CN101422613A - 一种具有低抗血凝性肝素－紫杉醇抗癌药物 - Google Patents

Abstract

一种具有低抗血凝性肝素－紫杉醇抗癌药物，本发明涉及一种化学键合型抗癌药物。肝素衍生物和紫杉醇或紫杉醇衍生物通过化学键合的方式制备出肝素－紫杉醇药物，该抗癌药物不但具有比肝素更低的抗血凝特性，而且具有比单纯紫杉醇药物更强的抗癌性能。

Description

一种具有低抗血凝性肝素—紫杉醇抗癌药物

技术领域

本发明涉及一种具有低抗血凝性能和强抗癌性能的化学键合型抗癌药物。

背景技术

紫杉醇是六十年代美国化学家从红豆杉中提取出来的具有独特抗癌活性的药物，治疗乳腺癌，卵巢癌等非常有效，近年来十分广泛地应用于临床研究，但是由于其溶解性极差等原因，限制了它的应用范围。我国的云南、陕西、黑龙江等地培植了大片的红豆杉林，具有丰富的天然资源，研究以紫杉醇为活性成分的纳米抗癌靶向药物，有利于我国天然资源的利用，为我国深度开发紫杉醇提供了新的途径。化学键合型纳米靶向抗癌药物系统，就是通过化学键合的方式将药物包裹在可降解载体中，制备成纳米量级，利用受体介导系统直接将药物载入肿瘤区域，提高靶向性，同时又可大大提高药物在患部的相对浓度。由于载药纳米微粒较小，比表面积大，对受体组织的黏附性大，给药后滞留性及与组织的接触时间，接触面积大为增加，从而提高药物的生物利用度，降低毒性，减少药剂量，对纳米抗癌靶向药物系统的研究具有深远意义。虽然肝素的应用对癌症病人的治疗有一定好处，但是由于肝素本身高抗凝性质会限制其在临床中的应用，因此在肝素应用于临床抗凝剂的应用是需要进行化学修饰的，通过对药物输送系统的抗凝性质进行评价，说明制备的药物输送系统具有较好的安全性，能够避免在注射过程中载体引起的流血不止的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以肝素衍生物为载体制备出肝素—紫杉醇抗癌药物，该肝素—紫杉醇抗癌药物输送系统不但提高紫杉醇药物的溶解性，同时相比肝素而言，该系统的抗血凝性能大为降低，并且相比单一紫杉醇药物，其抗癌性能也有较大提高。

本发明的目的是通过下述方式实现的。

本发明采用肝素衍生物负载紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物为氧乙酰化肝素，结构如式I所示，

式I

其中：

X为H或SO₃ ^-基团，

Y为H、SO₃ ^-或COCH₃基团，

n为1-17，

其中氧乙酰化羧基占全部羧基40-85％。

紫杉醇衍生物为氨基酸改性紫杉醇，其结构如式II所示：

式II

其中：

R为CH(CH₃)₂、CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅基团。

所述的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。

紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量为药物总重量的15-30％。

肝素衍生物通过化学键合方式与紫杉醇形成酯键或与紫杉醇衍生物形成酰胺键。

本发明以肝素衍生物负载紫杉醇抗癌药物并研究其抗血凝性能。肝素衍生物通过肝素钠的酯化反应制备得来；紫杉醇抗癌药物可以是紫杉醇或紫杉醇衍生物，紫杉醇衍生物通过氨基酸与紫杉醇反应制备得来，其中适宜优选的的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。肝素—紫杉醇抗癌药物通过肝素衍生物与紫杉醇或紫杉醇衍生物通过化学键合方式形成酯键或酰胺键制备得来，本发明的药物用于对正常人的血的抗凝性能和对MCF-7乳腺癌细胞抑制性能评价，结果表明，本发明的抗癌药物具有比肝素更低的抗血凝特性，并且相比单一紫杉醇药物，其抗癌性能有较大提高。

具体实施方式

以下制备过程以及效果的实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

(一)氧乙酰化肝素的制备

称量肝素钠(250mg，0.1mmol-OH)，溶于20mL去离子水中，低温下通过732(H⁺)阳离子交换树脂，并用去离子水淋洗至pH值不变，淋出液用三丁胺调至pH值至6.0，将液体浓缩冷冻干燥得三丁铵肝素衍生物(500mg，0.1mmol-OH)。在N₂保护下将其溶于10ml DMF中，搅拌下加入DMAP(36mg，0.3mmol)，乙酸酐(1330mg，13mmol)后，再加入三乙胺(1300mg，13mmol)，冰浴反应30h后，反应转移至室温反应24h，反应毕，反应液中加入200mL冰乙醇，磁力搅拌1h使其充分沉淀。溶液离心后，弃上层清液，沉淀用少量蒸馏水溶解，液体低温下通过732(H⁺)阳离子交换树脂，去离子水淋洗至pH值不变，淋出液浓缩后过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱，去离子水冲洗，淋出液浓缩冷冻干燥得到氧乙酰化肝素白色固体(140mg)，收率56％。

(二)紫杉醇及紫杉醇衍生物药物的制备

(1)未改性紫杉醇原药简称为Drugl。

(2)在芴甲氧羰基氨酸(27mg，0.08mmol)与紫杉醇(60mg，0.072mmol)的20mL无水二氯甲烷中加入DMAP(38.7mg，0.32mmol)，0℃搅拌反应30min。再向反应液中加入EDC(30.4mg，0.16mmol)在0℃反应30min后，升温至室温反应8h，反应毕，分别用0.1N HCl(20mL)和水(20mL)洗，用分出有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，蒸除有机相得浓缩液。在浓缩液中加入含有10％四氢吡啶20mL二氯甲烷室温反应2h。反应毕，浓缩反应液，浓缩物用50mL正己烷沉淀2次，离心后去上清液，粗产物用柱色谱(氯仿：甲醇，25：1)分离得缬氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug2)。

(3)采用上述方法可以制备得到亮氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug3)。

(4)采用上述方法可以制备得到苯丙氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug4)。

(三)化学键合型肝素—紫杉醇药物的制备

0.14g氧乙酰化肝素溶于20mL的DMF中，搅拌下加入0.06g紫杉醇或紫杉醇衍生物以及催化量的HClO₄，N₂保护下室温反应24h，反应毕蒸出过量的DMF，产物溶于5mL去离子水装入透析袋(MWCO3500)透析2天，透析液浓缩冻干得白色固体产物，并由紫外光谱法测定载药量。

(四)抗血凝性能评价

采管：用一次性真空采血管取正常人静脉血2.7ml，采血管中抗凝剂为0.109M的枸椽酸钠0.3ml。

正常人混合血浆的制备：将上述采血轻轻摇匀，然后进行转速3000rpm离心10min，收集上层液(血浆，黄色)。

活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定：肝素标品用蒸馏水配成0.15u/ml、0.3u/ml、0.45u/ml、0.6u/ml、0.75u/ml的溶液。待测样用蒸馏水配成3μg/ml的溶液。在0.1ml血浆中加入肝素标品溶液或待测样溶液25微升，混匀后，加入0.1mlAPTT试剂。混合液置于37℃孵育箱中，2分钟后，加入37℃预热的CaCl₂溶液0.1ml。PRECIL C2000型凝血仪自动记录凝固时间。通过测定活化部分凝血活酶时间(APTT)评价药物输送系统的抗凝性能，即效价。

(五)抗癌性能评价

将冻存的MCF-7乳腺癌细胞复苏后，加入完全培养液(RPMI 1640+10％小牛血清+0.1％抗生素)，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。细胞培养至指数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化，加入10mL完全培养液调整细胞浓度，取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100μL，平板置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h。

对照品紫杉醇配制成0.01，0.1，1，10，100μg/mL5个浓度；取待测药物HD1、HD2用完全培养液分别配制相当于紫杉醇浓度的5个浓度。将96孔细胞板中的培养液吸出，同时用PBS清洗后，在孔板中加入100μL含有药物的完全培养液，置于放入37℃、5％ CO₂培养箱中培养48h后，应用MTT法进行测定，用酶标仪测定每孔在570nm的OD值，计算细胞抑制率：

细胞抑制率(％)＝(正常细胞孔OD值—加药细胞孔OD值)/正常细胞孔OD值×100％

样品浓度对数值与细胞抑制率线性回归，计算出待测药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值。

具体的药物输送系统的抗凝性能和抗癌性能评价如下：

实施例1

氧乙酰化肝素n＝5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53％，药物为Drugl，载药量为25.4％，抗凝性能，即效价为25U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.65μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例2

氧乙酰化肝素n＝5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53％，药物为Drug2，载药量为16.3％，抗凝性能，即效价为17U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.42μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例3

氧乙酰化肝素n＝5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53％，药物为Drug3，载药量为18.4％，抗凝性能，即效价为28U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.046μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例4

氧乙酰化肝素n＝5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53％，药物为Drug4，载药量为16.1％，抗凝性能，即效价为12U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.037μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例5

氧乙酰化肝素n＝10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72％，药物为Drug1，载药量为22.8％，抗凝性能，即效价为29U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.57μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例6

氧乙酰化肝素n＝10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72％，药物为Drug2，载药量为19.2％，抗凝性能，即效价为20U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.35μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例7

氧乙酰化肝素n＝10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72％，药物为Drug3，载药量为17.9％，抗凝性能，即效价为24U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.078μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例8

氧乙酰化肝素n＝10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72％，药物为Drug4，载药量为17.2％，抗凝性能，即效价为15U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.081μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例9

氧乙酰化肝素n＝15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81％，药物为Drug1，载药量为19.2％，抗凝性能，即效价为27U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.62μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例10

氧乙酰化肝素n＝15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81％，药物为Drug2，载药量为20.3％，抗凝性能，即效价为25U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.25μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例11

氧乙酰化肝素n＝15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81％，药物为Drug3，载药量为18.8％，抗凝性能，即效价为29U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.046μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

实施例12

氧乙酰化肝素n＝15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81％，药物为Drug4，载药量为21.6％，抗凝性能，即效价为17U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝素的抗凝性能为127U/mg；对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.052μg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2μg/mL。

Claims (5)

1、一种具有低抗血凝性肝素—紫杉醇抗癌药物，其特征在于，采用肝素衍生物负载紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物为氧乙酰化肝素，结构如式I所示，

式I

其中：

X为H或SO₃ ^-基团，

Y为H、SO₃ ^-或COCH₃基团，

n为1-17，

其中氧乙酰化羧基占全部羧基40-85％。

2、根据权利要求书1所述的一种具有低抗血凝性肝素—紫杉醇抗癌药物，其特征在于，紫杉醇衍生物为氨基酸改性紫杉醇，其结构如式II所示：

式II

其中：

R为CH(CH₃)₂、CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅基团。

3、根据权利要求书2所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在于，所述的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。

4、根据权利要求书1-3任一项所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在于，紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量为药物总重量的15-30％。

5、根据权利要求书1-3任一项所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在于，肝素衍生物通过化学键合方式与紫杉醇形成酯键或与紫杉醇衍生物形成酰胺键。