CN101407790B - 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 - Google Patents
一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101407790B CN101407790B CN2008101218465A CN200810121846A CN101407790B CN 101407790 B CN101407790 B CN 101407790B CN 2008101218465 A CN2008101218465 A CN 2008101218465A CN 200810121846 A CN200810121846 A CN 200810121846A CN 101407790 B CN101407790 B CN 101407790B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cell
- cell
- anoxic
- cultivated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims description 13
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 title claims description 7
- 238000003672 processing method Methods 0.000 title abstract 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 14
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 abstract description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 abstract description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 abstract description 6
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 6
- 101000654725 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Proteins 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036698 Golgi reassembly-stacking protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 241000594182 Sarcophaga sigma Species 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000924552 Homo sapiens Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102100021688 Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000005747 Transcription Factor RelA Human genes 0.000 description 1
- 108010031154 Transcription Factor RelA Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- -1 bcl-xL Proteins 0.000 description 1
- 238000003236 bicinchoninic acid assay Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012806 monitoring device Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。所述方法为：将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养20～30小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。本发明的有益效果主要体现在：通过缺氧培养，可有效提高人骨髓间充质干细胞的旁分泌能力，能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，促红细胞生成素及其受体，进而提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
(二)背景技术
细胞移植治疗修复组织损伤是目前新兴的医疗领域热点。细胞疗法是对传统医学的一种补充手段，为某些难治性疾病的治疗提供新的希望。干细胞是一种能自我复制无限增殖，在特定的诱导条件下向同胚层或其他胚层细胞分化的祖细胞。根据不同组织来源，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，后者分布于大部分组织中。由于成体干细胞移植无伦理学问题和致瘤性，更适合于基因和细胞工程的“种子细胞”。间充质干细胞来源于中胚层细胞。可从很多组织分离获得，如肝脏、胎儿和脐带血、羊水和脂肪组织，但研究最多和最易得到的是骨髓(在全部骨髓单个核细胞占<0.01％)。
人骨髓间充质干细胞的鉴定主要包括：①在正常体外培养条件贴壁生长，呈长梭形或三角形；②流式细胞学检测95％以上的骨髓间充质干细胞表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45，CD34，CD14(或CD11b)，CD19(或CD79-α)，人白细胞抗原HLA-DR表面分子(小于2％阳性表达率)；③具有多分化潜能。大量动物实验显示骨髓间充质干细胞在修复组织损伤中有其独特的优势和良好的安全性，且人骨髓间充质干细胞移植能显著改善急性心肌梗死后心功能和延缓心室重构。进一步研究发现，移植的人骨髓间充质干细胞直接分化为心肌样细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，参与新生血管形成，更重要的是移植细胞通过旁分泌大量的细胞因子和生长因子，抗细胞凋亡和促血管新生，增加移植细胞的存活率。有研究认为，骨髓干细胞移植后能在局部存活增殖的仅占移植细胞的1/3，因为提高移植细胞在局部组织的存活率和旁分泌能力势必能提高细胞移植的疗效。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，以提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
本发明采用的技术方案是：
一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，所述方法为：将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞缺氧培养20～30小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植。所述缺氧培养是指在没有氧气存在下进行培养，可在氮气、二氧化碳或者氮气与二氧化碳混合气的氛围下进行培养，除了气体氛围与常规培养不同外，其他培养条件均可参照常规人骨髓间充质干细胞的体外培养条件进行。
缺氧预处理能激发细胞内源性保护机制，启动某些基因的表达和应激蛋白的合成，增强细胞抗缺氧能力。研究发现，缺氧预处理(亚致死量)能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，包括缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，血管合成素-1，血管内皮细胞因子受体Flk-1，促红细胞生成素及其受体。缺氧预处理能诱导骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、NF-κB亚单位P65和P50，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。缺氧预处理的骨髓间充质干细胞移植到急性心肌梗死局部能减少移植细胞和心肌细胞的凋亡，促进更多的血管新生，缩小心肌梗死面积和改善心功能。
具体的，所述方法为：在细胞移植前，将将继代第3代的人骨髓间充质干细胞于37℃下在低糖DMEM培养基中缺氧培养20～30小时后，恢复37℃常氧培养2小时以上(通常培养24小时细胞较为稳定)，获得处理后的人骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
具体的，所述缺氧培养为：在CO2体积浓度5％、N2体积浓度95％的混合气体中培养。所述常氧培养为：在CO2体积浓度5％、O2体积浓度95％的混合气体中培养。
具体的，所述方法如下：在细胞移植前，将人骨髓间充质干细胞于37℃下、在CO2体积浓度5％、N2体积浓度95％的混合气体中，于低糖DMEM培养基中缺氧培养24小时后，恢复37℃常氧培养24小时，获得处理后的人骨髓间充质干细胞再进行细胞移植。为提高人骨髓间充质干细胞旁分泌能力，该步骤操作可重复进行。
本发明的有益效果主要体现在：通过缺氧培养，可有效提高人骨髓间充质干细胞的旁分泌能力，能提高骨髓间充质干细胞合成大量的细胞生长因子和促血管生长因子，促红细胞生成素及其受体，进而提高人骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
(四)附图说明
图1为细胞在不同氧浓度下培养示意图；1为压缩空气瓶，2为CO2瓶，3为N2瓶，4为氧气探测监控装置，5为细胞培养箱，6为气体阀门；
图2为相差显微镜下人骨髓间充质干细胞形态学表现；
图3为缺氧培养刺激人骨髓间充质干细胞成倍分泌细胞生长因子和促血管生长因子；
图4为缺氧培养诱导人骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、NF-κВ亚单位P65和P50，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.无菌条件下从合适的成年患者(排除造血系统疾患)的髂后上棘抽取骨髓液30～50ml，放置于预先添加4000IU肝素的无菌玻璃瓶中，充分混匀避免骨髓液凝固，移至层流室生物安全柜进行下一步操作。
2.将等量低糖DMEM培养基(添加100U/ml青霉素和100U/ml链霉素，购自美国GIBCO公司)加入放置骨髓液的无菌玻璃瓶中稀释骨髓液，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞。
3.按照密度梯度分离法分离骨髓单个核细胞。在50ml无菌离心管中加入20ml淋巴细胞分离液(密度是1.077±0.001g/ml，购自上海恒信化学试剂有限公司)，将20ml骨髓液轻轻叠加在淋巴细胞分离液表面。在高速低温离心机中(Heraeus D-37520，购自德国Thermo Electron公司)以4℃条件下900g离心25分钟。离心完毕后，细胞分层，从下至下，可见培养基、白膜层、淋巴分离液和红细胞层。用1ml无菌移液器收集中间白膜层细胞于另一50ml离心管中，然后加入20ml低糖DMEM培养基，漂洗细胞表面残留淋巴分离液。于4℃条件下900g离心10分钟，弃上清，收集骨髓单个核细胞。以含10％胎牛血清(购自美国GIBCO公司)的低糖DMEM培养基重悬沉淀细胞，按2×105/cm2细胞密度接种至75cm2生长面积的细胞培养瓶(购自美国Coming公司)，放置于37℃，含5％CO2和饱和湿度的细胞培养箱(Forma3111，购自美国Thermo Fisher公司)中(参见图1)，静置48小时后首次换液，以去除不贴壁细胞。此后每4～5天换液一次，长满80％～90％以上传代。
4.以含10％胎牛血清低糖DMEM培养基进行原代和继代细胞培养，放置于37℃、一定湿度的含5％CO2的混合气体中常氧培养，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，每4～5天更换细胞培养基，去除非贴壁细胞，不断纯化人骨髓间充质干细胞。继代第3代时细胞可进行形态学、流式细胞学等细胞鉴定。
5.将正常氧浓度下培养的继代第3代人骨髓间充质干细胞移至缺氧培养箱中进行缺氧预处理。缺氧培养前细胞生长达约80％融合，细胞更换低糖DMEM培养基。于37℃、饱和湿度的含5％(v/v)CO2和95％(v/v)N2混合气体中缺氧培养，缺氧处理在一个能精确调控氧浓度的ProOx-C-chamber系统(购自美国Biospherix，Redfield公司)中进行，设定氧浓度为0.5％，缺氧时间为24小时。缺氧处理结束后恢复常氧培养(含5％CO2、95％空气，v/v)2小时后，进行免疫印迹法检测。
6.为提高人骨髓间充质干细胞抗凋亡和旁分泌能力，可反复进行上述第三步操作。
7.免疫印迹法检测细胞内生长因子缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，血管合成素-1(Ang1)，血管内皮细胞因子(VEGF)及其受体Flk-1，促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)等蛋白及抗凋亡基因cleavedcaspase-3、bcl-2、bcl-xL、P60、P65蛋白的表达改变。
收集的细胞用RIPA buffer(50mM HEPES，pH7.3，1％sodiumdeoxycholate，1％Triton X-100，0.1％SDS，150mM NaCL，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF)裂解后，14,000g离心30min，收集上清液冻存于-80℃备用。BCA法(Bicinchoninic Acid Assay，购自美国Sigma公司)测定蛋白浓度。40μg蛋白样品在6-15％SDS-PAGE梯度胶用Hoefer Mini-Gel system(Amersham Biosciences，购自美国Piscataway公司)电泳分离，用Hoefer Transfer Tank(AmershamBiosciences，美国Piscataway公司)将蛋白转移至PVDF膜(购自美国BioRad公司)上，膜置于缓冲液【Tris缓冲盐溶液，含0.1％Tween-20(TBS-T)，7％牛奶，pH7.6】室温下封闭2h，加入相应一抗(1:1000，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)于4℃条件下孵育过夜，小鼠抗β-actin(1:1000，购自国Santa Cruz Biotechnology公司)作为蛋白上样对照；膜用0.5％TBS-T洗涤后室温下与结合碱性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体(购自美国Promega公司)孵育2小时，最后TBS-T及TBS洗涤后用BCIP/NBT溶液显色(购自美国Sigma公司)，扫描后用 
CS8.0软件分析信号，实验结果见图2～图4。
结论：缺氧培养不会改变细胞生长形态，缺氧培养能刺激人骨髓间充质干细胞成倍分泌缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，血管合成素-1，血管内皮细胞因子受体Flk-1，促红细胞生成素及其受体，能诱导人骨髓间充质干细胞表达促生存蛋白P105、NF-κВ亚单位P65和P50，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，由此可知，缺氧培养可提高细胞移植的疗效。
Claims (3)
1.一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法，所述方法包括：
将经传代培养稳定的人骨髓间充质干细胞在低糖DMEM培养基中缺氧培养20～30小时后，再恢复常氧培养以用于细胞移植；所述缺氧培养为：在CO2体积浓度5％、N2体积浓度95％的混合气体中培养，所述常氧培养为：在CO2体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为：将继代第3代的人骨髓间充质干细胞于37℃下在低糖DMEM培养基中缺氧培养20～30小时后，恢复37℃常氧培养2小时以上，获得处理后的人骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：在细胞移植前，将人骨髓间充质干细胞于37℃下、于低糖DMEM培养基中缺氧培养
24小时后，恢复37℃常氧培养24小时，获得处理后的人骨髓间充质干细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101218465A CN101407790B (zh) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101218465A CN101407790B (zh) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101407790A CN101407790A (zh) | 2009-04-15 |
| CN101407790B true CN101407790B (zh) | 2010-09-29 |
Family
ID=40571003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008101218465A Active CN101407790B (zh) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101407790B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107630038A (zh) * | 2017-09-15 | 2018-01-26 | 浙江大学 | 提高老年大鼠骨髓间充质干细胞移植后生存能力的方法 |
| EP3428272A4 (en) * | 2016-03-10 | 2019-11-27 | KintaroCellsPower Co., Ltd. | PROCESS FOR PRODUCING A LIQUID CULTURE PRODUCT |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2944262C (en) * | 2014-04-07 | 2023-08-01 | Mesoblast International Sarl | Improved stem cell composition |
| US20160095885A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | WibiWorks Therapeutics, Inc. | Induction Medium & Methods for Stem Cell Culture & Therapy |
-
2008
- 2008-10-30 CN CN2008101218465A patent/CN101407790B/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3428272A4 (en) * | 2016-03-10 | 2019-11-27 | KintaroCellsPower Co., Ltd. | PROCESS FOR PRODUCING A LIQUID CULTURE PRODUCT |
| CN107630038A (zh) * | 2017-09-15 | 2018-01-26 | 浙江大学 | 提高老年大鼠骨髓间充质干细胞移植后生存能力的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101407790A (zh) | 2009-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101748096B (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| CN102127522B (zh) | 人脐带间充质干细胞及其制备方法 | |
| CN102002475B (zh) | 人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法 | |
| US20210301258A1 (en) | Method for Producing Dental Pulp-Derived Cells | |
| EP3196298B1 (en) | Method for inducing three-dimensional osteogenic differentiation of stem cells using hydrogel | |
| CN101802171A (zh) | 制备、分离及超低温保存子宫内膜/月经细胞 | |
| Danišovič et al. | Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering | |
| CN104726406A (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| CN102965335A (zh) | 用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用 | |
| CN101586095B (zh) | 一种骨髓间充质干细胞体外培养基及其应用 | |
| CN106318906A (zh) | 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN105779384A (zh) | 组织工程用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞种子细胞筛选培养冻存技术方法 | |
| CN104651305A (zh) | 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法 | |
| CN109706115B (zh) | 一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法 | |
| CN101407790B (zh) | 一种增强人骨髓间充质干细胞旁分泌能力的处理方法 | |
| CN103087982A (zh) | 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法 | |
| CN105850979A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法 | |
| CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| CN101543644B (zh) | 无支架工程软骨组织的构建方法及其产品 | |
| CN101550409B (zh) | 一种增强骨髓间充质干细胞抗细胞凋亡能力的处理方法 | |
| CN102703380B (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| CN116077448B (zh) | 人间充质干细胞注射液及其应用 | |
| CN106591230A (zh) | 人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 | |
| RU2517112C2 (ru) | Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга | |
| CN106566802A (zh) | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |