CN105779384A - 组织工程用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞种子细胞筛选培养冻存技术方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞种子细胞筛选培养冻存技术方法，本发明属于生物干细胞医学医药领域，羊膜来源间充质干细胞来源于中胚层的多能干细胞。本发明阐述并特别公开干细胞的获取创新分离提取冻存技术，胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质获取与制备技术，是hAMSCs附着提取制备是创新技术的关键要点，多组合培养液梯度无血清驯化培养体系设计也是专属获取hAMSCs所需的核心技术，关键技术组合提取培养是高效仿生生物科技发明技术。获取干细胞符合(ISCT)标准具有高纯度、干细胞增殖扩增、细胞活性强，同时满足了未来开发PDB‑MSCs干细胞临床药物设计开发；医疗救治开展干细胞回输要求；以及建立组织工程皮肤所需的种子干细胞多用途需求。

Description

组织工程用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞种子细 胞筛选培养冻存技术方法

技术领域

本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，人羊膜间充质干细胞的培养、扩增、保存技术。

人羊膜来源间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)来源于中胚层的多能干细胞，公认的具有高度自我更新能力和多向分化潜能。本发明阐述并特别公开hAMSCs这种干细胞的获取创新分离提取冻存技术，胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质获取与制备技术，是hAMSCs附着提取制备是创新技术的关键要点，多组合培养液梯度无血清驯化培养体系设计也是专属获取hAMSCs所需的核心技术，关键技术组合提取培养是高效仿生生物科技发明技术。

背景技术

近年来，国际国内对干细胞再生医学研究领域越来越重视，细胞治疗再生医学得到了前所未有推进，科研领域沐浴在时代的朝阳下得以蓬勃发展。尤其是间充质干细胞已经成为一种新的治疗手段广泛应用修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、临床骨修复、软骨修复、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修复、基因治疗、血管支持、角膜损伤、烧伤烫伤创面修复等多种疾病。经过体外培养扩增后的干细胞在组织工程再生和多种组织修复中展示出令科研工作者印象深刻的治疗广泛性潜能，这种潜能是科研领域毋庸置疑的发展方向。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)具有自我更新和多向分化的能力。来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。是一种非血源性的多功能干细胞，广泛存在于人体不同组织中，如骨髓、脂肪、牙周膜及脐带，胎盘组织等。近几年来有学者发现其主要来源骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stemcells,BMSc)可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥,骨髓间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及。BMSc可体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞、并在一定的条件下诱导可分化为神经细胞，而且可进行自体移植，避免免疫排斥，被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。也有研究者认为在胎盘组织中也含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其提取作为干细胞移植治疗的备选细胞。胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。

骨髓间充质干细胞，在美国FDA已批准在心肌干细胞移植方面进入一期临床试验,这充分展示了MSCs的巨大应用前景。不过骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较少，而且随着年龄的增加，在骨髓中的含量逐渐减少，其增殖分化能力也逐渐减弱；同时骨髓间充质干细胞的取材是有创侵入性操作，增加了捐献者的痛苦和感染的机会，所以骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制,并且病患严重感染、骨髓恶性肿瘤或随着年龄的增长,骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下,患者就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSCs,为此很有必要寻找新的MSCs来源。

胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由间质、血管、滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，也含大量的干细胞。脐血和脐带华通氏胶中都可能含有MSCs，而与脐带组织紧密相连,在胎儿出生后多作为废物与脐带一起被丢弃的胎盘也含有与骨髓间充质干细胞相似特性的细胞，胎盘组织中却含有这些前体细胞，极大程度上解决了干细胞的来源问题。

足月胎盘是分娩的废弃物，取材容易，对供者不造成损伤，无伦理问题，而且胎盘体积大，获得干细胞相对较多，所以胎盘间充质干细胞更方便适用于临床。有学者在胎儿蜕膜侧胎盘组织成功分离培养出胎盘间充质干细胞，并观察其生物学特性和抗凋亡细胞因子血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子的分泌水平，结果证实胎盘间充质干细胞的生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，并能分泌血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子和肝细胞生长因子。已有研究证实胎盘间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞类似的功能和特性，两者的多向分化潜能也类似，且胎盘来源的间充质干细胞的增殖能力更强。国内外很多研究者发现，胎盘来源间充质干细胞在体外实验中可被诱导分化为中胚层的心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、内胚层的胰岛细胞、肝细胞以及外胚层的神经元、星形胶质细胞、软骨细胞，而且这些结果同样在心肌梗死和帕金森大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓损伤灵长类动物模型等体内模型中治疗显效得到了证实。也有报道胎盘来源间充质干细胞将来进一步应用于修复人膝关节退行性改变或膝关节半月板损伤科研实验。

本发明尝直接从胎盘组织中分离间充质干细胞,包括人胎盘来源的，脐带血来源的，羊水来源的间充质干细胞的发明专利，并对所得细胞的生物学特性进行鉴定，为研究间充质干细胞分化能力，将其作为种子细胞开展临床应用研究提供独特的思路以获取体系依据。为间充质干细胞临床治疗以及基础研究奠定科研基础。

间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞，经过多年多位学者的研究后，虽然组织工程已经获得了很大进展，然而，但由于目前缺乏理想筛选方法，间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等问题，使其在临床级别回输的应用受到限制。因此，寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。

再生组织工程细胞建立工作始于本世纪(Harrison 1907,Carrel 1912),指导引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，被称为重要的基础科学之一，组织构建和细胞体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体内生理环境等系列特定体外微环境体系，进行孵化培养、使得组织细胞健康生长。间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，使得体外筛选培养人来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能，避免潜在有害基因对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等的影响，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、再生损伤修复等均有历史时期的重要不可取代的指导意义。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的极其重要场所。早期研究学者认为，外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象，并在两年之后得以证明，学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。

Hay在11年后报道了ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行为的现象得以关注并进行广泛的研究，但是并没有成型的理论基础来佐证ECM与细胞的密切关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间“动态互惠”的模型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，从而引起某些特定基因的表达。

研究并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用，直接参与了细胞的黏附、生长、游走、分化和程序性死亡(凋亡)的过程。外介质参与调节细胞因子、生长因子的活性、还能够直接激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用，因此，我们必须充分了解细胞外基质的化学、物理、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的“生物构架”。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。

最常规的一种培养hAMSCs干细胞的培养基就是添加有动物血清的培养基。然而，采用这种培养基培养的hAMSCs干细胞，不仅会因添加量问题出现生长过快或比较缓慢现象，而且超过几代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低，动物血清培养技术的综合增殖能力、免疫调节能力、分泌细胞因子的能力这三方面均会受到不可控方向变化。国内外不同地域厂商来源的动物源血清批次存在潜在的不重复性，也是影响了细胞扩增规模化生产的技术瓶颈；另一方面，相对于人是异源性，异种蛋白混入潜在细胞治疗具有不确定性，从而限制了其在临床上的应用。因此，探索快速扩增hAMSCs干细胞而又不影响其潜能的培养条件及其培养基组成的优化组合，是非常重要的研究内容。

人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。多组合培养体系模拟体内hAMSCs细胞环境的无血清培养方案与传统的含动物血清培养基相比，本发明提供取得hAMSCs干细胞不仅纯度高、贴壁性能强、获取细胞能够保持干细胞幼稚形态、具有更好的细胞增殖速率和细胞干性，而且培养获得的细胞表现出优异的细胞性能同时降低了培养成本。因此本发明方法获得保持稳定细胞特性的hAMCs，这对于进一步临床实验研究具有重要的意义。本发明特别公开了对hAMCs分离培养保存方法、生物学特性、干细胞特性以及其体外诱导分化能力的研究进行详细的技术路线，获取的hAMSCs符合(ISCT)标准具有满足了未来开发PDB-MSCs干细胞临床药物的设计开发；医疗救治开展干细胞回输要求；以及建立组织工程皮肤所需的种子干细胞多用途需求。

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发明内容

一、胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质种类：

其特征在于:针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体内人胎盘羊膜层作为细胞外基质为筛选贴附，间充质干细胞筛选分离和体外培养的方法，并使获得的高纯度间充质干细胞。

发明属生物干细胞细胞技术领域，方法特征包括：同体人胎盘羊膜层脱细胞底物预备；间充质干细胞的分离；利用高拟体内附着基质间充质干细胞的筛选及培养。

目前用该法在体外已稳定培养传代超过16(代)，经检测发现扩增16代前的间充质干细胞仍具有正常的染色体组型，无异常改变。经体内外实验证实该细胞无细胞毒，具有较强的增殖能力，并可以形成分化。间充质干细胞在科研、教学及临床的应用起到不可估量的作用，同时孕育着巨大学术方向与社会效益和经济效益，通过此种方法的理论基础推进我国间充质干细胞的学术基础建立。

二、胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质构成：

经分析含有多种胶原保留了天然三维孔隙结构。

三、胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质底物孔隙率与黏附表面特征：

高拟底物电镜观察，测定该种黏附的底物组织再生的基底膜孔隙直径为30～211μm。这种孔隙率所构建的三维空间黏附表面均有利于间充质干细胞黏附、附着生长、增殖、分化。

通过以上制备方法，有效的保留了细胞外基质的微观构架和完整的基底膜结构，其主要成分包括各型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基质成分，可为间充质干细胞快速粘附、增殖扩展提供有力的支持。因此，羊膜层高拟底物是目前最理想的细胞筛选的解决方案。

四、胎盘羊膜层细胞高拟体内细胞外基质制备具体实施步骤与方法：

一、包括以下两个步骤种方法:

步骤一：胎盘组织消毒处理过程：

胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质处理过程：取供体手术台无菌条件获取健康足月产婴儿胎盘组织，4℃保存，在生理盐水稀释含0.05～0.1％苯扎溴铵溶液中10～15min，充分清洗残留的血液，漂洗消毒处理至无色，在超净工作台内取出胎盘组织，剥除羊膜剪切成组织块浸泡，用无菌生理盐水反复冲洗残余苯扎溴铵。

步骤二：低温－30～－100℃冷冻干燥，真空度达到10～130pa，脱去羊膜组织块90～95％以上水分，取出密封与真空包装，经辐照15～80KGY剂量灭菌。终品可以长期保存。启动只需浸泡37℃，PBS液或下面所述营养液复苏15～30min即可应用，浸泡延长至10～12h效果更佳。使用后并且应用去细胞漂洗液(见下方法中相应提及适合的脱细胞液)脱细胞处理、再经过上述过程永生反复使用的特点。

1:步骤二具体实施方式:

上述所提及的脱细胞液制备如下所述：

二、方法：

实例方法1：羊膜组织块加入0.1～0.5％蛋白酶冰浴冷消48～12h，用含0.25％戊二醛磷酸缓冲溶液调节PH在7.20～7.40之间用交联液冲洗组织块3～6次，最后放入交联液中交联4～6h，结束后用超纯水(或注射用水)反复冲洗8～10次去除残留戊二醛，即可进行冷冻干燥脱水封装。

1.1:实例方法1具体实施方式:

方法一特点：交联剂可有效的使结缔组织蛋白不可溶性的交联构架，增强底物的抗降解性，保持底物完整，蛋白酶处理底物可使其柔任性增强。

获得的基底细胞层是细胞最为活跃的附着、分裂、分化场所，组织层空间架构在体外支架材料很难模拟模仿。故此类胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质是最适合间充质干细胞粘附、增殖、生长、分化所需的理想微环境场所。

实例方法2：酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法

0.1～0.25％DisPase中性蛋白酶与0.01～0.02％EDTA联合消化，中性蛋白酶作用于基底膜，选择性地分解纤维连接素与IV型胶原(4℃下作用48h)，然后应用非离子型表面活性剂使细胞溶解破坏TritonX－100(聚乙二醇辛基苯基醚)(0.1～0.8％溶液，室温下作用48～24h)与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物溶解于溶液中，同时TritonX－100中的亲油基端也能和细胞外膜蛋白结合破坏生物膜，从而达到脱弃细胞作用。

脱细胞后经方法1进行戊二醛交联步骤，即可进行冷冻干燥脱水封装。

2.1:实例方法2具体实施方式:

实例方法3：络合剂加盐-阴离子表面活性剂法

利用高渗氯化钠溶液((0.01～0.02％EDTA含0.1～1mol/L氯化钠溶液，37℃下作用24～12h))使锚状细丝与组织基底细胞的半桥粒分离开来，从而完整去除细胞，再用破膜剂十二烷基磺酸钠(0.1～0.8％SDS溶液，室温下作用60～30min)将细胞成分从羊膜中去除。

脱细胞后经方法1进行戊二醛交联步骤，即可进行冷冻干燥脱水封装。

3.1:实例方法3具体实施方式:

实例方法4：用0.1～0.6％胰蛋白酶和0.01～0.1％EDTA体积比(1：2)混合液联合消化组织块，37℃，快速消化60～10min,反复漂洗脱细胞，最后放入交联液中交联4～6h，结束后用超纯水(或注射用水)反复冲洗8～10次去除残留戊二醛，即可进行冷冻干燥脱水封装。

4.1:实例方法4具体实施方式:

以上方法均可组合制备出胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质高拟体内细胞外基质所进行筛选间充质干细胞。

上述方法制得略有差异，时间上成本上有异、但均可有效使得细胞成分被清除，基质的结构完整性被保留，含有弹力素、硫酸角质素、层粘素、各型胶原、纤维连接素、结合素、基底膜结构成分均可以完整保留。

对于附着性的种子间充质干细胞提供了有利微环境，使其表达、生长、增殖、分化等起到极其重要作用，常规筛选方法不可替代高模拟附着状态三维空间架构，我们称之为“细胞种植黑土壤环境”。

羊膜高拟体内细胞外基质筛选人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养法

五、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞取材筛选：

从手术台无菌条件下取健康足月产婴儿胎盘组织置于培养液A中，4℃保存。在超净工作台内取出胎盘，剥除羊膜，用PBS缓冲液充分清洗残留的血液，反复冲洗漂洗至无色，冲洗干净无血迹后用剪刀剪取胎盘羊膜组织剪成1mmx1mmx1mm的碎片。

人胎盘羊膜来源的间充质干细胞取材筛选步骤中的胎盘羊膜层组织块。

六、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞筛选培养步骤

因为人胎盘羊膜来源的间充质干细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞外基质的粘附速度要比其它类型细胞快得多，贴壁生长习性所以利用该种特性进行培养筛选。

七、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞筛选培养权利要求方法：

配制培养液A：胎盘多肽注射液0.06ml/L、EGF5～25ng/ml、干细胞生长因子(SCF)2～11ng/ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B4 0.5～1mg/L、维生素C1～4μg/ml、胰岛素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、链霉素100u/m L、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

A.1:配制培养液A具体实施方式

配制培养液B：胎盘多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、人血纤粘蛋白(FN)1～5μg/L、人层粘连蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍生因子(PDGF)1～10mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、维生素B1～5mg/L、叶酸1～10ng/ml、维生素E 0.05～1mg/L、维生素B4 0.5～1mg/L、黄体酮0.01～0.04μg/L、辅酶Q10 0.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、胰岛素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

B.1:配制培养液B具体实施方式

配制培养液C:胎盘多肽注射液0.02～0.8ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～6g/L、人血纤粘蛋白(FN)3～25μg/L、人层粘连蛋白(LN)10～60μg/L、重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～20mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)6～10μg/L、重组人肝细胞生长因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、重组人脑源性神经营养因子(BDNF)15～40ng/ml、维生素B1～4mg/L、叶酸1～15ng/ml、黄体酮0.01～0.06μg/L、维生素E 0.05～1.2mg/L、维生素C 0.1～10mg/L、维生素B4 0.1～0.5mg/L、辅酶Q10 0.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、还原性谷胱甘肽3～6μg/L、油酸0.5～7.5mg/L、转铁蛋白6～20mg/L、胰岛素5～7mg/L、多聚赖氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

C.1:配制培养液C具体实施方式

说明：临床细胞治疗回输阶段细胞扩增。相应进行递减性驯化培养相应降低或剔除以上所述配方中的有药理药效作用的添加物质。

2、消化液配制法：

消化液配制A:含溶质0.1％中性蛋白酶和0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1),无菌含双抗PBS为溶剂，配制溶液。

消化液配制B:含溶质0.8％IV型胶原酶和0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1),无胎盘多肽注射液培养液A为溶剂，配制溶液。

消化液配制C:含溶质0.1％中性蛋白酶和0.5％IV型胶原酶与0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1:1),无胎盘多肽注射液培养液A为溶剂，配制溶液。

3、筛选人胎盘羊膜来源的间充质干细胞冻融保存液制备：

抗冻溶质组分包括：维生素B4 1～10μg/ml，维生素C 1～4μg/ml，聚乙二醇4ml、(优选自体血清)人AB血清10～15％、甘油20％、甘露醇3ml、细胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亚砜(DMSO)10％、硫酸软骨素3～6％、保存液以配制培养液ABC为溶剂制备抗冻溶液。PH控制在7.3～7.4，0.22μm微孔滤过除菌。

3.1:3筛选细胞冻融保存液制备具体实施方式:

说明,其特征在于：该冷冻液可以通过冷冻长期保存人胎盘羊膜来源的间充质干细胞活性

5、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞筛选步骤方法：

步骤1、取人胎盘羊膜来源的间充质干细胞取材筛选步骤中的胎盘羊膜层组织块，用无菌(青霉素80～100u/ml和80～100μg/ml链霉素)PBS充分浸泡3～5min，以PBS冲洗3次，以消化液A常温消化10～15min,组织块悬液离心(900r/min离心5～10min)，弃去消化液A，收集组织块与细胞沉淀，在以消化液B或C(37℃,振荡120r/min条件下消化30min～60min),用数倍含10％自体血清或人AB血清培养液A洗涤终止消化,充分均匀吹打后过直径100μm的钢制筛网过滤，然后将过滤得到的细胞悬液离心(900r/min离心5～10min)，弃上清液，收集细胞沉淀，用等量PBS稀释后移入预先置有GE Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中，1200～2500r/min离心10～30min，吸取界面云雾状白膜层控温在18～20℃，PBS洗涤2～3次，收集离心获得的干细胞，再用适量培养液A重悬细胞,计数板计数后调整细胞浓度，以3x10⁴/ml。

步骤2、取胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质,用含抗生素的PBS冲洗3次，再用配制培养液A冲洗3次，于37℃，浸泡在培养液A中复苏10～12h备用。

步骤3、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的筛选及培养：取预备好的胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质放入100mm平皿加入配制培养液B，加入细胞浓度3×10⁴/ml脂肪干细胞悬液，37℃，气相5％CO₂培养箱培养6～72h取出，取出转移胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质，PBS或培养液B清洗3～6次，目标人胎盘羊膜来源的间充质干细胞贴壁粘附于胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质上。换皿加入配制培养液C培养，隔6～72h后更换全部培养基C，此后每2～3d换液一次继续扩增培养。

步骤4、消化富集传代培养：上述人胎盘羊膜来源的间充质干细胞经扩增后，间充质干细胞生长至80％～90％融合时，加入消化液配制B或C消化胎盘羊膜层高拟体内细胞外基质，37℃消化15～30min，用数倍含10％自体血清或人AB血清培养液B终止消化，稍加吹打，过滤收集细胞悬液转移到离心管，600～1200r/min离心4～6min，弃上清液，加入配制的培养液C，重悬细胞，以1～3×l0⁶/ml的密度转移传代按照上述步骤培养，置37℃、气相5％CO₂培养箱培养，每3～4d换配制培养液C一次继续扩增培养。

6、人胎盘羊膜来源的间充质干细胞生物学特性及免疫组织化学法检：

细胞形态：倒置显微镜观察的细胞形态，培养3d内贴壁细胞开始分裂增殖，细胞融合单层达80％铺满这时进行消化传代。观察3代hAMSCs细胞呈长梭形的成纤维细胞样生长，传代细胞生长迅速，纯度高，融合后hAMSCs可见细胞排列紧密呈平形排列或漩涡状集落生长，与经典的骨髓来源来源MSCs相似。

免疫组织化学表型：选取3代细胞应用流式细胞术检测研究发现hAMSCs均阳性表达CD29、CD44、CD49d、CD71、CD73、CD90、CD105并且阳性率均高达96.6～98.6％以上，这与学者De Ugarte等的研究结果相同。CD29是识别整合素亚单位的蛋白，广泛存在于除了红细胞外的各种组织及细胞中；CD44是目前所发现的成体干细胞最广泛表达的分布在胞膜和胞浆标志物，该阳性表达进一步证明干细胞的身份；CD90和CD105为间充质干细胞的特异性表型。且均能够高表达阳性印证所获取的hAMSCs干细胞具有较强的贴壁能力，细胞活性好。阴性表达CD34、CD45、CD19、CD11b和HLA-DR。而且波形蛋白阳性而上皮细胞标志CK19阴性。CD34和CD45是造血细胞系分子标志物,说明获得的干细胞具有成脂及成骨分化潜能。

细胞活性均>98％；

hAMSCs在体外特定条件下分别可向成脂、成骨、神经和胰岛样细胞诱导，人胎盘羊膜来源的间充质干细胞分化潜能，hAMSCs成脂诱导连续培养4d，镜下可见细胞立体感增强内有微小脂滴出现，脂滴3周后逐渐增大融合，形态为椭圆形或多边形，油红O染色法显示染红的脂质沉淀。hAMSCs成骨诱导后培养8d,胞质内细胞颗粒量增加，形态呈多角形,2周后细胞基质矿化物逐渐出现，形成多层小结结构，培养4周以上，可观察明显钙化结节，通过ALP染色呈阳性且细胞着色程度不同，细胞密集处着色更深。在选择茜素红染色后呈深红色结节沉积。

hAMSCs向神经细胞诱导神经诱导培养液之后6h细胞形态开始发生变化，24～48h细胞中间明显膨胀，细胞突起变细长，镜下可见突起末端出现部分分支，相邻细胞突起连成网，两端生长出类似的轴突或树突，神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色，胞质被染成棕黄色，呈阳性。

说明：胎盘羊膜存在能稳定增殖的干细胞，不表达造血细胞与移植排斥相关的细胞表面标记，提示从羊膜来源的基质细胞是MSCs，具有干细胞的特性属于免疫缺陷细胞，适宜于不同个体之间的临床回输移植治疗。经鉴定以及本发明的培养体系结果表明本分离培养所获得的细胞为人胎盘羊膜来源的间充质干细胞，其具有极强增的殖能力和多向分化潜能，是细胞临床回输移植治疗以及组织工程具有前景的种子干细胞，细胞纯度较高。在提升目标hAMSCs纯度，可重复进行具体实施方法3步骤来获得更高纯度的hAMSCs。

八、本发明的具有以下优点：

本发明公开了人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的培养、筛选、扩增技术，这些瓶颈一直是生物学干细胞领域研究的热点和难点，目前利用基底膜显著黏附特性进行分离纯化，采用三维空间培养扩增手段来获得。

该发明适合依赖扩增贴壁型细胞并提供三维高拟体内细胞外基质系统进行目标细胞水平的筛选与分离。

本发明属于高模拟体内贴附环境，体外培养hAMSCs干细胞的生物细胞新型培养技术。其特征在于：细胞基质底物为供体脱细胎盘羊膜为基质底物筛选最佳黏附场所筛选hAMSCs干细胞的制备方法，相应胎盘羊膜高模拟底物所在环境黏附筛选培养目标胎盘羊膜干细胞。用该方法取得的胎盘羊膜干细胞，具有高传代能力，高增殖能力，并可在体外环境诱导分化潜能，此方法比传统意义上的hAMSCs干细胞筛选更具科研与教学临床应用意义为深入研究干细胞生长增殖分化提供了不可估量的科研学术价值，开创了体外高拟体内贴壁附着培养的新纪元，此方法提出为国内国际首创。

通过这种高目标模式的筛选，结合hAMSCs低免疫原性，延长移植时间，增加组织工程与临床应用，提供了绝对优势的细胞治疗解决方案。

1、组织工程皮肤：胎盘羊膜高拟体内细胞外基质,基质附着体外筛选方法对种子hAMSCs进行筛选与于体内的微环境一致性是目前任何方法不可取代的，并且制备简单可反复使用，是构建含hAMSCs干细胞组织工程皮肤基础；

2、特异性强，通过免疫组化检测、透射电镜观察及流式细胞仪检测，结果表明本发明的hAMSCs纯度高；

3、hAMSCs创伤修复中的应用、在基因研究方面、美容整形修复，口腔疾病、皮肤病领域；

4、hAMSCs干细胞科研价值：hAMSCs干细胞细胞谱系的研究，深入探讨研究hAMSCs黏附、生长、增殖、分化、免疫表达等学科基础研究；

5、该方法可为其它器官体外培养再生提供良好的科研理论基础；

6、再生医学组织工程领域应用种子hAMSCs干细胞库。

附图说明

图1是本发明羊膜层高拟体内细胞外基质的制备流程。

图2是本发明的hAMSCs应用羊膜层高拟体内细胞外基质筛选培养方法流程。

Claims (8)

1.一种临床治疗级细胞治疗用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞制备方法，由以下步骤组成；

(1)人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合；(2)筛选用羊膜层高拟体内细胞外基质制备；(3)应用羊膜层高拟体内细胞外基质与人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合筛选培养人胎盘羊膜来源的间充质干细胞,以及人胎盘羊膜来源的间充质干细胞长期冻融保存液制备。

2.一种利用权利要求1所述的人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合包括：

配制培养液A：胎盘多肽注射液0.06ml/L、EGF5～25ng/ml、干细胞生长因子(SCF)2～11ng/ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B4 0.5～1mg/L、维生素C1～4μg/ml、胰岛素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、链霉素100u/m L、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml，PH控制在7.2～7.4；

配制培养液B：胎盘多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、人血纤粘蛋白(FN)1～5μg/L、人层粘连蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍生因子(PDGF)1～10mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、维生素B1～5mg/L、叶酸1～10ng/ml、维生素E 0.05～1mg/L、维生素B4 0.5～1mg/L、黄体酮0.01～0.04μg/L、辅酶Q10 0.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、胰岛素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培养液C:胎盘多肽注射液0.02～0.8ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～6g/L、人血纤粘蛋白(FN)3～25μg/L、人层粘连蛋白(LN)10～60μg/L、重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～20mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)6～10μg/L、重组人肝细胞生长因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、重组人脑源性神经营养因子(BDNF)15～40ng/ml、维生素B1～4mg/L、叶酸1～15ng/ml、黄体酮0.01～0.06μg/L、维生素E 0.05～1.2mg/L、维生素C 0.1～10mg/L、维生素B4 0.1～0.5mg/L、辅酶Q10 0.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、还原性谷胱甘肽3～6μg/L、油酸0.5～7.5mg/L、转铁蛋白6～20mg/L、胰岛素5～7mg/L、多聚赖氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

3.一种利用权利要求1所述筛用羊膜层高拟体内细胞外基质制备方法，包括

其中所述的羊膜层高拟体内细胞外基质；制备包括以下步骤：A)叶状绒毛膜组织消毒处理；B)羊膜层高拟体内细胞外基质脱细胞处理；C)将消毒或经脱细胞处理的羊膜层高拟体内细胞外基质进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理；其中所述步骤B)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。

4.如权利要求3所述的B)羊膜层高拟体内细胞外基质脱细胞处理步骤，其特征在于，所述的羊膜层高拟体内细胞外基质的制备方法中的冷酶交联剂法是：加入0.1～0.5％蛋白酶冰浴冷消48～12h，用含0.25％戊二醛磷酸缓冲溶液，pH在7.20～7.40之间，交联4～6h，超纯水或注射用水冲洗8～10次；

所述的制备方法中的酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法是：0.1～0.25％中性蛋白酶与0.01～0.02％EDTA，0.1～0.8％TritonX－100溶液，室温下作用48～24h；

所述的络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0.01～0.02％EDTA含0.1～1mol/L氯化钠溶液，37℃下作用24～12h，后用0.1～0.8％SDS溶液，室温下作用60～30min；

所述的胰酶联合EDTA交联液是：0.1～0.6％胰蛋白酶和0.01～0.1％EDTA，胰蛋白酶与EDTA溶液按照体积比为1：2配比，37℃快速消化60～10min，交联液中交联4～6h，交联后用超纯水或注射用水冲洗8～10次。

5.如权利要求3所述的C)步骤低温、脱水、辐照灭菌，其特征在于，低温－30～－100℃冷冻干燥，真空度达到10～130pa，脱去脐带组织高拟体内细胞外基质90～95％以上水分，取出密封与真空包装，经辐照15～80KGY剂量灭菌。

6.一种利用权利要求1所述的应用羊膜层高拟体内细胞外基质与人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合筛选培养人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的方法，包括：

a)制备人胎盘羊膜来源的间充质干细胞悬液：取材，消化液A,B或C二步消化，用权利要求2所述所述的含10％人血清培养液A终止消化，过滤GE Ficoll分离液，收集细胞层，重悬细胞计数，后加入培养液A；

b)人胎盘羊膜来源的间充质干细胞的筛选及培养：将羊膜层高拟体内细胞外基质加入权利要求2所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标人胎盘羊膜来源的间充质干细胞贴壁粘附于羊膜层高拟体内细胞外基质，加入权利要求2所述的培养液C进行扩增培养；

c)消化富集传代培养：消化液B或C消化，含10％人血清培养液B终止消化，离心后加入权利要求2所述的培养液C进行扩增培养；

d)人胎盘羊膜来源的间充质干细胞长期冻融保存液制备。

7.一种利用权利要求6所述的消化液A、B、C，其特征在于，组分包括：

消化液配制A:含溶质0.1％中性蛋白酶和0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1),无菌含双抗PBS为溶剂，配制溶液。

消化液配制B:含溶质0.8％IV型胶原酶和0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1),无胎盘多肽注射液培养液A为溶剂，配制溶液。

消化液配制C:含溶质0.1％中性蛋白酶和0.5％IV型胶原酶与0.1％Ⅱ型胶原酶(体积比1:1:1),无胎盘多肽注射液培养液A为溶剂，配制溶液。

8.一种利用权利要求1所述的人胎盘羊膜来源的间充质干细胞冻融保存液制备，其特征在于，抗冻溶质组分包括：维生素B4 1～10μg/ml，维生素C 1～4μg/ml，聚乙二醇4ml、(优选自体血清)人AB血清10～15％、甘油20％、甘露醇3ml、细胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亚砜(DMSO)10％、硫酸软骨素3～6％，保存配制液以权利要求2所诉无抗的培养液ABC为溶剂制备抗冻溶液。PH控制在7.3～7.4，0.22μm微孔滤过除菌。