкого, был назван антигеном эпителия/карциномы EGP-1 (непатентный документ 4). В 1995 году клонировали ген Trop-2, и в результате было подтверждено, что эти молекулы являются одинаковыми (непатентный документ 5). Более того, было установлено, что эта молекула имеет функцию усиления внутриклеточных сигналов кальция в злокачественных клетках (непатентный документ 6), и, таким образом, также ее называют связанным с опухолью трансдуктором сигнала кальция 2 (TACSTD2).
Ген hTROP-2 картирован на хромосоме 1р32, и он образует семейство генов TACSTD вместе с GA733-2, имеющим гомологию с ним приблизительно 50% (который известен как TACSTD1, эпителиальный гликопротеин EGP-2, ЕрСАМ или Trop-1) (непатентный документ 7). Белок hTROP-2 (323 аминокислотных остатка; SEQ ID NO: 2) имеет молекулярную массу приблизительно 36 кДальтон, и этот белок состоит из гидрофильного сигнального пептида (аминокислоты 1-26), внеклеточного домена (аминокислоты 27-274), трансмембранного домена (аминокислоты 275-297) и внутриклеточного домена (аминокислоты 298-323). Внеклеточный домен имеет четыре гетерогенных N-связанных участка гликозилирования и его кажущаяся молекулярная масса увеличивается на от 11 до 13 кДальтон вследствие добавления цепей Сахаров (непатентный документ 5). Считается, что семейство генов TACSTD имеет характерную последовательность тиреоглобулинового повтора (TY) во внеклеточном домене и связано с пролиферацией, инвазией и метастазированием злокачественных клеток.
До настоящего времени был идентифицирован физиологический лиганд hTROP-2, и его молекулярная функция не установлена. Однако было описано, что hTROP-2 передает сигнал кальция в опухолевых клетках (непатентный документ 6). Кроме того, исходя из тех фактов, что внутриклеточный серии 303 фосфорилируется Ca2+-зависимой протеинкиназой С (непатентный документ 4) и, что hTROP-2 имеет связывающую PIP2 последовательность в его внутриклеточном домене, было предположено, что hTROP-2 имеет функцию передачи сигнала в опухолевых клетках (непатентный документ 8).
В результате диагностических исследований in vitro, таких как иммуногистохимия (IHC) и проточно-цитометрический анализ, была описана сверхэкспрессия hTROP-2 во многих типах происходящих из эпителия карцином, таких как рак желудка, рак легкого, рак толстого кишечника, рак яичника, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени и рак пищевода. Напротив, экспрессия hTROP-2 в нормальных тканях ограничена клетками в эпителиальной области, и уровень экспрессии hTROP-2 в нормальных клетках является более низким, чем в злокачественных клетках. Таким образом, было сделано предположение о связи TROP-2 с образованием опухоли (патентные документы 1-3 и 9).
Более того, в анализе уровня экспрессии hTROP-2, использованного в качестве биомаркера в клинических образцах, было продемонстрировано, что, когда hTROP-2 экспрессируется в высокой степени, что коррелирует со злокачественностью рака толстого кишечника (непатентные документы 10 и 11), рака поджелудочной железы (непатентный документ 12) или рака ротовой полости (непатентный документ 13), возможность метастаза или рецидива такой опухоли является в значительной степени высокой. Более того, в анализе крупномасштабной экспрессии генов с использованием технологии микрочипов кДНК, hTROP-2 был идентифицирован в качестве кластера генов, который сверхэкспрессируется при наиболее высоком уровне в тяжелой папиллярной карциноме яичника, по сравнению с нормальным эпителием яичника (непатентный документ 14).
Более того, в последние годы была продемонстрирована важная роль hTROP-2 в образовании опухоли в моделях с использованием клеток рака толстого кишечника (непатентный документ 15). Поскольку экспрессия hTROP-2 стимулирует независимую от заякоривания пролиферацию опухолевых клеток и
- 1 031043 требуется для образования опухоли и пролиферации злокачественных клеток, подкожно трансплантированных мышам с иммунодефицитом, это показало возможность того, что hTROP-2 может действовать в качестве функционального опухолевого антигена, и его можно использовать в качестве новой терапевтической мишени.
На сегодняшний день описаны исследования, касающиеся противоопухолевых эффектов нескольких антител против hTROP-2. Антитело RS7 (патентный документ 1) исследовали с использованием моделей in vivo, в которых использовали радиоактивно меченные антитела, и была продемонстрирована противоопухолевая активность в моделях с ксенотрансплантатом у мышей nude. Однако не были описаны противоопухолевые эффекты антитела отдельно (голое антитело).
Кроме того, была описана цитотоксичность связанного с цитотоксином моноклонального антитела против hTROP-2 BR110 (патентный документ 2) в отношении клеточных линий злокачественной опухоли человека Н3619, Н2987, MCF-7, H3396 и Н2981 в экспериментах in vitro. Однако не была описана цитотоксичность голого антитела или иммунного конъюгата BR110 in vivo.
В последние годы было описано, что выделенное моноклональное антитело, которое продуцировалось из клеточной линии гибридомы AR47A6.4.2 или AR52A301.5, полученной иммунизацией мышей тканями злокачественной опухоли яичника человека, связывалось с hTROP-2, и что впервые в качестве голого антитела оно проявляло противоопухолевую активность в моделях с ксенотрансплантатом на мышах nude, а также цитотоксичность in vitro (патентные документы 3 и 4). В этих патентных документах упомянутое выше антитело проявляло противоопухолевые эффекты при введении антитела отдельно или в моделях с ксенотрансплантатом на мышах, в которых трансплантировали клеточные линии рака поджелудочной железы BxPC-3 и PL45, клеточную линию рака предстательной железы РС-3, клеточную линию рака молочной железы MCF-7 и клеточную линию рака толстого кишечника Colo205. Терапевтические эффекты антитела проявлялись в моделях, в которых трансплантировали клетки BxPC-3. Исключая это, образование опухоли и пролиферация только частично (приблизительно на 40-60%) подавлялись предупреждающим введением антитела, и для такого подавления образования опухоли и пролиферации было необходимо чрезвычайно большое количество (приблизительно 20 мг/кг) антитела.
Исходя из упомянутых выше предшествующих открытий, было сделано предположение о потенциальном применении антитела против hTROP-2 в качестве противоопухолевого антитела. Однако не все из антител против hTROP-2 проявляют противоопухолевые эффекты при введении антитела отдельно в качестве голых антител in vivo. Антитела проявляют различные функции в отношении hTROP-2, в зависимости от участка связывания, аффинности и профиля моноклонального антитела.
Патентный документ 1: патент США № 6653104.
Патентный документ 2: патент США № 5840854.
Патентный документ 3: патент США № 7420040. Патентный документ 4: патент США № 7420041.
Непатентный документ 1: Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75(4), pp. 1947-1951 (1978). Непатентный документ 2: Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78(8), pp. 5147-5150 (1981). Непатентный документ 3: Linnenbach AJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86(1), pp. 27-31 (1989). Непатентный документ 4: Basu A, et al., Int. J. Cancer, 62(4), pp. 472-479 (1995).
Непатентный документ 5: Fornaro M, et al., Int. J. Cancer, 62(5), pp. 610-618 (1995).
Непатентный документ 6: Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76(5), pp. 671-676 (1998).
Непатентный документ 7: Calabrese G, et al., Cell Genet, 92(1-2), pp. 164-165 (2001).
Непатентный документ 8: El Sewedy T et al., Int. J. Cancer, 75(2), pp. 324-330 (1998).
Непатентный документ 9: Cubas R, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1796(2), pp. 309-314 (2009).
Непатентный документ 10: Ohmachi T et al., Clin. Cancer Res., 12(10), pp. 3057-3063 (2006). Непатентный документ 11: Fang YJ, et al., Int. J. Colorectal Dis., 24(8), pp. 875-884 (2009). Непатентный документ 12: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), pp. 1290-1295 (2008).
Непатентный документ 13: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21 (2), pp. 186-191 (2008).
Непатентный документ 14: Santin AD, et al., Int. J. Cancer, 112(1), pp. 14-25 (2004).
Непатентный документ 15: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), pp. 280-285 (2008).
Сущность изобретения
В связи с указанными выше обстоятельствами, является желательной разработка антитела против hTROP-2 (моноклональное антитело против hTROP-2), имеющего высокую противоопухолевую активность in vivo, и, в частности, антитела против hTROP-2 или сходных с ним, которые обладают противоопухолевым эффектом в качестве голого антитела отдельно in vivo и, кроме того, которые обладают противоопухолевым эффектом в низкой дозе.
С учетом упомянутых выше обстоятельств было осуществлено настоящее изобретение. Настоящее изобретение относится антителу против hTROP-2 (моноклональное антитело против hTROP-2), гибридоме, которая продуцирует антитело, фрагменту антитела, комплексу (иммуноконъюгату) антитела или сходных с ним, и лекарственному средству, фармацевтической композиции для диагностики или лечения опухоли, средству для детекции или диагностики опухоли, и т.п., которые описаны ниже.
(1) Антитело против TROP-2 человека, которое обладает противоопухолевой активностью in vivo.
- 2 031043
Примеры антитела согласно (1) выше включают: антитело, проявляющее активность ингибирования роста опухоли 50% или более в дозировке 5-20 мг/кг массы тела; антитело, частота введения которого для того, чтобы оно проявляло активность ингибирования роста опухоли, составляет не более одного раза в неделю; антитело, проявляющее активность ингибирования роста опухоли 50% или более при однократном введении 10 мг/кг массы тела; антитело, обладающее противоопухолевой активностью в отношении двух или более типов клеточных линий опухоли человека; и антитело, имеющее константу диссоциации (величина Kd) 1,0х10-10 М или менее. В рамках настоящего изобретения опухоль представляет собой опухоль, например, по меньшей мере одного типа, выбранного из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека, и, в частности, рак поджелудочной железы человека. Кроме того, опухоль также включает рецидивирующую злокачественную опухоль и метастазирующую злокачественную опухоль. Более того, опухолевая клеточная линия представляет собой опухоль, например, по меньшей мере двух типов, выбранных из группы, состоящей из клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-59, клеточной линии рака поджелудочной железы человека BxPC-3, клеточной линии рака поджелудочной железы человека KP-3L, клеточной линии рака поджелудочной железы человека КР-2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-1, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-45Н, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-45Р, клеточной линии рака поджелудочной железы человека TCC-PAN2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека SUIT-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека САСО-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480, клеточной линии рака толстого кишечника человека DLD-1, клеточной линии рака толстого кишечника человека НСТ 116, клеточной линии рака молочной железы человека JIMT-1, клеточной линии рака молочной железы человека НСС1143, клеточной линии рака молочной железы человека MCF-7, клеточной линии рака предстательной железы человека DU145 и клеточной линии рака предстательной железы человека РС-3; и, в частности, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-59 и клеточной линии рака поджелудочной железы человека BxPC-3.
Таким антителом является антитело, для которого аминокислотные последовательности CDR 1-3 Vобласти Н-цепи антитела представлены в SEQ ID NO: 66-68, соответственно, и аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области L-цепи антитела представлены в SEQ ID NO: 71-73, соответственно.
Примером антитела согласно (1) выше является моноклональное антитело.
Примером антитела согласно (1) выше является рекомбинантное антитело, и более конкретные примеры включают химерное антитело, гуманизированное антитело и антитело человека.
Настоящее описание, пример описанного выше химерного антитела:
антитело в котором V-область Н-цепи химерного антитела состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65, и/или V-область L-цепи состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70.
(2) Моноклональные антитело против TROP-2 человека, которое продуцируется гибридомой, имеющей номер доступа FERM ВР-11346.
Примером антитела согласно (1) и (2) выше является антитело, которое связывается с участком, с которым связывается моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой, имеющей номер доступа FERM ВР-11346; и антитело, которое связывается с участком, содержащим по меньшей мере одну область (например, любую одну область), выбранную из группы, состоящей из области, состоящей из аминокислот в положениях 43-65, области, состоящей из аминокислот в положениях 152-165, области, состоящей из аминокислот в положениях 171-183, области, состоящей из аминокислот в положениях 109120, области, состоящей из аминокислот в положениях 43-56, и области, состоящей из аминокислот в положениях 193-206, в аминокислотной последовательности TROP-2 человека, представленной в SEQ ID NO: 2.
(3) Фрагмент антитела, происходящий из антитела согласно (1) или (2) выше.
Примером фрагмента антитела согласно (3) выше является: фрагмент антитела, содержащий аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 66-68, и/или аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 71-73, например, фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и/или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70.
(4) Гибридома, которая продуцирует антитело согласно (1) или (2) выше.
(5) Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело против TROP-2 человека, которая имеет номер доступа FERM ВР-11346.
(6) Конъюгат антитело-лекарственное средство, который содержит антитело согласно (1) или (2) выше и вещество, обладающее противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток.
(7) Конъюгат антитело-лекарственное средство, который содержит антитело согласно (3) выше и вещество, обладающее противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток.
Что касается конъюгата согласно (6) и (7) выше, опухоль представляет собой опухоль, например, по меньшей мере одного типа, выбранного из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы чело
- 3 031043 века, и в частности, рак поджелудочной железы человека. Кроме того, опухоль также включает рецидивирующую злокачественную опухоль и метастазирующую злокачественную опухоль.
(8) Фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из антитела согласно (1) и (2) выше, фрагмента антитела согласно (3) выше и конъюгата согласно (6) и (7) выше.
Примером композиции согласно (8) выше является композиция, используемая для лечения опухоли, и, в частности, композиция, которая не вызывает снижения массы тела в качестве побочного эффекта. Другим примером композиции является композиция, используемая для диагностики опухоли. В рамках настоящего изобретения опухоль представляет собой опухоль, например, по меньшей мере одного типа, выбранного из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека, и, в частности, рак поджелудочной железы человека. Кроме того, опухоль также включает рецидивирующую злокачественную опухоль и метастазирующую злокачественную опухоль.
(9) Средство для диагностики опухоли, которое содержит по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из антитела согласно (1) и (2) выше, фрагмента антитела согласно (3) выше и конъюгата согласно (6) и (7) выше.
Что касается диагностического средства согласно (9) выше, опухоль представляет собой, например, по меньшей мере один тип опухоли, выбранный из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека, и, в частности, рак поджелудочной железы человека. Кроме того, опухоль также включает рецидивирующую злокачественную опухоль и метастазирующую злокачественную опухоль.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено измерение аффинности связывания антигена (Kd: константа диссоциации) моноклонального антитела против hTROP-2 (K5-70). Abt: Антитело (общее); Agf: Антиген (свободный).
На фиг. 2 представлена реактивность культурального супернатанта гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело против hTROP-2, в отношении клеток HuH-7 (TROP-2-негативные) и клеток HuH-7-hTROP-2. Закрашенная гистограмма указывает на клетки HuH-7, а незакрашенная гистограмма указывает на клетки HuH-7-hTROP-2.
На фиг. 3 представлена реактивность моноклонального антитела против hTROP-2 в отношении клеточной линии рака поджелудочной железы человека (клетки РК-59), которая эндогенно экспрессирует hTROP-2 на клеточной поверхности. Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с каждым моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 4 представлена реактивность моноклонального антитела против hTROP-2 в отношении клеточной линии рака поджелудочной железы человека (клетки BxPC-3), которая эндогенно экспрессирует hTROP-2 на клеточной поверхности. Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с каждым моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 5 представлена реактивность моноклонального антитела против hTROP-2 (K5-70) в отношении клеточных линий рака поджелудочной железы человека. Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с каждым моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 6 представлена реактивность моноклонального антитела против hTROP-2 (K5-70) в отношении клеточных линий рака толстого кишечника человека (Colo320, CACO2, SW480, DLD1, CW2 и НСТ 116), клеточных линий рака молочной железы человека (JIMT-1 и НСС1143), и клеточных линий рака предстательной железы человека (РС-3 и DU145). Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 7 представлена перекрестная реактивность моноклональных антител против hTROP-2 в отношении TROP-2 мыши. Использовали клетки, полученные путем обеспечения временной экспрессии гена TROP-2 мыши в клетках СНО-К1, и в качестве положительного контрольного антитела использовали антитело Т2-102 (IgG1 мыши), проявляющее перекрестную реактивность с TROP-2 мыши. Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с каждым моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 8 представлена перекрестная реактивность моноклональных антител против hTROP-2 в отношении EpC7AM/TROP-1 человека. Использовали клетки, полученные путем обеспечения временной экспрессии гена EpCAM/TROP-1 человека в клетках СНО-К1, и в качестве положительного контрольного антитела использовали меченное РЕ моноклональное антитело против ЕрСАМ человека (Becton, Dickinson and Company). Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии только с вторич
- 4 031043 ным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеточной линии с каждым моноклональным антителом против hTROP-2.
На фиг. 9 представлена активность ингибирования роста клеток антител против hTROP-2 (Т6-16, Т5-86, К5-70 и К5-107) в отношении клеточной линии рака поджелудочной железы человека (клетки РК59). mIgG указывает на контрольное антитело (IgG мыши), и YY01 указывает на коммерчески доступное антитело против hTROP-2 (Santa Cruz). Белый столбец: 0 мкг/мл; серый столбец: 0,1 мкг/мл; черный столбец: 1 мкг/мл. Уровень активности выражали в качестве отношения к величине в случае, когда антитело не добавляли (0 мкг/мл). Планка погрешности указывает на стандартное отклонение. *Р<0,05, **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 10 представлен анализ зарастания царапины клеточной линии рака поджелудочной железы человека (клетки РК-59) в присутствии антител против hTROP-2 (T6-16 и К5-70).
На фиг. 10А представлены характерные примеры фотографий областей царапин для клеток РК-59. 0 сутки демонстрируют типичный пример сразу после нанесения царапины. Для mIgG (1 сутки) продемонстрирована фотография, полученная через 1 сутки (24 ч) после нанесения царапины, а затем добавления контрольного антитела (IgG мыши, 1 мкг/мл) в среду. Для К5-70 (1 сутки) продемонстрирована фотография, полученная через 1 сутки (24 ч) после нанесения царапины, а затем добавления антитела К5-70 (1 мкг/мл) в среду. Для T6-16 (1 сутки) продемонстрирована фотография, полученная через 1 сутки (24 ч) после нанесения царапины, а затем добавления антитела T6-16 (1 мкг/мл) в среду. Каждая стрелка на каждой фотографии указывает на ширину области царапины.
Фиг. 10В. Площадь области царапины анализировали с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Scion Image), и на основе полученной величины вычисляли величины для различных типов других образцов с использованием группы добавления контрольного mIgG на 0 сутки в качестве стандартной величины, равной 1. *Р <0,05, **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 11 представлен FACS-анализ с использованием маркера стволовых клеток, который проводили в отношении клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-59. На фиг. 11А представлено изображение, иллюстрирующее FACS, демонстрирующий экспрессию ЕрСАМ в клетках РК-59. Закрашенная гистограмма указывает на реакцию клеток только с вторичным антителом (меченное РЕ антитело против IgG мыши), и незакрашенная гистограмма указывает на реакцию клеток с антителом против ЕрСАМ человека (Becton, Dickinson and Company). На фиг. 11B и С представлены изображения, иллюстрирующие FACS, демонстрирующий экспрессию Р-гликопротеина/MCR1 клеток РК-59 (фиг. 11В), или экспрессию ABCG2 в клетках РК-59 (фиг. 11С). Синяя гистограмма показывает реакцию клеток только с вторичным антителом, а красная гистограмма указывает на реакцию клеток с антителом против Р-гликопротеина/MDR1 человека (BD Biosciences Pharmingen) (фиг. 11В), или с антителом против ABCG2 человека (BD Biosciences Pharmingen) (фиг. 11С). На фиг. 11D представлен FACS-анализ, в котором клетки РК-59 подвергали двойному окрашиванию маркерами стволовых клеток рака поджелудочной железы: меченным FITC антителом против CD24 человека (BD Biosciences Pharmingen) и меченным РЕ антителом против CD44 человека (BD Biosciences Pharmingen). Каждое число на фиг. 11D указывает на имеющееся соотношение клеток в каждой фракции.
На фиг. 12 представлена оценка противоопухолевой активности нового клона моноклонального антитела против hTROP-2 K5-70 (IgG2a мыши) в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток РК-59.
На фиг. 12А представлен рост опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши) и группе введения К5-70 (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *Р<0,05, **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 12В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 21 сутки (сутки 21) (последний день эксперимента) в тесте на фиг. 12 А. Числовая величина на каждом графике указывает на среднее значение±стандартное отклонение. **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 13 представлена оценка противоопухолевой активности клона К5-107 (А), клона Т6-16 (В) и клона К5-116-2-1 (С) в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток РК59. Обозначение · указывает на контрольную группу (IgG мыши), и обозначение О указывает на группу введения антитела против hTROP-2. Стрелка на графике указывает на период введения антитела, и пронумерованная величина на каждой графике указывает на среднее значение±стандартное отклонение. *Р<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 14 представлена оценка противоопухолевой активности клона К5-107 (А), клона Т6-16 (В) и клона К5-116-2-1 (С) в отношении ксенотрансплантатов в моделях предупреждения с использованием клеток РК-59. Обозначение · указывает на контрольную группу (IgG мыши), и обозначение О указывает на группу введения антитела против hTROP-2. Стрелка на графике указывает на период введения антитела и пронумерованная величина на каждой графике указывает на среднее значение±стандартное отклонение. *Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 15 представлена оценка противоопухолевой активности клона К5-70 в отношении ксенотрансплантатов в моделях предупреждения и лечения с использованием клеток BxPC-3. На фиг. 15 А
- 5 031043 представлен рост опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши) и в группе введения К5-70 в моделях предупреждения (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 15В представлен рост опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши) и в группе введения К5-70 в моделях лечения (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *Р<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 16 представлена дозозависимая противоопухолевая активность клона К5-70 в отношении ксенотрансплантатов в моделях предупреждения с использованием клеток РК-59. Объем опухоли выражен в качестве среднего значения±стандартное отклонение.
На фиг. 16А представлен рост опухоли с течением времени в контрольной группе и в группах введения К5-70 при различных дозах (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *Р<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента), **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 16В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 17 суток (сутки 17) (последний день эксперимента) в испытании фигуры 16 А. Число на каждом графике указывает на среднее значение±стандартное отклонение. **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 17 представлено схематическое изображение химерного белка TROP-2 человека/мыши. SP: сигнальная последовательность; домен TY: область тироглобулина 1 типа; ТМ: трансмембранная область; С: внутриклеточная область, где закрашенная область представляет собой полипептид, происходящий из hTROP-2, в то время как незакрашенная область представляет собой полипептид, происходящий из TROP-2 мыши. Число в верхнем положении схематического изображения химерного белка указывает на номер аминокислоты белка TROP-2 мыши, а номер в его нижнем положении указывает на номер аминокислоты белка hTROP-2.
На фиг. 18 представлены результаты, полученные путем идентификации связывающей области моноклонального антитела против hTROP-2 с использованием химерного TROP-2 человека/мыши. С использованием клеток НЕК293, которые постоянно экспрессируют либо химерный белок TROP-2-C человека/мыши (hmTROP-2-C), либо химерный белок TROP-2-D мыши/человека (hmTROP-2-D), исследовали реактивность в отношении моноклональных антител против hTROP-2, представленных на фигуре. В качестве отрицательного контроля использовали IgG2b.
На фиг. 19 представлены результаты, полученные путем идентификации связывающей антитело области моноклонального антитела против hTROP-2. Ген hTROP-2 и каждый химерный ген TROP-2 человека/мыши вводили в клетки НЕК293, а затем с использованием клеток, в которых временно экспрессировались гены, проводили FACS-анализ.
На фиг. 19(А) представлены результаты исследования реактивности антител К5-70, К5-107, Т5-86 и К5-116-2-1 в отношении hTROP-2 (верхняя строка), hmTROP-2-A (средняя строка) и hmTROP-2-B (нижняя строка). В качестве отрицательного контроля использовали IgG2b мыши.
На фиг. 19В представлены результаты исследования реактивности антител T6-4 и T6-16 в отношении hTROP-2 (верхняя строка), hmTROP-2-A (средняя строка) и hmTROP-2-B (нижняя строка). В качестве отрицательного контроля использовали IgG2b мыши.
На фиг. 20 представлена экспрессия hTROP-2 в нормальных тканях человека. Наборы нормальных тканей человека подвергали иммунному окрашиванию молоклональным антителом против hTROP-2 клона К5-63-17. (А) кожа, (В) пищевод, (С) почка (кора), (D) почка (мозговое вещество), (Е) поджелудочная железа, (F) предстательная железа, (G) мочевой пузырь, (Н) миндалевидная железа, (I) сердце, (J) печень (увеличение: х200).
На фиг. 21 представлена экспрессия hTROP-2 в злокачественных тканях. Наборы злокачественных тканей человека подвергали иммунному окрашиванию молоклональным антителом против hTROP-2 клона К5-63-17. (А) рак молочной железы, (В) рак легкого, (С) рак пищевода, (D) рак желудка, (Е) рак поджелудочной железы, (F) рак толстого кишечника, (G) рак мочевого пузыря, (Н) рак предстательной железы, (I) рак яичника (увеличение: х100).
На фиг. 22 представлена противоопухолевая активность клона К5-70 при однократном введении в отношении ксенотрансплантатов в моделях предупреждения с использованием клеток РК-59.
На фиг. 22А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения К5-70 (О) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на введение антитела. *P<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента), **P<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 22В представлена нанесенная на график масса каждой мыши в момент времени 28 суток (28 сутки) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 22 А. **P<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 22С представлено образование опухоли с течением времени у каждой мыши в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения К5-70 (О). Стрелка указывает на введение антитела.
На фиг. 23 представлена противоопухолевая активность клона К5-70 в отношении ксенотрансплан
- 6 031043 татов в моделях лечения с использованием клеток рака толстого кишечника человека SW480.
На фиг. 23А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения К5-70 (О) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 23В представлена нанесенная на график масса каждой мыши в момент времени 44 сутки (сутки 44) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 23А. **Р<0,01 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 24 представлена противоопухолевая активность клона К5-116-2-1 в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток SW480.
На фиг. 24А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения Т6-16 (О) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. **Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 24В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 42 сутки (сутки 42) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 24 А. **Р<0,01 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 25 представлена противоопухолевая активность клона T6-16 в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток SW480.
На фиг. 25А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения Т6-16 (о) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *P<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 25В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 42 сутки (сутки 42) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 25А. *Р<0,05 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 26 представлена дозозависимая противоопухолевая активность клона К5-70 в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток SW480.
На фиг. 26А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (IgG мыши ·) и в группе введения К5-70 (0:1 мг/кг, Δ: 5 мг/кг, □: 10 мг/кг) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *P<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 26В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 42 сутки (сутки 42) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 26А. *P<0,05 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 27 представлена противоопухолевая активность клона К5-70 в отношении ксенотранасплантатов в моделях лечения с использованием клеток SW480.
На фиг. 27 А представлена противоопухолевая активность антитела К5-70 при интервалах введения один раз в неделю. Представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (·: IgG мыши) и в группе введения К5-70 (О: 10 мг/кг) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелки-указатели (сутки 10, 17, 24, 31 и 38) указывают на введение антитела К5-70. *P<0,05 согласно tкритерию Стьюдента.
На фиг. 27В представлено образование опухоли с течением времени путем введения антитела К5-70 с интервалами введения один раз в десять суток (: qlOd) или один раз каждые две недели (·: ql4d). Закрашенный круг (Δ) указывает на контрольную группу (IgG мыши, 10 мг/кг) (среднее значение±стандартное отклонение). Закрашенные стрелки-указатели (▼: сутки 9, 19 и 29) и незакрашенные стрелки-указатели (V сутки 9, 23 и 37) указывают на введение антитела К5-70. *Р<0,05, **Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента.
На фиг. 28 представлена дозозависимая противоопухолевая активность клона T6-16 в отношении ксенотрансплантатов в моделях лечения с использованием клеток SW480.
На фиг. 28А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (·: IgG мыши) и в группе введения Тб-16 (О: 1 мг/кг, Δ: 5 мг/кг, □: 10 мг/кг) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. **P<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 28В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 43 сутки (сутки 43) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 28А. **Р<0,01 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 29 представлена противоопухолевая активность клона T6-16 в отношении ксенотрансплантата в моделях лечения с использованием клеток SW480. Представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (·: IgG мыши, 10 мг/кг) и в группе введения Т6-16 (10 мг/кг) (О: q7d, Δ: q10d) (среднее значение±стандартное отклонение). Концы стрелок (сутки 10, 17, 24, 31 и 38) и стрелки (сутки 10, 20, 30 и 40) указывают на введение антитела T6-16. В контрольной группе введение проводили один раз в трое суток. *Р<0,05, **P<0,01 согласно t-критерию Стьюдента.
На фиг. 30 представлена противоопухолевая активность клона К5-70 в отношении ксенотрансплантата в моделях предупреждения с использованием клеток предстательной железы человека DU-145.
- 7 031043
На фиг. 30А представлено образование опухоли с течением времени в контрольной группе (·: IgG мыши) и в группе введения К5-70 (О) (среднее значение + стандартное отклонение). Стрелка указывает на период введения антитела. *P<0,05 (согласно t-критерию Стьюдента).
На фиг. 30В представлена нанесенная на график масса опухоли каждой мыши в момент времени 40 сутки (сутки 40) (последний день эксперимента) в испытании согласно фиг. 30А. *Р<0,05 (согласно tкритерию Стьюдента).
На фиг. 31 представлена активность ингибирования метастазирования клона К5-70 в моделях метастазов в печень с использованием клеток РК-59.
На фиг. 31А и 31В представлено изображение вырезанной печени в случае контрольной группы (IgG мыши) (А) и группы введения К5-70 (В), которое было получено через б недель после трансплантации клеток. Стрелки указывают на очаги метастазирования в печень.
На фиг. 32 представлена противоопухолевая активность К5-70 в моделях с ксенотрансплантатами с использованием клеток SW480, которые представляют собой модели рецидивирующей злокачественной опухоли после введения иринотекана гидрохлорида. На этой фигуре представлено образование опухоли с течением времени в группе без введения (♦), в группе введения иринотекана гидрохлорида (40 мг/кг) + К5-70 (О: 10 мг/кг) и в группе введения иринотекана гидрохлорида (40 мг/кг) + IgG мыши(·: 10 мг/кг) (среднее значение±стандартное отклонение). Стрелки-указатели (сутки 11, 14 и 17) указывают на введение иринотекана гидрохлорида. Антитело К-70 или IgG мыши вводили один раз каждые трое суток, начиная с 20 суток. Стрелка указывает на период введения антитела. *Р<0,05, **Р<0,01 согласно tкритерию Стьюдента.
На фиг. 33 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области Н-цепи (VH) клона К5-70 (SEQ ID NO: 34) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 35). Сигнальный пептид указан курсивом. Глутамин (Q), подчеркнутый двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; IYWIN, NIYPSDSYTNYNQKFKD и TSMADY) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 клона К5-70 VH представлены в SEQ ID NO: 36-38, соответственно.
На фиг. 34 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области L-цепи (VL) клона К5-70 (SEQ ID NO: 39) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 40). Сигнальный пептид показан курсивом. Аспарагиновая кислота (D), подчеркнутая двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; RASQSIGTSIH, YASESIS и QQSNSWPFT) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 VL клона К5-70 представлены в SEQ ID NO: 41-43, соответственно.
На фиг. 35 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области Н-цепи (VH) клона К5-107 (SEQ ID NO: 44) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 45). Сигнальный пептид представлен курсивом. Глутамин (Q), подчеркнутый двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; SYWMH, NIYPGGGYTNYDEKFKS и SSVFDY) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 VH клона К5-107 представлены в SEQ ID NO: 46-48, соответственно.
На фиг. 36 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области L-цепи (VL) клона К5-107 (SEQ ID NO: 49) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 50). Сигнальный пептид показан курсивом. Аспарагиновая кислота (D), подчеркнутая двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; RASQNIGTSIH, YASESIS и QQSNSWPFT) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 VL клона К5-107 представлены в SEQ ID NO: 51-53, соответственно.
На фиг. 37 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области Н-цепи (VH) клона К5-116-2-1 (SEQ ID NO: 54) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 55). Сигнальный пептид представлен курсивом. Глутамин (Q), подчеркнутый двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; SYWIT, NIYPSDSYTNYNQKFRD и LFDY) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 VH клона К5-116-2-1 представлены в SEQ ID NO: 56-58, соответственно.
На фиг. 38 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области L-цепи клона К5-116-2-1 (VL) (SEQ ID NO: 59) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID
- 8 031043
NO: 60). Сигнальный пептид показан курсивом. Аспарагиновая кислота (D), подчеркнутая двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; RASQSIGTSIH, YASESIS и QQSNSWPFT) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 913242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 13 VL клона R5-116-2-1 представлены в SEQ ID NO: 61-63, соответственно.
На фиг. 39 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области Н-цепи (VH) клона Т6-16 (SEQ ID NO: 64) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 65). Сигнальный пептид представлен курсивом. Глутаминовая кислота (Е), подчеркнутый двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; DYNMH, YIYPYNGGTGYNQRFKS и EDYGSSPSYAMDY) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 1-3 VH клона Т6-16 представлены в SEQ ID NO: 66-68, соответственно.
На фиг. 40 представлена нуклеотидная последовательность кДНК вариабельной области L-цепи клона T6-16 (VL) (SEQ ID NO: 69) и установленная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 70). Сигнальный пептид показан курсивом. Аспарагиновая кислота (D), подчеркнутая двойным подчеркиванием, указывает на N-концевой аминокислотный остаток зрелого пептида. Последовательности CDR (подчеркнуты; RSSQSLVHGNGNTYLH, KVSNRFS и SQTTHVPT) определяли в соответствии с определениями Rabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 913242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Аминокислотные последовательности CDR 13 VL клона Т6-16 представлены в SEQ ID NO: 71-73, соответственно.
Способ осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение описано подробно.
Представленное ниже описание не предназначено для ограничения объема настоящего изобретения. Помимо представленных ниже примеров, настоящее изобретение можно модифицировать и осуществлять, соответствующим образом, в диапазоне, который не ухудшает замысла настоящего изобретения.
Настоящее описание включает все содержимое описания заявки на патент Японии № 2010-113302 (поданной 17 мая 2010 года), которая является приоритетным документом для настоящей заявки.
Кроме того, все публикации, цитированные в настоящем описании, которые включают документы уровня техники и патентные документы, такие как выложенные публикации заявок и публикации патентов, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
1. Сущность настоящего изобретения.
Как указано выше, TROP-2 человека (hTROP-2) представляет собой однократно проходящий через мембрану мембранный белок 1 типа, имеющий полную длину 323 аминокислотных остатка. Известно, что ген hTROP-2 и его продукт экспрессируются в различных типах злокачественных опухолей.
Как упоминалось выше, является желательной разработка антитела против hTROP-2 человека (моноклональное антитело против hTROP-2 человека) или сходных с ним, имеющего высокую противоопухолевую активность in vivo. В таких обстоятельствах автор настоящего изобретения провел скрининг чрезвычайно большого количество клонов и в результате автор изобретения успешно получил клон, обладающий высокой противоопухолевой активностью in vivo. В частности, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфично распознает внеклеточную область hTROP-2 in vivo, и, в частности, к моноклональному антителу, проявляющему высокую аффинность пикомолярного (пМ) порядка. Антитело по настоящему изобретению чрезвычайно пригодно в том, что оно представляет собой моноклональное антитело против hTROP-2, которое проявляет значительную активность ингибирования роста опухоли при более низкой дозе, чем доза существующего антитела против hTROP-2 (например, при дозировке 1/20), когда его вводят отдельно в качестве голого антитела, и которое также проявляет значительную активность ингибирования роста опухоли в моделях лечения имеющих опухоли мышей, в которых используют множество типов злокачественных клеток человека.
2. Получение антитела против hTROP-2.
(1) Получение антитела.
Информация, касающаяся аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2) hTROP-2, описана под номером доступа NP002344 на web-сайте, например, NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Информация, касающаяся нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1), кодирующей аминокислотную последовательность hTROP-2, описана под номером доступа NM002353 на web-сайте, описанном выше.
В качестве антигена можно использовать полипептид или пептид (который также называют просто пептидом), содержащий по меньшей мере часть (всю или часть) аминокислотной последовательности hTROP-2, и, предпочтительно, можно использовать пептид, содержащий по меньшей мере часть (всю или часть) аминокислотной последовательности внеклеточной области hTROP-2. Внеклеточная область (включая сигнальный пептид) hTROP-2 указывает на область, содержащую аминокислоты в положениях 1-274 из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 (сигнальный пептид:
- 9 031043 аминокислоты в положениях 1-26). В настоящем описании, что касается пептида, используемого в качестве антигена, представленное выше описание по меньшей мере часть аминокислотной последовательности конкретно не ограничено с точки зрения длины. Например, предпочтительными являются область, содержащая аминокислоты в положениях 1-145 из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, область, содержащая аминокислоты в положениях 146-274 из той же аминокислотной последовательности, что описана выше и т. п.
Пептид, используемый в качестве антигена, можно получать либо путем химического синтеза, либо способом генетической инженерии с использованием Escherichia coli или сходных с ними. Можно использовать способ, хорошо известный специалистам в данной области.
Когда пептид получают путем химического синтеза, его можно синтезировать хорошо известным способом пептидного синтеза. Кроме того, для синтеза пептидов можно использовать как способ твердофазного синтеза, так и способ жидкофазного синтеза. Также можно использовать коммерчески доступное устройство для синтеза пептидов (например, PSSM-8, изготовленное Shimadzu Corporation, и т.д.).
Когда пептид синтезируют способом генетической инженерии, сначала конструируют и синтезируют ДНК, кодирующую пептид. Конструирование и синтез такой ДНК можно проводить в соответствии со способом ПЦР с использованием вектора, содержащего полноразмерный ген hTROP-2 или сходный с ним в качестве матрицы, и также с использованием праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны синтезировать желаемую область ДНК. После этого ДНК лигируют в подходящий вектор с получением рекомбинантного вектора, используемого для экспрессии белка, а затем этот рекомбинантный вектор встраивают в хозяина, так чтобы представляющий интерес ген мог экспрессироваться в нем, тем самым получая трансформант (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
В качестве вектора используют фаг или плазмиду, способные автономно реплицироваться в микроорганизме-хозяине. Кроме того, также можно использовать вирус животного или вирусный вектор насекомого. Для получения рекомбинантного вектора очищенную ДНК можно расщеплять подходящими ферментами рестрикции, а затем отщепленную таким образом часть ДНК можно встраивать в участок фермента рестрикции или сходные с ним в ДНК подходящего вектора, так чтобы он лигировался в вектор. Тип хозяина, используемого для трансформации, конкретно не ограничен, при условии, что он способен экспрессировать представляющий интерес ген. Примеры такого хозяина включают бактерии (Escherichia coli, Bacillus subtilis и т.д.), дрожжи, клетки животного (клетки COS, клетки СНО и т.д.), клетки насекомого и насекомых. Также в качестве такого хозяина можно использовать млекопитающее, такое как коза. Способ введения рекомбинантного вектора в хозяина является общеизвестным.
Описанный выше трансформант культивируют, а затем из культуры собирают пептид, используемый в качестве антигена. Термин культура используют в настоящем описании для обозначения как (a) культурального супернатанта, так и (b) культивируемых клеток, культивируемой клеточной массы или продукта их разрушения.
После завершения культивирования, когда представляющий интерес пептид продуцируют в клеточной массе или в клетках, пептид экстрагируют путем разрушения клеточной массы или клеток. С другой стороны, когда представляющий интерес пептид продуцируется вне клеточной массы или вне клеток, культуральный раствор используют прямо или клеточную массу, или клетки извлекают из культурального раствора путем центрифугирования, или сходных с ним. После этого представляющий интерес пептид можно выделять и очищать путем однократного применения биохимических способов, широко используемых при выделении и очистке пептидов, таких как осаждение с сульфатом аммония, гель-фильтрация, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, или путем комбинирования надлежащим образом упомянутых выше биохимических способов.
В настоящем изобретении пептид, используемый в качестве антигена, также можно получать путем трансляции in vitro с использованием бесклеточной системы для синтеза. В этом случае можно использовать два способа, а именно, способ с использованием РНК в качестве матрицы и способ с использованием ДНК в качестве матрицы (транскрипция/трансляция). В качестве такой системы для бесклеточного синтеза можно использовать коммерчески доступную систему, такую как система Expressway™ (Invitrogen), PURESYSTEM (зарегистрированный торговый знак; Post Genome Institute) или систему TNT (зарегистрированный торговый знак; Promega).
Полученный таким образом пептид может связывать подходящий белок-носитель, такой как бычий сывороточный альбумин (BSA), гемоцианин лимфы улитки (KLH), тиреоглобулин человека или γглобулин курицы.
Более того, антиген может представлять собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот относительно аминокислотной последовательности hTROP-2 (SEQ ID NO: 2) или ее неполной последовательности, как описано выше. Например, можно использовать пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой одна или более (предпочтительно, одна или несколько (например, 1-10 и, более предпочтительно, 1-5)) аминокислот удалены, или одна или более (предпочтительно, одна или несколько (на
- 10 031043 пример, 1-10 и, более предпочтительно, 1-5)) аминокислот заменены другими аминокислотами, или одна или более (предпочтительно, одна или несколько (например, 1-10 и, более предпочтительно, 1-5)) других аминокислот добавлены, относительно аминокислотной последовательности hTROP-2 или его неполной последовательности. В настоящем изобретении ген, подлежащий введению в клетку или сходные с ней, представляет собой ген, кодирующий белок hTROP-2 или его частичный фрагмент, или его мутантный белок или его фрагмент. В качестве такого гена можно использовать, например, ген, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или ее неполную последовательность.
Более того, в качестве гена, подлежащего введению в клетку или сходные с ней, также можно использовать нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся в жестких условиях с последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и кодирующую белок, обладающий активностью hTROP-2, или ее неполную последовательность.
Название жесткие условия используют в настоящем описании для обозначения условий промывания после завершения гибридизации. В качестве таких жестких условий концентрация соли (натрия) в буфере составляет от 10 до 500 мМ и температура составляет от 42 до 72°C и, предпочтительно, указанное выше условие содержания соли представляет собой от 50 до 300 мМ и температура составляет от 55 до 68°C.
Мутацию можно вносить в ген известным способом, таким как способ Kunkel или способ дуплекса с разрывами, с использованием, например, набора для внесения мутаций, в котором используется сайтнаправленный мутагенез, такого как система для сайт-направленного мутагенеза GeneTailor™ (изготовленная Invitrogen) или система для сайт-направленного мутагенеза TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, и т.д.; изготовленная Takara Bio Inc.).
(2) Получение поликлонального антитела.
Полученный антиген вводят млекопитающему для иммунизации. Тип такого млекопитающего конкретно не ограничен. Например, можно использовать крысу, мышь и кролика, и среди них предпочтительной является мышь.
Дозировку антигена на животное можно определять соответствующим образом, в зависимости от присутствия или отсутствия адъюванта. Примеры такого адъюванта включают полный адъювант Фрейнда (FCA), неполный адъювант Фрейнда (FIA) и адъювант на основе гидроксида алюминия. Иммунизацию можно проводить, главным образом, путем инъекции антигена в вену, подушечку лапы, в подкожный слой или брюшную полость животного. Кроме того, интервал иммунизации конкретно не ограничен и иммунизацию проводят с интервалами от нескольких суток до нескольких недель, предпочтительно, с интервалами 1 неделя, от 1 до 10 раз, и, предпочтительно, 2 или 3 раза. От трех до семи суток после последнего дня иммунизации измеряют титр антител путем ферментного иммуноанализа (ELISA или EIA), радиоиммунного анализа (RIA) или других способов. Когда достигают желаемого титра антитела, кровь можно собирать с получением антисыворотки. В описанном выше способе сбора антитела, если это необходимо для очистки антитела, антитело можно очищать путем выбора подходящего способа из известных способов, таких как осаждение с сульфатом аммония, ионообменная хроматография, гельфильтрация и аффинная хроматография, путем комбинирования упомянутых выше способов соответствующим образом. После этого измеряют реактивность поликлонального антитела в антисыворотке способом ELISA или сходными с ним.
(3) Получение моноклонального антитела. (3-1) Сбор антителопродуцирующих клеток.
Антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению не ограничено, однако, предпочтительно оно представляет собой моноклональное антитело.
Полученный антиген вводят млекопитающему, такому как крыса, мышь или кролик, для иммунизации. Дозировку антигена на животное можно определять соответствующим образом, в зависимости от присутствия или отсутствия адъюванта. Здесь можно использовать те же адъюванты, которые описаны выше. Также здесь можно применять те же способы иммунизации, которые описаны выше. Через от одних до шестидесяти суток, и предпочтительно, через от одних до четырнадцати суток после последнего дня иммунизации, антителопродуцирующие клетки собирают. Примеры таких антителопродуцирующих клеток включают клетки селезенки, клетки лимфатических узлов и клетки периферической крови. Среди них предпочтительными являются клетки лимфатических узлов и клетки селезенки.
(3-2) Слияние клеток.
Для получения гибридом (антителопродуцирующая клеточная линия) проводят слияние антителопродуцирующих клеток с клетками миеломы. В качестве клеток миеломы, подлежащих слиянию с антителопродуцирующими клетками, можно использовать широкодоступные общепринятые клетки из животных, таких как мыши. Клеточная линия, используемая в рамах изобретения, предпочтительно, представляет собой клеточную линию, которая имеет селективность в отношении лекарственных средств, не может выжить в неслитом состоянии в селективной среде HAT (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин), и может выжить только в состоянии, слитом с антителопродуцирующими клетками.
Примеры клеток миеломы включают клеточные линии миеломы, такие как P3-X63-Ag8.653, РЗX63-Ад8(X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) и Sp2/0-Ag14(Sp2/0). Клетки миеломы можно выбирать соответствующим образом, учитывая совместимость с антителопродуцирующими клетками.
- 11 031043
После этого клетки миеломы подвергают слиянию с антителопродуцирующими клетками. Для такого слияния клеток антителопродуцирующие клетки (от 1х106 до 1х107 клеток/мл) смешивают с клетками миеломы (от 2х105 до 2х106 клеток/мл) в среде для клеток животных, такой как среда DMEM или RPMI-1640, не содержащая сыворотки. Соотношение клеток между антителопродуцирующими клетками и клетками миеломы (антителопродуцирующие клетки: клетки миеломы) не ограничено. Как правило, соотношение, предпочтительно, составляет от 1:1 до 10:1 и, более предпочтительно, 3:1. После этого проводят реакцию слияния в присутствии средства, обеспечивающего слияние клеток. В качестве такого средства, обеспечивающего слияние клеток, можно использовать полиэтиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу 1000-6000 Дальтон (D), или сходные с ним. Кроме того, также возможно проводить слияние антителопродуцирующих клеток с клетками миеломы с использованием коммерчески доступного устройства для слияния клеток, в котором используется электрическая стимуляция (например, электропорация).
(3-3) Выбор и клонирование гибридом.
Представляющие интерес гибридомы отбирают из клеток после обработки для слияния клеток. В качестве способа селекции гибридом суспензию клеток соответствующим образом разбавляют, например, средой RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку, а затем разбавленный раствор распределяют в микропланшет для титрования. После этого в каждую лунку добавляют селективную среду. Культивирование проводят, заменяя соответствующим образом селективную среду свежей средой. В результате приблизительно через 14 суток после начала культивирования на селективной среде можно получать клетки, растущие в селективной среде, в качестве гибридом.
После этого проводят скрининг для исследования того, присутствует ли в супернатанте растущих гибридом антитело, реагирующее с hTROP-2. Скрининг гибридом можно проводить общепринятым способом, и, таким образом, способ скрининга конкретно не ограничен. Например, из культурального супернатанта растущих гибридом, содержащегося в лунке, отбирают аликвоту, а затем проводят скрининг с помощью ELISA, EIA, RIA или сходных с ними.
Клонирование слитых клеток можно проводить способом лимитирующих разведений или сходными с ним. Затем определяют антитело, демонстрирующее высокую реактивность в отношении hTROP-2 способом проточной цитометрии или сходными с ним, и отбирают гибридому, продуцирующую это антитело. Отобранную гибридому принимают в качестве клона.
(3-4) Сбор моноклонального антитела.
В качестве способа культивирования полученной гибридомы, а затем сбора моноклонального антитела из полученной культуры можно выбирать обычный способ культивирования, способ образования асцитов или сходные с ними. Термин культура используют в настоящем документе для обозначения обеспечения роста гибридом в культуральной чашке или в культуральной бутыли, или обеспечения роста гибридом в брюшной полости животного, как описано ниже.
В случая способа культивирования клеток, гибридомы культивируют в среде для клеток животных, такой как среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональную телячью сыворотку, среда MEM или бессывороточная среда, в общепринятых условиях культивирования (например, 37°C, концентрация CO2 5%) в течение 7-14 суток, а затем из культурального супернатанта можно получать антитело.
В случае способа образования асцита, приблизительно 1х107 гибридом вводят в брюшную полость животного того же вида, что и млекопитающее, из которого происходят клетки миеломы, так чтобы обеспечить пролиферацию больших количеств гибридом. Через 2-3 недели после этого, предпочтительно, собирают асцитическую жидкость.
В описанном выше способе сбора антител, если необходимо очистить антитело, антитело можно очищать путем выбора надлежащим образом подходящего способа из известных способов, таких как осаждение с сульфатом аммония, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и аффинная хроматография, или путем комбинирования указанных выше способов.
(3-5) Отбор клона, обладающего противоопухолевой активностью.
Антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее противоопухолевой активностью in vivo.
Термин противоопухолевая активность используют в настоящем описании для обозначения активности уничтожения опухолевых клеток (злокачественных клеток) или активности ингибирования роста опухоли. Предпочтительные примеры такой противоопухолевой активности включают активность ингибирования роста злокачественных клеток и активность ингибирования ангиогенеза опухоли. Тип опухоли (опухолевых клеток) человека, в отношении которого антитело по настоящему изобретению способно проявлять противоопухолевую активность, включает различные типы различных опухолей человека, при которых подтверждена экспрессия hTROP-2. Тип такой опухоли человека конкретно не ограничен. Например, предпочтительными являются одно или два, или более из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека, и более предпочтительным является рак поджелудочной железы человека.
Более того, описанная выше опухоль может представлять собой рецидивирующую злокачествен
- 12 031043 ную опухоль или метастазирующую злокачественную опухоль. Антитело по настоящему изобретению также способно проявлять превосходную противоопухолевую активность в отношении этих типов опухолей.
Наличие противоопухолевой активности in vivo может быть подтверждено, например, с использованием имеющей опухоль мыши (модель с ксенотрансплантатом на мышах), под кожу которой трансплантированы желаемые опухолевые клетки, а затем путем введения антитела, полученного, как описано выше, мыши. В этом случае, антитело можно вводить сразу после трансплантации опухолевых клеток (модели предупреждения). Альтернативно, его можно вводить после подтверждения того, что трансплантированная опухоль достигла заданного объема (модели лечения). Способ введения не ограничен. Например, антитело можно вводить один раз в трое суток, раз в неделю, раз в десять суток или каждые две недели, или оно может представлять собой однократное введение (только один раз) в дозировке 5-20 мг/кг массы тела, путем внутрибрюшинного введения или сходных с ними. В случае моделей предупреждения присутствие или отсутствие противоопухолевой активности и ее уровень можно оценивать на основе частоты образования опухоли и объема опухоли. В случае моделей лечения, присутствие или отсутствие противоопухолевой активности и ее уровень можно оценивать на основе объема опухоли.
В настоящем изобретении предпочтительным примером антитела против hTROP-2, имеющего противоопухолевую активность in vivo, является антитело, в котором аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области Н-цепи представлены в SEQ ID NO: 66-68, соответственно, и/или аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области L-цепи представлены в SEQ ID NO: 71-73, соответственно. Предпочтительным примером V-области Н-цепи является V-область Н-цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65. Предпочтительным примером V-области Lцепи является V-область L-цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70.
В настоящем изобретении, более конкретно, предпочтительным примером антитела против hTROP2, обладающего противоопухолевой активностью in vivo, является моноклональное антитело против hTROP-2 (название клона: T6-16), продуцируемое гибридомой с номером доступа FERM ВР-11346.
В настоящем описании гибридома с номером доступа FERM ВР-11346 называется гибридомой мыши-мыши T6-16, и она была депонирована 1 марта 2 011 года. Гибридома была депонирована в
International Patent Organism Depositary (IPOD), National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Independent Administrative Institution under the Ministry of Economy, Trade and Industry (the AIST, Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Япония, почтовый индекс: 3058566).
(3-6) Эпитоп антитела против hTROP-2.
Тип эпитопа (антигенной детерминанты) антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению не ограничен, при условии, что он имеет по меньшей мере часть hTROP-2 в качестве антигена. Например, такой эпитоп, предпочтительно, представляет собой по меньшей мере часть области, образованной удалением области, состоящей из аминокислот в положениях 252-260, из аминокислотной последовательности hTROP-2, представленной в SEQ ID NO: 2, более предпочтительно, по меньшей мере часть области, состоящей из аминокислот в положениях 1-69 или по меньшей мере часть области, состоящей из аминокислот в положениях 100-274 (за исключением области, состоящей из аминокислот в положении 252260), и, еще более предпочтительно, по меньшей мере часть области, состоящей из аминокислот в положениях 27-69, или области, состоящей из аминокислот в положениях 109-206. Особенно предпочтительные примеры описанного выше эпитопа включают область, состоящую из аминокислот в положениях 4365, область, состоящую из аминокислот в положениях 152-165, область, состоящую из аминокислот в положениях 171-183, область, состоящую из аминокислот в положениях 109-120, область, состоящую из аминокислот в положениях 193-206, область, состоящую из аминокислот в положениях 43-56, и участок, содержащий такую область, в аминокислотной последовательности hTROP-2, представленной в SEQ ID NO: 2. Более особенно предпочтительные примеры включают область, состоящую из аминокислот в положениях 43-65, область, состоящую из аминокислот в положениях 152-165, область, состоящую из аминокислот в положениях 171-183, область, состоящую из аминокислот в положениях 109-120, и участок, содержащий такую область. Антитело против hTROP-2, которое распознает описанные выше области (связывается с описанными выше областями или участками, содержащими такие области), имеет, например, высокую активность интернализации в опухолевые клетки, и, таким образом, в высокой степени подходит в качестве иммуноконъюгата, как описано ниже.
(3-7) Характеристики антитела против hTROP-2.
Как описано выше, антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению представляет собой антитело, обладающее высокой противоопухолевой активностью in vivo в низкой дозе. В частности, предпочтительно, чтобы антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению проявляло активность инги
- 13 031043 бирования роста опухоли, составляющую 50% или более (предпочтительно, 80% или более, более предпочтительно, 90% или более, еще более предпочтительно, 95% или более, и, особенно предпочтительно, практически 100% (например, 98% или более, или 99% или более)) в дозе (в качестве голого антитела) 20 мг/кг массы тела или менее (предпочтительно, 10 мг/кг массы тела или менее, более предпочтительно, 5 мг/кг массы тела или менее, и еще более предпочтительно, 1 мг/кг массы тела или менее) в модели на животных, имеющих опухоль.
В этом случае, активность ингибирования роста опухоли (%) можно вычислять, например, по следующей формуле:
Активность ингибирования роста опухоли (%)=100-[(объем опухоли или масса опухоли в группе введения антитела)/(объем опухоли или масса опухоли в контрольной группе)] х 100.
Кроме того, антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению, предпочтительно, имеет противоопухолевую активность в отношении двух или более типов опухолевых клеточных линий человека. Тип такой опухолевой клеточной линии человека не ограничен. Например, такие опухолевые клеточные линии человека представляют собой клеточные линии по меньшей мере двух типов, выбранных из группы, состоящей из различных типов клеточных линий рака поджелудочной железы человека, клеточных линий рака предстательной железы человека, клеточных линий рака толстого кишечника человека и клеточных линий рака молочной железы. В частности, предпочтительные примеры таких опухолевых клеточных линий человека включают клеточные линии по меньшей мере двух типов, выбранных из группы, состоящей из клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-59, клеточной линии рака поджелудочной железы человека BxPC-3, клеточной линии рака поджелудочной железы человека KP-3L, клеточной линии рака поджелудочной железы человека КР-2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-1, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-45Н, клеточной линии рака поджелудочной железы человека РК-45Р, клеточной линии рака поджелудочной железы человека TCC-PAN2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека SUIT-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека САСО-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480, клеточной линии рака толстого кишечника человека DLD-1, клеточной линии рака толстого кишечника человека НСТ 116, клеточной линии рака молочной железы человека JIMT-1, клеточной линии рака молочной железы человека НСС1143, клеточной линии рака молочной железы человека MCF-7, клеточной линии рака предстательной железы человека DU145 и клеточной линии рака предстательной железы человека РС-3. Среди них, в качестве описанных выше двух или более типов опухолевых клеточных линий человека, более предпочтительными являются клеточная линия рака поджелудочной железы человека РК-59 и клеточная линия рака поджелудочной железы человека BxPC-3.
Более того, антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению имеет константу диссоциации (величину Kd), предпочтительно, 1,0х10-10 М или менее, более предпочтительно, 1,0х10-11 М или менее, и еще более предпочтительно, 1,0х10-12 М или менее. В рамках настоящего описания способность к связыванию (аффинность) антитела можно измерять в форме константы диссоциации (величины Kd), константы скорости диссоциации (Kdiss [1/с]) или константы скорости ассоциации (Kass [1/M.c]), например, с помощью анализа Скэтчарда или сенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса, называемого Biacore. В качестве такого устройства Biacore можно использовать, например, Biacore 3000, Biacore 2000, Biacore X, Biacore J и Biacore Q (все из которых изготавливаются Biacore). Предпочтительно, чтобы антитело имело константу диссоциации (величину Kd), которая является настолько малой, насколько это возможно, чтобы оно могло иметь высокую способность к связыванию (аффинность). Величину Kd определяют на основе двух параметров Kdiss и Kass, и она может быть выражена формулой: Kd[M] = Kdiss/Kass. В качестве способа вычисления величины Kd, предпочтительно, можно использовать способ, описанный в примерах ниже (в частности, пример 10).
(4) Рекомбинантное антитело и фрагмент антитела.
(4-1) Рекомбинантное антитело.
В предпочтительном варианте осуществления антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению предусмотрено рекомбинантное антитело. Тип такого рекомбинантного антитела не ограничен. Примеры включают химерное антитело, гуманизированное антитело и антитело человека.
Химерное антитело (т.е. гуманизированное химерное антитело) представляет собой антитело, образованное лигированием (конъюгацией) вариабельной области происходящего из мыши антитела в константную область происходящего из человека антитела (см. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984), и т.д.). Когда получают такое химерное антитело, можно легко конструировать лигированное таким образом антитело способом генетической рекомбинации.
Когда получают гуманизированное антитело, определяющую комплементарность область (CDR) трансплантируют из вариабельной области антитела мыши в вариабельную область антитела человека, так чтобы получить реконструированную вариабельную область, в которой каркасная область (FR) происходит из человека и CDR происходит из мыши (это называют пересадкой CDR (трансплантацией CDR)). Затем реконструированную таким образом гуманизированную вариабельную область человека лигируют в константную область человека. Такой способ получения гуманизированного антитела хоро
- 14 031043 шо известен в данной области техники (см. Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen С et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); публикацию патента Японии (Kohyo) No. 4-502408 A (1992) (патент Японии № 2828340; Queen et al.), и т.д.).
Как правило, в случае антитела человека (полное антитело человека), его структура, содержащая гипервариабельную область, которая представляет собой антигенсвязывающий центр V-области, другие части V-области и константную область, является такой же, как и структура антитела человека. Однако такая гипервариабельная область также может происходить из других животных. Способ получения антитела человека является общеизвестным, и был разработан способ получения последовательностей генов, которые являются общими у человека, путем генетической инженерии. Антитело человека можно получать, например, способом с использованием продуцирующей антитело мыши, которая имеет хромосомные фрагменты человека, содержащие гены Н-цепи и L-цепи антитела человека (см. Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, Т. и Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722727, и т.д.), или способом получения происходящего из фагового дисплея антитела человека, выбранного из библиотеки антител человека (см. Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189203; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431, и т.д.).
В случае упомянутого выше химерного антитела, гуманизированного антитела и антитела человека, связанная N-гликозидной связью цепь сахара в Fc-области антитела, предпочтительно, представляет собой цепь сахара, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на его восстанавливающем конце. Конкретным примером является антитело, состоящее из генетически рекомбинантной молекулы антитела, которое имеет в Fc-области молекулы антитела цепь сахара, в которой положение 1 фукозы не связано с положением 6 N-ацетилглюкозамина на восстанавливающем конце связанной N-гликозидной связью цепи сахара через а связь. Такое антитело способно значительно увеличить активность ADCC. Этот фактор (характеристики связанной N-гликозидной связью цепи сахара в Fc-области антитела) является предпочтительным также для упомянутого выше поликлонального антитела и моноклонального антитела.
(4-2) Фрагмент антитела.
Антитело по настоящему изобретению включает фрагмент антитела против hTROP-2 (неполный фрагмент) по настоящему изобретению. В рамках изобретения фрагмент антитела по настоящему изобретению обладает активностью связывания с hTROP-2 (а именно, способен связываться с hTROP-2) и также обладает противоопухолевой активностью in vivo, как в случае антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению.
Фрагмент антитела означает область участка поликлонального антитела против hTROP-2 или моноклонального антитела против hTROP-2 (а именно, фрагмент антитела, происходящий из антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению). Примеры такого фрагмента антитела включают пептиды, содержащие, в качестве по меньшей мере его части, Fab, Fab', F(ab')2, Fv (вариабельный фрагмент антитела), одноцепочечное антитело (Н-цепь, L-цепь, V-область Н-цепи и V-область L-цепи, и т.д.), scFv, диатело (димер scFv), dsFv (стабилизированная дисульфидной связью V-область) и определяющую комплементарность область (CDR).
Fab представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой приблизительно 50000, обладающий активностью связывания антигена, который образован связыванием приблизительно половины N-концевой стороны Н-цепи с целой L-цепью через дисульфидную связь, из числа фрагментов, получаемых обработкой молекул антитела протеазой папаином. Кроме того, также можно получать такой Fab путем встраивания ДНК, кодирующей Fab антитела, в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем вводить вектор в прокариоты или эукариоты, так чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем.
F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой приблизительно 100000, обладающий активностью связывания антигена, размер которого немного превышает Fab, который связан с Fab через дисульфидную связь в шарнирной области, из числа фрагментов, получаемых обработкой молекул антитела протеазой пепсином. Кроме того, также можно получить такой F(ab')2 путем связывания Fab тиоэфирной связью или дисульфидной связью, как описано ниже.
Fab' представляет собой фрагмент антитела с молекулярной массой приблизительно 50000, обладающей активностью связывания антигена, который образован расщеплением дисульфидной связи в шарнирной области упомянутого выше F(ab')2. Кроме того, также можно получать такой Fab' путем встраивания ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела, в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем встраивания вектора в прокариоты или эукариоты, чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем.
scFv представляет собой фрагмент антитела, обладающий активностью связывания антигена, который представляет собой полипептид VH-P-VL или VL-P-VH, образованный лигированием одной Vобласти Н-цепи (VH) с одной V-областью L-цепи (VL) с использованием пригодного пептидного линкера
- 15 031043 (Р). Такой scFv можно получать путем получения кДНК, кодирующей VH и VL антитела, конструирования ДНК, кодирующей scFv, встраивания ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введения вектора в прокариоты или эукариоты, так чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем.
Диатело представляет собой фрагмент антитела, образованный димеризацией scFv, который обладает двухвалентной активностью связывания антигена. Такая двухвалентная активность связывания антигена может быть идентичной, или она может различаться. Такое диатело можно получать путем получения кДНК, кодирующей VH и VL антитела, конструирования ДНК, кодирующей scFv, так чтобы длина аминокислотной последовательности Р составляла 8 остатков или менее, встраивания ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введения вектора в прокариоты или эукариоты, так чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем.
dsFv представляет собой фрагмент антитела, образованный связыванием полипептидов, в которых один аминокислотный остаток каждой из VH и VL заменен остатком цистеина, друг с другом через дисульфидную связь между остатками цистеина. Аминокислотный остаток, подлежащий замене на остаток цистеина, можно выбирать на основе оценки трехмерной структуры антитела согласно способу Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-7 04, 1994). Такой dsFv можно получать путем получения кДНК, кодирующей VH и VL антитела, конструирования ДНК, кодирующей dsFv, встраивания ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введения вектора в прокариоты или эукариоты, чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем.
Пептид, содержащий CDR, содержит по меньшей мере одну область CDR из VH (CDR 1-3) и CDR из VL (CDR 1-3). Более предпочтительные примеры такого пептида включают пептид, содержащий все из CDR VH, и пептид, содержащий все из CDR VL. Особенно предпочтительным примером пептида является пептид, содержащий все из CDR VH и VL (всего 6 областей). Предпочтительные примеры аминокислотной последовательности такого CDR включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 66-68 и 71-73, как описано выше. В пептиде, содержащем множество CDR, они могут быть связаны друг с другом прямо или через пригодный пептидный линкер. Такой пептид, содержащий CDR, можно получать путем конструирования ДНК, кодирующей VH и VL антитела, встраивания ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введения вектора экспрессии в прокариоты или эукариоты, так чтобы обеспечить экспрессию ДНК в нем. Более того, такой пептид, содержащий CDR, также можно получать способами химического синтеза, такими как способ с Fmoc (способ с флуоренилметилоксикарбонилом) и способ с tBoc (способ с трет-бутилоксикарбонилом).
Фрагмент антитела по настоящему изобретению, как есть, может представлять собой фрагмент антитела, который содержит часть или всю Fc-область антитела, в которой фукоза не связана с Nацетилглюкозамином на восстанавливающем конце связанной N-гликозидной связью цепи сахара. В ином случае, фрагмент антитела по настоящему изобретению также может представлять собой слитый белок, в котором упомянутый выше фрагмент антитела слит с частью или всей Fc-областью антитела, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином на восстанавливающем конце связанной Nгликозидной связью цепи сахара. Такой фрагмент антитела способен значительно увеличить активность ADCC, и, таким образом, является предпочтительным.
Далее в настоящем описании упомянутые выше фрагменты антитела также включены в антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению.
3. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство.
В качестве иммуноконъюгата, полученного с использованием упомянутого выше антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению, может быть предоставлен конъюгат антитело-лекарственное средство, который содержит упомянутое выше антитело и вещество (соединение, и т.д.), обладающее противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток. Следует отметить, что конъюгат, образованный путем предварительного получения каждого из упомянутой выше молекулы антитела и упомянутого выше вещества, обладающего противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток, по отдельности, а затем комбинирования их, как правило, называют иммуноконъюгатом. С другой стороны, конъюгат, полученный лигированием гена белкового токсина, используемого в качестве такого вещества, обладающего противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток, с геном антитела в соответствии со способом генетической рекомбинации, чтобы обеспечить его экспрессию в качестве отдельного белка (слитого белка), обычно называют иммунотоксином.
Примеры вещества, обладающего противоопухолевой активностью, включают доксорубицин, калихеамицин, митомицин С, ауристатин Е и радиоактивный изотоп (RI). Примеры вещества, обладающего активностью уничтожения клеток, включают сапорин, лизин, экзотоксин pseudomonas, дифтерийный токсин и радиоактивный изотоп (RI). Среди них, предпочтительно, используют сапорин и экзотоксин pseudomonas. Тип RI, обладающего противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток, конкретно не ограничен, и примеры такого RI включают
- 16 031043
90γ , ш1п, 125I , 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189Re, 177Lu
67Си, 212Bi, 213Bi, 211At, 198Au, 224Ac, 1261, 233I, 77Br, 113mIn, 95Ru
97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94mTc, ΙΣΙτη,Γρθ ΙΣΣτη,Γρθ ΙΣδτη,Γρθ 165Tm
167Tm, 168Tm, 211Ag, 197Pt, 109Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, iOSRh
142pr, 143pr, 161Tb, , 166Ho, 199Au , 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 18F, 75Se
201Т1, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212 Pb и 223Ra.
Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство не ограничен. Например, применяют способ связывания антитела с лекарственным средством через дисульфидную связь или гидразоновую связь.
Упомянутое выше антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению является превосходным с точки зрения активности интернализации в опухолевые клетки-мишени, которые экспрессируют hTROP2. Таким образом, путем предварительного комбинирования вещества, обладающего противоопухолевой активностью и активностью уничтожения клеток, с антителом против hTROP-2, становится возможным обеспечение прямого и высокоселективного действия такого вещества на опухолевые клетки. Конъюнгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению является в высокой степени превосходным с точки зрения способности доставки средства в опухолевые клетки-мишени.
Активность интернализации в клетки можно оценивать путем флуоресцентного мечения антитела родамином или сходными с ним, а затем наблюдения за миграционным поведением и локализацией антитела с использованием флуоресцентного микроскопа или сходных с ним.
Более того, в настоящем изобретении, в дополнение к упомянутому выше конъюгату антителолекарственное средство, также может быть предусмотрен конъюгат фрагмент антитела-лекарственное средство, в котором вместо антитела используют упомянутый выше фрагмент антитела. Что касается деталей такого конъюгата фрагмент антитела-лекарственное средство, могут соответствующим образом применяться описания упомянутого выше конъюгата антитело-лекарственное средство.
Далее в настоящем описании такой конъюгат фрагмент антитела-лекарственное средство также включен в конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению.
4. Фармацевтическая композиция.
Антитело против hTROP-2 и конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению пригодны в качестве активных ингредиентов, содержащихся в фармацевтической композиции.
Фармацевтическая композиция пригодна в качестве фармацевтической композиции для лечения и/или диагностики опухоли. В частности, поскольку антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению и конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий указанное выше антитело, обладают превосходной активностью ингибирования роста опухоли в качестве такой противоопухолевой активности, их, предпочтительно, используют для лечения опухоли. Иными словами, антитело против hTROP-2 и конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению пригодны в качестве активных ингредиентов, содержащихся в лекарственном средстве против опухоли и средстве для диагностики опухоли. Следует отметить, что описанное выше лечение опухоли включает ингибирование роста опухоли и подавление роста опухоли. В частности, в случае лекарственного средства против опухоли, примеры лекарственного средства против опухоли включают ингибитор роста опухоли и супрессор роста опухоли.
Предпочтительно, предоставлять фармацевтическую композицию по настоящему изобретению в форме фармацевтической композиции, содержащей антитело против hTROP-2 и/или конъюгат антителолекарственное средство по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента(ов), и дополнительно содержащей фармакологически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с известными противоопухолевыми средствами. Путем такого комбинированного применения можно достигать более высокого противоопухолевого эффекта.
Мишеневые заболевания (опухоли), против которых применяют фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, включают: упомянутые выше различные типы известных опухолей человека, в которых ранее была подтверждена экспрессия hTROP-2. Среди прочих, особенно предпочтительными являются один или несколько типов, выбранных из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека. Такое мишеневое заболевание может представлять собой одно заболевание, или два, или более заболеваний могут развиться совместно. Более того, мишеневая опухоль может представлять собой рецидивирующую злокачественную опухоль или метастазирующую злокачественную опухоль. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению (далее, антитело против hTROP-2 и/или конъюгат антителолекарственное средство по настоящему изобретению) можно эффективно использовать в качестве лекарственного средства и диагностического средства против рецидивирующей злокачественной опухоли или метастазирующей злокачественной опухоли.
Примеры фармакологически приемлемого носителя включают эксципиент, разбавитель, наполни
- 17 031043 тель, дезинтегрирующее вещество, стабилизатор, консервант, буфер, эмульгатор, ароматизатор, краситель, подсластитель, загуститель, модификатор лекарственных веществ, солюбилизатор и другие добавки. С использованием одного или нескольких типов таких носителей, фармацевтическую композицию можно получать в форме инъекции, жидкого средства, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропа и т.д. Эти фармацевтические композиции можно вводить перорально или парентерально. Другой формой для парентерального введения является, например, инъекция, содержащая один или несколько активных ингредиентов, которые получают обычным способом. Такую инъекцию можно получать путем растворения или суспендирования антитела по настоящему изобретению в фармакологически приемлемом носителе, таком как нормальный солевой раствор или коммерчески доступная дистиллированная вода, используемая для инъекции.
В частности, когда фрагмент антитела, происходящий из антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению (в частности, фрагмент антитела с низкой молекулярной массой) вводят в живой организм, в дополнение к упомянутым выше компонентам можно использовать коллоидную дисперсионную систему. Ожидается, что такая коллоидная дисперсионная система обладает эффектом повышения стабильности соединения (фрагмента антитела) в живом организме или эффектом эффективного транспорта такого соединения в конкретный орган, ткань или клетку. Тип такой коллоидной дисперсионной системы не ограничен при условии, что она является широко используемой. Примеры такой коллоидной дисперсионной системы включают дисперсионные системы, содержащие, в качестве основ, полиэтиленгликоль, макромолекулярный конъюгат, макромолекулярный агрегат, нанокапсулы, микросферы, гранулы и липиды, включающие эмульгатор типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительные примеры такой коллоидной дисперсионной системы включают множество липосом и везикул из искусственных мембран, которые обладают эффектом эффективного транспорта такого соединения в конкретный орган, ткань или клетку (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698).
Дозировки фармацевтической композиции по настоящему изобретению различаются, в зависимости от возраста, пола, массы тела и симптомов пациента, терапевтических эффектов, способа введения, времени лечения, типов антитела против hTROP-2 и конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, содержащихся в фармацевтической композиции, и т.д. Как правило, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в диапазоне от 600 мкг до 6000 мг на взрослого человека на введение. Однако доза не ограничивается упомянутым выше диапазоном.
В случае, когда фармацевтическую композицию вводят в форме инъекции, например, ее можно вводить в дозировке от 100 мкг до 100 мг на введение, на массу тела пациента-человека, один раз или в разделенной дозе на протяжении нескольких введений, в качестве средней суточной дозы. Предпочтительно, фармацевтическую композицию можно вводить раз в трое суток, раз в неделю, раз в десять суток, или раз в две недели, или путем однократного введения (где общее количество введений равно 1). Примеры дозированной формы включают внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию, внутримышечную инъекцию и внутрибрюшинную инъекцию. Среди них предпочтительной является внутривенная инъекция. Кроме того, такую инъекцию можно приготавливать в форме неводного разбавителя (например, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, спирты, такие как этанол, и т.д.), суспензии или эмульсии. Такую инъекцию можно стерилизовать путем механической стерилизации с использованием фильтра, смешения с микробицидным средством, и т.д. Инъекцию можно получать в форме инъекции, приготавливаемой перед применением. В этом случае, стерилизованную твердую композицию получают способом лиофилизации или сходными с ним, а затем композицию растворяют в стерилизованной дистиллированной воде, используемой для инъекции, или в других растворителях перед ее применением, после чего ее можно использовать.
Настоящее изобретение относится к применению упомянутого выше антитела против hTROP-2 и/или конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению для получения фармацевтического средства (лекарственное средство) для лечения и/или диагностики опухоли. Кроме того, настоящее изобретение относится к упомянутому выше антителу против hTROP-2 и/или конъюгату антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, которые используют для лечения и/или диагностики опухоли.
Более того, настоящее изобретение также относится к применению упомянутого выше антитела против hTROP-2 и/или конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению для лечения и/или диагностики опухоли.
5. Детекция опухоли.
Детекция опухоли по настоящему изобретению характеризуется тем, что включает обеспечение реакции упомянутого выше антитела против hTROP-2 по настоящему изобретению с образцом, взятым из живого организма (далее называемым биологическим образцом), и детекцию сигнала(ов) вступившего в реакцию антитела.
Как описано выше, было подтверждено, что hTROP-2 специфически экспрессируется в различных типах опухолевых клеток. Таким образом, hTROP-2, и, в частности, свободный hTROP-2 (часть hTROP
- 18 031043
2, представляющая собой внеклеточную область) можно использовать в качестве маркера для различных типов опухолей. В частности, такой hTROP-2, предпочтительно, можно использовать в качестве маркера для рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
Таким образом, антителу против hTROP-2 по настоящему изобретению позволяют реагировать с биологическим образцом, а затем проводят детекцию сигнала вступившего в реакцию антитела, так чтобы выявить опухоль. Полученный сигнал антитела можно использовать в качестве индикатора количества антигена в биологическом образце (т.е. количества hTROP-2 или количества свободного hTROP-2). При детекции опухоли с использованием антитела по настоящему изобретению, сначала биологическому образцу, взятому в качестве анализируемого образца от индивидуума, такому как срез ткани или кровь, используемые в качестве исследуемой мишени, позволяют связываться с антителом по настоящему изобретению в реакции антиген-антитело. После этого на основе результатов измерения количества связавшегося антитела измеряют количество представляющего интерес антигена, содержащегося в биологическом образце. Это измерение можно проводить в соответствии с известными способами иммуноанализа. Например, можно использовать способ иммунопреципитации, способ иммуноагглютинации, радиоиммунный анализ, иммунонефелометрию, способ вестерн-блоттинга, проточную цитометрию и т.п. В радиоиммунном анализе используют меченое антитело, и, таким образом, сигнал антитела выражают в качестве количества меченого антитела, которое прямо выявляют. В ином случае, антитело, концентрация или титр которого известны, можно использовать в качестве стандартного раствора, и, таким образом, сигнал заданного антитела можно выражать в качестве относительной величины. Следовательно, измерение как в стандартном растворе, так и в анализируемом образце, можно проводить с использованием устройства для измерения, и сигнал антитела в биологическом образце можно выражать в качестве величины, относительной к величине стандартного раствора, используемой в качестве критерия. Примеры такого радиоиммунного анализа включают способ ELISA, способ EI, способ RIA, флуоресцентный иммуноанализ (FIA) и люминесцентный иммуноанализ. Среди них способ ELISA является особенно предпочтительным, поскольку он является простым и высокочувствительным.
В соответствии с настоящим изобретением, состояние опухоли можно оценивать или диагностировать с использованием результата детекции, полученного с помощью упомянутого выше способа детекции, в качестве индикатора. Например, когда результат детекции превышает заданную стандартную величину, состояние опухоли определяют как положительное по опухоли, и когда результат детекции меньше заданной стандартной величины, его определяют как отрицательный по опухоли. В случае положительного по опухоли результата, определяют, что мог развиться определенный тип опухоли, и, таким образом, можно оценить состояние опухоли. Термин состояние опухоли используют в настоящем описании для обозначения присутствия или отсутствия развития опухоли, или ее степени прогрессирования. Таким образом, конкретные примеры состояния опухоли включают присутствие или отсутствие развития опухоли, степень ее прогрессирования, степень злокачественности, присутствие или отсутствие метастазов, и присутствие или отсутствие рецидива.
В упомянутой выше оценке, в качестве состояния опухоли, подлежащего оценке, может быть выбрано только одно состояние из упомянутых выше примеров, или могут быть объединены и выбраны несколько примеров. Присутствие или отсутствие опухоли можно оценивать путем определения того, развилась ли опухоль относительно заданной стандартной величины, используемой в качестве границы, на основе полученного результата детекции. Степень злокачественности используют в качестве индикатора, который указывает на степень прогрессирования злокачественной опухоли. На основе результата детекции рассматриваемую опухоль можно классифицировать на определенную стадию заболевания и можно оценивать. В ином случае раннюю злокачественную опухоль и развернутую злокачественную опухоль можно отличить друг от друга, а затем их можно оценивать. Например, также можно определить рассматриваемую опухоль как раннюю злокачественную опухоль или развернутую злокачественную опухоль с использованием результата детекции в качестве индикатора. Метастаз опухоли можно оценивать путем определения того, появилось ли новообразование в области, отдаленной от положения первоначального очага повреждения, с использованием результата детекции в качестве индикатора. Рецидив можно оценивать путем определения того, превышает ли результат детекции заданную стандартную величину вновь после стадии промежуточного периода или ремиссии.
Далее настоящее изобретение более конкретно описано в следующих примерах. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1. Клонирование гена hTROP-2.
Полноразмерный ген hTROP-2 выделяли из печени эмбриона человека (10-недельный эмбрион) способом ОТ-ПЦР. Сначала конструировали следующие праймеры для ПЦР на основе последовательности гена hTROP-2 (номер доступа Genbank № NM002353).
Прямой праймер:
5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (SEQ ID NO: 3)
Обратный праймер:
- 19 031043
5'-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3' (SEQ IDno: 4)
Когда конструировали праймеры, к обратному праймеру добавляли последовательность, расщепляемую ферментом рестрикции XhoI, за исключением стоп-кодона. кДНК синтезировали из общей РНК (TAKARA), полученной из печени эмбриона человека (10-недельный эмбрион). С использованием этой кДНК в качестве матрицы, проводили реакцию ПЦР с упомянутыми выше праймерами. После этого проводили разделение с помощью агарозного гель-электрофореза и извлечение полосы представляющего интерес фрагмента, а затем его клонировали в вектор pCRII (Invitrogen) (pCRII-hTROP-2). Клонированную кДНК hTROP-2 подтверждали секвенированием.
Вектор экспрессии конструировали путем вырезания фрагмента EcoRI/XhoI, содержащего ген hTROP-2 из pCRII-hTROP-2, а затем встраивания этого фрагмента в участок EcoRI/XhoI вектора pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hTROP-2-myc/His). Более того, фрагмент HindIII/PmeI, содержащий ген hTROP-2, вырезали из pcDNA4-hTROP-2-myc/His (где участок расщепления HindIII имел тупой конец), а затем фрагмент встраивали в участок PmeI вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen), так чтобы сконструировать вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к неомицину (pcDNA3.1-hTROP-2myc/His).
Пример 2. Конструирование клеточной линии, способной стабильно экспрессировать ген hTROP-2.
Вектор экспрессии (pcDNA3.1-hTROP-2-myc/His), кодирующий полноразмерную кДНК hTROP-2, полученный описанным выше способом, вводили в клетки НЕК293 (RIKEN), клетки HuH-7 (HSRRB), клетки 7Е2-С (описанные в WO 2005/052156) и клетки СНО-К1 (HSRRB), с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen), и проводили селекцию с использованием антибиотика G418 (генетицин; GIBCO BRL). После этого устанавливали и получали клеточную линию, которая стабильно экспрессировала hTROP-2.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка внеклеточной области hTROP-2.
Фрагмент гена, кодирующий часть внеклеточной области hTROP-2 (в частности область, состоящую из аминокислот в положениях 1-263 из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2), амплифицировали способом ПЦР. Для амплификации использовали следующие праймеры.
Прямой праймер:
5'-ttcctccgccccaccatggc-3' (SEQ ID NO: 3)
Обратный праймер:
5'-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3 ' (SEQ id NO: 5)
В этом процессе к обратному праймеру добавляли последовательность, расщепляемую ферментом рестрикции XhoI. Фрагмент ДНК, амплифицированный способом ПЦР, разделали агарозным гельэлектрофорезом, а затем его очищали с использованием набора для экстракции из геля Gel Extraction Kit QIAquick (зарегистрированный торговый знак) (QIAGEN). Очищенный фрагмент ДНК субклонировали в вектор PCR Blunt vector (Invitrogen) (pCRB-hTROP-2 EC), и последовательность гена подтверждали. Затем фрагмент EcoRI/XhoI, содержащий фрагмент гена, кодирующий внеклеточную область hTROP-2, вырезали из pCRB-hTROP-2 EC, а затем его встраивали в участок EcoRI/XhoI вектора pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4mH-hTROP-2 EC). Далее, для получения участка расщепления ферментом рестрикции NruI, следующие олигонуклеотиды соединяли и встраивали в участок BamHI/EcoRI pcDNA4mHhTROP-2 EC.
Олигонуклеотид 1:
Олигонуклеотид 2:
5'-aattccaccactcgcgactagtg-3' (SEQ IDno: 7)
Аналогично линкер pBgl II (TAKARA) встраивали в участок PmeI pcDNA4mH-hTROP-2 EC (pcDNA4mH-NB-hTROP-2 EC). Для получения рекомбинантного белка с использованием бакуловируса, фрагмент NruI/BgIII, содержащий фрагмент гена, кодирующий внеклеточную область hTROP-2, вырезали из pcDNA4mH-NB-hTROP-2 ЕС, а затем встраивали в участок NruI/BgIII вектора pPSC8 (Nosan Corporation) (pPSC8-hTROP-2 EC). Продуцирование рекомбинантного белка внеклеточной области hTROP-2 с использованием бакуловируса было поручено Nosan Corporation.
Рекомбинантный белок внеклеточной области hTROP-2 очищали следующим образом. Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Biosciences) добавляли в культуральный супернатант, содержавший рекомбинантный белок, так что им позволяли связываться друг с другом при 4°C в течение 2 ч. После этого полученный материал промывали фосфатным буфером, содержавшим 20 мМ имидазол, с использованием EconoColumn (BIO RAD), а затем его элюировали с помощью фосфатого буфера, содержавшего 300 мМ имидазол, с тем чтобы его очистить.
Пример 4. Выделение кДНК ЕрСАМ человека и конструирование вектора экспрессии.
Полноразмерный ген ЕрСАМ человека выделяли из эмбриональной печени человека (10-недельный эмбрион) способом ОТ-ПЦР. Сначала конструировали следующие праймеры для ПЦР, исходя из последовательности гена ЕрСАМ человека (номер доступа Genbank № NM002354).
- 20 031043
Прямой праймер:
5'-tcctcgtgtcccactcccgg-3' (SEQ ID NO: 8)
Обратный праймер:
5'-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3' (SEQ ID no: 9)
Когда конструировали праймеры, к обратному праймеру добавляли последовательность, расщепляемую ферментом рестрикции XhoI, за исключением стоп-кодона. кДНК синтезировали из общей РНК (TAKARA), полученной из печени эмбриона человека (10-недельный эмбрион). С использованием этой кДНК в качестве матрицы, проводили реакцию ПЦР с упомянутыми выше праймерами. После этого проводили разделение с помощью агарозного гель-электрофореза и извлечение полосы представляющего интерес фрагмента, а затем его клонировали в вектор pCRII (Invitrogen) (pCRII-hEpCAM). Клонированную кДНК ЕрСАМ человека подтверждали секвенированием.
Вектор экспрессии конструировали путем вырезания фрагмента EcoRI/XhoI, содержащего ген ЕрСАМ из pCRII-hEpCAM, а затем встраивания этого фрагмента в участок EcoRI/XhoI вектора pcDNA4/myc-His© A (Invitrogen) (pcDNA4-hEpCAM-myc/His). Более того, фрагмент HindIII/PmeI, содержащий ген ЕрСАМ человека, вырезали из pcDNA4-hEpCAM-myc/His (где участок расщепления HindIII имел тупой конец), а затем фрагмент встраивали в участок PmeI вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen), так чтобы сконструировать вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к неомицину (pcDNA3.1hEpCAM-myc/His).
Пример 5.
Получение моноклонального антитела против hTROP-2.
В качестве иммуногенов использовали клеточные линии, способные стабильно экспрессировать hTROP-2 (клетки НЕК293-hTROP-2, клетки CHO-K1-hTROP-2 и клетки 7E2-C-hTROP-2); клеточную линию рака поджелудочной железы человека, эндогенно экспрессирующую белок hTROP-2 на клеточной поверхности (РК-59, RCB1901; приобретенную в банке клеток RIKEN); и рекомбинантный белок внеклеточной области hTROP-2, полученный описанным выше способом.
В случае клеточных линий, способных стабильно экспрессировать hTROP-2, использовали 1Х107 клеток, и в случае рекомбинантного белка hTROP-2 использовали 20 мкг белка. Клеточные линии или рекомбинантный белок смешивали с адъювантом TiterMax Gold (Funakoshi Corporation) в соотношении при смешивании 1:1, с тем чтобы получить эмульсию. Затем эмульсию инъецировали в две подушечки лап или брюшную полость мыши (C57/BL6, Balb/c) (первоначальная иммунизация). Когда иммунизацию проводили путем инъекции в две подушечки лап в течение короткого периода времени, через от трех до десяти суток после первоначальной иммунизации проводили вспомогательную инъекцию. На следующие сутки после конечной иммунизации собирали лимфатические узлы обоих колен, а затем получали лимфоциты. Когда иммунизацию проводили путем инъекции в брюшную полость в течение длительного периода времени, вспомогательные инъекции проводили с интервалами один раз в неделю после первоначальной иммунизации (где вспомогательные инъекции проводили в течение от 1 до 2 месяцев). После этого из селезенки выделяли В-клетки стандартным способом. В случае иммунизации с использованием клеток в качестве иммуногенов, в качестве вспомогательных инъекций использовали суспензию клеток, которая представляла собой PBS, содержавший 5Х106 клеток. В случае использования белка в качестве иммуногена, использовали раствор 5 мкг в PBS.
Полученные лимфоциты смешивали с клеточной линией миеломы мыши (P3-X63-Ag8.653) в соотношении при смешивании 3:1, а затем проводили слияние клеток в соответствии со способом с полиэтиленгликолем. После этого слитые клетки культивировали в течение 7-2 8 суток в среде с метилцеллюлозой (торговое название: ClonaCell-HY Cloning Medium D; Stem Cell), которая содержала HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Каждую из единичных колоний растущих гибридом отбирали и помещали в 96-луночный планшет с плоским дном, и с использованием жидкой селективной среды, содержавшей HAT, гибридомы культивировали в инкубаторе с 5% CO2. Культуральный супернатант растущих гибридом из единичных колоний подвергали первичному скринингу с помощью Cell ELISA (описанного ниже), а затем вторичному скринингу с помощью анализа FACS с использованием клеток HuH-7-hTROP-2, PK-59, тем самым получив 300 типов гибридом, которые продуцировали моноклональные антитела против hTROP-2, распознающие белки hTROP-2, экспрессируемые на поверхности живых клеток.
Пример 6. Первичный скрининг с использованием Cell ELISA.
Клетки СНО-1<1 (отрицательный контроль для hTROP-2; приобретенные от Japan Health Sciences Foundation) и клетки CHO-K1-hTROP-2 (или клетки HUH-7 (отрицательный контроль для hTROP-2, приобретенные от Japan Health Sciences Foundation) и клетки HuH-7-hTROP-2) поочередно инокулировали в 96-луночный культуральный планшет (BD Falcon) с плотностью клеток 3Х104 клеток/лунка, а затем клетки культивировали в атмосфере с 5% CO2 при 37°C в течение 1-2 суток. Среду для культивирования клеток удаляли декантацией. После этого клетки промывали ледяным PBS, а затем обрабатывали 4% параформальдегидом в PBS в течение 5 мин для иммобилизации клеток. Клетки промывали PBS, охлажденным на льду, а затем подготавливали планшет для ELISA. После этого проводили ELISA стандартным способом. Конкретные методики описаны ниже.
- 21 031043
Сначала проводили блокирование 2% раствором обезжиренного молока в PBS при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч. Затем к нему добавляли культуральный супернатант гибридомы, а затем их подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем полученный материал промывали три раза 0,1% раствором Tween20 в PBS. В качестве вторичного антитела, меченное пероксидазой хрена (HRP) антитело против IgG мыши (GE Healthcare Biosciences), разбавленное в 1000 раз блокирующим раствором, добавляли к полученному материалу, а затем подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого полученный материал промывали три раза 0,1% раствором Tween20 в PBS. В реакционный раствор добавляли раствор субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин: SIGMA) для проведения цветной реакции, а затем реакцию останавливали добавлением 1 М серной кислоты. После этого измеряли поглощение (405 нм) с использованием устройства для считывания микропланшетов Microplate reader Model 550 (BIO RAD). Гибридомы, соответствующие культуральному супернатанту гибридом, проявляющему высокую величину поглощения относительно отрицательного контроля, подвергали крупномасштабному культивированию в 24-луночном планшете с плоским дном, а затем подвергали вторичному скринингу с использованием FACS-анализа.
Пример 7. Вторичный скрининг с использованием FACS-анализа.
Гибридомы, которые были определены как положительные в описанном выше первичном скрининге с использованием Cell ELISA, подвергали вторичному скринингу с использованием FACS-анализа. При оценке клеток гибридомы, в качестве отрицательных контрольных клеток использовали клетки HuH-7, которые представляли собой клетки рака печени человека, которые не экспрессируют hTROP-2, и в качестве индикатора использовали реактивность в отношении клеток HuH-7-hTROP-2, которые стабильно экспрессировали hTROP-2. Затем проводили оценку на основе реактивности в отношении клеток РК-59 (RCB1901; приобретенные в клеточном банке RIKEN), которые представляли собой клетки рака поджелудочной железы человека, эндогенно экспрессирующие белок hTROP-2 на клеточной поверхности.
Клетки извлекали из культуральной чашки с помощью обработки трипсином, а затем получали суспензию клеток (плотность клеток: 2х106 клеток/мл). Культуральный супернатант гибридом, которые оказались положительными при первичном скрининге с использованием Cell ELISA, подвергали реакции с 100 мкл суспензии клеток при 4°C в течение 20 мин. Реакционную смесь промывали PBS, а затем ее подвергали реакции с меченным РЕ антителом против IgG мыши (BD Pharmingen) (0,1 мкг) (4°C, 30 мин). После этого реакционную смесь анализировали с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
В итоге, было установлено приблизительно 300 типов гибридом, которые продуцируют моноклональное антитело против hTROP-2, распознающее белок hTROP-2, экспрессированный на поверхности живых клеток.
Пример 8. Идентификация изотипа.
Изотип продуцированного моноклонального антитела против hTROP-2 идентифицировали с использованием MOUSE MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (Serotec) в соответствии со способом, описанным в упоминаемом выше наборе.
Пример 9. Формирование асцитов и очистка антитела против TROP-2.
Клоны гибридом, полученные описанным выше способом, вводили с плотностью 3х106 клонов в брюшную полость мышей BALB/c nude, которым ранее (за семь суток) был введен 2,6,10,14тетраметилпентадекан (пристан). Через две недели асцитическую жидкость собирали. Более того, эту асцитическую жидкость подвергали осаждению с каприловой кислотой, а затем аффинной очистке с использованием колонки с белком G (HiTrap protein G; GE Healthcare Biosciences) или колонки с белком А (HiTrap protein A; GE Healthcare Biosciences) с получением моноклональных антител против hTROP-2 из отдельных клонов гибридом.
Пример 10. Измерение аффинности связывания антигена (измерение величины Kd).
Аффинность связывания антигена (величину Kd) полученного моноклонального антитела против hTROP-2, вычисляли способом с использованием ELISA (Djavadi-Ohaniance L. et al. (1996), In Antibody Engineering, Chapter 4, pp. 77-97. IRL Press, Oxford).
В частности, очищенный рекомбинантный белок hTROP-2 (0,1 мкг/мл) добавляли в 96-луночный планшет для культивирования (Corning), чтобы иммобилизовать антиген на твердую фазу (при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4°C в течение ночи). Затем полученный планшет промывали PBS три раза, а затем в него добавляли 2% обезжиренное молоко (раствор в PBS) для блокирования (при комнатной температуре в течение 1 ч). Полученный планшет промывали PBS два раза. После этого в описанный выше планшет для ELISA добавляли комплекс антиген-антитело который был ранее получен путем смешения раствора антигена (очищенный белок hTROP-2; 50, 25, 12,5, 6,25 или 3,125 нМ) с каждым клоном (0,5 нМ) моноклонального антитела против hTROP-2, а затем уравновешивания смеси, и их подвергали реакции (при комнатной температуре в течение 1 ч). Продукт реакции промывали PBS три раза, а затем его подвергали реакции с меченным HRP антителом против IgG мыши (конечная концентрация: 1 мкг/мл) (GE Healthcare Biosciences), разбавленным блокирующим раствором (при комнатной
- 22 031043 температуре в течение 1 ч). Затем продукт реакции промывали 0,1% раствором Tween20 в PBS, а затем в полученный планшет добавляли раствор субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин: SIGMA) для проведения цветной реакции. Затем к продукту реакции добавляли 1 М серную кислоту для завершения реакции. С использованием устройства для считывания планшетов Microplate reader Model 550 (BIO RAD) измеряли поглощение.
Для измерения константы диссоциации (Kd) использовали следующие выражения.
В соответствии с законом действующих масс, реакция антиген-антитело представляется с помощью следующих выражений.
kl
Ag (Антиген) + Ab (Антитело) <=> Ag-Ab (Комплекс антиген-антитело) - ---(1) к2
Kd = k2/kl = AgfxAbf / Ag-Ab = AgfxAbf / x .......(2)
В выражении (2) Agf соответствует концентрации свободного антигена, Abf соответствует концентрации свободного антитела, и Ag-Ab соответствует концентрации комплекса антиген-антитело. Если Ag-Ab=x, то концентрация свободного антитела представляется следующим выражением.
Abf=Abt-x (3)
Таким образом, описанное выше выражение (2) может представлять собой
Kd- Agf x(Abt—х)/х (4)
Если обе стороны выражения (4) умножить на x/KdxAbt, х / Abt = Agfx(l — x/Abt)x 1/Kd x/Abtxl/Agf = (1 — x/Abt)xl/Kd (5)
Если X=x/Abt и Y=x/AbtxAgf в выражении (5),
Y = (l-X)xl/Kd (6)
Исходя из выражения (6), вычисляли величину Kd.
Величины Kd полученных 300 клонов моноклонального антитела против hTROP-2 измеряли описанным выше способом. В результате 133 клона проявляли величину Kd 1x10-10 (М) или менее, 59 клонов проявляли величину Kd 1 x10-11 (M) или менее, и 2 клона проявляли величину Kd 1 x10-12 (М) или менее.
Среди моноклональных антител против hTROP-2, которые проявляли активность ингибирования роста опухоли in vivo, были выявлены величины Kd для 5-70 (IgG2a мыши), T6-16 (IgG2a мыши), К5-107 (IgG1 мыши), К5-116-2-1 (IgG1 мыши) и Т5-86 (IgG1 мыши), составляющие 6, 8x10-12 (М), 4,3x10-12 (М), 4,7x10-12 (М), 2,69x10-11 (М) и 8,49x10-11 (М) , соответственно (фиг. 1 и табл. 1).
Таблица 1. Величины Kd для моноклональных антител против hTROP-2
№ клона K5-70 T6-16 K5-107 K5-116-2-1 T5-86
Kd (χ10-12Μ) 6, 8 4,3 4,7 26, 9 84, 9
Пример 11. Реактивность моноклональных антител против hTROP-2 в отношении злокачественных клеточных линий человека.
Злокачественные клеточные линии человека (опухолевые клеточные линии человека), использованные в этих исследованиях, были приобретены в Health Science Research Resources Bank (HSRRB), клеточном банке RIKEN (RIKEN), ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures) и DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). В частности, использовали следующие клеточные линии.
huH-1 (HSRRB), HUH-6 (HSRRB), HuH-7 (HSRRB), JHH-5 (HSRRB), JHH-6 (HSRRB), JHH-7(HSRRB) , HLE (HSRRB), HLF (HSRRB), HepG2 (HSRRB), Alexander (HSRRB), KP-1N (HSRRB), KP-1NL (HSRRB) , KP-2 (HSRRB) , KP-3 (HSRRB) , KP-3L (HSRRB) , PK-1 (RIKEN) , PANC-1 (RIKEN) , MIA PaCa-2 (HSRRB) , PK-59 (RIKEN) , PK45H (RIKEN) , PK-45P (RIKEN) , BxPC-3 (ATCC) , SUIT-2 (HSRRB) , TCC-PAN2 (HSRRB), SW480 (ATCC), DLD-1 (HSRRB), LoVo (HSRRB), COLO-320 (RIKEN), CACO-2 (RIKEN), CW-2 (RIKEN), HCT 116 (ATCC), HCC-56 (HSRRB), MCF-7 (HSRRB), JIMT-1 (DSMZ), HCC1143 (ATCC), A549 (HSRRB), DU145 (RIKEN) и PC-3 (HSRRB).
Злокачественные клетки извлекали из культуральной чашки с помощью обработки трипсином, а затем получали суспензию клеток (плотность клеток: 2x106 клеток/мл). К 100 мкл суспензии клеток добавляли моноклональное антитело против hTROP-2 (0,1 мкг), а затем им позволяли реагировать при 4°C в
- 23 031043 течение 20 мин. Реакционный раствор промывали PBS, а затем его подвергали реакции с меченным РЕ антителом против IgG мыши (BD Biosciences Pharmingen) (0,1 мкг) (при 4°C в течение 30 мин). После этого полученный материал анализировали с помощью FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company).
Все из полученных антител против hTROP-2 не связывались с клеточной линией рака печения человека HuH-7, которая не экспрессировала эндогенно hTROP-2. С другой стороны, антитела против hTROP-2 связывались с клетками HuH-7-hTROP-2, в которых стабильно экспрессировался ген hTROP-2 (фиг. 2). После этого реактивность полученных моноклональных антител против hTROP-2 в отношении клеточных линий злокачественной опухоли человека (в которых на клеточной поверхности эндогенно экспрессировался белок hTROP-2) исследовали с помощью FACS-анализа. В результате все из полученных 300 типов моноклональных антител против hTROP-2 связывались с клеточными линиями рака поджелудочной железы человека (PK-59 и BxPC-3). В частности, все из антител K5-70, Т6-16, K5-107, K5116-2-1 и Т5-86, которые проявляли активность ингибирования роста опухоли in vivo, связывались со злокачественными клеточными линиями человека на высоких уровнях. Например, по сравнению со случаем, когда злокачественные клеточные линии подвергали реакции только с меченным РЕ антителом против IgG мыши (BD Biosciences Pharmingen), упомянутые выше антитела проявляли следующую способность связывания в отношении клеток РК-59 и клеток BxPC-3 при средней интенсивности флуоресценции: К5-70 (44 раз), T6-16 (59 раз), К5-107 (89 раз), К5-116-2-1 (122 раза) и Т5-86 (15 раз) (для клеток РК-59; фиг. 3); и К5-70 (45 раз), T6-16 (25 раз), К5-107 (90 раз), К5-116-2-1 (121 раз) и Т5-86 (10 раз) (для клеток BxPC-3; фиг. 4).
Что касается злокачественных клеточных линий человека, отличных от РК-5 9 и BxPC-3, среди 12 типов клеточных линий рака поджелудочной железы моноклональные антитела против hTROP-2 связывались с KP-2, KP-3L, РК-1, РК-45Н, SUIT-2 и TCC-PAN2, и не связывались с KP-1N, KP-1NL, KP-3, PANC-1 и MIA-РаСа2 (фиг. 5). Среди клеточных линий рака толстого кишечника человека моноклональные антитела против hTROP-2 связывались с САСО-2, SW480, DLD-1 и НСТ 116, и не связывались с COLO-320 и CW-2 (фиг. 6). Более того, моноклональные антитела против hTROP-2 связывались с JIMT-1 и НСС1143 (обе из которых представляли собой клеточные линии рака молочной железы человека) и с РС-3 и DU145 (обе из которых представляли собой клеточные линии рака предстательной железы человека). Таким образом, они распознавали белки hTROP-2, эндогенно экспресирующиеся на клеточной поверхности многих типов злокачественных клеточных линий человека (фиг. 6).
Пример 12. Перекрестная реактивность с белком TROP-2 мыши и белком TROP-1/EpCAM человека.
Для исследования специфичности полученных моноклональных антител, реактивность антител в отношении белка TROP-2 мыши, демонстрирующего гомологию 80% на уровне аминокислотной последовательности с белком hTROP-2, и в отношении белка TROP-1/ЕрСАМ, демонстрирующего гомологию 50% на уровне аминокислотной последовательности с белком hTROP-2, исследовали с помощью FACSанализа.
В частности, каждый из вектора экспрессии (TROP-2 мыши-pcDNA3.1(+), предоставляемый Institute of Molecular and Cellular Biosciences, the University of Tokyo), содержащего полноразмерную кДНК гена TROP-2 мыши (код доступа GenBank № NM020047, Y08830), и вектора экспрессии (pcDNA3.1hEpCAM-myc/His), содержащего полноразмерную кДНК гена TROP-1/EpCAM человека (номер доступа GenBank № NM002354), временно вводили в клетки СНО-K с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Через 24-48 ч после этого клетки извлекали из культуральной чашки путем обработки их трипсином, а затем получали суспензию клеток. Полученную таким образом суспензию клеток последовательно подвергали реакции с продуцированным моноклональным антителом против hTROP-2 (0,1 мкг) и с меченным РЕ антителом против IgG мыши, а затем его анализировали с помощью FACSCalibur.
Антитело Т2-102 (IgG1 мыши), использованное в качестве положительного контроля, которое продемонстрировало перекрестную реактивность в отношении TROP-2 мыши, проявляло высокую способность к связыванию клеток СНО-К1, в которых временно экспрессировался ген TROP-2 мыши. С другой стороны, антитела К5-70, Т6-16, К5-107, К5-116-2-1 и Т5-86 антитела не продемонстрировали какой-либо перекрестной реактивности с TROP-2 мыши (фиг. 7).
Аналогично, моноклональное антитело против ЕрСАМ человека (BD Biosciences Pharmingen), используемое в качестве положительного контроля, проявляло высокую способность к связыванию с клетками СНО-К1, в которых временно экспрессировался EpCAM/TROP-1 человека. С другой стороны, антитела К5-70, Т6-16, К5-107, К5-116-2-1 и Т5-86 не продемонстрировали такой перекрестной реактивности с EpCAM/TROP-1 человека (фиг. 8).
Указанные выше результаты продемонстрировали, что полученные моноклональные антитела против hTROP-2, и, в частности, антитела К5-70, Т6-16, К5-107, К5-116-2-1 и Т5-86, которые проявляли противоопухолевую активность in vivo, специфично связывались с hTROP-2.
Пример 13. Измерение активности ингибирования роста клеток.
В качестве способа исследования активности моноклонального антитела против hTROP-2 в отношении ингибирования функции hTROP-2, оценивали влияние антитела на рост клеток злокачественной опухоли человека, которые эндогенно экспрессируют hTROP-2 на поверхности клетки, путем измерения
- 24 031043 количества живых клеток с использованием TetraColor ONE (Seikagaku Corporation). В частности, клетки РК-59 суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 0,5% эмбриональную телячью сыворотку (изготовленную BioWest) в концентрации клеток 2х105 клеток/мл, а затем 100 мкл полученной суспензии клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Затем в лунки добавляли IgG мыши (отрицательный контроль) и моноклональное антитело против hTROP-2 (конечные концентрации: 0,1 и 1 мкг/мл), а затем смеси культивировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO2 в течение 72 ч. В качестве контроля использовали коммерчески доступное моноклональное антитело против hTROP-2 (клон YY01, Santa Cruz). В лунки добавляли TetraColor ONE (Seikagaku Corporation), а затем их подвергали реакции в инкубаторе с 5% CO2 в течение 1-2 ч. После завершения реакции 96-луночный культуральный планшет прямо подвергали измерению поглощения при длине волны 490 нм (контрольная длина волны: 655 нм), с использованием устройства для считывания микропланшетов. Эксперимент проводили с использованием 3 лунок для каждой группы. Тест на значимость отличий проводили согласно t-критерию Стьюдента, и в качестве статистически значимого было определено Р<0,05.
Среди моноклональных антител против hTROP-2, которые были получены в компании авторов изобретения до настоящего времени, приблизительно 160 клонов исследовали описанным выше способом с точки зрения их эффекта на рост клеток РК-59. В результате было подтверждено, что T6-16, Т5-86, К5-70 и К5-107, которые проявляли активность ингибирования роста опухоли in vivo, обладают активностью ингибирования роста клеток 20%-40%, по сравнению с IgG мыши (отрицательный контроль). Стало очевидным, что эти антитела против hTROP-2 обладают активностью связывания белков hTROP-2, которые экспрессируются на поверхности злокачественных клеток человека, нейтрализации белков hTROP-2 и ингибирования роста злокачественных клеток (фиг. 9).
Пример 14. Анализ зарастания царапины.
Эффект моноклонального антитела против hTROP-2 на миграционную способность злокачественных клеток человека оценивали с помощью анализа зарастания царапины. Клетки РК-59 суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку в концентрации клеток 3х105 клеток/мл, а затем в каждую лунку 96-луночного культурального планшета добавляли 100 мкл приготовленной суспензии клеток. Когда клетки достигали смыкания монослоя, часть культивируемых в качестве монослоя клеток счищали путем нанесения на планшет царапины в продольном направлении верхушкой наконечника. Моноклональное антитело против hTROP-2 и IgG мыши, использованный в качестве отрицательного контроля, добавляли в среду до конечных концентраций 0,1 и 1 мкг/мл, соответственно, а затем проводили культивирование в течение 24 ч. Перед добавлением антитела (0 сутки) и после 24 ч культивирования (1 сутки), область со счищенными клетками фотографировали, а затем измеряли расстояние между клетками. Более того, площадь такой счищенной области количественно определяли с использованием программного обеспечения Scion Image. Эксперимент проводили с использованием 8 лунок для каждой группы. Тест на значимость отличий проводили согласно t-критерию Стьюдента, и в качестве статистически значимого было определено Р<0,05.
Исследовали эффект антитела hTROP-2 в отношении миграционной способности клеток, оккупирующих царапину. Как в случае анализа ингибирования роста клеток, оценивали антитела, обладающие благоприятными эффектами. В качестве способа оценки, клетки фотографировали на 0 сутки (когда добавляли антитело) и на 1 сутки (через 24 ч после добавления антитела), и миграционное расстояние (мкм) и площадь царапины определяли с помощью анализа изображений. В результате, как показано на фиг. 10, наблюдали очевидные отличия с точки зрения миграционной способности клеток. Антитела T616 и К5-70, которые использовали в данном испытании, имели значительную активность ингибирования роста по сравнению с контролем. Даже в исследовании воспроизводимости наблюдали ту же тенденцию. В частности, T6-16 имело результат Р<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента), и была выявлена корреляция с испытанием in vivo.
Пример 15. Оценка благоприятных эффектов моноклонального антитела против hTROP-2 на имеющих опухоль мышей.
Модель предупреждения.
Клеточные линии рака поджелудочной железы (PK-59 и BxPC-3), которые экспрессировали hTROP2, удаляли обработкой клеток трипсином, и к ним добавляли PBS для получения суспензии клеток, имеющей концентрацию 1х108 клеток/мл. Полученную таким образом суспензию клеток смешивали с равным количеством матригеля (BD Biosciences Pharmingen) на льду. С использованием шприца 26 G 100 мкл полученной смеси (5х106 клеток) инъецировали подкожно в правый бок каждой самки мыши nude в возрасте 6 недель (Balb/c, nu/nu). В день трансплантации злокачественных клеток (1 сутки), мышей подразделяли на группы и начинали введение антитела (1, 5 или 10 мг/кг массы тела, внутрибрюшинное введение). После этого введение антитела продолжали с интервалами раз в трое суток. Противоопухолевую активность оценивали на основе частоты образования опухоли и объема опухоли. Объем опухоли вычисляли по следующей формуле.
Объем опухоли (мм3) = (меньшая ось)2х(большая ось)хл/6
Модель лечения.
- 25 031043
Клеточные линии рака поджелудочной железы (PK-59 и BxPC-3), которые экспрессировали hTROP2, удаляли обработкой клеток трипсином, и к ним добавляли PBS для получения суспензии клеток, имеющей концентрацию 1х108 клеток/мл. Полученную таким образом суспензию клеток смешивали с равным количеством матригеля (BD Biosciences Pharmingen) на льду. С использованием шприца 26 G 100 мкл полученной смеси (5х106 клеток) инъецировали подкожно в правый бок каждой самки мыши nude в возрасте 6 недель (Balb/c, nu/nu). От пяти до шести суток после трансплантации злокачественных клеток мышей объем опухоли которых увеличился до 50-150 мм3 (среднее значение: приблизительно 100 мм3), подразделяли на группы. День, когда мышей подразделяли на группы, определяли как первые сутки (1 сутки) и начинали введение антитела. Антитело вводили внутрибрюшинно с интервалами раз в трое суток (10 мг/кг массы тела). Противоопухолевую активность оценивали путем измерения объема опухоли. Тест на значимость отличий проводили согласно t-критерию Стьюдента, и в качестве статистически значимого было определено Р<0,05.
Пример 16. Анализ противоопухолевой активности моноклонального антитела hTROP-2 in vivo в модели с ксенотрансплантацией клеток рака поджелудочной железы человека.
Для антитела, используемого для лечения злокачественной опухоли, которое нацелено на hTROP-2, необходимо иметь активность специфического уничтожения опухолевых тканей, экспрессирующих hTROP-2, или ингибирования роста опухоли.
Моноклональные антитела против hTROP-2 (приблизительно 160 клонов), которые были вновь получены в рамках настоящего изобретения, оценивали с использованием моделей лечения с ксентрансплантатами клеточной линии рака поджелудочной железы РК-59. Клетки РК-59 экспрессируют на их поверхности ЕрСАМ (фиг. 11 А), действующий в качестве маркера стволовых клеток рака поджелудочной железы (Chenwei Li, et al., Cancer Res 2007; 67: (3). 1030-1037), и также экспрессируют Ргликопротеин/MDR1 (фиг. 11В) и ABCG2/CDw338 (фиг. НС) (Chen, С. J. et al., Cell 47 (3), 381-389 (1986), Allikmets, R., et al., Hum. Mol. Genet. 5 (10), 1649-1655 (1996)), которые представляют собой ABCтранспортеры, связанные с устойчивостью к лекарственным средствам. Кроме того, клетки РК-59 содержат фракцию клеток (8,93%) (фиг. 11D), положительных как по CD24, так и по CD44, что является характерным для стволовых клеток рака поджелудочной железы, и предположительно они являются клеточной линией высоко злокачественного рака поджелудочной железы человека (Chenwei Li, et al., Cancer Res 2007; 67: (3). 1030-1037, Jane E. Visvader и Geoffrey J. Lindeman. Nat Rev Cancer. Vol. 8 (10) :755-68, 2008).
Большинство из вновь полученных приблизительно 160 клонов не проявляли благоприятных эффектов в моделях лечения с ксенотрансплантатом клеток РК-59. Среди таких клонов можно было получить клоны, проявляющие значительную активность ингибирования роста опухоли, а именно, клоны K570, T6-16, K5-107, Т5-86 и K5-116-2-1.
В группе введения клона К5-70 (IgG2a мыши), скорость роста опухоли ингибировалась на статистически значимом уровне. На 21 сутки после начала введения (сутки 21), объем опухоли в контрольной группе (N=14) составлял 1200,8±377,3 мм3, в то время как объем опухоли в группе введения клона К5-70 составлял 748,7±1б2,9 мм3 (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) (фиг. 12А). Когда объем опухоли во время начала введения антитела определяли как 1,0, объем опухоли на 21 сутки (сутки 21) составлял 7,8 в группе введения клона K5-70, в то время как объем опухоли в контрольной группе составлял 12,5 (фиг. 12А) . Масса вырезанной опухоли составляла 0,43±0,14 г (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) в группе введения клона K5-70, в то время как масса вырезанной опухоли в контрольной группе составляла 0,73±0,26 г. Таким образом, клон K5-70 проявлял активность ингибирования приблизительно 60% (фиг. 12В).
Аналогично, скорость роста опухоли ингибировалась на статистически значимом уровне даже в группе введения клона К5-107 (IgG1 мыши) (N=8), группе введения клона T6-16 (IgG2a мыши) (N=8), группе введения Т5-86 (IgG1 мыши) и группе введения клона K5-116-2-1 (IgG2a мыши) (N=8). На 17 сутки после начала введения (сутки 17), объем опухоли в группе введения клона К5-107 (N=8) и в группе введения клона T6-16 (N=8) составлял 698,2±175,9 мм3 (Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента) и 707,2±254,5 мм3 (Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента), соответственно, в то время как объем опухоли в контрольной группе составлял 1039,3±271,6 мм3. Аналогично, на 16 сутки после начала введения (сутки 16), объем опухоли клона в группе введения K5-116-2-1 (N=8) составлял 508,5±225,2 мм3 (Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента), в то время как объем опухоли в контрольной группе (N=8) составлял 797,0±172,9 мм3 (фиг. 13).
С другой стороны, в случае клона Т5-86, на 15 сутки после начала введения (сутки 15), объем опухоли в группе введения клона Т5-86 (N=8) составлял 744,1±289,1 мм3, в то время как объем опухоли в контрольной группе (N=8) составлял 1033,2±319,4 мм3. Таким образом, не было выявлено значимых отличий с точки зрения объема опухоли. Однако при сравнении массы опухоли, измерение которой проводили в тот же день, масса опухоли в группе введения клона Т5-86 составляла 0,44±0,13 г (Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента), в то время как масса опухоли в контрольной группе составляла 0,62±0,14 г. Таким образом, клон Т5-86 проявлял значительную активность ингибирования.
- 26 031043
Более того, с точки зрения как объема опухоли, так и массы опухоли, соотношение (Т/С) для каждой группы введения клона антитела и контрольной группы в последний день эксперимента представлено в табл. 2 ниже. Как показано в табл. 2, антитело каждого клона проявляло значительную активность ингибирования (Т/С = 62%-72%) в каждой группе введения клона антитела.
Таблица 2
Группа N (количество мышей) Объем опухоли Т/С (%) Масса опухоли Т/С (%)
К5-70 14 62,3** 58,8**
К5-107 8 67,2* 65, 0*
Т6-16 8 68,0* 64,7*
Т5-86 8 72,0 70,5*
К5-116-2-1 8 63, 8* 60,5*
*P<0,05, **P<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента)
Более того, анализировали противоопухолевую активность каждого из клонов K5-70, T6-16 и K5116-2-1 в моделях предупреждения с ксенотрансплантатами клеточной линии рака поджелудочной железы PK59. После завершения введения каждого клона антитела, рост опухоли ингибировался у всех индивидуумов (N=8). На 18 сутки после начала введения (сутки 18) объем опухоли в группе введения клона К5-70 (10 мг/кг массы тела) составлял 62,4±80,4 мм3 (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), в то время как объем опухоли в контрольной группе (N=8) составлял 880,8±206,4 мм3. Таким образом, клон K5-70 проявлял активность ингибирования роста опухоли 92,9%. На 28 сутки после начала введения (сутки 28) объем опухоли в группе введения клона T6-16 (10 мг/кг массы тела) составлял 152,4± 122,3 мм3 (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), в то время как объем опухоли в контрольной группе (N=8) составлял 992,3±250,8 мм3. Таким образом, клон T6-16 проявлял активность ингибирования роста опухоли 84,6%. На 20 сутки после начала введения (сутки 20) объем опухоли в группе введения клона K5-116-2-1 (10 мг/кг массы тела) составлял 207,7±319,2 мм3 (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), в то время как объем опухоли в контрольной группе (N=8) составлял 1159,4±413,3 мм3. Таким образом, клон K5-116-2-1 проявлял активность ингибирования роста опухоли 82,1% (фиг. 14 и табл. 3). Более того, во всех экспериментах не было значимых отличий между контрольной группой и группой введения каждого из антител против hTROP-2 с точки зрения изменения средней массы тела на протяжении периода исследования.
С точки зрения как объема опухоли, так и массы опухоли, отношение (Т/С) для каждой группы введения клона антитела к контрольной группе в последний день эксперимента представлено в табл. 3 ниже. Как представлено в табл. 3, значимое ингибирование роста опухоли наблюдали в каждой группе введения клона антитела, и особенно значимый эффект, такой как Т/С=10% или менее, был подтвержден в группе введения клона K5-70.
Таблица 3
Группа N (количество мышей) Объем опухоли Т/С (%) Масса опухоли Т/С (%)
К5-70 8 7, 1** 5, 8**
Тб-16 8 15, 3** 10,5**
К5-116-2-1 8 23,2** 21,5**
**P<0,01 (согласно t-критерию Стьюдента)
Известное антитело против TROP-2 AR47A6.4.2 (патент США № 7420041) проявляло эффект ингибирования роста опухоли в дозировке 20 мг/кг в моделях предупреждения с ксенотрансплантатами с использованием различных злокачественных клеточных линий человека. Это антитело против TROP-2 AR47A6.4.2 ингибировало рост опухоли клеточной линии рака поджелудочной железы человека PL45 в процентном отношении практически на 100%. Однако это антитело имело эффект ингибирования опухоли клеточной линии рака поджелудочной железы BxPC-3 в процентном отношении приблизительно 50%, клеточной линии рака предстательной железы РС-3 в процентном отношении приблизительно 40%, клеточной линии рака молочной железы MCF-7 в процентном отношении приблизительно 60% и клеточной линии рака толстого кишечника Со1 о205 в процентном отношении приблизительно 40%. Напротив, антитело против hTROP-2 по настоящему изобретению, описанное в настоящей заявке, проявляло более высокий эффект ингибирования роста опухоли в дозировке, составляющей половину упомянутой выше дозы (10 мг/кг).
Пример 17. Анализ эпитопов.
Получение химерного белка TROP-2 человека/мыши.
Ген TROP-2 человека мыши получали способом ПЦР. Праймеры для ПЦР, представленные ниже, конструировали на основе последовательности гена TROP-2 человека и последовательности гена TROP-2 мыши (номер доступа Genbank № NM020047).
Праймеры для TROP-2-C человека/мыши
- 27 031043
Y606 (прямой): 5'-cctgagcctacgctgcgacgaagtggtgcg-3' (SEQ
ID NO: 10)
Y607 (обратный): 5'-cgcaccacttcgtcgcagcgtaggctcagg-3' (SEQ
ID NO: 11)
Праймеры для TROP-2-A человека/мыши
Y612 (прямой): 5'-gactgctccacgctgacttccaagtgcctg-3' (SEQ
ID NO: 12)
Y613 (обратный): 5'-caggcacttggaagtcagcgtggagcagtc-3’ SEQ
ID NO: 13)
Праймеры для TROP-2-B человека/мыши
Y614 (прямой): 5'-ctcgtggacaacgatggcctctacgacccg-3 ' (SEQ
ID NO: 14)
Y615 (обратный): 5'-cgggtcgtagaggccatcgttgtccacgag-3' (SEQ
ID NO: 15)
Праймеры для TROP-2-D мыши/человека
Y608 (прямой): 5'-ccaaagcctgcgctgcgatgagctggtgcgc-3' (SEQ
ID NO: 16)
Y609 (обратный): 5'-gcgcaccagctcatcgcagcgcaggctttgg-3' (SEQ ID NO: 17)
Праймеры для TROP-2-E мыши/человека
Y616 (прямой): 5'-agcttcctatccgcggtgcactacgagcag-3' (SEQ
ID NO: 18)
Y617 (обратный): 5’-ctgctcgtagtgcaccgcggataggaagct-3' (SEQ
ID NO: 19)
Праймеры для TROP-2-F мыши/человека
Y618 (прямой): 5’-gacattaaaggcgagtctctattccagggc-3' (SEQ
ID NO: 20)
Y619 (обратный): 5'-gccctggaatagagactcgcctttaatgtc-3’ (SEQ
ID NO: 21)
Праймеры для TROP-2 мыши
Прямой праймер: 5-ctactccaccccaccctggcg-3’ (SEQ ID NO: 22)
Обратный праймер: 5'-ctcgagcaagctaggttcgcttctc-3’ (SEQ ID
NO: 23)
К обратному праймеру для TROP-2 мыши добавляли последовательность, расщепляемую ферментом рестрикции XhoI, за исключением стоп-кодона. Схематическое изображение полученных химерных белков TROP-2 человека/мыши представлено на фиг. 17.
Химерный белок hmTROP-2-A представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося с N-конца до аминокислоты в положении 69 белка hTROP-2, и полипептида, располагающегося с аминокислоты в положении 64 до С-конца белка TROP-2 мыши. Химерный белок hmTROP-2-B представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося от N-конца до аминокислоты в положении 101 белка hTROP-2, и полипептида, располагающегося с аминокислоты в положении 96 до С-конца белка TROP-2 мыши. Химерный белок hmTROP-2-C представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося от N-конца до аминокислоты в положении 145 белка hTROP-2, и полипептида, располагающегося от аминокислоты в положении 140 до С-конца белка TROP-2 мыши. Химерный белок mhTROP-2-D представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося от N-конца до аминокислоты в положении 139 белка TROP-2 мыши, и полипептида, располагающегося от аминокислоты в положении 146 до С-конца белка hTROP-2. Химерный белок mhTROP-2-E представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося от N-конца до аминокислоты в положении 187 белка TROP-2 мыши, и полипептида, располагающегося от аминокислоты в положении 194 до С-конца белка hTROP-2. Химерный белок mhTROP-2-F представляет собой химерный белок, который состоит из полипептида, располагающегося от N-конца до аминокислоты в положении 227 белка TROP-2 мыши, и полипептида, располагающегося от аминокислоты в положении 234 до С-конца белка hTROP-2.
Векторы экспрессии, используемые для получения описанных выше химерных белков, специально конструировали с помощью следующих способов. Для получения химерного гена hmTROP-2-A, ген hTROP-2 использовали в качестве матрицы и ПЦР проводили с использованием прямого праймера для
- 28 031043 hTROP-2 и праймера для TROP-2-A человека/мыши Y613. Аналогично, ген TROP-2 мыши использовали в качестве матрицы, и ПЦР проводили с использованием праймера для TROP-2-A человека/мыши Y612 и обратного праймера для TROP-2 мыши. Фрагмент ДНК, амплифицированный способом ПЦР, проявляли с использованием акриламидного геля, а затем представляющую интерес полосу извлекали экстракцией. Затем два типа экстрагированных фрагментов ДНК смешивали для получения матрицы, а затем проводили ПЦР с использованием прямого праймера для hTROP-2 и обратного праймера для TROP-2. Продукт ПЦР проявляли с помощью агарозного гель-электрофореза, а затем представляющий интерес фрагмент ДНК экстрагировали. Экстрагированный фрагмент ДНК клонировали в вектор PCR (зарегистрированный торговый знак)-Blunt (Invitrogen) (pCRB-hmTROP-2-A), а затем последовательность гена подтверждали. Вектор экспрессии для клеток животных получали извлечением гена hTROP-2 из pcDNA3.1-hTROP-2myc/His путем расщепления EcoRI/XhoI, а затем встраивания в него фрагмента EcoRI/XhoI, содержавшего химерный ген hmTROP-2-A, полученный из pCRB-hmTROP-2-A (pcDNA3.1-hmTROP-2-A-myc/His). Кроме того, следующие химерные гены получали тем же способом, который описан выше, и конструировали векторы экспрессии: hmTROP-2-B (с использованием прямого праймера для TROP-2 человека, праймера для TROP-2-B человека/мыши Y615, праймера для TROP-2-B человека/мыши Y614 и обратного праймера для TROP-2 мыши), hmTROP-2-C (с использованием прямого праймера для TROP-2, праймера для TROP-2-C человека/мыши Y607, праймера для TROP-2-C человека/мыши Y606 и обратного праймера для TROP-2), mhTROP-2-D (с использованием прямого праймера для TROP-2 мыши, праймера для TROP-2-D мыши/человека Y609, праймера для TROP-2-D мыши/человека Y608 и обратного праймера для TROP-2 человека), mhTROP-2-E (с использованием прямого праймера для TROP-2 мыши, праймера для TROP-2-E мыши/человека Y617, праймера для TROP-2-E мыши/человека Y616 и обратного праймера для TROP-2 человека), mhTROP-2-F (с использованием прямого праймера для TROP-2 мыши, праймера для TROP-2-F мыши/человека Y619, праймера для TROP-2-F мыши/человека Y618 и обратного праймера для TROP-2 человека) (pcDNA3.1-hmTROP-2-B-myc/His, pcDNA3.1-hmTROP-2-C-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His, pcDNA3.1-mhTROP-2-E-myc/His и pcDNA3.1-mhTROP-2-F-myc/His).
Установление клеточных линий НЕК293, которые конститутивно экспрессируют химерные белки hTROP-2, TROP-2-C человека/мыши и TROP-2-D мыши/человека.
Каждый из описанных выше векторов экспрессии pcDNA3.1 -hTROP-2-myc/His, pcDNA3.1hmTROP-2-C-myc/His и pcDNA3.1-mhTROP-2-D-myc/His вводили в клетки НЕК293. Селекцию проводили с использованием антибиотика G418 (Calbiochem), и были установлены клеточные линии HEK293, конститутивно экспрессирующие белок hTROP-2, химерный белок hmTROP-2-C и химерный белок mhTROP-2-D.
Идентифицировали связывающие области моноклональных антител против hTROP-2 K5-70, Т5-86, K5-107, T6-4, Т6-16 и K5-116-2-1, которые проявляли благоприятные эффекты в моделях лечения с ксенотрансплантатами клеточной линии рака поджелудочной железы PK-59. Сначала исследовали реактивность моноклональных антител против hTROP-2, проявляющих благоприятные эффекты в случае клеток HEK293, которые постоянно экспрессируют химерные белки hmTROP-2-C и mhTROP-2-D, с помощью FACS-анализа (фиг. 18). В результате было выявлено, что K5-70, K5-107, Т5-86 и К5-116-2-1 реагировали с hmTROP-2-C, но что эти антитела не реагировали с mhTROP-2-D. С другой стороны, T6-4 и T6-16 реагировали с mhTROP-2-D, но они не реагировали с hmTROP-2-C. Исходя из этих результатов, область связывания каждого из K5-70, K5-107, Т5-84 и К5-116-2-1 была ограничена до области, располагающейся от N-конца до аминокислоты в положении 145 hTROP-2, и область связывания каждого из T6-4 и T6-16 была ограничена до области, располагающейся от аминокислоты в положении 146 до аминокислоты в положении 274 hTROP-2 (фиг. 18).
Для более подробного анализа областей связывания получали векторы, используемые для экспрессии химерных белков hmTROP-2-А, hmTROP-2-B, mhTROP-2-E и mhTROP-2-F, и анализировали реактивность химерных белков в отношении моноклональных антител против hTROP-2, проявляющих благоприятные эффекты (фиг. 19). Каждый из вновь полученных векторов экспрессии, которые были предназначены для экспрессии химерных белков, вводили в клетки HEK293, а затем проводили FACS-анализ с использованием клеток, которые временно экспрессировали химерные белки. K5-70, K5-107, Т5-86 и K5-116-2-1 реагировали с hmTROP-2-A, но не реагировали с mhTROP-2-B. Все из 6 исследованных типов моноклональных антител реагировали с hTROP-2. Эти результат отчетливо показал, что область связывания K5-70, K5-107, Т5-86 и K5-116-2-1 присутствует в области, располагающейся от N-конца до аминокислоты в положении 69 hTROP-2. Более того, T6-4 и T6-16 не реагировали ни с mhTROP-2-E, ни с mhTROP-2-F. Это показало, что эти антитела распознают область, располагающуюся от аминокислоты в положении 146 до аминокислоты в положении 193 hTROP-2.
Пример 18. Иммуногистохимия.
Материалы/Способ.
Для иммунногистохимического окрашивании использовали следующие наборы нормальных и злокачественных тканей.
Наборы нормальных тканей человека:
человек, нормальные органы в двух экземплярах (каталожный номер №: АВ1, Super Bio Chips);
- 29 031043 нормальные ткани более чем с одним пятном (каталожный номер №: A103(VI), ISU ABXIS).
Наборы тканей рака легкого:
рак легкого человека-метастаз-норма (каталожный номер №: ССА3, Super Bio Chips);
ткань карциномы легкого человека с пограничной тканью, очаги 2 областей (каталожный номер №: OD-CT-RsLug03-002, Shanghai Outdo Biotech)
Набор тканей рака поджелудочной железы:
ткань карциномы поджелудочной железы монопатологического типа от 60 случаев, очаги 2 областей (каталожный номер №: OD-CT-DgPan03-001, Shanghai Outdo Biotech).
Наборы тканей рака печени:
печеночно-клеточная карцинома, степени I-III с контролями в виде нормальной ткани, наборы тканей от 63 случаев (каталожный номер №: CS03-01-002U, Cybrdi);
ткань карциномы печени человека монопатологического типа от 30 случаев, очаги 2 областей (каталожный номер №: OD-CT-DgLiv02-002, Shanghai Outdo Biotech).
Наборы тканей рака толстого кишечника:
рак ободочной и прямой кишки человека (каталожный номер №: CD3, Super Bio Chips);
карцинома толстого кишечника человека с пограничной тканью, очаги 2 областей (каталожный номер №: OD-CT-DgCol03-002, Shanghai Outdo Biotech).
Наборы тканей метастаза в лимфатический узел и метастаза в печень рака толстого кишечника: набор тканей рака толстого и прямого кишечника (толстая и прямая кишка) с согласующимся метастазом в лимфатический узел, 44 случая/99 очага, предметное стекло для исследований (каталожный номер №: CO991t, Biomax us).
Набор тканей рака толстого и прямого кишечника (толстой и прямой кишки) с согласующимся метастазом в лимфатический узел и нормальной соседней тканью, 43 случая/99 очага (каталожный номер №: СО992, Biomax us).
Ткань рака толстого кишечника и метастаза в печень (каталожный номер №: A203(IV), ISU ABXIS).
Наборы тканей рака молочной железы:
рак молочной железы человека-метастаз-норма (каталожный номер №: СВА3, Super Bio Chips); карцинома молочной железы человека с пограничной тканью, очаги 2 областей (каталожный номер №: OD-CT-RpBre03-002, Shanghai Outdo Biotech).
Наборы тканей рака желудка:
рак желудка человека (каталожный номер №: CQ1, Super Bio Chips);
карцинома желудка человека с пограничной тканью, очаги 2 областей (каталожный номер №: ODCT-DgStm03-002, Shanghai Outdo Biotech).
Набор тканей злокачественной опухоли пищевода:
злокачественная опухоль пищевода человека (каталожный номер №: CR1, Super Bio Chips);
карцинома пищевода человека с пограничной тканью, очаги 2 областей (каталожный номер №: ODCT-DgEso03-002, Shanghai Outdo Biotech).
Набор тканей рака яичника:
рак яичника человека (каталожный номер №: CJ1, Super Bio Chips).
Набор тканей рака предстательной железы:
рак предстательной железы человека-норма (каталожный номер №: СА3, Super Bio Chips).
Набор тканей рака мочевого пузыря:
наборы тканей карциномы мочевого пузыря/карцинома переходных клеток, степени I-III с нормальными тканями (каталожный номер №: CC12-01-001U, Cybrdi).
Информацию о пациентах и клиническую информацию, касающуюся описанных выше наборов тканей, получали из листа данных, прилагаемых к ним, и на домашних страницах отдельных компаний.
Способ иммуногистохимического окрашивания.
После завершения депарафинизации, предметные стекла с набором нормальных и злокачественных тканей подвергали обработке протеазой пепсином при 37°C в течение 5 мин. После этого срезы использовали в иммунном окрашивании с использованием моноклонального антитела против hTROP-2. Цветную реакцию проводили с использованием DAB (3,3'-диаминобензидин) в качестве субстрата и в качестве контрастного окрашивания затем проводили окрашивания ядер с использованием гематоксилина.
Более конкретно, эти действия проводили следующим образом. Погруженный в парафин срез подвергали депарафинизации, а затем подвергали обработке протеазой пепсином (DAKO) при 37°C в течение 5 мин. После активации антигена срез обрабатывали при комнатной температуре в течение 20 мин с использованием раствора, полученного добавлением раствора пероксида водорода к метанолу в конечной концентрации 0,3%, так чтобы устранить эндогенную активность пероксидазы. Полученный материал промывали PBS при комнатной температуре в течение 5 минут два раза, а затем его блокировали при комнатной температуре в течение 30 мин с использованием раствора PBS, содержавшего 1,5% нормальную сыворотку лошади (DAKO), чтобы осуществить блокирование неспецифического связывания в тканях. Затем полученный материал подвергали реакции с моноклональным антителом клона К5-63-17 (конечная концентрация: 10 мкг/мл), которое было разбавлено раствором PBS, содержавшим 1,5% нормаль
- 30 031043 ную сыворотку лошади, при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем промывали PBS при комнатной температуре в течение 5 мин три раза. После этого биотинилированное антитело против IgG мыши (Vector), которое было разбавлено в 200 раз раствором PBS, содержавшим 1,5% нормальную сыворотку лошади, подвергали реакции при комнатной температуре в течение 30 мин. Продукт реакции промывали PBS при комнатной температуре в течение 5 мин три раза, и реагент набора Vectastain ABC kit (Vector) смешивали в соответствии с инструкцией, прилагаемой к нему, получая комплекс ABC. Этот комплекс ABC подвергали реакции при комнатной температуре в течение 30 мин. Продукт реакции промывали PBS при комнатной температуре в течение 5 мин три раза, а затем проводили цветное проявление с использованием раствора Histofine Peroxydase Substrate Simple Stain DAB solution (Nichirei Biosciences). После завершения цветного проявления продукт реакции промывали деионизированной водой в течение 5 мин, и ядро окрашивали раствором гематоксилина Майера (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). После этого проводили дегидратацию спиртом с последующим пропитыванием ксилолом и заливкой Entellan New (Merck Japan).
Результаты
Экспрессия hTROP-2 в нормальных тканях человека.
Профиль экспрессии hTROP-2 в нормальных тканях человека анализировали с использованием моноклонального антитела против hTROP-2 клона К5-63-17. Набор нормальных тканей человека (каталожный номер №: АВ1, Super Bio Chips) депарафинизировали, а затем подвергали гидрофильной обработке. Затем антиген активировали протеазой пепсином, а затем проводили иммунное окрашивание с использованием моноклонального антитела против hTROP-2 клона К5-63-17 (фиг. 20). В результате, окрашивание наблюдали в коже, пищеводе, почке (кора и мозговое вещество), поджелудочной железе, предстательной железе, мочевом пузыре и миндалевидной железе. Большинство окрашенных изображений имело локализацию в клеточной мембране (фиг. 20А, В, С, D, F, G и Н), однако экспрессию hTROP-2 частично наблюдали даже в цитоплазме (фиг. 20Е и Н). С другой стороны, такое окрашивание не наблюдали в сердце, печени, желудке, тонком кишечнике, толстом кишечнике, скелетных мышцах, легком, селезенке, тимусе и т.п. (фиг. 201 и J).
Экспрессия hTROP-2 в тканях злокачественной опухоли человека.
Для исследования экспрессии hTROP-2 (hTROP-2-положительный уровень) в тканях злокачественной опухоли человека, наборы тканей злокачественной опухоли различных типов подвергали иммунному окрашиванию с использованием моноклонального антитела против hTROP-2 клона К5-63-17. Срез ткани, в котором окрашивалось 10% или более злокачественных клеток, определяли как положительный по hTROP-2. Результаты окрашивания представлены в табл. 4.
Таблица 4
Ткани Количество TROP-2-
злокачественной положительных по подожительный
опухоли TROP-2 случаев/общее уровень (%)
число случаев
Рак молочной железы 32/80 40
Рак легкого 53/81 65, 4
Рак пищевода 69/90 76, 7
Рак желудка 25/90 27,8
Рак толстого 29/178 16, 3
кишечника
Рак поджелудочной 26/62 41,9
железы
Рак печени 7/92 7, 61
Рак мочевого пузыря 42/59 71,2
Рак предстательной 35/38 92,1
железы
Рак яичника 14/58 24,1
Типичные окрашенные изображения представлены на фиг. 21. Среди типов злокачественной опухоли, для которых анализировали экспрессию hTROP-2, рак предстательной железы имел наиболее высокий положительный уровень (92,1%), и также рак легкого (65,4%), рак пищевода (76,7%), рак мочевого пузыря (71,2%) и т.п. имели высокие положительные уровни. Рак печени имел наиболее низкий положительный уровень (7,61%). На окрашенных изображениях наблюдали, что, как и в случае нормальных клеток, hTROP-2 в высокой степени локализовался на клеточной мембране, даже в случае злокачественных клеток (фиг. 21 A-F, Н и I). Кроме того, в некоторых случаях hTROP-2 также локализовался в цито
- 31 031043 плазме (фиг. 21 А, В, Е и G).
hTROP-2-положительный уровень при раке поджелудочной железы составлял 41,9%. Анализировали взаимосвязь между hTROP-2-положительным уровнем и степенью (степень дифференцировки) рака поджелудочной железы. В результате hTROP-2 экспрессировался с высокой частотой при раке поджелудочной железы высокой степени, а именно, с низким уровнем дифференцировки (табл. 5).
Таблица 5. hTROP-2-положительные пятна при раке поджелудочной железы 26/62 (41,94%)
Степень - + Положительный уровень
I 8 0 0%
I-II 5 0 0%
II 19 21 52,5%
II-III 4 5 55, 6% р<0,01
всего 36 26
Пример 19. Противоопухолевая активность моноклонального антитела против TROP-2 человека в моделях лечения с ксенотрансплантатами клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480.
Противоопухолевая активность каждого из моноклональных антител против TROP-2 человека (клоны K5-70, K5-116-2-1 и T6-16) исследовали с помощью моделей лечения с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480. Клетки SW480 (5х106 клеток) подкожно трансплантировали в правый бок каждой из самок мышей NOD-scid в возрасте 6 недель (1 сутки). Когда объем опухоли достигал 100 мм3, проводили распределение на группы (7 сутки или 10 сутки). С 7 суток или 10 суток проводили внутрибрюшинное введение антитела с интервалами введения раз в трое суток. Противоопухолевую активность клона K5-70 и противоопухолевую активность клонов K5-116-2-1 и T6-16 оценивали в независимых исследованиях по отдельности. В исследовании по оценке противоопухолевой активности K5-70, объем опухоли в контрольной группе (IgG мыши (10 мг/кг массы тела), N=8) на 44 сутки после трансплантации злокачественных клеток (44 сутки) составил 365,4±214,6 мм3. С другой стороны, объем опухоли в группе введения K5-70 (10 мг/кг массы тела) составил 27,4±29,4 мм3 (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), и, таким образом, образование опухоли в значительной степени ингибировалось в группе введения K5-70 (уровень ингибирования: 92,5%) (фиг. 23А). Что касается массы опухоли, масса опухоли в контрольной группе составляла 0,11 ±0,07 г, в то время как масса опухоли в группе введения K5-70 составляла 0,005±0,007 (г) (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), демонстрируя уровень ингибирования 95,5% (фиг. 23В). В частности, у двух из восьми отдельных мышей в группе введения K5-70 образование опухоли полностью ингибировалось, и присутствие опухоли не подтвердилось.
В исследованиях по оценке противоопухолевой активности K5-116-2-1 и T6-16, которые проводили по отдельности, объем опухоли в контрольной группе на 42 сутки составлял 713,8±354,5 мм3 (N=8). Напротив, объем опухоли в группе введения K5-116-2-1 (10 мг/кг массы тела) составлял 188,9±97,4 мм3 (N=8, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) (фиг. 24 А), и объем опухоли в группе введения T6-16 (10 мг/кг массы тела) составлял 292,8± 199,7 мм3 (N=8, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) (фиг. 25А). Таким образом, две из описанных выше групп введения продемонстрировали уровни ингибирования 73,5% и 59,0%, соответственно. Что касается также массы опухоли, масса опухоли в контрольной группе составляла 0,39±0,19 г. Напротив, масса опухоли в группе введения K5-116-2-1 составляла 0,10±0,07 г (Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента), и масса опухоли в группе введения T6-16 составляла 0,17±0,14 г (Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента). Таким образом, две из описанных выше групп введения продемонстрировали уровни ингибирования 72,2% и 56,4%, соответственно (фиг. 24В и фиг. 25В).
Пример 20. Дозозависимая противоопухолевая активность клона T6-16 в моделях лечения с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480.
Затем исследовали дозозависимую противоопухолевую активность клона T6-16 (IgG2a мыши) в моделях лечения с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480. Клетки SW480 (5х106 клеток) подкожно трансплантировали в правый бок каждой из самок мышей NOD-scid в возрасте 6 недель. Через десять суток после трансплантации (сутки 10), когда средний объем опухоли достигал 100 мм3, мышей распределяли в контрольную группу (IgG мыши, группа введения 10 мг/кг массы тела, N=8, 105,8±9,9 мм3), в группу введения T6-16 (1 мг/кг массы тела) (N=8, 104,4±13,3 мм3), в группу введения T6-16 (5 мг/кг массы тела) (N=8, 104,7±13,0 мм3), и в группу введения T6-16 (10 мг/кг массы тела) (N=8, 104,8±12,4 мм3). Затем проводили внутрибрюшинное введение с интервалами введения раз в трое суток. На 43 сутки объем опухоли в контрольной группе составлял 473,5±137,0 мм3. С другой стороны, в группах введения T6-16 наблюдали дозозависимую активность ингибирования образования опухоли. Таким образом, объем опухоли в группе введения 1 мг/кг массы тела составлял 397,9±97,5 мм3 (уровень ингибирования: 16,0%), объем опухоли в группе введения 5 мг/кг
- 32 031043 массы тела составлял 195,9±89,7 мм3 (уровень ингибирования: 58,7%, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) и объем опухоли в группе введения 10 мг/кг массы тела составлял 190,2±5б,5 мм3 (уровень ингибирования: 59,8%, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) (фиг. 28А). Аналогично, что касается массы опухоли на 43 сутки, масса опухоли в контрольной группе составляла 0,19±0,07 г. С другой стороны, масса опухоли в группе введения T6-16 (1 мг/кг массы тела) составляла 0,20±0,08 г, масса опухоли в группе введения 5 мг/кг массы тела составляла 0,08±0,04 г (уровень ингибирования: 57,9%, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента) и масса опухоли в группе введения 10 мг/кг массы тела составляла 0,09±0,04 г (уровень ингибирования: 52,6%, Р<0,01 согласно t-критерию Стьюдента). Таким образом, была подтверждена дозозависимая противоопухолевая активность (фиг. 28В).
Пример 21. Анализ интервалов введения клона T6-16 в моделях лечения с ксенотрансплантатом с использованием клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480.
Затем, для анализа оптимальных интервалов введения клона T6-16 (IgG2a мыши), исследовали противоопухолевую активность клона T6-16, когда его вводили с интервалами введения один раз в неделю (раз в 7 суток) и один раз в 10 суток в моделях лечения с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480. Клетки SW480 (5х106 клеток) подкожно трансплантировали в правый бок каждой из самок мышей NOD-scid в возрасте 6 недель. Через десять суток после трансплантации (сутки 10), когда средний объем опухоли достигал 100 мм3, мышей распределяли в контрольную группу (IgG мыши, группа введения 10 мг/кг массы тела, N=8, 105,8±9,9 мм3), группу введения T6-16 (10 мг/кг массы тела, один раз в неделю) (N=8, 105,0±11,6 мм3), группу введения T6-16 (10 мг/кг массы тела, раз в 10 суток) (N=5, 130,8±2,4 мм3). Затем начинали введение. На 43 сутки объем опухоли в контрольной группе составлял 473,5± 137,0 мм3. С другой стороны, объем опухоли в группе введения T6-16 (раз в неделю) составлял 243,7±65,3 мм3 (уровень ингибирования: 48,5%, Р<0,01 согласно tкритерию Стьюдента), и объем опухоли в группе введения T6-16 (раз в 10 суток) составлял 297,8±54,4 мм3 (уровень ингибирования: 37,1%, Р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента) (фиг. 29). В документах уровня техники (US 7420040 и US 7420041), когда антитела вводили в моделях лечения с ксенотрансплантатами с использованием клеточной линии рака поджелудочной железы (BxPC-3) в дозировке 20 мг/кг массы тела три раза в неделю (с интервалами введения 2 суток), антитела проявляли противоопухолевую активность с уровнем ингибирования 50-60%.
Напротив, было выявлено, что антитело T6-16 проявляет значительную противоопухолевую активность, когда его вводили в дозировке, составляющей половину дозировке антитела уровня техники раз в 10 суток (с интервалами введения 8 суток). Если учитывать единичную дозировку и интервалы введения, очевидно, что антитело T6-16 проявляло значительную противоопухолевую активность в общей дозировке, составляющей по меньшей мере одну восьмую дозировок антител уровня техники.
Пример 22. Картирование эпитопов с использованием технологии CLIPS.
Материалы и способы.
Синтез пептидов.
15-мерные и 30-мерные линейные пептиды, происходящие из внеклеточных доменов TROP-2, которые использовали в этом эксперименте, получали путем твердофазного синтеза согласно способу с Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил). Кроме того, для анализа прерывистых эпитопов синтезировали 17мерные пептиды, происходящие из внеклеточного домена TROP-2, на оба конца которых были добавлены остатки цистеина, и конформацию, имеющую одну или две структуры петель, реконструировали с помощью технологии CLIPS (технология химически связанных пептидов на каркасе). Когда другой остаток цистеина присутствовал вблизи добавленного остатка цистеина, его заменяли аланином.
ELISA для скрининга эпитопов.
5034 типа синтезированных пептидов ковалентно связывали с картами PEPSCAN (455 пептида/карта), а затем анализировали связывание синтезированных пептидов с антителами способом ELISA. Картам PEPSCAN позволяли реагировать с моноклональными антителами против TROP-2 человека (К570, К5-107, К5-116-2-1, Т5-86 и T6-16), разбавленными до концентрации 1 мкг/мл блокирующим буфером (фосфатный буфер, содержащий 4% сыворотку лошади, 5% овальбумин и 1% Tween). После промывания полученному материалу позволяли реагировать с разбавленным в 1000 раз комплексом пероксидаза-вторичное антитело при 25°C в течение 1 ч. После промывания к реакционному раствору добавляли раствор субстрата (раствор, содержащий 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолина сульфонат (ABTS) и 2 мкл 3% раствора пероксида водорода), а затем проводили хромогенную реакцию в течение 1 ч. Активность связывания антител количественно определяли путем фотографирования с помощью камеры CCD, а затем проведения анализа изображений.
Результаты
Моноклональные антитела против TROP-2 человека К5-70, К5-107, К5-116-2-1, Т5-86 и T6-16, которые проявляли благоприятные эффекты, подвергали анализу эпитопов с использованием технологии CLIPS (химически связанные пептиды на каркасе). Следует отметить, что термин номер аминокислоты используют в настоящих примерах для обозначения номера аминокислоты в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 (белок hTROP-2 (323 аминокислотных остатка)).
- 33 031043
Результат анализа антитела К5-70 представлен в табл. 6 ниже. В результате было выявлено, что 33 пептида проявляют высокую активность связывания с антителом K5-70. В этих 33 пептидах, неоднократно присутствовала последовательность, содержащая VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (номера аминокислот 43-65) (пептиды № 1-7 и 9 в табл. 6), последовательность, содержащая HHILIDLRHRPTAG (номера аминокислот 152-165) (пептиды №. 14, 22-25, 28, 29, 31 и 33 в таблице б), последовательность, содержащая VHYEQPTIQIELRQ (номера аминокислот 193-206) (пептиды № 8, 10, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 23, 26, 28, 30 и 32 в табл. 6), и последовательность, содержащая DAELRRLFRER (номера аминокислот 171-183) (пептиды № 11, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 22, 25, 29 и 31 в табл. 6). Антитело K5-70 особенно сильно связывалось с последовательностью, содержащей VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD. Из этих результатов, было предположено, что в белке hTROP-2 упомянутые выше 4 типа областей последовательностей пептидов, вероятно, являются эпитопами антитела K5-70.
Таблица 6. Связывание антитела К5-70 с пептидами CLIPS, происходящими из внеклеточных
доменов TROP-2 человека
номер пептид связывание K5-70
1 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2742
2 TVCS PDG PG G RCQCRALG 5G М AVDCSTLTS 2604
3 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2562
4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2402
5 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 1770
6 PTNNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDC 1391
7 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD CSTLTSK 932
8 CAAVH YEQPTIQIE LRCAAVH YEQPTIQIELRC 876
9 CPTN К M TVCSPDG PG G RCQCRALG SG M AVD 839
10 CVHYEQPTIQIELRQNCVHYEQPTIQIELRQNC 825
11 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 725
12 RLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQ 687
13 AVHYEQPTIQIELRQ 642
14 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 624
15 CPKFVAAVHYEQPTIQCGLDLRVRGEPLQVERC 579
16 CH S D LD AE LRR LF RERCG LD LRV 538
17 FQGRGGLDLRVRGEP 538
18 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 524
19 CHSDLDAELRRLFRERCRGEPLQ 519
20 CTIQIELRQNTSQKAACVHYEQPTIQIELRQNC 513
21 CVHYEQPTIQIELRQNCHSDLDAELRRLFRERC 511
22 CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 489
23 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 489
24 CHHILIDLRHRPTAGACGLDLRVRGEPLQVERC 488
25 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 483
26 CVHYEQPTIQtELRQNC 483
27 CAFNHSDLDAELRRLFCVHYEQPTIQIELRQNC 478
28 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 473
29 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 472
30 VHYEQPT1QIELRQNCGLDLRVRGEPLQVERC 470
31 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERC 469
32 AVHYEQPTIQIELRQCAVHYEQPTIQIELRQC 468
33 CHSDLDAELRRLFRERCDELVRTHHILIDLRHC 466
Результат анализа для антитела К5-107 представлен в табл. 7 ниже. В результате, было выявлено, что последовательность, содержащая VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (номера аминокислот 43-65) содержалась в 10 из 20 пептидов (пептиды № 1-6, 8, 13, 14 и 17 в табл. 7) (табл. 7).
Таким образом, было предположено, что в белке hTROP-2 упомянутая выше область последовательности пептида, состоящая из VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD, может представлять собой эпитоп антитела К5-107.
Таблица 7. Связывание антитела К5-107 с пептидами CLIPS, происходящими из внеклеточных доменов TROP-2 человека
номер пептид связывание K5-107
1 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 2763
2 NKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCST 2761
3 KMTVCSPDG PGG RCQCRALGSG M AVDCSTL 2752
4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLT 2726
5 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2723
6 TVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTS 2720
7 TCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV 2716
8 VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSK 2689
9 CSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKC 2655
10 CTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMA 2655
11 NCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGM 2207
12 DNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSG 1816
13 TNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCS 1525
14 CTVCSPD G PGG RCQCR ALGSG M AVD ASTLTS КС 1118
15 QDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGS 874
16 SPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTLTSKCL 561
17 CTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDASTC 380
18 TVCSPDGPGGRCQCR 312
19 CAPKNARTLVRPSEHACARTLVRPSEHALVDNC 284
20 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 272
- 34 031043
Результат анализа антитела К5-116-2-1 представлен в таблице 8 ниже. В этом анализе три типа пептидных последовательностей, а именно, последовательность, содержащая VCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD (номера аминокислот 43-65) (пептиды № 1-7, 15 и 25 в табл. 8), последовательность, содержащая HHILIDLRHRPTAG (номера аминокислот 152-165) (пептиды № 8-11, 16, 17, 19, 20, 22-24 и 27-29 в табл. 8), и последовательность, содержащая DLDAELRRLFRER (номера аминокислот 171-183) (пептиды № 11-14, 17, 19, 21, 23 и 29 в табл. 8) появлялись несколько раз (табл. 8). Таким образом, было предположено, что в белке hTROP-2 эти три типа областей последовательности пептида могут представлять собой эпитопы антитела K5-116-2-1.
Таблица 8. Связывание антитела K5-116-2-1 с пептидами CLIPS, происходящими из внеклеточных доменов TROP-2 человека
номер пептид связывание K5-116-2-1
1 TVCSPDGPGGRCQCRALGSG MAVDCSTLTS 2672
2 N KMTVCSPDGPGGRCQC RALGSG MAVDCST 2613
3 TN KMTVCSPDGPGG RCQCRALGSGMAVDCS 2482
4 MTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAV DCSTLT 2440
5 KMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDCSTL 2423
6 CPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVD 2136
7 PTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALGSGMAVDC 1723
8 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 1643
9 CTHHILIDLRHRPTAGC 1586
10 CVHYEQPTIQIELRQNCHHI LI DLRHRPTAGAC 1504
11 CHHILIDLRHRPTAGCHSDLDAELRRLFRERC 1475
12 HSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1467
13 CDAELRRLFRERYRLHCHSDLDAELRRLFRERC 1462
14 CDAELRRLFRERYRLHCPK 1442
15 VCSPDGPGG RCQCRALGSG MAVDC STLTSK 1432
16 DLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNH 1421
17 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 1392
18 CFQGRGGLDLRVRGEPC 1376
19 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1366
20 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 1342
21 CHSDLDAELRRLFRERCHSDLDAELRRLFRERC 1331
22 CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 1323
23 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 1266
24 CHHI LI DLRHRPTAGACRGEPLQVERTLIYYLC 1229
25 CSPDGPGGRCQCRAL 1227
26 CTVASPDGPGGRAQARACVHYEQPTI QI ELRQN C 1223
27 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPT1QIELRQNC 1222
28 LSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHS 1220
29 CDELVRTHHILIDLRHCHSDLDAELRRLFRERC 1205
Результаты анализа для антител Т5-86 и T6-16 представлены в табл. 9 и табл. 10 ниже, соответственно. В этих анализах антитела сильно связывались с пептидом, содержащим последовательность, состоящую из DPEGRFKARQCN (номера аминокислот 109-120). Упомянутая выше пептидная последовательность содержалась в 22 из 26 пептидов, связывающихся с антителом Т5-86 (пептиды № 1-3, 5-8, 1013, 15-19 и 21-26 в табл. 9), и она содержалась в 4 из 26 пептидов, связывающихся с антителом T6-16 (пептиды № 1, 2, 9 и 13 в табл. 10) (табл. 9 и табл. 10). Более того, в анализе, касающимся антитела Т5-8 6, помимо последовательности, содержащей DPEGRFKARQCN (номера аминокислот 109-120), несколько раз встречалась последовательность, содержащая VCSPDGPGGRCQCR (номера аминокислот 43-56) (пептиды № 4, 14 и 20 в табл. 9). Более того, в анализе, также касающемся антитела T6-16, несколько раз была найдена другая последовательность, содержащая HHILIDLRHRPTAG (номера аминокислот 152165) (пептиды № 4-8, 10-12, 19, 21, 23, 25 и 26 в табл. 10). Таким образом, было предположено, что в белке hTROP-2 два типа областей последовательности пептида, а именно, DPEGRFKARQCN (номера аминокислот 109-120) и VCSPDGPGGRCQCR (номера аминокислот 43-56), могут быть эпитопами антитела К5-86. Также было предположено, что в белке hTROP-2 два типа областей последовательности пептида, а именно, DPEGRFKARQCN (номера аминокислот 109-120) и HHILIDLRHRPTAG (номера аминокислот 152-165), могут представлять собой эпитопы антитела T6-16.
Таблица 9. Связывание антитела Т5-86 с пептидами CLIPS, происходящими из внеклеточных доменов TROP-2 человека номер пептид связывание Т5-86
CYDPDADPEGRFKARQCADPEGRFKARQANQTC
PDCDPEGRFKARQCN
CADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC
VCSPDGPGGRCQCRA
CYDPDADPEGRFKARQCPDADPEGRFKARQANC CADPEGRFKARQANQTCTDPDADPEGRFKARQC CADPEGRFKARQANQTCYDPDADPEGRFKARQC DCDPEGRFKARQCNQ CTVASPDGPGGRAQARCHSDLDAELRRLFRERC CDADPEGRFKARQANQCDADPEGRFKARQANQC
2306
2292
2287
DGRFKARQANQTSVAWCARTLVRPSEHALVDNC
2019
DAD PEG RFK ARQANQTCPD AD PEG RFKARQANC CPDADPEGRFKARQANCPDADPEGRFKARQANC CSPDGPGGRCQCRAL CEGRFKARQANQTSVACEGRFKARQANQTSVAC CTVASPDGPGGRAQARCPDADPEGRFKARQANC CGLYDPDADPEGRFKACPDADPFGRFKARQANC
DPDCDPEGRFKARQCNCQTSVCWCVNSVGVR CPEGRFKARQANQTSVCDELVRHHILIDLRHC CPDGPGGRAQARALGSCHSDLDAELRRLFRERC CTLVRPSEHALVDNDGCGRFKARQANQTSVAWC
CPDADPEGRFKARQANCYDPDADPEGRFKARQC CGLYDPDADPEGRFKACPEGRFKARQANQTSVC YDPDCDPEGRFKARQ CPDADPEGRFKARQANCADPEGRFKARQANQTC CDPEGRFKARQCNQT
1980
1950
1946
1895
1890
1857
1850
1841
1830
1820
1795
1793
1775
1773
1772
- 35 031043
Связывание антитела T6-16 с пептидами CLIPS, происходящими из внеклеточных доменов TROP-2 человека
номер пептид связывание Т6-16
1 CVNSVGVRRTDKGDLSCPDCYDPDADPEGRFKARQC 1072
2 CSVGVRRTDKGDLSLRCYDPDADPEGRFKARQC 786
3 HSDLDAEIRR1FRERCHSDLDAELRRLFRERC 714
4 CDELVRTHHILIDLRHCDLDAELRRLFRERYRC 713
5 CVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILI 688
6 VRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRP 670
7 CVERTLIYYLDEIPPKCHHILIDLRHRPTAGAC 626
8 CHHILIDLRHRPTAGACHSDLDAELRRLFRERC 620
9 CVNSVGVRRTDKGDLSCPDADPEGRFKARQANC 611
10 CVHYEQPTIQIELRQNCHHILIDLRHRPTAGAC 602
11 VGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRH 601
12 CAGAFNHSDLDAELRRCHHILIDLRHRPTAGAC 592
13 CSVGVRRTDKGDLSLRCPDADPEGRFKARQANC 585
14 CVRPSEHALVDN DGLYCSVGVRRTDKGDLSL RC 573
15 CDAEIRRIFRERYRLHCHSDIDAEIRRIFRERC 566
16 CSVGVRRTDKGDLSLRCNDGLYDPDADPEGRFC 559
17 CVNSVGVRRTDKGDLSCGLYDPDADPEGRFKAC 553
18 CDLDAELRRLFRERYRCHSDLDAELRRLFRERC 534
19 CDELVRTHHILIDLRHCHHILIDLRHRPTAGAC 534
20 CAGAFNHSDLDAELRRCDLDAELRRLFRERYRC 529
21 CDAELRRLFRERYRLHCDELVRTHHILIDLRHC 527
22 CVHYEQPTIQIELRQNCDLDAELRRLFRERYRC 526
23 CHHILIDLRHRPTAGACVHYEQPTIQIELRQNC 524
24 CGVRRTDKGDLSLRADCGVRRTDKGDLSL RADC 524
25 CGLDLRVRGEPLQVERCHHILIDLRHRPTAGAC 521
26 CDLDAELRRLFRERYRCDELVRTHHI LI DLRHC 516
Пример 23. Секвенирование вариабельных областей генов антител мыши против TROP-2 человека (клоны К5-70, К5-107, К5-116-2-1 и T6-16).
Общую РНК экстрагировали из 3х106 гибридом, продуцирующих моноклональное антитело мыши против TROP-2, с использованием реагента TRIzol (Invitrogen). Что касается клона K5-70, клона K5-107 и клона К5-116-2-1, кДНК синтезировали с использованием набора для амплификации кДНК SMARTer™ RACE cDNA Amplification kit (Clontech) в соответствии со способом, включенным в набор, с использованием праймера, специфичного к Н-цепи IgG мыши (5'-TCCAKAGTT-3' (SEQ ID NO: 24)), и праймера, специфичного к L-цепи IgG мыши (5'-GCTGTCCTGATC-3' (SEQ ID NO: 25)). Что касается клона T6-16, кДНК синтезировали с использованием набора GeneRacer kit (Invitrogen) в соответствии со способом, включенным в набор, с использованием праймера oligo-dT. Каждый из генов, кодирующих вариабельные области (VH, VL) Н- и L-цепей клона К5-70 (IgG2a мыши), клона K5-107 (IgG1 мыши) и клона K5-116-2-1 (IgG2a мыши) клонировали способом ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной, как описано выше. В этом процессе в качестве 5'-праймера использовали смесь 10х Universal Primer A Mix (UPM), включенную в набор для амплификации кДНК SMARTer™ RACE cDNA Amplification kit. С другой стороны, в качестве 3'-праймера для амплификации VH, использовали праймер, имеющий последовательность, специфичную к Н-цепи IgG мыши, и в качестве 3'-праймера для амплификации VL использовали праймер, имеющий последовательность, специфичную к L-цепи IgG мыши.
5'-праймер (10xUniversal Primer A Mix (UPM)):
Длинный (0,4 мкМ) ' -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ' (SEQ
ID NO: 26)
Короткий (2 мкМ)
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 27)
3’-праймер (R-праймер):
VH: 5'-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3’ (SEQ ID NO: 28)
5'-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3’ (SEQ ID NO: 29)
VL: 5T-CACTGCCATCAATVTTCCACTTGACA-3T (SEQ ID NO: 30)
С использованием каждого из описанных выше праймеров ПЦР проводили со следующим составом реакционного раствора и условиями реакции. Кроме того, R-праймер для амплификации кДНК VH получали путем смешения двух из описанных выше последовательностей друг с другом в эквимолярном со отношении, а затем использовали.
Состав реакционного раствора
ДНК-матрица 2, 5 мкл
5 х буфер PrimeSTAR (Мд2+ plus) 10 мкл
2,5 мМ dNTP 4 мкл
ДНК-полимераза PrimeSTAR HS (2,5 Е/мкл) 0, 5 мкл
10 х Universal Primer A Mix (UPM) 5 мкл
R-праймер (10 мкМ) 1 мкл
Стерилизованная вода 2 7 мкл
Всего 50 мкл
- 36 031043
Условия реакции.
Реакцию проводили при 94°C (10 с), а затем проводили цикл, состоящий из денатурации нагреванием/диссоциации при 98°C (10 с)^отжига при 60°C (5 с^синтеза/элонгации при 72°C (60 с) всего 30 раз. Наконец, реакцию проводили при 72°C (3 мин).
Синтезированные кДНК VH и VL субклонировали в вектор pMD20-T (Takara bio Inc.), и определяли их нуклеотидные последовательности. Нуклеотидные последовательности множества клонов VH и клонов VL декодировали, и идентифицировали нуклеотидные последовательности, специфичные к вариабельным областям Н-цепи и L-цепи мыши. На фиг. 33 и фиг. 34 представлены консенусные нуклеотидные последовательности кДНК VH и VL K5-70, и предполагаемые аминокислотные последовательности. На фиг. 35 и фиг. 36 представлены консенусные нуклеотидные последовательности кДНК VH и VL K5107, и предполагаемые аминокислотные последовательности. На фиг. 37 и фиг. 38 представлены консенусные нуклеотидные последовательности кДНК VH и VL K5-116-2-1, и предполагаемые аминокислотные последовательности.
Гены, кодирующие вариабельные области (VH, VL) Н- и L-цепей клона T6-16, клонировали способом ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной как описано выше. В этом процессе в качестве 5'-праймера использовали праймер, включенный в набор GeneRacer. С другой стороны, в качестве 3'-праймера для амплификации VH использовали праймер, имеющий последовательность, специфичную к Н-цепи IgG мыши, и в качестве 3'-праймера для амплификации VL использовали праймер, имеющий последовательность, специфичную к L-цепи IgG мыши.
5'-праймер (F-праймер):
5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (SEQ ID NO: 31)
3'-праймер (R-праймер):
VH: 5’-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’ (SEQ ID NO: 32)
VL: 5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 33)
С использованием каждого из описанных выше праймеров проводили ПЦР со следующим составом реакционного раствора и условиями реакции.
Проводили цикл, состоящий из денатурации нагреванием/диссоциации при 98°C (10 с) ^отжига при 57°C (10 с^синтеза/элонгации при 72°C (60 с) всего 35 раз.
Синтезированные кДНК VH и VL субклонировали в вектор pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen), и определяли их нуклеотидные последовательности. Нуклеотидные последовательности множества клонов VH и клонов VL декодировали, и идентифицировали нуклеотидные последовательности, специфичные к вариабельным областям Н-цепи и L-цепи мыши. На фиг. 39 и фиг. 40 представлены консенусные нуклеотидные последовательности кДНК VH и VL T6-16, и предполагаемые аминокислотные последовательности.
Промышленная применимость.
Настоящее изобретение способно обеспечить антитело, которое специфично реагирует с hTROP-2 и обладает высокой противоопухолевой активностью in vivo, и, в частности, моноклональное антитело, обладающее высокой противоопухолевой активностью in vivo в низкой дозе. Кроме того, настоящее изобретение способно обеспечить гибридому, которая продуцирует антитело, фрагмент антитела, комплекс антитела или сходные с ними и различных типов лекарственных средств, фармацевтическую композицию для диагностики или лечения опухоли, способ детекции опухоли и набор для детекции или диагностики опухоли.
Список последовательностей, свободный тексту.
- 37 031043
SEQ ID NO: 3 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 4 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 5 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 6 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 7 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 8 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 9 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 10 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 11 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 12 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 13 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 14 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 15 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 16 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 17 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 18 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 19 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 20 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 21 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 22 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 23 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 24 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 25 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 26 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 27 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 28 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 29 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 30 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 31 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 32 Синтетическая ДНК
SEQ ID NO: 33 Синтетическая ДНК
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> LivTech, Inc.
<120> Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью IN VIVO <130> PCT11-0004 <150> JP 2010-113302 <151> 2010-05-17 <160> 73 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2080 <212> ДНК <213> homo sapiens
- 38 031043 <220>
<221> CDS <222> (339)..(1310) <400> 1 gcgggtcccc agaagcctac aggtgagtat cggttctccc cttcccggct ttcggtccgg 60 aggaggcggg agcagcttcc ctgttctgat cctatcgcgg gcggcgcagg gccggcttgg 120 ccttccgtgg gacggggagg ggggcgggat gtgtcaccca aataccagtg gggacggtcg 180 gtggtggaac cagccgggca ggtcgggtag agtataagag ccggagggag cggccgggcg 240 gcagacgcct gcagaccatc ccagacgccg gagcccgagc cccgacgagt ccccgcgcct 300 catccgcccg cgtccggtcc gcgttcctcc gccccacc atg gct cgg ggc ccc ggc 356
Met Ala Arg Gly Pro Gly ctc gcg ccg cca ccg ctg cgg ctg ccg ctg ctg ctg ctg gtg ctg gcg 404
Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala
1520 gcg gtg acc ggc cac acg gcc gcg cag gac aac tgc acg tgt ccc acc 452
Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp Asn Cys Thr Cys Pro Thr
3035 aac aag atg acc gtg tgc agc ccc gac ggc ccc ggc ggc cgc tgc cag 500
Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly Pro Gly Gly Arg Cys Gln
4550 tgc cgc gcg ctg ggc tcg ggc atg gcg gtc gac tgc tcc acg ctg acc 548 Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp Cys Ser Thr Leu Thr 55 60 6570 tcc aag tgt ctg ctg ctc aag gcg cgc atg agc gcc ccc aag aac gcc 596 Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser Ala Pro Lys Asn Ala
8085 cgc acg ctg gtg cgg ccg agt gag cac gcg ctc gtg gac aac gat ggc 644
Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu Val Asp Asn Asp Gly
95100 ctc tac gac ccc gac tgc gac ccc gag ggc cgc ttc aag gcg cgc cag 692
Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg Phe Lys Ala Arg Gln
105 110115 tgc aac cag acg tcg gtg tgc tgg tgc gtg aac tcg gtg ggc gtg cgc 740
Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn Ser Val Gly Val Arg
120 125130 cgc acg gac aag ggc gac ctg agc cta cgc tgc gat gag ctg gtg cgc 788 Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys Asp Glu Leu Val Arg 135 140 145150 acc cac cac atc ctc att gac ctg cgc cac cgc ccc acc gcc ggc gcc 836
Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg Pro Thr Ala Gly Ala
155 160165 ttc aac cac tca gac ctg gac gcc gag ctg agg cgg ctc ttc cgc gag 884
Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg Arg Leu Phe Arg Glu
170 175180
- 39 031043 cgc tat cgg ctg cac ccc aag ttc gtg gcg gcc gtg cac tac gag cag 932
Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala Ala Val His Tyr Glu Gln
185 190195 ccc acc atc cag atc gag ctg cgg cag aac acg tct cag aag gcc gcc 980
Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn Thr Ser Gln Lys Ala Ala
200 205210 ggt gac gtg gat atc ggc gat gcc gcc tac tac ttc gag agg gac atc 1028
Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Glu Arg Asp Ile
215 220 225230 aag ggc gag tct cta ttc cag ggc cgc ggc ggc ctg gac ttg cgc gtg 1076
Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly Gly Leu Asp Leu Arg Val
235 240245 cgc gga gaa ccc ctg cag gtg gag cgc acg ctc atc tat tac ctg gac 1124
Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp
250 255260 gag att ccc ccg aag ttc tcc atg aag cgc ctc acc gcc ggc ctc atc 1172
Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu Thr Ala Gly Leu Ile
265 270275 gcc gtc atc gtg gtg gtc gtg gtg gcc ctc gtc gcc ggc atg gcc gtc 1220
Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu Val Ala Gly Met Ala Val
280 285290 ctg gtg atc acc aac cgg aga aag tcg ggg aag tac aag aag gtg gag 1268
Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly Lys Tyr Lys Lys Val Glu
295 300 305310 atc aag gaa ctg ggg gag ttg aga aag gaa ccg agc ttg tag1310
Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu Pro Ser Leu
315320 gtacccggcg gggcagggga tggggtgggg taccggattt cggtatcgtc ccagacccaa 1370 gtgagtcacg cttcctgatt cctcggcgca aaggagacgt ttatcctttc aaattcctgc 1430 cttccccctc ccttttgcgc acacaccagg tttaatagat cctggcctca gggtctcctt 1490 tctttctcac ttctgtcttg aaggaagcat ttctaaaatg tatccccttt cggtccaaca 1550 acaggaaacc tgactggggc agtgaaggaa gggatggcat agcgttatgt gtaaaaaaca 1610 agtatctgta tgacaacccg ggatcgtttg caagtaactg aatccattgc gacattgtga 1670 aggcttaaat gagtttagat gggaaatagc gttgttatcg ccttgggttt aaattatttg 1730 atgagttcca cttgtatcat ggcctacccg aggagaagag gagtttgtta actgggccta 1790 tgtagtagcc tcatttacca tcgtttgtat tactgaccac atatgcttgt cactgggaaa 1850 gaagcctgtt tcagctgcct gaacgcagtt tggatgtctt tgaggacaga cattgcccgg 1910 aaactcagtc tatttattct tcagcttgcc cttactgcca ctgatattgg taatgttctt 1970 ttttgtaaaa tgtttgtaca tatgttgtct ttgataatgt tgctgtaatt ttttaaaata 2030 aaacacgaat ttaataaaat atgggaaagg cacaaaccag aaaaaaaaaa 2080
- 40 031043 <210> 2 <211> 323 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 2
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu 1 5 1015
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
2530
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly 35 4045
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val 50 5560
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
70 7580
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala 85 9095
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
- 41 031043
210 215220
Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg 260 265270
Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu 275 280285
Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly
290 295300
Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu
305 310 315320
Pro Ser Leu <210> 3 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК
<400> 3
ttcctccgcc ccaccatggc 20
<210> 4 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 4 ctcgagcaag ctcggttcct ttctc <210> 5 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК
- 42 031043 <400> 5 ctcgagctcg tccaggtaat agatgagcg 29 <210> 6 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 6 gatccactag tcgcgagtgg tgg 23 <210> 7 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 7 aattccacca ctcgcgacta gtg 23 <210> 8 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК
<400> 8
tcctcgtgtc ccactcccgg 20
<210> 9 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 9 ctcgagtgca ttgagttccc tatgc 25 <210> 10 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 10
- 43 031043 cctgagccta cgctgcgacg aagtggtgcg <210> 11 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 11 cgcaccactt cgtcgcagcg taggctcagg <210> 12 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 12 gactgctcca cgctgacttc caagtgcctg <210> 13 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 13 caggcacttg gaagtcagcg tggagcagtc <210> 14 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 14 ctcgtggaca acgatggcct ctacgacccg <210> 15 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 15 cgggtcgtag aggccatcgt tgtccacgag
- 44 031043 <210> 16 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 16 ccaaagcctg cgctgcgatg agctggtgcg c 31 <210> 17 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 17 gcgcaccagc tcatcgcagc gcaggctttg g 31 <210> 18 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 18 agcttcctat ccgcggtgca ctacgagcag 30 <210> 19 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 19 ctgctcgtag tgcaccgcgg ataggaagct 30 <210> 20 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 20 gacattaaag gcgagtctct attccagggc 30 <210> 21
- 45 031043 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 21 gccctggaat agagactcgc ctttaatgtc <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 22 ctactccacc ccaccctggc g <210> 23 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 23 ctcgagcaag ctaggttcgc ttctc <210> 24 <211> 9 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 24 tccakagtt <210> 25 <211> 12 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 25 gctgtcctga tc 12 <210> 26 <211> 45 <212> ДНК
- 46 031043 <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 26 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt <210> 27 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 27 ctaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 28 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 28 gggaartarc ccttgaccag gca 23 <210> 29 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 29 gggaartagc ctttgacaag gca 23 <210> 30 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 30 cactgccatc aatvttccac ttgaca 26 <210> 31 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная
- 47 031043 <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 31 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 32 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 32 gccagtggat agacagatgg 20 <210> 33 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Синтетическая ДНК <400> 33 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 34 <211> 402 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(402) <400> 34 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 1015 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
2530 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045 acc atc tac tgg ata aac tgg gtg aaa cag agg cct gga caa ggc ctt 192 Thr Ile Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
5560 gag tgg atc gga aat att tat cct tct gat agt tat act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 7580
- 48 031043 caa aag ttc aag gac aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ccg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105110 tat tac tgt aca aga acg tct atg gcg gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120125 act ctc aca gtc tcc tca402
Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 <210> 35 <211> 134 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 35
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
5 1015
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
2530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045
Thr Ile Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 5560
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
70 7580
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ser Met Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120125
Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 <210> 36 <211> 5
- 49 031043 <212>
<213>
Белок homo sapiens <400>
Ile Tyr Trp Ile Asn 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 37
Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
5 10 15
Asp <210> 38 <211> 6 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 38
Thr Ser Met Ala Asp Tyr
5 <210> 39 <211> 381 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(381) <400> 39 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 1015 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agc 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 4045 att ggc aca agc ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca 192
Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
5560
- 50 031043 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 7580 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn
9095 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120125 <210> 40 <211> 127 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 40
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
5 1015
Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 4045
Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 5560
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 7580
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 9095
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
100 105110
Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120125 <210> 41 <211> 11 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 41
- 51 031043
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 42
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
5 <210> 43 <211> 9 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 43
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
5 <210> 44 <211> 402 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(402) <400> 44 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 1015 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag caa cct ggg tct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg
2530 cct gga gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045 acc agc tac tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cat gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu
5560 gag tgg att gga aat att tat cct ggt ggt ggt tat act aac tac gat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp 65 70 7580 gag aag ttc aag agc aag ggc aca ctg act gta gac aca tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 9095
- 52 031043 aca gcc tac atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105110 tat tac tgt aca aga tca tcc gtt ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc 384 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120125 act ctc aca gtc tcc tca402
Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 <210> 45 <211> 134 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 45
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
5 1015
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg
2530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu 50 5560
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp
70 7580
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 9095
Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Ser Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120125
Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 <210> 46 <211> 5 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 46
- 53 031043
Ser Tyr Trp Met His
5 <210> 47 <211> 17 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 47
Asn Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys
5 10 15
Ser <210> 48 <211> 6 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 48
Ser Ser Val Phe Asp Tyr
5 <210> 49 <211> 381 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(381) <400> 49 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 1015 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag aac 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 4045 att ggc aca agc ata cac tgg ttt cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
5560 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 7580
- 54 031043 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 9095 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120125 <210> 50 <211> 127 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 50
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
5 1015
Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn 35 4045
Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 5560
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
70 7580
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 9095
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
100 105110
Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120125 <210> 51 <211> 11 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 51
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His
5 10
- 55 031043 <210> 52 <211> 7 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 52
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
5 <210> 53 <211> 9 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 53
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
5 <210> 54 <211> 396 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(396) <400> 54 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 1015 gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg agg 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
2530 cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045 acc agc tac tgg ata acc tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt 192 Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
5560 gag tgg atc gga aat att tat cct tct gat agt tat act aac tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 7580 caa aag ttc agg gac aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agt 288 Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
9095 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ccg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105110
- 56 031043 tat tac tgt tca gcc ctc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc 384 Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 115 120 125 aca gtc tcc tca 396
Thr Val Ser Ser
130 <210> 55 <211> 132 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 55
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
5 1015
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
2530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045
Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 5560
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
70 7580
Gln Lys Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105110
Tyr Tyr Cys Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
115 120125
Thr Val Ser Ser
130 <210> 56 <211> 5 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 56
Ser Tyr Trp Ile Thr
5
- 57 031043 <210> 57 <211> 17 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 57
Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
5 10 15
Asp <210> 58 <211> 4 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 58
Leu Phe Asp Tyr <210> 59 <211> 381 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(381) <400> 59 atg gta tcc aca cct cag ttc ctt gta ttt ttg ctt ttc tgg att cca 48 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 1015 gcc tcc aga ggt gac atc ttg ctg act cag tct cca gcc atc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530 gtg agt cca gga gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agc 144 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
4045 att ggc aca agc ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tct cca 192 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
5560 agg ctt ctc ata aag tat gct tct gag tct atc tct ggg atc cct tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 7580 agg ttt agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttt att ctt agc atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 9095
- 58 031043 agt gtg gag tct gaa gat att gca gat tat tac tgt caa caa agt aat 336 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 agc tgg cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa 381 Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 60 <211> 127 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 60
Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro
5 1015
Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
2530
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 4045
Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
5560
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser
70 7580
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Ser Ile Asn 85 9095
Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
100 105110
Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120125 <210> 61 <211> 11 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 61
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
5 10 <210> 62 <211> 7 <212> Белок
- 59 031043 <213> homo sapiens <400> 62
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
5 <210> 63 <211> 9 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 63
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
5 <210> 64 <211> 423 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(423) <400> 64 atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggc 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 1015 gtc cac tct gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
2530 cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
4045 act gac tac aat atg cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu
5560 gaa tgg att gga tat att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 7580 cag agg ttc aag agc agg gcc aca atg act gta gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095 aca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gat gac tct gca gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105110 tat tac tgt gca aga gaa gac tac ggt agt agc ccc tct tat gct atg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met 115 120125
- 60 031043 gac tat tgg ggt caa gga acc tca gtc atc gtc tcc tca 423
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
130 135 140 <210> 65 <211> 141 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 65
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
5 1015
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
2530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 4045
Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu 50 5560
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 7580
Gln Arg Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 9095
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val
100 105110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met
115 120125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
130 135140 <210> 66 <211> 5 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 66
Asp Tyr Asn Met His
5 <210> 67 <211> 17 <212> Белок
- 61 031043 <213> homo sapiens <400> 67
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
5 10 15
Ser <210> 68 <211> 13 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 68
Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
5 10 <210> 69 <211> 390 <212> ДНК <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(390) <400> 69 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 1015 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
2530 agt ctt gga gat cag gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 4045 gta cac ggt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192 Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
5560 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 7580 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg acg gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
9095 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105110
- 62 031043 tct caa act aca cat gtt ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa 384 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ata aaa 390
Ile Lys
130 <210> 70 <211> 130 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 70
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
5 1015
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
2530
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 4045
Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 5560
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
70 7580
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 9095
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105110
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu
115 120125
Ile Lys
130 <210> 71 <211> 16 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 71
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15
- 63 031043 <210> 72 <211> 7 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 72
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
5 <210> 73 <211> 8 <212> Белок <213> homo sapiens <400> 73
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Thr
5

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело против TROP-2 человека, которое обладает противоопухолевой активностью in vivo, где аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области Н-цепи антитела представляют собой SEQ ID NO: 66-68 соответственно, и аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области L-цепи антитела представляют собой SEQ ID NO: 71-73 соответственно.
    2. Антитело по п.1, которое обладает противоопухолевой активностью в отношении двух или более типов опухолевых клеточных линий человека.
    3. Антитело по п.1 или 2, где константа диссоциации (величин Kd) составляет 1,0х10-10 М или менее.
    4. Антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой моноклональное антитело.
    5. Антитело по любому из пп.1-4, где опухоль представляет собой по меньшей мере один тип опухоли, выбранный из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
    6. Антитело по любому из пп.1-4, где опухоль представляет собой рак поджелудочной железы человека.
    7. Антитело по любому из пп.1-6, где опухоль представляет собой рецидивирующий рак или метастазирующий рак.
    8. Антитело по любому из пп.2-7, где опухолевые клеточные линии представляют собой клеточные линии по меньшей мере двух типов, выбранных из группы, состоящей из клеточной линии рака поджелудочной железы человека PK-59, клеточной линии рака поджелудочной железы человека BxPC-3, клеточной линии рака поджелудочной железы человека KP-3L, клеточной линии рака поджелудочной железы человека KP-2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека PK-1, клеточной линии рака поджелудочной железы человека PK-45^ клеточной линии рака поджелудочной железы человека PK45Р, клеточной линии рака поджелудочной железы человека TCC-PAN2, клеточной линии рака поджелудочной железы человека SUIT-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека САСО-2, клеточной линии рака толстого кишечника человека SW480, клеточной линии рака толстого кишечника человека DLD-1, клеточной линии рака толстого кишечника человека НСТ 116, клеточной линии рака молочной железы человека JIMT-1, клеточной линии рака молочной железы человека НСС1143, клеточной линии рака молочной железы человека MCF-7, клеточной линии рака предстательной железы человека DU145 и клеточной линии рака предстательной железы человека РС-3.
    9. Антитело по любому из пп.2-7, где опухолевые клеточные линии представляют собой клеточную линию рака поджелудочной железы человека PK-59 и клеточную линию рака поджелудочной железы человека BxPC-3.
    10. Антитело по любому из пп.1-9, где антитело представляет собой рекомбинантное антитело.
    11. Антитело по п.10, где рекомбинантное антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.
    12. Антитело по п.11, где V-область Н-цепи химерного антитела состоит из аминокислотной после
    - 64 031043 довательности, представленной в SEQ ID NO: 65, или аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот в положениях 20-141 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65 и V-области L-цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70 или аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот в положениях 20-130 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
    13. Выделенное моноклональное антитело против TROP-2 человека, содержащее аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области Н-цепи антитела, представленные в SEQ ID NO: 66-68 соответственно, и аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области L-цепи антитела, представленные в SEQ ID NO: 71-73 соответственно, которое продуцируется гибридомой, имеющей номер доступа № FERM ВР-11346.
    14. Выделенный фрагмент антитела, происходящий из антитела по любому из пп.1-13, который содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 66-68 и аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 71-73.
    15. Фрагмент антитела по п.14, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 или аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 20-141 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70 или аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот в положениях 20-130 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70.
    16. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело против TROP-2 человека, содержащее аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области Н-цепи антитела, представленные в SEQ ID NO: 66-68 соответственно, и аминокислотные последовательности CDR 1-3 V-области L-цепи антитела, представленные в SEQ ID NO: 71-73 соответственно, которая имеет номер доступа № FERM ВР-11346.
    17. Конъюгат антитело-лекарственное средство, который содержит антитело по любому из пп.1-13 и вещество, обладающее противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток.
    18. Конъюгат фрагмент антитела-лекарственное средство, который содержит фрагмент антитела по любому из пп.14 или 15 и вещество, обладающее противоопухолевой активностью и/или активностью уничтожения клеток.
    19. Конъюгат по п.17 или 18, где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
    20. Конъюгат по п.17 или 18, где опухоль представляет собой рак поджелудочной железы человека.
    21. Конъюгат по п.17 или 18, где опухоль представляет собой рецидивирующую злокачественную опухоль или метастазирующую злокачественную опухоль.
    22. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, которая содержит антитело по любому из пп.1-13 или фрагмент антитела по любому из пп.14 или 15, или конъюгат по любому из пп.17-21, или их комбинацию.
    23. Композиция по п.22, которая не вызывает снижения массы тела в качестве побочного эффекта.
    24. Композиция по п.22 или 23, где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
    25. Композиция по любому из пп.22-24, где опухоль представляет собой рецидивирующую злокачественную опухоль или метастазирующую злокачественную опухоль.
    26. Лекарственное средство против опухоли, которое содержит антитело по любому из пп.1-13 или фрагмент антитела по любому из пп.14 или 15, или конъюгат по любому из пп.17-21, или их комбинацию.
    27. Лекарственное средство по п.26, которое не вызывает снижения массы тела в качестве побочного эффекта.
    28. Лекарственное средство по п.26 или 27, где опухоль представляет собой опухоль по меньшей мере одного типа, выбранного из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
    29. Средство для диагностики опухоли, которое содержит антитело по любому из пп.1-13 или фрагмент антитела по любому из пп.14 или 15, или конъюгат по любому из пп.17-21, или их комбинацию.
    30. Диагностическое средство по п.29, где опухоль представляет собой опухоль по меньшей мере одного типа, выбранного из группы, состоящей из рака поджелудочной железы человека, рака предстательной железы человека, рака толстого кишечника человека и рака молочной железы человека.
    - 65 031043
    Аффинность
    Фиг. 1
    К5-70 Т6-16 К5-107
    К5-116-2-1 Т5-86
    Фиг. 2
    Фиг. 3
    - 66 031043
    - 67 031043
    Фиг. 7
    Фиг. 8 □ 0 мкг/мл □ 0.1 мкг/мл 1 мкг/мл
    Фиг. 9
    CD
    Фиг. 10А
    - 68 031043
    1.2 сутки 1 сутки О сутки 1 сутки О сутки 1 сутки 0 сутки 1 сутки mlgG YY01 К5-70 Тб-16
    Фиг. 10B
    Фиг. 11
    К5-70/лечение §
    Сутки после введения
    Фиг. 12
    О
    1.5
    0.5
    О
    IgG К5-70
    Сутки после введения
    Фиг. 13
    - 69 031043
    Фиг. 14
    К5-70 /ВхРС-3
    Сутки после введения
    Фиг. 15
    Сутки после введения
    Фиг. 16
    SP ΤΥ-домен тм с 1 323 hmTROP-2-A 64 -----п- 318 1 69 --------LJ- hmTROP-2-B 96 -----П- 318 1 101 -----U- hmTROP-2-C 140 -----п- 318 1 145 --------LJ- mhTROP-2-D 1 п I— 139 u I__ 146 323 mhTROP-2-E 1 П I— 188 mhTROP-2-F L1 I 1 п I— 193 228 323 U I__ 233 323 Фиг. 17
    - 70 031043
    KR.11R.9.1 _ TR-Λ _ TR.dR
    Q
    CL
    Фиг. 18
    Фиг. 19
    *
    ВИЗЕ™
    z
    Μ НЯИЯЕ,
    ζ
    Фиг. 20
    - 71 031043 (А) (В) (С) (□) (Е) (F) (G) (Η) (I)
    Фиг. 21
    Фиг. 22
    - 72 031043
    Фиг. 23В
    Фиг. 24В
    - 73 031043
    Фиг. 25В
    Сутки после трансплантации
    Фиг. 26А
    Фиг. 26в
    - 74 031043
    Фиг. 27B
    700.0
    600.0
    500.0 с о >ϊ с о ф ril ю О
    400.0
    300.0
    200.0
    100.0
    -·- IgG мыши
    -о- 1 мг/кг
    -Δ- 5 мг/кг
    ΗΣΗ 10 мг/кг
    0.0
    Сутки после трансплантации
    Фиг. 28 А
    Фиг. 28В
    Фиг. 29
    - 75 031043
    Сутки после трансплантации
    Фиг. 30А
    Фиг. 30В
    Фиг. 31
    1200
    1000
    О 10 20 30 40 50
    Сутки после трансплантации
    Фиг. 32
    - 76 031043
    К5-70 VH
    ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAG MG WSCIILFLVATATGVHSQ GTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCC VQLQQPGAELVRPGASVKLS
    TGCAAGGCTTCTGGCTACACСTTCACCATCTACTGGATAAACTGGGTGAAACAGAGGCСT CKASGYTFT I Y W I N W V К Q R P GGACAAGGC С T T GAGT GGAT C GGAAAT AT T T AT С С T T С T GAT AGT T AT AC T AAC T ACAAT GQGLEWIG NIYPSDSYTNYN CAAAAGT T CAAGGACAAGGCCACAT T GACT GTAGACAAAT CCTCCAGCACAGCCTACAT G Q К F К D KATLTVDKSSSTAYM CAGCTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAACGTCTATG QLSSPTSEDSAVYYCTR T S M GCGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
    A D Y WGQGTTLTVSS
    Фиг. 33
    K5-70
    VL
    ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAGGT MVS TPQFLVFLLFW I P A S R G GACAT CT T GCT GACT CAGT CT CCAGCCAT CCT GT CT GT GAGT CCAGGAGAAAGAGT CAGT =DILLTQSPAILSVSPGERVS t T CT CCT GCAGGGC CAGT CAGAGCAT T GGCACAAGCATACAC T GGT AT CAGCAAAGAACA F S C RASQSIGTSIH W Y Q Q R T
    AATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCC NGSPRLLIK Y A S E S I S G I P S
    AGGT T TAGT GGCAGT GGAT CAGGGACAGAT T T TAC T CT TAGCAT CAACAGT GT GGAGT С T RFSGSGSGTDFTLSINSVES GAAGATAT T GCAGAT TAT TAC T GT CAACAAAGTAATAGCT GGCCAT T CACGT T C GGC T C G EDIADYYC QQSNSWPFT F G S GGGACAAAGT T GGAAATAAAA
    G T К L E I К
    Фиг. 34
    K5-107 VH
    ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAG MGWSCIILFLVATATGVHSQ^ GTCCAACTGCAGCAACCTGGGTCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCC VQLQQPGSELVRPGASVKLS T GCAAGGCT T С T GGCTACACAT T CACCAGC TAC T GGAT GCAC T GGGT GAAGCAGAGGCAT CKASGYTFT S Y W Μ H W V К Q R H GGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTGGTGGTTATACTAACTACGAT GQGLEWIG NIYPGGGYTNYD GAGAAGT T CAAGAGCAAGGGCACACT GACT GTAGACACAT CCT CCAGCACAGCCTACAT G E К F К S К GTLTVDTSSSTAYM САСС T CAGCAGCC T GACAT С T GAGGACT CT GC GGT CT AT TAC T GTACAAGAT CAT CC GT T HLSSLTSEDSAVYYCTR S S V TTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA F D Y W GQGTTLTVSS
    Фиг. 35
    K5-107 VL
    ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAGGT MVSTPQFLVFLLFWIPASRG GACAT CT T GC T GAC T CAGT CT CCAGCCAT CC T GT С T GT GAGT CCAGGAGAAAGAGT CAGT JDILLTQSPAILSVSPGERVS
    T T CT CCT GCAGGGC CAGT CAGAACAT T GGCACAAGCATACAC T GGT T T CAGCAAAGAACA F S C RASONIGTSIH W F Q Q R T
    AATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCC NGSPRLLIK Y A S E S I S G I P S
    AGGT T TAGT GGCAGT GGAT CAGGGACAGAT T T TAC T С T TAGCAT CAACAGT GT GGAGT CT RFSGSGSGTDFTLSINSVES GAAGAT AT T GCAGAT TAT TAC T GT CAACAAAGTAAT AGCT GGCCAT T CACGT T C GGCT CG EDIADYYC QQSNSWPFT F G S GGGACAAAGT T GGAAATAAAA
    G T К L E I К
    Фиг. 36
    - 77 031043
    К5-116-2-1 VH
    ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAG MGWSCIILFLVATATGVHSQ GTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCC VQLQQPGAELVRPGASVKLS TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAACCTGGGTGAAGCAGAGGCCT CKASGYTFT S Y W I T W V К Q R P GGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAAT GQGLEWIG NIYPSDSYTNYN CAAAAGT T CAGGGACAAGGCCACAT TGACT GTAGACAAAT CCT CCAGTACAGCCTACAT G Q К F R D KATLTVDKSSSTAYM CAGCTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTTCAGCCCTCTTTGAC QLSSPTSEDSAVYYCSA L F D TACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA YWGQGTTLTVSS
    Фиг. 37
    K5-116-2-1 VL
    ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTGTATTTTTGCTTTTCTGGATTCCAGCCTCCAGAGGT MV STPQFLVFLLFWIPASRG GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGT J3ILLTQSPAILSVSPGERVS
    T T CT C CT GCAGGGCCAGT CAGAGCAT T GGCACAAGGATAGACT GGTAT GAGCAAAGAACA F S C RASQSIGTSIH W Y Q Q R T
    AATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCC NGSPRLLIK Ύ A S E S I S G I P S
    AGGT T TAGT GGCAGT GGAT CAGGGACAGAT T T TAT T С T TAGCAT CAACAGT GT GGAGT CT RFSGSGSGTDFILSINSVES GAAGATATTGCAGATTATTAGTGTCAACAAAGTAATAGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCG EDIADYYC QQSNSWPFT F G S GGGACAAAGT T GGAAATAAAA
    G T К L E I К
    Фиг. 38
    T6-16 VH
    ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAG MG WSWIFLFLLSGTAGVHSE GTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCC VQLQQSGPELVKPGASVKIS T GCAAGGC T T CT GGATACACAT T CAC T GAC TACAATAT GCAC T GGGT GAAGCAGAGC CAT CKASGYTFT D Y Ν Μ H W V К Q S H GGAAAGAACСTTGAATGGATTGGATATATTTATССTTACAATGGTGGTACTGGCTACAAC GKNLEWIG YIYPYNGGTGYN CAGAGGT T CAAGAGCAGGGC CACAAT GACT GT AGACAAAT С С T C CAGCACAGC CTACAT G 0 R F К S RATMTVDKSSSTAYM GAGCTCCGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAAGACTAC ELRSLTSDDSAVYYCAR E D Y GGTAGTAGCCCCTCTTATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCATCGTCTCC GSSPSYAMDY WGQGTSVIVS TCA
    S
    Фиг. 39
    T6-16 VL
    ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAT MKLPVRLLVLMFW I PASS SD= GTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGGCCTCCATC VVMTQTPLSLPVSLGDQASI T CT T GCAGAT CTAGT CAGAGCC T T GTACACGGTAAT GGAAACACC TAT T TACAT T GGTAC S C RSSOSLVHGNGNTYLH W Y СTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTССTGATСTACAAAGTTTCCAACCGATTTTСT LQKPGQSPKLLIY К V S N R F S GGGGT CCCAGACAGGT T CAGT GGCAGT GGAT CAGGGACGGAT T T CACACT CAAGAT CAGC GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAACTACACATGTTCCCACG RVEAEDLGVYFC SQTTHVPT TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA FGSGTKLEIK
    Фиг. 40
EA201291260A 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo EA031043B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010113302 2010-05-17
PCT/JP2011/061709 WO2011145744A1 (ja) 2010-05-17 2011-05-17 in vivoで抗腫瘍活性を有する抗ヒトTROP-2抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201291260A1 EA201291260A1 (ru) 2013-05-30
EA031043B1 true EA031043B1 (ru) 2018-11-30

Family

ID=44991828

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500220A EA201500220A1 (ru) 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo
EA201500219A EA035852B1 (ru) 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo
EA201291260A EA031043B1 (ru) 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500220A EA201500220A1 (ru) 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo
EA201500219A EA035852B1 (ru) 2010-05-17 2011-05-17 Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9062100B2 (ru)
EP (1) EP2573120B1 (ru)
JP (2) JP5859434B2 (ru)
KR (1) KR101624381B1 (ru)
CN (1) CN103228673A (ru)
AU (1) AU2011255870B2 (ru)
BR (1) BR112012029281B1 (ru)
CA (1) CA2798778C (ru)
EA (3) EA201500220A1 (ru)
ES (1) ES2664809T3 (ru)
IL (1) IL222812B (ru)
MX (2) MX350781B (ru)
NZ (2) NZ603455A (ru)
SG (2) SG10201503904XA (ru)
WO (1) WO2011145744A1 (ru)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US7238785B2 (en) 2002-03-01 2007-07-03 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US9745380B2 (en) 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
US9770517B2 (en) 2002-03-01 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Anti-Trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CA2508831C (en) 2002-12-13 2012-05-01 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
MX350781B (es) 2010-05-17 2017-09-18 Livtech Inc * Anticuerpo anti-humano trop-2 que tiene actividad anti-tumoral in vivo.
US9427464B2 (en) 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
ITCH20120008A1 (it) * 2012-05-16 2013-11-17 Saverio Alberti Uso di trop-2 come marcatore predittivo di risposta a terapia anti-tumorale basata su inibitori di cd9, akt e vie di segnale collegate
CN102827282B (zh) * 2012-09-04 2015-02-11 林红 人源抗Trop-2基因工程抗体IgG及其应用
US9492566B2 (en) 2012-12-13 2016-11-15 Immunomedics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
US9931417B2 (en) 2012-12-13 2018-04-03 Immunomedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
US10137196B2 (en) 2012-12-13 2018-11-27 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and SN-38 for improved efficacy and decreased toxicity
US10206918B2 (en) 2012-12-13 2019-02-19 Immunomedics, Inc. Efficacy of anti-HLA-DR antiboddy drug conjugate IMMU-140 (hL243-CL2A-SN-38) in HLA-DR positive cancers
SI2900277T1 (sl) 2012-12-13 2022-05-31 Immunomedics, Inc. Odmerki imunokonjugatov protiteles in SN-38 za boljšo učinkovitost in zmanjšano toksičnost
US11253606B2 (en) 2013-07-23 2022-02-22 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, Bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
PL3044323T3 (pl) * 2013-09-13 2022-06-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposoby wykrywania i ilościowego oznaczania białka komórki gospodarza w liniach komórkowych
SG11201601823TA (en) 2013-09-13 2016-04-28 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
CN105849126B (zh) 2013-12-25 2020-02-18 第一三共株式会社 抗trop2抗体－药物偶联物
PT3101032T (pt) 2014-01-31 2019-04-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Onjugado de anticorpo anti-her2-fármaco
AU2015219495B2 (en) 2014-02-21 2019-11-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
EP3227340B1 (en) * 2014-12-04 2020-06-17 Mediterranea Theranostic S.R.L. Humanized anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
AU2016252771B2 (en) 2015-04-22 2021-12-16 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating Trop-2-positive cancer cells
US10195175B2 (en) 2015-06-25 2019-02-05 Immunomedics, Inc. Synergistic effect of anti-Trop-2 antibody-drug conjugate in combination therapy for triple-negative breast cancer when used with microtubule inhibitors or PARP inhibitors
KR20180021723A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 선택적 제조 방법
JP6920293B2 (ja) * 2015-10-30 2021-08-18 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ＩｇＧ軽鎖におけるＮ末端切断の防止
CN108601841A (zh) 2016-02-10 2018-09-28 免疫医疗公司 Abcg2抑制剂与sacituzumab govitecan(immu-132)的组合克服表达trop-2的癌中对sn-38的抗性
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
TW201828993A (zh) 2016-12-12 2018-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合
IL268102B1 (en) 2017-01-17 2024-08-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-GPR 20 antibody and anti-GPR 20 antibody-drug conjugate
CA3050332A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Immunomedics, Inc. Treatment of trop-2 expressing triple negative breast cancer with sacituzumab govitecan and a rad51 inhibitor
EP3606964A4 (en) 2017-04-03 2020-12-09 Immunomedics, Inc. SUBCUTANE ADMINISTRATION OF ANTIBODY DRUG CONJUGATES FOR CANCER THERAPY
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
US11945882B2 (en) 2017-08-31 2024-04-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
US11318212B2 (en) 2017-08-31 2022-05-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
CN108680750A (zh) * 2017-12-29 2018-10-19 广西壮族自治区人民医院 Trop2蛋白表达量的elisa检测方法及试剂盒
ES2980468T3 (es) 2018-05-18 2024-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo-fármaco anti-MUC1-exatecán
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
US20220089768A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-24 Trio Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific protein molecules and uses thereof
JP2022524338A (ja) * 2019-03-05 2022-05-02 武田薬品工業株式会社 拘束され、条件的に活性化された結合タンパク質
CN112243443B (zh) * 2019-05-10 2023-03-17 江苏豪森药业集团有限公司 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US20230270870A1 (en) 2019-05-29 2023-08-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
KR20230015888A (ko) 2020-03-20 2023-01-31 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 사시투주맙 고비테칸 요법에 대한 바이오마커
CN115996756A (zh) 2020-05-08 2023-04-21 博尔特生物治疗药物有限公司 弹性蛋白酶底物肽连接子免疫缀合物及其用途
EP4196168A1 (en) 2020-08-13 2023-06-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Pyrazoloazepine immunoconjugates, and uses thereof
IT202000031838A1 (it) * 2020-12-22 2022-06-22 Saverio Alberti Piattaforma per ottenere anticorpi monoclonali diretti contro antigeni processati tumore-specifici
CN114685669A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 和铂医药(苏州)有限公司 结合trop2的抗体及其用途
KR20230163450A (ko) 2021-03-26 2023-11-30 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 2-아미노-4-카복사마이드-벤즈아제핀 면역접합체 및 이의 용도
JP2024511088A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド ２－アミノ－４－カルボキサミド－ベンゾアゼピン免疫複合体、及びその使用
CN115429893A (zh) 2021-06-02 2022-12-06 百奥泰生物制药股份有限公司 药物偶联物及其用途
CA3222269A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 Gilead Sciences, Inc. Combination mcl-1 inhibitors with anti-cancer agents
EP4351657A1 (en) 2021-06-11 2024-04-17 Gilead Sciences, Inc. Combination mcl-1 inhibitors with anti-body drug conjugates
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
CA3234604A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Shelley Erin ACKERMAN Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
IL312728A (en) 2021-11-30 2024-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibodies masked in protease-wells
CN114195888B (zh) * 2021-12-07 2023-06-09 江苏中新医药有限公司 一种抗新冠抗体药物的核心序列
KR20240141757A (ko) 2022-02-09 2024-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 환경 응답성 마스킹 항체 및 그 이용
TW202432187A (zh) 2022-12-23 2024-08-16 美商建南德克公司 小腦蛋白降解劑結合物及其用途
WO2024147503A1 (ko) * 2023-01-04 2024-07-11 주식회사 애스톤사이언스 Trop2 면역원성 펩타이드
WO2024173384A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001501801A (ja) * 1995-10-19 2001-02-13 ブリストル−マイヤーズ スクイッブ カンパニー モノクローナル抗体ｂｒ１１０およびその使用
JP2006502698A (ja) * 2002-03-01 2006-01-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッド Ｒｓ７抗体
JP2009527230A (ja) * 2006-02-24 2009-07-30 アリアス リサーチ、インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ−２の表面発現を証明する細胞の細胞傷害性媒介

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
ES2382987T3 (es) 2003-11-28 2012-06-15 Kanagawa Academy Of Science And Technology Método de detección de cáncer de hígado, diagnóstico de cáncer de hígado y curación del cáncer
US20080131428A1 (en) * 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
EP2393512B1 (en) 2009-02-05 2016-10-26 ONCOXX Biotech s.r.l. Anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors
MX350781B (es) 2010-05-17 2017-09-18 Livtech Inc * Anticuerpo anti-humano trop-2 que tiene actividad anti-tumoral in vivo.
JP2015095020A (ja) * 2013-11-11 2015-05-18 株式会社デンソーアイティーラボラトリ 画像付二次元コード生成装置、画像付二次元コード生成方法、及び画像付二次元コード生成プログラム

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001501801A (ja) * 1995-10-19 2001-02-13 ブリストル−マイヤーズ スクイッブ カンパニー モノクローナル抗体ｂｒ１１０およびその使用
JP2006502698A (ja) * 2002-03-01 2006-01-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッド Ｒｓ７抗体
JP2009527230A (ja) * 2006-02-24 2009-07-30 アリアス リサーチ、インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ−２の表面発現を証明する細胞の細胞傷害性媒介
JP2009528995A (ja) * 2006-02-24 2009-08-13 アリアス リサーチ、インコーポレイテッド 癌性疾患修飾抗体１４１２０５−０５

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2011145744A1 (ja) 2013-07-22
MX369106B (es) 2019-10-29
NZ702053A (en) 2016-01-29
AU2011255870B2 (en) 2015-05-28
MX2012013327A (es) 2012-12-05
JP5859434B2 (ja) 2016-02-10
KR20130038278A (ko) 2013-04-17
EA201291260A1 (ru) 2013-05-30
NZ603455A (en) 2015-01-30
CN103228673A (zh) 2013-07-31
BR112012029281B1 (pt) 2020-12-08
CA2798778A1 (en) 2011-11-24
SG10201503904XA (en) 2015-06-29
JP2015221793A (ja) 2015-12-10
IL222812B (en) 2018-06-28
EA201500219A1 (ru) 2015-10-30
US9670287B2 (en) 2017-06-06
EP2573120A1 (en) 2013-03-27
KR101624381B1 (ko) 2016-05-25
MX350781B (es) 2017-09-18
BR112012029281A2 (pt) 2016-11-29
US20160053018A1 (en) 2016-02-25
EP2573120B1 (en) 2018-01-17
IL222812A0 (en) 2012-12-31
EA201500220A1 (ru) 2015-10-30
ES2664809T3 (es) 2018-04-23
AU2011255870A8 (en) 2013-01-24
EA035852B1 (ru) 2020-08-20
US20130089872A1 (en) 2013-04-11
CA2798778C (en) 2016-01-05
AU2011255870A1 (en) 2013-01-17
EP2573120A4 (en) 2013-10-16
US9062100B2 (en) 2015-06-23
SG185583A1 (en) 2012-12-28
WO2011145744A1 (ja) 2011-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10202461B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
US9670287B2 (en) Anti-human TROP-2 antibody having anti-tumor activity in vivo
JP5219827B2 (ja) ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体
JP5615169B2 (ja) ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体
NZ623464B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ716839A (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo
NZ716839B2 (en) Anti-human trop-2 antibody having an antitumor activity in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM