CN101314787A - 用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法。所述红酵母还原酶制剂由红酵母细胞中提取而得，包含羰基还原酶和甘露醇脱氢酶。通过甘露醇脱氢酶和羰基还原酶的反应耦合，可以使用廉价的甘露醇作为辅底物，在羰基还原反应过程中实现辅酶NADPH的原位再生和循环利用。在合成反应体系中只需加入催化量的辅酶，即可实现高浓度羰基底物的完全和高选择性还原。生产工艺简单，产品易于提取纯化，可用于制备各种高光学纯度的手性仲醇特别是(S)－芳香仲醇。
Description
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及由红酵母提取的含羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶的还原酶制剂的制备，及其用于羰基化合物还原制备相应光学活性手性仲醇的方法。
背景技术：
光学活性手性仲醇是很多医药、农药、香料以及其它精细化学品合成的重要中间体，其合成有多种方法，包括化学法催化手性仲醇的不对称合成以及生物催化的手性拆分或不对称合成。化学法催化酮的不对称还原合成光学活性手性仲醇，通常需要结构复杂的过渡金属配合物作为催化剂，催化剂价格昂贵，制备和回收比较困难、对环境有较严重的污染，其生产应用受到限制。生物法合成光学活性手性仲醇具有成本低、产品光学纯度高，无环境污染等独特优点，其研究、开发和应用备受国内外广泛关注。
目前生物催化法制备光学活性手性仲醇的途径主要有两种：一是通过脂肪酶催化对外消旋手性仲醇的对映体进行动力学拆分；二是通过还原酶催化对潜手性酮的羰基进行不对称还原。后一种途径，原料的原子利用率为100％，产物无需复杂的分离、纯化步骤，工艺简便，易于进行工业化生产。但该方法有一个比较大的缺点，酮的还原需要等当量的还原型辅酶(NADH或NADPH)，由于还原型辅酶价格昂贵，为降低合成成本，必须对辅酶进行原位再生和重复使用。辅酶的高效再生是生物催化还原中必须重点解决的技术问题。
用微生物整细胞作为催化剂，细胞内存在着完整的辅酶还原再生系统，在反应体系中添加适量的培养基碳源，如葡萄糖，即可实现辅酶的自身再生，生产成本低。尽管如此，用整细胞催化羰基化合物还原，由于细胞内酶的含量低，因此需要大量的催化剂，催化剂的质量可能达底物质量的几倍甚至几十倍。比如杨忠华等用酵母细胞催化4-氯苯乙酮的还原，底物浓度低于20mM(大约3g/L)，需要加入20g/L的酵母细胞，而产物得率仅33％[见《精细化工》，2007年24卷1期，63-66]。这种方法催化效率比较低下，并且大量细胞的存在给产品的提取、纯化造成一定的困难。
用分离提取的还原酶作为催化剂，通过其它的酶偶联催化可实现还原型辅酶的有效再生，工艺非常简便，催化效率较高[Appl.Microbiol.Biotechnol.，2007，76：237-248]。常用的辅酶再生用酶包括葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶等，但这些酶的价格比较贵，限制了其大规模工业应用。
我们在之前的研究中，发现红酵母CGMCC-1735(保藏于中国普通微生物保藏中心，专利保藏号：CGMCC 1735)可以催化羰基化合物还原合成光学活性手性仲醇[中国发明专利，公开号CN1869197A，公开日2006.11.29]。进一步研究发现，在红酵母CGMCC-1735细胞中除了羰基还原酶之外，还存在甘露醇脱氢酶，其中羰基还原酶以NADPH为辅酶，催化羰基底物脱氢生成光学活性手性仲醇；而甘露醇脱氢酶可以催化甘露醇脱氢生成果糖，以NADP+为辅酶，同时实现NADPH的再生，反应示意图如附图1所示。
发明内容：
为了能更经济地生产光学活性手性仲醇，本发明的目是提供一种用红酵母还原剂制剂制备光学活性手性仲醇的方法。
所述红酵母还原酶制剂，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。
所述红酵母还原酶制剂的制备；按照已申请的发明专利[中国发明专利，公开号CN1869197A，公开日2006.11.29]中的方法对红酵母CGMCC-1735进行发酵培养，离心收获细胞。将红酵母细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机进行细胞破碎，破碎液高速离心，取离心上清液，其中含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶两种组分，在离心上清液中加入硫酸铵进行蛋白质沉淀，收集35～90％硫酸铵浓度区间的蛋白质沉淀，对含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的蛋白质沉淀进行冷冻干燥，获得红酵母还原酶粗酶制剂；或者进一步对含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的硫酸铵沉淀蛋白质进行部分纯化，分离除去杂蛋白，合并含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的洗脱液，进行冷冻干燥，获得部分纯化红酵母还原酶制剂。通过上述两种方法获得的红酵母还原酶制剂均可用于催化酮的不对称还原，只是酶制剂中羰基还原酶和甘露醇脱氢酶含量不同，催化效率有-定差异。
用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法：
取一定量的羰基化合物、甘露醇、红酵母还原酶制剂以及辅酶加入缓冲液中，这里所说的羰基化合物选自苯环或甲基被取代的苯乙酮衍生物或乙酰吡啶衍生物，其结构通式为：R1COR2，其中R1代表-C6H5，-C6H4X或-C5NH5，R2代表-CH3，-CH2CH3，-C2H2X，-CH2CH2X，X代表-F，-Cl，-Br，-I，-OH，-NH2，-NO2或-N3，根据底物不同，其浓度为10~200mM；加入甘露醇的摩尔量与羰基化合物摩尔量的比例为(1～20)∶1，优选为(3～5)∶1；根据红酵母还原酶制剂中酶含量的不同，视酶制剂纯度不同，酶制剂的加入量为0.01％-10％(w/w)；加入的辅酶可以是还原型辅酶NADPH，也可以是氧化性辅酶NADP+，反应液中浓度为0.001～1.0mM，；缓冲液的pH值为7～11，最适范围为9～10。
将上述反应混合物在恒温环境中混合反应一段时间，反应温度为20～40℃，优选为25～35℃；反应结束后用有机溶剂萃取反应液中生成的产物，分离、收集含有目标产物的有机相溶剂，干燥后蒸发除去溶剂，即可获得目标产物。
采用本发明红酵母还原酶制剂催化羰基化合物的不对称还原，反应体系中只需加入催化量的NADP+或NADPH以及一定量廉价的甘露醇即可实现还原型辅酶NADPH的再生、循环使用，无须加入等剂量昂贵的还原型辅酶NADPH。催化剂易于制备，反应底物浓度高，产物提取简便，光学纯度高，具有较好的工业应用开发前景。
附图说明：
图1为红酵母制剂催化光学活性手性仲醇生产的示意图；
图2红酵母粗酶DEAE-Toyopearl阴离子柱层析洗脱图；
具体实施方式：
(一)红酵母还原酶制剂，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。
(二)以下是用红酵母还原酶制剂催化羰基化合物还原制备光学活性手性仲醇的实施例，用于说明本发明的方法，但并不限制本发明的内容和范围。
红酵母还原酶粗品制备的实施例
取240g红酵母湿细胞悬浮于2 L Tris-HCl缓冲液中，缓冲液浓度为50mM，pH为7.5，其中含有100mM NaCl。用高压均质机进行细胞破碎，破碎液高速离心，分离除去细胞碎片。将离心上清液冷却至4℃，缓慢搅拌，加入固体硫酸铵粉末进行蛋白质沉淀，收集35％～90％硫酸铵饱和度区间的蛋白质沉淀，冷冻干燥，获得红酵母还原酶粗酶制剂2.1g。
红酵母还原酶粗品的纯化实施例
如实施例1制备红酵母还原酶粗酶制剂，取0.5g粗酶制剂，溶解于20ml Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)中，用相同的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)透析除去硫酸铵，将透析后的酶液上样到DEAE-Toyopearl阴离子柱上，用含有连续梯度NaCl(0～1.0M)的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)进行洗脱，收集含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶活力的组分。红酵母粗酶部分纯化结果如图2所示，图中：◇280nm蛋白质吸光值；■甘露醇脱氢酶；▲羰基还原酶，由此可见，大部分杂蛋白被分离除去。将羰基还原酶和甘露醇脱氢酶组分混合，冷冻干燥，获得部分纯化红酵母还原酶制剂32mg。
用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法实施例1-8
取5mg红酵母还原酶粗酶制剂，加到1ml NaHC3-Na2CO3缓冲液(100mM，pH 9.0)中，加入不同浓度的各种底物，例如乙酰吡啶、苯环或甲基取代的苯乙酮衍生物，另外加入20μl浓度为10mM的NADPH溶液以及72mg甘露醇，在30℃恒温摇床上振摇反应。反应24h后用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液加入无水硫酸钠干燥后，通过气相色谱分析反应转化率以及产品的光学纯度。结果如表1所示。
表1红酵母粗酶制剂催化乙酰吡啶以及芳香酮不对称还原
用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法实施例9
取50mg红酵母还原酶粗酶制剂，加到10ml NaHCO3-Na2CO3缓冲液(100mM，pH 9.0)中，加入0.12g 2-乙酰吡啶(终浓度为100mM)，加入0.1ml浓度为10mM的NADP+溶液，加入0.9g甘露醇，在30℃恒温摇床上振摇反应，间歇取样，测定反应转化率。反应1h，转化率为17.1％，至24h，底物完全转化，分离获得产物(S)-2-吡啶-1-乙醇0.098g，光学纯度＞99％。
用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法实施例10
取10mg部分纯化红酵母还原酶制剂，加到50ml NaHCO3-Na2CO3缓冲液(100mM，pH9.0)中，加入0.605g 2-乙酰吡啶(终浓度为100mM)，加入1ml浓度为10mM的NADP+溶液，加入3.6g甘露醇，在30℃恒温摇床上振摇反应，间歇取样，测定反应转化率。反应1h，转化率为41.5％，至5h，底物已经完全还原转化。加入50ml乙酸乙酯萃取反应液中的产物(S)-2-吡啶-1-乙醇，静置分层，取出乙酸乙酯确机相，在水相中再次加入50ml乙酸乙酯进行萃取，如此重复4次。合并乙酸乙酯有机相，加入适量无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋转蒸发除去滤液中的乙酸乙酯，获得产物(S)-2-吡啶-1-乙醇粗品0.5g，光学纯度＞99％。
Claims (8)
1、一种用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，包括以下步骤：取一定质量的红酵母还原酶制剂溶解于适合的缓冲液中，加入羰基化合物、甘露醇和催化量的辅酶进行反应，生成光学活性的手性仲醇。
2、根据权利要求1所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：所述羰基化合物的结构通式为：R1COR2；其中R1代表-C6H5，-C6H4X，或者-C5NH5；R2代表-CH3，-CH2CH3，-CH2X，-CH2CH2X，X代表F，Cl，Br，I，OH，NH2，NO2，N3中的任一种。
3、根据权利要求2所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：羰基底物选自苯环或甲基被取代的苯乙酮衍生物或乙酰吡啶衍生物。
4、根据权利要求1所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：所述羰基底物的浓度为10～200mM；甘露醇与羰基底物的摩尔浓度比为(1～20)∶1。
5、根据权利要求4所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：甘露醇与羰基底物的摩尔浓度比为(3～5)∶1。
6、根据权利要求1所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：所加的辅酶是NADPH或者是NADP+，在反应液中其浓度为0.001～1.0mM。
7、根据权利要求1所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：反应温度为20～40℃；所说的缓冲液pH为7～11。
8、根据权利要求7所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其特征在于：反应温度为25～35℃；所说的缓冲液pH为9～10。
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