CN101590034B - 化合物儿茶素在制备抗耐药菌株药物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物儿茶素在抗耐药菌株方面的应用以及该化合物儿茶素在协同抑制耐药金黄色葡萄球菌方面的应用，同时还涉及了该化合物儿茶素与青霉素联合使用时在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。本发明所涉及的化合物儿茶素对金黄色葡萄球菌耐药菌株具有抑制活性，与青霉素混合进行协同作用试验中，证明本发明的化合物儿茶素具有协同抑制耐药金黄色葡萄球菌菌株活性，且其稳定性优于β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾。体内试验也表明儿茶素与青霉素在协同作用下对耐药金黄色葡萄球菌菌株具有抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然化合物儿茶素在抗耐药菌株方面的应用，尤其涉及其在体内外的协同抗耐药菌方面的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是医院感染的主要病原菌之一，金黄色葡萄球菌可以引起小到皮肤感染，大到可以致命的严重肺炎、脑膜炎以及骨关节感染、心内膜炎和菌血症。通常接受血液透析治疗的晚期肾脏疾病患者特别容易感染金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌感染是引起住院病人感染和死亡的主要原因。随着新型抗生素的不断问世，金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增强，成为临床治疗的棘手问题，而目前，对于新抗菌药物的研究开发，主要是合成，半合成以及寻找新的、产生抗生素的高产优质微生物菌种，其研发过程相当复杂，且抗菌药物价格昂贵。从植物中，尤其是药用植物中寻找具有抗耐药菌株活性成分的研究，将会是一个全新的技术领域。
儿茶素类化合物种类繁多，其中以儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素等黄烷类化合物为代表，在植物中分布广泛，其中以豆科(如儿茶、鸭皂树)、茜草科(如儿茶钩藤)、蔷薇科(如委陵菜、山樱桃、鹅绒委陵菜、单子山楂)、蓼科(如大黄、拳参、萹蓄)、山茶科(如山茶)、七叶树科(如红七叶树、加洲七叶树)为多。儿茶素类化合物具有明显的清除体内自由基、抗癌、抗菌抗炎、抗突变、抗衰老及改善肝功能等生物活性。目前，有关儿茶素的研究主要集中在茶叶儿茶素的人体保健(如抗氧化抗衰老)、肉类保鲜等方面。而国内外关于儿茶素抗菌方面的研究，也大部分是针对植物中特别是茶叶中总多酚或总儿茶素类进行抗菌筛选，很少有进行深入的单体体内外抗菌活性的研究；至于儿茶素对抗耐药菌株活性的研究，至今尚未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对天然化合物儿茶素进行抗菌特别是体内协同抗耐药菌株的活性应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种化合物儿茶素在抗耐药菌株方面的应用。
所述的化合物儿茶素与青霉素联合使用时在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。
所述的化合物儿茶素在协同抑制耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。
所述的儿茶素与青霉素的重量比为(1～3)∶1。
儿茶素与青霉素的重量比优选为2∶1。
本发明所涉及的化合物儿茶素对金黄色葡萄球菌耐药菌株具有抑制活性，与青霉素混合进行协同作用试验中，证明本发明的化合物儿茶素具有协同抑制耐药金黄色葡萄球菌菌株活性，且其稳定性优于β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾。体内试验也表明儿茶素与青霉素在协同作用下对耐药金黄色葡萄球菌菌株具有抑制活性。另外，本发明所涉及的化合物儿茶素在自然界分布广泛，有丰富的原料来源，将其应用在治疗金黄色葡萄球菌感染方面具有很好的效果，且成本低。本发明的儿茶素从茜草科帽蕊木属植物中提取，筛选出具有抗耐药菌成分的药物，进一步丰富了中草药资源方面的研究内容。
本发明针对目前金黄色葡萄球菌耐药性严重的问题，对儿茶素进行了体外和体内抗菌试验。体外试验发现其对金黄色葡萄球菌敏感菌株无活性，而对其耐药菌株有活性，在此基础上，体外协同试验发现其与青霉素在最佳配比作用下对耐药金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，并且体内试验也表明本发明化合物儿茶素在协同作用下也有较好的活性。
菌株敏感程度检测
目前临床学耐药细菌的检测，主要是根据美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical and Laboratory Standards NCCLS)执行标准，采用纸片扩散法：用普通方法可获得浓度的常规抗菌药物不能被抑制，或(和)在特殊耐药机制与有效临床不能治疗时，MIC接近或大于常规水平，这种菌株被定义为耐药菌株。
参照NCCLS实验，对金黄色葡萄球菌敏感菌株及耐药菌株，以营养琼脂为培养基，采用青霉素G和德国Serva公司生产的青霉素(Serva31749)进行菌株敏感程度测定，按照中国药品生物制品检定所、卫生部抗菌药物细菌耐药性检测中心制定的药敏试验判断标准。
本次试验中所使用的金黄色葡萄球菌耐药菌株，当应用青霉素G测定敏感度时，1000U/disc所产生的抑菌圈直径为13毫米；而标准中青霉素G 10U/disc，抑菌圈直径小于20毫米时，即判断为耐药菌株。据此可以判断该耐药菌株为耐药性金黄色葡萄球菌，并用Serva 31749寻找出该菌株对青霉素的MIC为7.5μg/disc。见表1
表1菌株敏感程度测定
金黄色葡萄球菌敏感菌株与耐药菌株对青霉素敏感性试验测试表
注：该实验平行重复3次，取平均值
附图说明
图1为儿茶素在液体培养条件下与青霉素的协同作用；
图2为儿茶素与青霉素协同作用下的抑菌率。
具体实施方式
实施例1
抗金黄色葡萄球菌活性研究
试药：儿茶素，青霉素G(哈尔滨制药六厂)，Penicillin Serva31749(Germany serva com.Ltd)
菌种：金黄色葡萄球菌(26112-5)青霉素敏感菌株；金黄色葡萄球菌(CMCC 26003对青霉素G，苯唑青霉素，头孢唑啉，氟哌酸耐药)
培养基：营养琼脂培养基(中国科学院上海昆虫科技开发公司康乐培养基厂生产)
纸片扩散法对植物帽蕊木的分离产物儿茶素进行抗菌活性筛选。初筛后发现，本发明化合物儿茶素对金黄色葡萄球菌敏感菌株没有活性，但对其耐药菌株有活性。在此基础上，本发明又进行了复筛，结果见表2。
表2化合物对金黄色葡萄球菌耐药菌株的抑制作用
| 浓度 | 1/5 | 1/10 | 1/20 | 1/40 | |
| 儿茶素(μg/mm) | 300 | - | - | - | - |
| D(mm) | 10 | - | - | - | - |
注：该实验平行重复3次，取平均值
D为抑菌圈直径
由表2可知，该发明化合物对耐药菌株有抑制活性，且MIC为300μg/disc(MIC以培养基上完全无菌生长的试药最高稀释度作为该药的最低抑菌浓度)。
实施例2
本实施例为儿茶素在协同抑制耐药金黄色葡萄球菌方面的应用
协同作用试验
抗生素的联合使用以及增效剂在临床上的广泛使用，使协同作用理论日益完善。根据抗生素合并后的抗菌活性，有显著的差异决定于合并用药中每个抗生素的组分，对联合使用后的抗生素效果进行评判：当合并用药后的抗菌活性高于其组分抗菌活性总和时，则产生协同作用。
将儿茶素与青霉素(Serva31749)按重量比例为1∶1；2∶1；3∶1的比例混合，寻找最优配比。结果见表3。
表3化合物与青霉素协同作用最优配比的筛选
注：3次试验均值；D：抑菌圈直径；Con：原始浓度，即未稀释前的浓度，单位ug/disc；
-：无菌生长；Ratio：化合物与青霉素配比；M21：化合物儿茶素
由表3可以看出，M21与青霉素有协同作用，且其最优配比是2∶1。
实施例3
本实施例为儿茶素与青霉素联合使用时在抗耐药金黄色葡萄球菌方面的应用。
协同作用下对菌株的抑制率
将儿茶素与青霉素以2∶1的最佳比例混合，用甲醇配成4μg/ml的溶液，按浓度梯度加入接种菌株CMCC 26003的10ml培养基试管中，置于摇床上，28℃ 150次/min的条件下分别培养0，2，4，6，……24小时取出，分别置于冰箱内统一测定。同时做不加试药的空白对照和不加试药与接种菌株的空白对照，分别培养12小时和24小时，将待测定的培养试管，取600μl于EP管中，离心机10000r/min处理，取上清液200μl，作为空白对照，各取200μl分别加入菌体培养液于96孔板，Molecular Devices Spectral Max 190比色仪器上，测定OD600(光密度)。利用细菌悬液与浑浊度成正比的关系，用以表示该菌株在本实验条件下的相对生长量。并可根据公式计算百分抑制率I％，公式见下：
I％＝100％(Vmax-Vmaxb)/Vmaxl
(注：I％为百分抑制率；Vmax为样品OD600，Vmaxb为样品空白OD600，Vmaxl为阴性对照组OD600。)
以OD600为纵坐标，以实验药物的浓度微克/毫升为横坐标，对每次试验的结果在坐标上找出相应的点，联结这些点得到两条曲线，此为附图1。在根据上述公式计算出百分抑制率，以I％为纵坐标，以实验药物浓度微克/毫升为横坐标，作出柱状图，此为附图2。
由附图1可以看出，在培养12小时后(A曲线)，96μg/ml浓度下的试药对菌株抑制作用相当明显；24小时后(B曲线)，抑制效果明显降低；由附图2可以看出，12小时与24小时所产生的抑制率相似，在浓度96μg/ml下，抑制率分别为84.42％和84％。
实施例4
本实施例为儿茶素的体内试验
(1)材料仪器：
试药：本发明化合物M21(儿茶素)，青霉素G(哈尔滨制药六厂)
动物：昆明小鼠，空腹体重18～22g，雌雄各半(由河南省医学动物实验中心提供)
菌株：金黄色葡萄球菌(26112-5)青霉素敏感菌株；金黄色葡萄球菌(CMCC 26003对青霉素G，苯唑青霉素，头孢唑啉，氟哌酸耐药)
仪器：LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)
(2)儿茶素对金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡的保护作用
将儿茶素与青霉素以最佳配比2∶1混合，作为试药。金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)原菌液，离心，沉淀以5％酵母液稀释至所需浓度(最小致死量MLD)，制备成感染菌液供小鼠腹腔注射用。
取昆明小鼠75只，空腹称重，随机分为5组，每组15只，即生理盐水组(A组)、青霉素阳性对照组(B组)、化合物与青霉素配比物的低、中、高剂量组(C1、C2、C3组)。实验日晨每只鼠均腹腔注入100％MLD感染菌液0.5ml，感染后即刻和6h分别对每只小鼠腹腔注射受试药物，观察各组小鼠死亡情况。结果见表4。
表4化合物与青霉素G 2∶1协同作用下对感染CMCC 26003小鼠的影响(n＝15)
对感染动物的保护率(％)＝(空白死亡率-给药组死亡率)/空白组死亡率
由表4可见，化合物与青霉素协同作用下对感染金黄色葡萄球菌耐药菌株的小鼠具保护作用，150和200mg/kg剂量组对感染小鼠的死亡保护率分别为50％、66.7％，与生理盐水组比较具有显著性差异。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (1)
1.化合物儿茶素与青霉素在制备抗耐药金黄色葡萄球菌药物中的应用，其中，儿茶素与青霉素的重量比为2∶1。
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| EP0761226B1 (en) * | 1995-09-06 | 2001-05-30 | Mitsui Norin Co., Ltd. | Composition and method of potentiating antibiotics with polyphenols |
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