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CN101321686A - 用于多路信号传递和光编码的多组分纳米颗粒 - Google Patents

用于多路信号传递和光编码的多组分纳米颗粒 Download PDF

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CN101321686A
CN101321686A CN200680045199.3A CN200680045199A CN101321686A CN 101321686 A CN101321686 A CN 101321686A CN 200680045199 A CN200680045199 A CN 200680045199A CN 101321686 A CN101321686 A CN 101321686A
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CN
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nano particle
luminophore
microballoon
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kinds
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CN200680045199.3A
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谭尉泓
王琳
杨朝勇
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Original Assignee
University of Florida Research Foundation Inc
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Abstract

本发明可以为生物分析中的多路信号传递提供多重发光基团的二氧化硅纳米颗粒。在具体的实施方案中，两种无机发光基团，三(2，2′－－联吡啶)锇(II)双(六氟磷酸)(OsBpy)和三(2，2′－－联吡啶)二氯化钌(II)六水合物(RuBpy)，或三种有机发光基团，5－异硫氰酸荧光素(5－FITC)、5－羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺酯(5－CR6G，SE)和6－羧基－X－罗丹明，琥珀酰亚胺酯(6－ROX，SE)，以精确控制的比例被同时装入二氧化硅纳米颗粒中，所述纳米颗粒具有需要的大小和所需的表面官能度。单波长激发的多重发射使所述纳米颗粒具有光编码的能力，可以被应用于快速的和高通量的多路检测中。

Description

用于多路信号传递和光编码的多组分纳米颗粒
相关专利申请的交叉引用
政府资助
本主题发明的完成得到来自NI H批准号为GM-66137、NIH批准号为NS-045174和NSF批准号为EF-0304569的政府资助。政府对本发明具有某些权利。
背景技术
在食品和水安全、临床诊断和军事/民间冲突中，快速并准确地检测微量的例如病原菌的有机体是重要的。最近，由于利用生物战试剂的恐怖活动的危险的增加，对各种微生物的检测受到很大关注。
大肠杆菌(Escherichia coli) O157：H7(E.coli O157：H7)是通过食物传播的最危险的细菌性病原体之一。它常见于生牛肉、水果、蔬菜、沙拉棒产品、意大利腊肠(salami)和其他食物产品中。E.coliO157：H7感染的爆发已经引起严重的疾病，并且导致大规模的死亡。因此，为了防止意外的爆发或者国际恐怖分子策划的袭击，对微量的E.coli O157：H7以及其他病原微生物的早期检测是至关重要的。
被用于微生物早期检测的检测技术的关键需求是专一性、速度和敏感性。传统的检测方法可以提供存在大量的生物体(例如细菌物种)的定性的和定量的信息。然而，因为许多这样的方法依赖于微生物可以在专用的生长培养基中在一定时间(大约需要1-5天)长成可见的集落的能力，所以时间的限制和现场分析的难易程度是主要的限制。而且，对微量细菌的检测一般需要扩增或者富集所述样品中的靶细菌。由于所述复杂的测定步骤，这些方法趋于费力而且耗时。
最近，已经进行了一些努力改进传统的细菌检测方法，以缩短所述测定的时间。一种尝试是传统方法的修饰和自动化。另外，许多的改进是检测技术的改善，例如：直接表面发光滤光器技术(directepiluminescent filter technique)(DEFT)、基于质谱的方法，以及计数和鉴别试剂盒。最有希望的技术之一是流式细胞术，基于一个流动系统中的发光信号，它每小时可以检测102-103 E.coli O157：H7细胞/mL。虽然大大减少了检测时间，但是敏感性的提高仍然是一个挑战。
最近，多路生物测定(multiplexed bioassay)的开发成为一个关注和应用都迅速扩展的领域。与单个靶的检测方法对比，多路测定可以减少每次分析的时间和成本，允许更简单的测定步骤，减少所需样品的体积，以及使样品的比较得以实现并且使测定结果可重复和可靠。许多疾病诊断和生物医学研究需要来自多个靶的信息，例如大量的蛋白和基因。多路测定可以快速筛选大量的核酸和蛋白，因此是配合基因组学和蛋白组学进展的关键。利用空间分辨测量(spatiallyresolved measurement)，寡核苷酸微阵列和蛋白阵列可以处理高度的多路检测，但是实验设备和检测系统通常不方便日常使用，不能被应用于监测实时的或近乎实时的事件，并且不能被应用于生物样品的成像。
多路的基于微球的流式细胞术测定有几个优势，例如靶选择的灵活性、快速结合动力学和被良好控制的结合条件。荧光团和量子点都被植入聚合体的微珠中以进行高容量光谱编码。由于具有大小可调节的发射和宽带激发性质的独特优点，量子点具有作为一个合适的波长和强度的多路技术的发光基团的潜力。然而，在纳米水平进行平行编码并不容易。
因为许多生物学系统(包括病毒、膜和蛋白复合体)是天然的纳米结构，所以需要开发纳米级的具有多路能力的信号传递标记。
发明内容
本发明可以提供二元发光基团(dual-luminophore)和三元发光基团(triple-luminophore)二氧化硅纳米颗粒(NP)，用于生物分析中的多路信号传递。
本文使用的词“纳米颗粒”或“NP”指一种直径为约1-1000nm的颗粒。类似地，所述术语“纳米颗粒”或“NP”的复数形式是指多数的颗粒具有约1-1000nm的平均直径。
在一个具体的实施方案中，两种无机发光基团，三(2，2′-联吡啶)锇(II)双(六氟磷酸)(Tris(2，2′-bipyridyl)osmium(II)bis(hexafluorophosphate))(OsBpy)和三(2，2′-联吡啶)二氯化钌(II)六水合物(Tris(2，2′-bipyridyl)dichloro ruthenium(II)hexahydrate)(RuBpy)，或三种有机发光基团，[5-异硫氰酸荧光素](5-FITC)、[5-羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺酯](5-CR6G，SE)和[6-羧基-X-罗丹明，琥珀酰亚胺酯](6-ROX，SE)，以精确控制的比例被同时装入二氧化硅NP中，所述NP具有需要的大小和所需的表面官能度。单波长激发的多重发射使所述NP具有光编码的能力，可以被应用于快速的和高通量的多路检测中。
可以把所述NP制备成从几纳米或更小至几百纳米或更大范围内的大小，在能清晰分辨的两个波长下具有特定的发光强度比，并且具有重复性。
提到纳米颗粒的“大小”是指所述纳米颗粒的最大的直线尺寸。例如，一个完全球状的纳米颗粒的大小是它的直径。
本发明的NP当用作信号传递标记的时候也具有以下的独特性质以进行高敏感性测量：高度信号放大、极好的耐光性并且易于进行表面生物偶联。
本发明的另一个方面提供一种使用抗生物素蛋白-生物素的简化的配体结合系统。
附图说明
图1显示在一个分光光度计上的RuBpy和OsBpy染料的激发和发射光谱。
图2是一张二元发光基团掺杂的羧基官能化的NP的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图3a表明几种代表性的二元发光基团掺杂的NP样品的发射光谱。
图3b显示八种代表性的二元发光基团掺杂的NP样品的标准化的发射光谱。
图4a是一张装配至链亲和素包被的直径为5.5μm的二氧化硅微球的70nm的生物素标记的NP的SEM图像。
图4b是一张装配进入链亲和素包被的直径为5.5μm的二氧化硅微球的70nm的非生物素化的NP的SEM图像。
图5显示从点图得到的计数事件，为所制备的微球溶液的理论浓度的函数。
图6a显示抗-小鼠IgG偶联的微球与小鼠IgG偶联的NP之间的专一性的结合。
图6b显示抗-人IgG偶联的微球与小鼠IgG偶联的NP之间的非专一性的结合。
图6c显示抗-人IgG偶联的微球与人IgG偶联的NP之间的专一性的结合。
图6d显示抗-小鼠IgG偶联的微球与人IgG偶联的NP之间的非专一性的结合。
图7是一张显示两组微球的分类的二维点图，所述分类是基于一个流式细胞仪上的对数的橙色荧光(FL2)和对数的红色荧光(FL3)的同时分析。
图8显示FRET NP样品的标准化的发射光谱。
图9显示FRET NP样品在UV照射下的颜色。
图10显示五种类型的微球-NP复合体在单波长激发下的共聚焦荧光图像。
具体实施方式
本发明的一个实施方案可以为平行的和高通量的生物分子信号传递提供生物偶联的纳米颗粒(NP)，所述颗粒是通过使用一种基于二元染料的微乳化方法或者一种基于三元染料的史托伯法(
Figure A20068004519900071
process)形成。
一种本发明的方法的一个实施方案包含以精确控制的比例把多种类型的染料分子同时掺杂至NP中。所述产生的NP在单波长激发下呈现可清晰分辨的多重发射。因此，本发明的多路分析可以使用单波长激发产生多重波长的发射。这样的排布可以简化操作。
本发明的例证的系统使用植入一种NP内部的两种类型的无机的或三种类型的有机的染料分子的发光强度比。强度比分析在生物分析和生物成像中被有效地应用，以提供可重复的测量并且使例如光漂白的潜在问题最小化。与流式细胞仪或光学显微镜相结合，本发明的NP可以实现十分快速、高度选择和高度敏感的多路生物分析和光编码。例如，所述系统可以被用来靶向生物物质，所述生物物质如细菌、DNA、mRNA、蛋白、抗原和抗体。
因为NP特别小、惰性、亮，并且容易为偶联进行修饰，所以它们特别有用。所述纳米级的大小和所述NP的特性使得与所述生物识别事件的物理干扰最小化，并且使得所述生物识别事件的光失真最小化。
本发明的NP的直径可以为约1nm至约1000nm或更大。对于许多应用，所述直径优选约10nm-约300nm(例如约10、15、20、25、30、35、50、75、100、150、200、250或300nm)。更优选地，本发明的NP的平均大小在1nm-300nm的范围内；甚至更优选地，本发明的NP的平均大小在2nm-70nm的范围内。在多数的NP的离差中，所述大小分布优选具有一个不大于约25％(例如1、2、3、5、10、15、20和25％)的多数NP的平均直径(或最大的直线尺寸)的标准差。
本发明的NP可以是实心的(即基本上没有孔)。虽然这种形式是许多应用的优选，但是本发明中的NP也可以是有孔的。根据本主题发明，可以用编号为6,924,116和6,548,264的美国专利中公开的方法合成NP。所述6,924,116和6,548,264的全文都通过引用的方式被纳入本文。
虽然有许多不同类型的纳米材料可以被应用于生物分析，但是本发明的一个实施方案可以使用发光基团掺杂的二氧化硅NP。所述二氧化硅颗粒的性质使得可以相对容易地为偶联各种生物分子对表面进行修饰，使之在生物测定系统中有广泛的应用。这些NP具有独特的特征，所述特征如强烈的发光信号、极好的耐光性，以及易于进行生物偶联，以便在生物相互作用和识别的时候容易对纳米材料和生物分子间进行连接。另外，可以容易地制备这些NP，并且可以在电荷和官能度两方面把它们的表面修饰成需要的表面性质。
在一个实施方案中，可以通过两步制备NP。在一个初始的24小时的聚合过程中，形成染料掺杂的二氧化硅NP。在随后的包被后步骤中，各种官能团被紧密地结合到所述NP上。存在于所述表面上的这些官能团特别适合于与生物分子的偶合反应。每个染料掺杂的NP包含数万种染料分子并且因此表现出高信号放大的能力。一个染料掺杂的二氧化硅NP的发光强度比一个染料分子的发光强度高大约104倍。而且，所述NP显示极好的耐光性。
RuBpy和OsBpy两种染料都是过渡金属配体配合物(transition-metal-ligand complex)(MLC)；它们具有长寿命，并且高度光稳定。在所述NP制备过程中的双重二氧化硅包被可以把所述染料分子与所述外部环境隔离。所述染料分子因此被保护而接触不到如光暴露引起的溶剂分子和自由基的成分，所以可以有效地减少或消除光解。
制备具有现有的荧光基团的NP的可能性可以为各种应用提供多种NP。在一个实施方案中，发光NP的信号增强是基于每个NP中包含的数万个发光染料分子。这可以形成用显著的光信号放大进行的发光检测的基础。当通过一种外部的能量源激发的时候，所述荧光染料发射光子(荧光)，可以观察并检测所述光子(荧光)以进行定量的和定性的分析。
因此，根据本主题发明，所述靶(例如一种在细菌表面上的抗原)上的每个结合位点的识别可以被一个包含数万个染料分子的NP标记。因此，所述发光信号比单个染料分子提供的发光信号高数万倍，因此提供了高倍放大的信号。这特别适合于检测单个的细菌或浓度很低的样品，以及具有有限的表面抗原的靶细菌。
本主题发明的二氧化硅NP是高度光稳定的，因为所述染料分子被包裹在保护性的二氧化硅基质中。所述高度发光的二氧化硅NP容易具有一个高度的敏感性，这可以减少或消除对所述细菌样品进行进一步的靶扩增或富集的需求。而且，也可以为减少基质效应进行大量的样品稀释。
在本主题发明的某些的实施方案中，生物偶联的NP可以装载有生物识别的分子，所述分子例如抗体、寡核苷酸、生物素或链亲和素，所述分子已知会与特殊的生物分子结合。
在一个实施方案中，专一性的单克隆抗体被固定在所述NP表面以形成NP-抗体的偶联物。通过抗体-抗原相互作用和识别，所述抗体偶联的NP可以容易地并专一性地鉴定各种细菌(或其他细胞)。当结合物识别一种细胞表面的抗原的时候，它们与所述靶细菌结合，为单个细胞的检测提供一个亮的发光信号。对于一种细菌，有许多表面抗原可以被抗体-偶联的NP专一性地识别。因此，每个细菌上可以结合数千个NP，每个NP优选包含数千个染料分子，因此产生一个被极度放大的信号。
为进行多路信号传递和生物分析，本发明包括具有不同表面修饰的多重发光基团掺杂的二氧化硅NP。这些官能化的NP可以容易地用生物分子标记，并且具有光编码的能力。通过在单个的NP中整合不同量的两种发光基团，可以精确地控制所述发光强度比并使之适合于在多靶标检测中应用。所述操作简便，并且人工效应(artificial effect)很小。而且，染料掺杂的NP具有超常优点，即实现高敏感性的高发光强度和极好的耐光性，所述优点使得这些NP特别适合作为生物标记试剂。
本发明的方法适合于进行抗原和核酸的快速而敏感的分析，并且在临床的、食品的、环境的和法医的实验室中具有许多潜在的应用。材料和方法
试剂.可以根据本领域已知的方法合成三(2，2′--联吡啶)锇(II)双(六氟磷酸)(OsBpy)。三(2，2′--联吡啶)二氯化钌(II)六水合物(RuBpy)、5-异硫氰酸荧光素(5-FITC)、四乙基正硅酸盐(TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-Aminopropyl)tr iethoxysilane)(APTS)和曲拉通X-100(Triton X-100)(TX-100)来自于Aldrich Chemical Co.Inc.(Milwaukee，WI)。5-羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺酯(5-CR6G，SE)和6-羧基-X-罗丹明，琥珀酰亚胺酯(6-ROX，SE)来自于Invitrogen，Co.(Carlsbad，CA)。THPMP[(3-三羟基甲硅烷基)丙基甲基-膦酸酯]和CTES[羧基乙基硅烷三醇，钠盐]来自于Gelest，Inc.(Tullytown，PA)。环己烷、n-己醇和氢氧化铵(28-30wt％)来自于Fisher Scientific Co.(Pittsburgh，PA)。牛血清白蛋白(BSA)、吐温20(Tween 20)和MES[2-(N-吗啉)乙磺酸]来自于Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。纯化的人IgG和小鼠IgG、抗人血清的山羊抗血清和抗小鼠血清的山羊抗血清(法医的)来自于ICN Pharmaceuticals，Inc.(Aurora，OH)。EZ-连接磺基-NHS-LC-生物素[磺基-丁二酰亚胺基-6-(生物素酰氨基)己酸酯(Sulfo-succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate)]、磺基-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)和EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基碳二亚胺氢氯化物]来自于Pierce Chemicals(Rockford，IL)。链亲和素包被的微球(5.50μm直径)和羧化的二氧化硅微球(直径5.06μm)来自于Bangs Laboratories(St.Louis，MO)。所有其他化学试剂都是分析纯试剂级。蒸馏去离子水(Easy Pure LF)被应用于制备所有的水溶液。
仪器.在示例的实施方案中，Hitachi S-4000扫描电子显微镜(SEM)被应用于NP的鉴定。Fluorolog TAU-3分光光度计(JobinYvon-Spex，Instruments S.A.，Inc.Edison，NJ)被用来记录激发和发射光谱。通过激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，Japan)获得光学的和发光的图像。FACScan(Becton Dickinson Immunocytometry Systemsof San Jose，CA)被应用于流式细胞分析。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅是为了说明的目的，并且它们的各种细微的修饰或变化对本领域技术人员来说是可以预期的，并被包括在本申请的主旨和范围内。
实施例1产生二元染料掺杂的纳米颗粒
在一个实施方案中，分别制备RuBpy和OsBpy染料的水溶液，然后以精确控制的摩尔比混合。所述两种发光基团混合溶液的终体积是约480μl。
通过混合约1.77ml的TX-100、约7.5ml的环己烷、约1.8ml的正己醇和约480μl的二元染料混合溶液，制备油包水的微乳剂。然后加入TEOS(约100μl)作为二氧化硅形成的前体，之后加入60μl NH4OH以启动聚合过程。在室温下继续所述反应24小时，接着加入约50μl的TEOS和约10μl的APTS、约40μl的THPMP(用于胺修饰)或约50μl的CTES(用于羧基修饰)。在搅拌的条件下再继续所述反应24小时。
在所述反应完成之后，使用丙酮把NP从所述微乳剂中分离，之后离心并用乙醇和水清洗数次以去除表面上的分子。在所述清洗过程中使用超声处理以从所述颗粒表面去除任何物理吸附的发光基团。
虽然在一个示例的实施方案中描述的是二元染料掺杂的NP，但是需要清楚的是可以使用多于两种的染料。
实施例2-链亲和素微球与生物素化的纳米颗粒的偶联
在一个实施方案中，通过胺修饰的NP和磺基-NHS-LC-生物素之间的反应制备生物素标记的NP。用含约0.1％的吐温20的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)离心三次清洗链亲和素包被的微球，并且以大约1.0×108颗粒/ml的终浓度溶解于相同的缓冲液中。
制备一系列的包含不同数量的颗粒的微球溶液，并且加入等份的过量生物素-NP溶液。在室温下轻轻摇晃每个悬浮液约2个小时，并且使用氩激光器在488nm的激发用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪分析。对橙色(585nm)和红色(＞650nm)发光通道进行监测。所有的溶液都以同样的流速(60μl/min)和相等的时间(3分钟)通过所述流式细胞仪。
实施例3-抗体与羧化的微球和纳米颗粒共价连接
在一个实施方案中，在NP上的游离的羧酸基与含胺的抗体交联。
简言之，通过用去离子水离心一次对约100μl的0.22％(w/v)COOH-修饰的NP悬浮液进行清洗。然后在约1ml的0.1M MES，pH 5.5中重新悬浮所述沉淀。新鲜制备10mM磺基-NHS和4mM EDC溶解于MES缓冲液的水溶液，并且约0.5ml的每种溶液立即加入到NP溶液中。在室温下轻轻搅拌孵育所述NP。在约15分钟后，离心所述NP并且用10mM的磷酸盐缓冲液，pH 7.4清洗。
在约1.5ml磷酸缓冲液中重新悬浮之后，把所述NP加入约50μl的1mg/ml浓度的抗体中。在室温下轻轻翻转摇晃所述混合液孵育约2小时。
在10mM的磷酸缓冲液中清洗所述NP，然后重新悬浮于淬灭溶液(quenching solution)(含0.05％(w/v)BSA的40mM Tris-HCl)约60分钟以阻断游离的羧酸根。通过交替离心纯化蛋白包被的NP，并且重新悬浮于含1％的BSA的磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)中，储存于约4℃备用。
根据相同的步骤，把第二抗体与羧化的二氧化硅微球共价连接。
实施例4-抗体-纳米颗粒与第二抗体-微球的偶联
在一个实施方案中，抗体偶联的NP和第二抗体修饰的微球在孵育缓冲液(10mM磷酸缓冲液，pH 7.4，1％BSA，0.05％吐温20)中稀释，以一个实验最优化的比(500∶1)混合，并且在室温下轻轻摇晃约30分钟。
通过离心(500rpm，10分钟)清洗所述产物三次，重新悬浮于相同的缓冲液中并且在4℃储存。用市售的激光扫描共聚焦显微镜测定NP-包被的微球发的光。
用氩离子激光器在488nm的波长激发，并且用两个不同的光电倍增管检测两个正交的检测通道(分别检测RuBpy和OsBpy)。橙色和红色通道都被存储为24-位的TIF图像。
实施例5-流式细胞仪多路检测
在一个实施方案中，具有9∶1和2∶1(610nm；710nm)的发光强度比的NP与人IgG和小鼠IgG分别偶联。相同数量的抗小鼠IgG和抗人IgG包被的微球(1.62×10-17摩尔)与最优量的小鼠IgG和人IgG标记的纳米颗粒(8.1×10-15摩尔)混合。用稀释缓冲液稀释所述混合液，并且通过所述流式细胞仪。
实施例6-二元染料纳米颗粒鉴定
图1显示RuBpy和OsBpy染料在一台分光光度计上的激发和发射光谱。线“a”表示RuBpy在610nm发射的激发光谱；线“b”表示OsBpy在710nm发射的激发光谱；线“c”表示RuBpy在488nm发射的激发光谱；并且线“d”表示OsBpy在488nm发射的激发光谱。这两种染料共享一个宽的有重叠的激发光谱，但是具有两个不同的最大发射波长，RuBpy为610nm，OsBpy为710nm。通过以特定的摩尔比掺杂这两种染料，在单波长的激发下，所述NP在610nm和710nm下给出可控制的峰强度比。
图2是一张二元发光基团掺杂的羧基官能化的NP的扫描电子显微镜(SEM)图像。如SEM显示的，每个所述的羧基修饰的NP的直径是约70±3nm。所述胺修饰的NP具有相似的大小。所述官能化的NP很好地分散到水溶液中，并且由于NP间的静电排斥力没有观察到凝聚的出现。所述羧基基团修饰的NP在中性pH下带负电荷，并且所述胺修饰的NP上的惰性膦酸酯基团也形成一个完全阴性的表面电荷，所述阴性电荷阻止NP的凝聚。
通过改变两种染料的掺杂的量可以精确地控制二元染料NP的发光强度比。图3a显示具有不同掺杂量的两种染料的几种NP样品的发射光谱。图3a的插图显示所述强度比与两种染料的摩尔比之间有好的相关性。为了确定所述强度比是否在不同批之间具有重复性，比较来自五种平行的NP溶液的平均峰强度比；变异系数为7％，表明只要所述强度比互相之间差异14％，在多路检测中就可以完全区分所述NP。
利用这些信息，可以制备没有峰比重叠的新一批的NP样品。图3b显示具有不同掺杂量的两种染料的几种NP样品的标准化的发射光谱。所述Y轴显示610nm和710nm的峰发光强度比。通过控制这两种染料的掺杂浓度，(488nm激发)获得不同的强度比(例如包括9∶1、7∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶5、1∶8、1∶17和1∶27)；它们任意两个之间的差异都超过14％。通过改变两种染料(RuBpy/OsBpy)的掺杂量，可以获得更多的比组合，使真正的多路信号传递可能并且可行。
实施例7-使用生物素-纳米颗粒和链亲和素-微球的配体结合系统
在一个实施方案中，所述二元染料NP与生物素和抗生物素蛋白被应用于多路信号传递应用中。生物素是相对小的分子，它与抗生物素蛋白和链亲和素有高亲和性(Ka＝1.3×1015M-1)。所述连接反应很快，并且一旦结合形成，所述结合不受例如pH、有机溶剂和其他变性剂的大部分的变化的影响。在这个实施方案中，生物素标记的NP和链亲和素偶联的微球以一种合适的摩尔比混合。抗生物素蛋白-生物素的相互作用使NP装配到所述微球表面。在进行多路检测之前，这个装配最初作为一个简化的配体结合系统完成。
胺修饰的NP可以与活化的生物素酯发生反应，以把生物素分子与所述NP连接。为了确定所述偶联的效率，TMR-标记的生物素与各种量的或者生物素化的或者未生物素化的NP相混合。上清液的发光强度与加入的NP的量之间的函数被获得，并证明成功的生物素化。链亲和素包被的微球可以与这些生物素化的NP发生反应。
用二分NP的平面的横断区域除理论的微球表面区域，可以估计包装到微球表面的NP的数量。结果值被应用于为每种微球确定悬浮液中所需的NP的最小数量。在这种情况下计算的值是25,000∶1。在一个实施方案中，使用50,000∶1的比以保证所述微球表面足够饱和。
装配在链亲和素包被的直径为5.5μm的二氧化硅微球上的70nm的生物素标记的NP的SEM图像显示在图4a中。所述生物素化的NP附着于所述微球，清楚地证明生物素和链亲和素之间的结合。相反，当所述微球经过未生物素化的NP处理的时候，所述微球的表面仅有最低限度的NP(图4b)。
使用这些NP包被的微球进行流式细胞实验。不同浓度的微球溶液与等份的过量的生物素标记的NP混合，以保证每个微球被成功地包被。在分析之前通过产生漩涡使珠悬浮液分散。用流式细胞仪进行单个微球的大小和发光的分析。应用橙色和红色发光对微球进行分类，它们的比相关于利用分光光度计测定的在610nm和710nm下的峰强度比。图5显示从生物素化的NP包被的链亲和素微球的点图得到的计数事件为制备的微球溶液的理论浓度的函数。因为本实施例中的每种溶液以相同的流速通过所述流式细胞仪，并持续相同时间，所以所述计数的数量应该与所述理论浓度具有线性关系。图5可以证明这个线性关系。该模型系统显示，所述NP可以被成功地应用于靶标记和计数，并且所述应用可以被扩展至多路免疫检测。
实施例8-用于多路免疫测定的二元发光基团掺杂的二氧化硅纳米颗粒
本发明的一个实施方案包括一种在用双染料的NP的多路免疫测定中使用的系统。具有各种强度比的抗体偶联的NP和第二抗体包被的微球被应用于专一性的免疫测定识别。所述NP/微球相互作用刺激偶联的NP与细胞或细菌表面上的潜在的受体/抗原之间的识别过程。
可以把两种单独的分析物应用于多路免疫测定中。使用基于碳二亚胺的反应，小鼠IgG和人IgG分别与NP偶联；山羊抗-小鼠IgG和山羊抗-人IgG以相似的方式被固定于微球上。为了验证所述小鼠IgG已经成功地与所述NP偶联，通过在所述生物偶联步骤加入BSA替代小鼠IgG，之后加入TMR-标记的山羊抗-小鼠IgG进行对照实验。离心所述装配物，并且把所述沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中。TMR-标记的山羊抗-小鼠IgG将会专一性地结合小鼠IgG偶联的NP，并且非专一性地结合BSA偶联的NP。在545nm激发所述沉淀以观察所述NP上标记的TMR分子的发射。来自用TMR-标记的山羊抗-小鼠IgG孵育的小鼠-IgG-包被的NP显著高的发光强度可以证实所述NP表面上的抗体的成功结合。
在一个实施方案中，在进行一项多路检测之前，以非多路的形式分别优化每项检测的参数。每个组的NP偶联于每个反应都需要的靶微球。经过离心和清洗，用缓冲溶液重新悬浮所述产物，并且装载于载玻片上进行成像。
因为被应用于控制所述装配过程的方法涉及专一性的生物化学相互作用，所以在一个实施方案中验证这些装配的组合物是所述颗粒之间的这些专一性的相合作用的结果，而不是非专一性相互作用的结果。在上述的同样的步骤之后，进行两组抗体包被的NP和两组第二抗体包被的微球的交叉反应。为了减少非专一性结合，所述孵育缓冲液包含1％BSA和0.05％吐温20，孵育时间限制在30分钟，并且优化NP与微球的摩尔比以获得最佳的S/N比。所述优化的NP与微球的摩尔比被确定为500∶1。观察NP包被的微球在专一性的或非专一性的反应条件下的共聚焦发光图像。
图6a显示抗-小鼠IgG偶联的微球与小鼠IgG偶联的NP之间的专一性的结合；图6b显示抗-人IgG偶联的微球与小鼠IgG偶联的NP之间的非专一性的结合；图6c显示抗-人IgG偶联的微球与人IgG偶联的NP之间的专一性的结合；并且图6d显示抗-小鼠IgG偶联的微球与人IgG偶联的NP之间的非专一性的结合。因此，可以观察到抗-小鼠IgG微球与小鼠IgG-NP之间的专一性的结合(图6a)和抗-人IgG微球与人IgG-NP之间的专一性的结合(图6c)，而抗-人IgG微球与小鼠IgG-NP之间的非专一性的结合(图6b)和抗-小鼠IgG微球与人IgG-NP之间的非专一性的结合(图6d)是不显著的。
利用这两组微球，使用二元发光基团掺杂的二氧化硅NP为混合分析物的检测进行概念验证(proof-of-concept)的流式细胞实验。选择具有9∶1和2∶1的强度比(610nm∶710nm)的两种类型的荧光NP，然后分别用人IgG和小鼠IgG标记。相同数量的抗-小鼠-IgG-包被的微球和抗-人-IgG-包被的微球(都是1.62×10-17摩尔)与这两种类型的IgG包被的NP(都是8.1×10-15摩尔)混合，形成混合物。图7是一张显示两组微球的分类的二维点图，所述分类是基于一个流式细胞器上的对数的橙色荧光(FL2)和对数的红色荧光(FL3)的同时分析。在R1区域中的点代表小鼠IgG NP包被的抗-小鼠IgG微球(2∶1)，在R2区域中的点代表人IgG NP包被的抗-人IgG微球(9∶1)。对两个区域内的点的数量进行计数。因为在两个区域中使用了相同数量的微球，所以预期每个区域中微球的计数数量相等。实验结果表明，在R1和R2区域中的总体分布分别是46.56％和53.42％，当考虑到可能的亲和力差异的时候，所述结果与预期值很好地吻合。因此，通过生物偶联NP，本发明的系统有助于微球的多路检测。这些NP可以被应用于细菌/细胞识别，特别是那些专一性抗原极少的细菌/细胞识别，在所述细菌/细胞识别中使用染料分子会出现困难。基于以下的原因这些NP可以克服这样的困难：(1)NP的更高的发光强度改善了所述检测的限制，特别是对于某些具有有限数量的表面抗原的靶，和(2)由于所述二氧化硅基质的保护，所述NP是高度光稳定的；虽然染料分子也会出现严重的光漂白的问题。
使用的NP的发射峰比是9∶1和2∶1。然而，图7表明，测量空间的少量重叠可能导致某些微球与邻近的组被错误地分类，并且限制所述多路的能力。所述重叠是由所述流式细胞仪测量中选定的光滤光片配置的收集效率引起。所述FACScan中使用的滤光片有橙色发光通道的带通滤光片(585±42nm)和红色发光通道的长通滤光片(＞650nm)，两种滤光片都没有进行RuBpy或OsBpy染料的优化(当流式细胞仪是公用设备，并且不允许改变光系统时)。利用更加合适的滤光片组可以提高多路检测的能力。
实施例9-生成三元发光基团掺杂的二氧化硅纳米颗粒(FRET纳米颗粒)
在一个实施方案中，通过二步的史托伯法(
Figure A20068004519900171
process)制备三元发光基团掺杂的二氧化硅NP。在所述第一步中，三种类型的胺活性染料([5-异硫氰酸荧光素](5-FITC)、[5-羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺酯](5-CR6G，SE)和[6-羧基-X-罗丹明，琥珀酰亚胺酯](6-ROX，SE))分别溶解于无水DMF中，加入过量的APTS，并在避光的条件下搅拌24h。在所述第二步中，以需要的比例混合所述三种染料溶液，并且加入到一个装有乙醇和氢氧化铵的干净的玻璃反应器中。轻轻搅拌所述混合液24h。然后加入TEOS并再搅拌24h。在所述反应之后，在14,000rpm下离心所述样品30min，收集二氧化硅NP。通过离心和倾析用乙醇和磷酸盐缓冲液进一步清洗所述NP数次，以去除未反应的化学试剂。
应当理解，其他类型的染料也可能适合这个系统，并且可以使用多于三种的染料。
实施例10-用于多路光信号传递的多种颜色FRET纳米颗粒
本发明的一个实施方案包括一种用于多路光信号传递的使用三元发光基团掺杂的二氧化硅NP的系统。三种类型的有机发光基团以不同的比例被掺杂进入相同的NP中。由于所述发光基团的荧光能量转移，单波长的激发可以产生所述NP的可调节的发射标记。图8显示具有不同浓度的三种染料的FRET NP样品的标准化的发射光谱。通过改变所述三种染料的掺杂的量，可以获得更多的比例组合。不同的NP在UV光照下可以显示不同的颜色，如图9所示。五种类型的有不同颜色的NP被生物素分子标记，并且与链亲和素偶联的微球偶联，图10显示在单波长激发下产生五种不同颜色的微球-NP复合体的共聚焦荧光图像。这可以证明，同时对多种细菌性病原体的鉴定不仅可以用二元发光基团掺杂的NP通过流式细胞检测完成，而且可以用多颜色的FRET通过常规的光学显微镜实现。每种类型的NP被一种专一性的抗体修饰，并且与细菌样品混合。NP具有可区分的多种颜色的单波长激发可以同时进行多种细菌的高通量检测。
在单波长激发下颜色可调性的优点也使所述FRET NP可用于制造用于显示的NP单层，以及制造复合的电子-光学装置。所述NP形态的变化导致电流密度和辐射强度的提高。NP产生的所述光的颜色比其他光源产生的更加饱和。
使用发光NP的多颜色光编码具有几个优点，例如高度信号放大、极好的耐光性和易于生物偶联。利用所述新开发的NP，可以直接在纳米尺寸水平进行所述多路分析，因此使人工干扰最小化。所述染料掺杂的NP是高度敏感的，这使得可以在甚至很低靶浓度下进行颗粒的检测。一个NP的发光强度比单个染料分子发光强度高约104倍。这个优点使NP标记特别适合于低靶浓度的情况。与流式细胞术测定联合，该方法被证明是快速的、选择性的和敏感的。本发明为临床监护和感染性疾病的检测例如多细菌和病毒的快速诊断提供了非常高的灵活性和效率。
本文参考或者引用的所有的专利、专利申请、临时申请和出版物的全文(包括所有图和表)通过引用的方式被纳入本文，除非它们与本说明书的明确教导相矛盾。

Claims (20)

1.一种包含至少两种无机发光基团的纳米颗粒，其中所述发光基团被包被在一种二氧化硅基质中。
2.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述发光基团是三(2，2′--联吡啶)锇(II)双(六氟磷酸)(OsBpy)和三(2，2′--联吡啶)二氯化钌(II)六水合物(RuBpy)。
3.根据权利要求2的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径是约1nm-约300nm。
4.根据权利要求2的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径是约2nm-约70nm。
5.根据权利要求2的纳米颗粒，其中所述二氧化硅基质包含一种官能团。
6.根据权利要求5的纳米颗粒，其中所述官能团为选自以下的生物识别分子：抗体、寡核苷酸、生物素和链亲和素。
7.根据权利要求6的纳米颗粒，其中所述官能团是生物素。
8.根据权利要求6的纳米颗粒，其中所述官能团是一种IgG抗体。
9.根据权利要求6的纳米颗粒，其中所述官能团是链亲和素。
10.一种包含多个纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包含至少两种无机发光基团，其中所述发光基团被包被在一种二氧化硅基质中。
11.一种包含至少三种有机发光基团的纳米颗粒，其中所述发光基团被包被在一种二氧化硅基质中。
12.根据权利要求11的纳米颗粒，其中所述发光基团是5-异硫氰酸荧光素(5-FITC)、5-羧基罗丹明6G，琥珀酰亚胺酯(5-CR6G，SE)和6-羧基-X-罗丹明，琥珀酰亚胺酯(6-ROX，SE)。
13.根据权利要求12的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径是约1nm-约300nm。
14.根据权利要求12的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径是约2nm-约70nm。
15.根据权利要求12的纳米颗粒，其中所述二氧化硅基质包含一种官能团。
16.根据权利要求15的纳米颗粒，其中所述官能团为选自以下的生物识别分子：抗体、寡核苷酸、生物素和链亲和素。
17.根据权利要求16的纳米颗粒，其中所述官能团是生物素。
18.根据权利要求16的纳米颗粒，其中所述官能团是一种IgG抗体。
19.根据权利要求16的纳米颗粒，其中所述官能团是链亲和素。
20.一种包含多个纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含至少三种有机发光基团，其中所述发光基团被包被在一种二氧化硅基质中。
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