CN101319236A - 水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法 - Google Patents

Abstract

水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法，属于生物化工技术领域。本发明以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在水/离子液体两相体系中，以潜手性酮为底物还原制备相应手性醇：用出芽短梗霉CGM CCNo.1244催化4－氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)－4－氯－3－羟基丁酸乙酯，和葡萄汁酵母ATCC 26602催化4，4，4－三氟乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(R)－4，4，4－三氟－3－羟基丁酸乙酯。本发明的方法展示了离子液体无毒无味、不易挥发、生物相容性好、不污染环境、产物分离简单、回收容易可重复使用等优点。同时，本发明方法提高了反应产物的转化率、浓度和对映体过量值，加快了反应的进程。

Description

水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法

技术领域

水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法，属于生物化工技术领域。本发明涉及一种新的反应体系来有效地提高微生物细胞催化不对称还原反应制备手性醇，特别是催化制备卤代羟基丁酸酯的方法，具体地，在水/离子液体两相体系中用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCCNo.1244催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602催化4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

离子液体(Ionic liquids，ILs)是由带正电荷的离子和带负电荷的离子构成，它在-100℃至200℃之间均呈液体状态，因此也通常称之为室温离子液体。离子液体作为溶剂与催化剂引起人们的广泛兴趣。与典型的有机溶剂不同，离子液体一般不会成为蒸汽，所以在实验过程中不会产生对大气造成污染的有害气体，而且多数离子液体对水具有稳定性，容易在水相中制备得到，使用方便，离子液体可以反复多次使用。在化工生产过程中采用ILs，则可减少使用挥发性大的有机溶剂，降低对环境的污染，减少废物的产生。ILs研究的潜在价值已经得到了各国化学工作者的普遍认可。

有机相微生物细胞催化可以利用介质工程和催化剂工程等有效手段来实现催化反应的优化控制。但存在的问题：1)有机溶剂易造成环境污染；2)酶在极性有机溶剂中易失活；3)极性底物在非极性有机溶剂中溶解度很小。离子液体作为一种优良的溶剂取代有机溶剂，有以下优点：1)有助于提高立体选择性；2)操作上有很强的稳定性；3)可以反复利用，利于环保，节约成本；4)产物易分离。大部分的研究表明，生物催化剂在离子液中具有较高的活性、(立体、区域)选择性及稳定性。

离子液替代传统的有机溶剂作为绿色反应介质用于生物催化与生物转化，近年来才引起人们的重视。大部分的研究表明，生物催化剂在离子液中具有较高的活性、选择性及稳定性。离子液体在生物催化中的应用是一个崭新的研究领域，研究日渐深入广泛，相关报道越来越多。但关于离子液体中生物催化不对称还原方面的专利和文章报道却不多见。

已经有人报道了在离子液体和缓冲溶液双相体系中用脱氢还原酶催化立体选择性还原2-辛酮为2-辛醇，转化率接近100％，对映异构体过量值(e.e.值)＞99％，并显示脱氢还原酶在离子液体中有更好的稳定性(Eckstein M，等，Chem.Commun.2004：1084-1085)。还有以乳酸杆菌细胞为催化剂，在离子液体/水两相体系中还原4-氯苯乙酮制备手性芳香醇。在离子液体[Bmim]Tf₂N中的转化率及e.e.值分别达到92.8％和99.7％(Holger Pfruender，等Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，4529-4531)。国内也有报道以离子液体1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/水两相为反应体系，用酵母Candida Pseudotropicalis催化2’-氯-苯乙酮(2’-C1-AP)还原成S-2’-氯-苯乙醇(S-2’-C1-PE)，产物S-2’-氯-苯乙醇产率可达85.9％，e.e.值大于99.9％(胡佳斌等，化学反应工程与工艺.2007，23：207-211)。

本发明采用离子液体作为一种优良的溶剂替代传统的有机溶剂，在水/离子液体两相体系中用微生物整细胞催化不对称还原羰基化合物制备具有光学活性的卤代羟基酯。本发明结合发明人实验室研究非水相生物催化的优势，在原发明“生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯的菌种和方法”(孙志浩等CN1778889A)和“生物催化制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法”(孙志浩CN1948499A)的基础上，研究开发了“水/离子液体两相体系中微生物细胞催化不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯”和“水/离子液体两相体系中微生物细胞催化不对称还原4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯”的新方法。

4-氯-3-羟基丁酸酯(4-chloro-3-hydroxybutanoate esters，CHBE)是一种重要的有机中间体，分子中有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)和(S)-CHBE均是非常有前景的重要的手性砌块，还可经由氯基的置换、还原等反应，导入其他基团生成所需的手性药物中间体。如(R)-CHBE可用于合成L-肉碱、(-)-大内酰亚胺和(R)-γ-氨基-β-丁酸。还可以转化生成(+)-负霉素和手性2，5-环己二烯酮的合成子。另一方面(S)-CHBE也可用于很多活性药物的合成。它是对映体选择性合成一些重要手性药物如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键手性中间体，而且还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂。

(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯(Ehtyl(R)-4，4，4-trifluoro-3-hydroxybutanoate，简称为(R)-TFHBE)是一种合成氟代化合物的重要中间体，如它可以用于合成抗抑郁药单胺氧化酶-A抑制剂贝氟沙通(Befloxatone)，可以作为合成非天然氨基酸L-三氟苏氨酸和D-三氟苏氨酸的手性中间体，还可以用于合成多种三氟甲基化中间体，如三氟甲基-β-丁内酯和γ-戊内酯，以及三氟甘油酸乙酯等。

由于上述两种产品的潜手性底物(4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯(TFAAE)易合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获得相应手性醇是非常有效的制备途径，而且反应条件温和，产物不易被微生物代谢利用，用微生物细胞催化制备手性卤代羟基丁酸酯非常有利。目前所知上述两种底物还原制备手性醇的方法的成功途径是水/有机溶剂两相体系中微生物细胞催化不对称还原法(CN1778889A，CN1948499A)，但发现该方法中有底物对微生物细胞的毒性及在水/溶剂中的不稳定性问题，转化率和产物浓度不高，而且该方法所选择的有机相邻苯二甲酸二丁酯沸点高，分离回收困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的反应体系来有效地提高微生物细胞催化不对称还原反应制备手性醇，特别是催化制备卤代羟基丁酸酯的方法，具体地，在水/离子液体两相体系中利用微生物菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602催化4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯的不对称还原制备(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法。并以此获得高光学纯度、高反应产率、高产物浓度，同时简化产物分离提取方法。

本发明的技术方案：水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法，以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在水/离子液体两相体系中，以潜手性酮为底物还原制备相应手性醇，步骤如下：

步骤(1)：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602，分别进行常规培养、发酵，发酵液过滤得菌体，作为整细胞生物催化剂；

步骤(2)：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244的整细胞生物催化剂以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物，或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)ATCC 26602的整细胞生物催化剂以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯(TFAAE)为底物，用磷酸盐缓冲液与离子液体为两相体系进行转化反应，所用的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bmim]PF₆)，([bmim]PF₆)与缓冲溶液的体积比为0.2∶1～2∶1，底物浓度为10～100g/L；所述磷酸盐缓冲液为含5％葡萄糖的0.1mol/L、pH 6.6～7.0的磷酸钾缓冲溶液；

步骤(3)：酶转化反应：在反应体系中加入湿菌体，加入湿菌体量为50～200g/L，酶反应温度为20～35℃，酶转化时间为1～30小时，pH5.5～7.5；

步骤(4)：分批补料转化反应：在步骤(3)中每两小时一次加入10～100g/L的底物进行转化，连续4～6次，在线控制pH5.5～7.5；

步骤(5)：萃取、脱溶后得产物：转化液离心分离菌体，去除水相，离子液体相以异丙醇萃取产物，用异丙醇萃取三次，收集合并萃取液，蒸发回收溶剂异丙醇，剩余物为相应产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，或(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯；

步骤(6)：离子液体的回收使用：转化液离心分离菌体，去除水相，离子液体相以异丙醇萃取产物，分离收集离子液体，加碱调节pH，水洗至中性，活性炭脱色，水洗再干燥后得到回收的纯净离子液体，在步骤(2)中重复使用。

微生物菌种：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244，为发明人筛选并保藏于中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(www.im.ac.cn)，且已公开，公开号CN1778889A，公开日2006年5月31日。葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602，保藏于美国马里兰州洛克菲勒美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，(www.atcc.org)，公开出售。

步骤(1)微生物菌体的培养：

A)出芽短梗霉CGMCC No.1244的培养基和培养条件为：

麦芽糖5～50g/L，酵母浸膏10～50g/L，蛋白胨5～20g/L，硫酸铵1～10g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，硫酸镁0.1～1g/L，pH 4～9，温度20～40℃，培养1～5天。

B)葡萄汁酵母ATCC 26602的培养基和培养条件为：

乙酸钠10～100g/L，玉米浆10～100g/L，磷酸二氢钾1～10g/L，硫酸镁0.1～1g/L，pH 4～9，温度20～40℃，培养1～5天；

在反应过程中使用离子液体(ILs)，采用ILs是用来溶解产物、底物，以抑制底物、产物对菌体的毒性，同时提高产物转化率及光学纯度。离子液体除选用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bmim]PF₆)外，还可选用1-丁基-2、3-二甲基咪唑六氟磷酸盐([bmmim]PF₆)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([bmim]BF₄)，N-辛基吡啶四氟硼酸盐([opy]BF₄)，1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐([bmim]MeF₃)中之一种。所述离子液体购于河南利华制药有限公司、杭州科默化学有限公司。

产物的提取具体操作为：转化反应结束后，将反应液离心(8,000转/分钟、20分钟，4℃)，取出下层离子液体用等体积的异丙醇进行萃取三次，合并萃取液，再向其中加入1％～5％(w/v)的无水硫酸镁，搅匀后静置过夜，除去残留的水分。将离子液体过滤，除去无水硫酸镁。80℃下水浴旋转蒸发回收溶剂，得到油状液体产物，分别用GC分析测定，与标准品(Sigma Co.)图谱对照，确定为相同物质。

底物COBE和CHBE的浓度测定：采用VARIAN CP WAX 52CB极性色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，分析条件为气化室温度250℃，检测器温度250℃，柱温100℃保留2min，以8℃/min升温至240℃维持2min，载气为氢气，流速为2.0mL/min，分流比1∶50。

产物对映体过量值的测定：用手性色谱柱CP-Chirasil Dex CB(0.25mm×25m×0.25μm)。产品处理方法：取上层清液用乙酸乙酯萃取，得萃取液0.5mL，蒸发去除溶剂。然后，滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中保持1h，冷却后加5mL乙酸乙酯稀释。分析条件为气化室温度250℃，检测器温度250℃，柱温100℃保留2min，以2℃/min升温至130℃维持1min，再以5℃/min升温至180℃保留2min，载气为氢气，流速为2.0mL/min，分流比1∶50。

TFAAE和TFHBE的浓度测定：采用VARIAN CP WAX 52CB极性色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，分析条件为气化室温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以10℃/min升温至180℃保留5min，载气为氢气，流量为2.0mL/min，分流比1∶50。

产物对映体过量值的测定：用手性色谱柱CP-Chirasil Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)分离，分析条件为气化室温度250℃，检测器温度250℃，柱温100℃保留2min，以2℃/min升温至130℃维持1min，再以5℃/min升温至180℃保留2min，载气为氢气，流量为2.0mL/min，分流比1∶50。

本发明的有益效果：本发明选择一种新型两相体系用微生物整细胞催化不对称还原潜手性羰基酯化合物，在水/离子液体两相体系中不对称还原反应的产物浓度、转化率及光学纯度获得提高，如(S)-CBHE浓度可以达到75.1g/L(分批补料方法)，转化率96.5％，对映体过量值最高达到98.2％e.e.。(R)-TFHBE的浓度最高可以达到42.0g/L，转化率最高90.3％，对映体过量值最高为85.4％e.e.。本发明相比其它催化反应体系有以下优点：1)离子液体体系无毒无味，不易挥发，生物相容性好，不污染环境；2)离子液体体系中产物分离简单，离子液体本身回收容易，可以反复多次循环使用而对产物的转化率和对映体过量值没有明显影响；3)离子液体体系对提高产物浓度、转化率和光学纯度有促进作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1

离子液体的选择

A.出芽短梗霉CGMCC No.1244不对称还原COBE生成(S)-CBHE反应中离子液体的选择

斜面培养：培养基为100mL麦芽汁，其中加葡萄糖2g，琼脂2g，pH6.5，按通常方法121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却制斜面接种，30℃培养2天，作为斜面活化种子。

种子培养和发酵：培养基：麦芽糖30g/L，酵母浸膏20g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.7g/L，pH 6.0。装液量为500mL三角瓶装液80mL，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接斜面种子，180转/分钟摇床，30℃培养2天，作为种子或发酵酶液(整细胞催化剂)。

发酵酶液中湿菌体含量为2.5g/100mL，离心10分钟(8,000转/分钟)收集菌体，用磷酸钾缓冲液(0.1mol/L，pH6.6)清洗两次，将菌体转入10mL含葡萄糖的相同缓冲液中，与等体积的离子液体或有机溶剂(对比用)混合，同时加入35g/L底物COBE，于30℃，180转/分下反应8h。反应结束，离心除去菌体和水相，得到离子液体相或有机相(对比用)，离子液体用异丙醇萃取，分离收集萃取液，适量无水硫酸镁干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析。结果如表1：

表1出芽短梗霉CGMCC No.1244不对称还原COBE离子液体的选择

两相体系	转化率(％)	e.e.(％)
			水单相	35.9	96.1
水/邻苯二甲酸二丁酯	90..0	96.6
			水/正己烷	38.7	96.9
水/[bmim]PF6	94.2	96.6
			水/[bmmim]PF6	50.1	97.3
水/[bmim]BF4	32.0	97.3
			水/[opy]BF4	-	-
水/[bmim]MeF3	-	-

由表1可以看出水/[bmim]PF₆中出芽短梗霉CGMCC No.1244不对称还原COBE生成(S)-CBHE效果较好。

B.葡萄汁酵母ATCC 26602不对称还原TFAAE生成(R)-TFBHE反应中离子液体的选择

斜面培养：培养基为100mL麦芽汁，加葡萄糖2g，琼脂2g，pH6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接种，30℃培养2天，作为斜面活化种子。

种子培养和发酵：培养基：麦芽糖2g/L，酵母浸膏2g/L，蛋白胨0.5g/L，乙酸钠2g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.01g/L，pH 6。装液量为500mL三角瓶装液80mL，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接斜面种子，180转/分钟摇床，30℃培养2天，作为种子或发酵酶液。

发酵酶液中湿菌体含量为2.5g/100mL，离心10分钟(8,000转/分钟)收集菌体，用磷酸钾缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)清洗两次，将菌体转入10mL含葡萄糖的相同缓冲液中，与等体积的离子液体或有机溶剂(对比用)混合，同时加入30g/L底物TFAAE，于30℃，180转/分下反应8h。反应结束，离心除去菌体和水相，得到离子液体或有机相(对比用)，离子液体用异丙醇萃取，分离收集萃取液，适量无水硫酸镁干燥过夜，过滤后进行气相色谱分析。结果如表2：

表2葡萄汁酵母ATCC 26602不对称还原TFAAE中离子液体的选择

两相体系	转化率(％)	e.e.(％)
			水单相	56.7	80.4
水/邻苯二甲酸二丁酯	74.6	79.0
			水/正己烷	11.9	64.0
水/[bmim]PF6	77.9	83.5
			水/[bmmim]PF6	68.9	65.3
水/[bmim]BF4	62.4	67.9
			水/[opy]BF4	-	-
水/[bmim]MeF3	-	-

由表2可以看出葡萄汁酵母ATCC 26602也是在水/[bmim]PF₆中催化不对称还原TFAAE生成(R)-TFBHE的效果较好。

实施例2

不同相体积比对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

出芽短梗霉CGMCC No.1244或葡萄汁酵母ATCC 26602按实施例1方法产酶培养24h后，称取1g湿菌体加于150mL三角瓶装10mL 0.1mol/L，pH 6.6～7.0磷酸钾缓冲液中，含底物量为30g/L，分别添加不同相体积比的离子液体[bmim]PF₆，离子液体与缓冲液的体积比为1∶5，5∶5，10∶5，15∶5，20∶5，于30℃，180转/分下反应8h。反应结束后，反应液离心除去菌体与水相，得离子液体相，用等体积异丙醇萃取三次，合并萃取液，适量无水硫酸镁干燥，过滤后进行气相色谱分析，结果如表3：

表3相体积比对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

由表3可以看出，水/离子液体两相体系中，出芽短梗霉CGMCC No.1244或葡萄汁酵母ATCC 26602催化不对称还原反应，在离子液体与缓冲液相体积比为1∶1时转化率及对映体过量值获得较好结果。

实施例3

不同温度对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

出芽短梗霉CGMCC No.1244或葡萄汁酵母ATCC 26602按实施例1方法产酶培养24h后，称取1g湿菌体加于50mL三角瓶装5mL 0.1mol/L、pH 6.6～7.0磷酸钾缓冲液中，与等体积的离子液体[bmim]PF₆混合，含底物量为35g/L，分别考察不同温度下对转化反应的影响，在温度为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃下，180转/分下反应8h。反应结束后，反应液离心除去菌体与水相，得离子液体相，用等体积异丙醇萃取三次，合并萃取液，适量无水硫酸镁干燥，过滤后进行气相色谱分析，结果如表4：

表4不同温度对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

实施例4

不同底物浓度对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

出芽短梗霉CGMCC No.1244或葡萄汁酵母ATCC 26602按实施例1方法产酶培养24h后，称取1g湿菌体加于50mL三角瓶装5mL 0.1mol/L、pH6.6～7.0磷酸钾缓冲液中，与等体积的离子液体[bmim]PF₆混合，分别添加含底物量为25g/L，36g/L，49g/L，60g/L，72g/L，于30℃，180转/分下反应8h。反应结束后，反应液离心除去菌体与水相，得离子液体相，用等体积异丙醇萃取三次，合并萃取液，适量无水硫酸镁干燥，过滤后进行气相色谱分析，结果如表5：

表5不同底物浓度对水/离子液体两相体系中转化反应的影响

实施例5

水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原转化时间曲线

A.水/离子液体两相体系中出芽短梗霉CGMCC No.1244不对称还原COBE生成(S)-CBHE反应的转化时间曲线

出芽短梗霉CGMCC No.1244按实施例1A方法产酶培养，按实施例2～实施例4的优化条件，称取1g湿菌体加于50mL三角瓶装5mL 0.1mol/L、pH6.6磷酸钾缓冲液中，与等体积的离子液体[bmim]PF₆混合，添加49g/L的COBE，于30℃，180转/分下反应，不同时间取样。反应液离心除去菌体与水相，得离子液体相，用等体积异丙醇萃取三次，合并萃取液，适量无水硫酸镁干燥，过滤后进行气相色谱分析，结果如表6：

表6水/离子液体两相体系中CGMCC No.1244不对称还原反应的转化时间曲线

反应时间(h)	转化率％	e.e.％	(S)-CHBE浓度(g/L)
				0.25	11.8	97.5	5.8
0.5	25.4	96.8	12.4
				1	36.7	97.2	18.0
1.5	55.8	96.7	27.3
				2	66.8	96.6	32.7
3	87.7	97.4	43.0
				4	88.7	97.0	43.5
5	95.4	96.8	46.7
				6	93.1	97.4	45.6
7	92.9	97.6	45.5

B.水/离子液体两相体系中葡萄汁酵母ATCC 26602不对称还原TFAAE生成(R)-TFBHE反应的转化时间曲线

葡萄汁酵母ATCC 26602按实施例1B方法产酶培养，按实施例2～实施例4的优化条件，称取1g湿菌体加于50mL三角瓶装5mL 0.1mol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液中，与等体积的离子液体[bmim]PF₆混合，添加38g/L的TFAAE，于30℃，180转/分下反应，不同时间取样。反应液离心除去菌体与水相，得离子液体相，用等体积异丙醇萃取三次，合并萃取液，适量无水硫酸镁干燥，过滤后进行气相色谱分析，结果如表7：

表7水/离子液体体系中ATCC26602不对称还原反应的转化时间曲线

反应时间	转化率	e.e.％	(R)-TFBHE浓度(g/L)
				1	7.3	80.7	2.8
2	24.1	81.6	9.2
				3	36.6	78.8	13.9
4	54.5	79.0	20.7
				5	60.3	81.1	22.9
6	65.4	84.6	24.9
				7	68.1	84.9	25.9
8	72.0	84.6	27.4
				9	79.6	82.7	30.2
10	85.7	83.1	32.6
				11	85.4	79.4	32.5
12	85.2	81.0	32.4
				13	84.7	79.9	32.2
14	84.9	81.4	32.3
				15	84.2	78.8	32.0

实施例6

水/离子液体两相体系中分批补加底物的生物催化不对称还原转化反应

出芽短梗霉CGMCC No.1244按实施例1A方法产酶培养24h，按实施例5A方法进行转化，于0.1mol/L，pH6.6磷酸钾缓冲液20mL，加入4g湿菌体，分四次加入底物COBE，分别在0h，2h，6h，8h加入，每次加480mg(加入底物的总浓度为24g/L)。pH保持在5.5～7.5左右，反应每隔一定时间取样，进行气相色谱分析，结果如表8：

表8水/离子液体两相体系中分批补加底物的转化反应结果

反应时间	转化率	e.e.％	(S)-CHBE浓度(g/L)
				2	97.5	97.3	23.4
4	72.3	96.7	34.7
				6	95.4	97.7	45.8
7	84.3	98.2	60.7
				8	78.2	97.2	75.1
10	77.3	96.7	73.4
				12	73.7	97.5	70.8

实施例7

水/离子液体两相体系生物催化不对称还原反应的离子液体回收反复使用

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244按实施例1A方法产酶培养24h，按实施例5A方法进行转化，得到转化液离心分离菌体，去除水相，用两倍体积于离子液体的异丙醇量萃取其中的产物，萃取2～3次左右。分离取出离子液体相，向离子液体中加入碱化剂如氢氧化钠，氢氧化钾，氨水，碳酸钠等中一种或一种以上的混合物，使离子液体pH≥7；室温下搅拌混合液，使中和反应完全；静置分层，取离子液体相加水，水洗至中性；静置分层，用加热减压蒸馏使离子液体充分脱水，然后放入80℃干燥箱中干燥24h以上。离子液体的回收收率可达90％以上。烘干后的离子液体按实施例5A的方法进行转化，如此反复回收使用6次。结果如表9：

表9水/离子液体两相体系生物催化反应离子液体回收反复使用结果

使用次数	转化率	e.e.％
			1	96.7	97.2
2	95.4	98.4
			3	96.2	97.3
4	94.3	96.7
			5	94.6	97.7
6	92.1	96.4

Claims (1)

1.水/离子液体两相体系中生物催化不对称还原羰基化合物的方法，其特征是以选择性羰基还原酶产生菌为出发菌株，在水/离子液体两相体系中，以潜手性酮为底物还原制备相应手性醇，步骤如下：

步骤(1)：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602，分别进行常规培养、发酵，发酵液过滤得菌体，作为整细胞生物催化剂；

步骤(2)：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC No.1244的整细胞生物催化剂以4-氯乙酰乙酸乙酯COBE为底物，或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)ATCC 26602的整细胞生物催化剂以4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯TFAAE为底物，用磷酸盐缓冲液与离子液体为两相体系进行转化反应，所用的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[bmim]PF₆，[bmim]PF₆与缓冲溶液的体积比为0.2∶1～2∶1，底物浓度为10～100g/L；所述磷酸盐缓冲液为含5％葡萄糖的0.1mol/L、pH 6.6～7.0的磷酸钾缓冲溶液；

步骤(3)：酶转化反应：在反应体系中加入湿菌体，加入湿菌体量为50～200g/L，酶反应温度为20～35℃，酶转化时间为1～30小时，pH5.5～7.5；

步骤(4)：分批补料转化反应：在步骤(3)中每两小时一次加入10～100g/L的底物进行转化，连续4～6次，在线控制pH5.5～7.5；

步骤(5)：萃取、脱溶后得产物：转化液离心分离菌体，去除水相，离子液体相以异丙醇萃取产物，用异丙醇萃取三次，收集合并萃取液，蒸发回收溶剂异丙醇，剩余物为相应产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，或(R)-4，4，4-三氟-3-羟基丁酸乙酯；

步骤(6)：离子液体的回收使用：转化液离心分离菌体，去除水相，离子液体相以异丙醇萃取产物，分离收集离子液体，加碱调节pH，水洗至中性，活性炭脱色，水洗再干燥后得到回收的纯净离子液体，在步骤(2)中重复使用。