CN101255424B

CN101255424B - 与癫痫相关scn1a基因的启动子及其构建方法和临床应用

Info

Publication number: CN101255424B
Application number: CN 200710031681
Authority: CN
Inventors: 廖卫平; 龙跃生; 赵绮华; 蔡阳林; 石奕武; 易咏红; 曾扬
Original assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2027-11-26
Also published as: CN101255424A

Abstract

本发明涉及与癫痫相关的SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用，其特征是：1)基因启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)由核心启动子及其上游调控区序列和5’非翻译区外显子序列构成，其中，序列表中非划线部分为核心启动子及其上游调控区序列，划线部分为5’非翻译区外显子序列。其构建方法是：1)利用正常人的外周血制备基因组DNA，利用正常人海马组织及大脑皮质制备总RNA；2)准备好所需的菌株、细胞株及质粒；3)准备好所需的试剂及试剂盒，利用试剂抽提白细胞基因组DNA和脑组织总RNA；4)以序列表中SEQ ID №：2作为引物，进行PCR扩增，获得与癫痫相关的SCN1A基因启动子序列，并构建该启动子的表达载体。本发明可用于癫痫和其它神经系统疾病患者的SCN1A基因启动子及5’非翻译区所有外显子突变的功能鉴定，将在癫痫及其它神经系统疾病的临床检测中发挥重要作用。

Description

与癫痫相关SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用

技术领域

本发明涉及与癫痫相关的SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用，适用于癫痫及其它神经系统疾病的诊断。属于人体基因工程技术领域。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是大脑神经元突发性异常放电，导致反复发作的大脑功能障碍的一种慢性疾病。其发病率高，病程长，对家庭及社会的影响大。离子通道的活动是神经系统电兴奋性的基础。已有研究表明：基因突变后导致离子通道结构和功能的改变以及离子通道基因表达水平的异常改变在癫痫发生中起重要作用，其中电压依赖型钠通道在动作电位的产生和传播中起关键作用，因而成为近年来癫痫及其它神经系统疾病的基础研究和临床诊断的焦点。

目前已经发现许多编码I型电压依赖型钠通道d亚基(Na_V1.1)的SCN1A基因的突变位点与癫痫发生相关，许多全面性癫痫伴热性惊厥(GEFS+)及严重性婴儿肌阵挛(SMEI)患者的SCN1A基因不同位点发生错义突变、无义突变或缺失突变等。其中一半以上的SMEI突变位点导致蛋白质翻译时被剪切(Truncation)，成为无功能蛋白(Loss of function)，这表明SCN1A基因的表达水平下降与癫痫发病密切相关。小鼠的SCN1A基因单倍敲除实验也证实：SCN1A基因单倍表达不足(Haploinsufficiency)会导致癫痫发生。最新研究发现：SCN1A基因异常表达或突变会导致海马抑制性中间神经元的兴奋性下降，而不影响海马兴奋性锥体神经元的功能，从而推断这些异常导致海马回路的兴奋性增高，引起癫痫发作。

调节基因表达的机制比较复杂，有功能蛋白的合成要受mRNA转录、蛋白质翻译以及翻译后水平的加工、包装及运输等各个因素的影响，其中转录水平的调节是最为关键的环节，由于基因启动子是mRNA转录所必需的，并且它决定了基因表达的空间、时间和表达的强度等；因此，鉴定出SCN1A基因的启动子对于癫痫患者的临床诊断，指导癫痫的治疗具有重要价值。

发明内容

本发明的第一个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子。

本发明的第二个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法。

本发明的第三个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子的临床应用。

本发明的第一个目的可以通过采取如下措施达到：

与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：

1)基因启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)由核心启动子及其上游调控区序列和5’非翻译区外显子序列构成，其中，序列表中非划线部分为核心启动子及其上游调控区序列，划线部分为5’非翻译区外显子序列。

本发明的第一个目的还可以通过采取如下措施达到：

本发明的一种实施方式是：基因启动子的5’非翻译区由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子通过转录后加工，组成成熟mRNA的5’非翻译区；成熟mRNA的5’非翻译区的结构是：外显子大小分别为86bp，92bp和49bp，分布在第一个编码外显子上游75kb片段内，第一个非编码外显子与第二个非编码外显子相之间的内含子长约为71kb，第二个非编码外显子与第三个非编码外显子之间的内含子长约4kb，第三个非编码外显子紧邻第一个编码外显子。

本发明的一种实施方式是：能使荧光素酶报告基因在神经来源的成神经纤维瘤母细胞SH-SY5Y中表达，而在非神经来源的人胚肾293细胞HEK-293中没有表达，即该启动子包含了神经性细胞特异转录功能基序。

本发明的第二个目的可以采取如下措施达到：

与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法，其特征是：

1)利用正常人的外周血制备基因组DNA，利用正常人海马组织及大脑皮质制备总RNA；

2)准备好所需的菌株、细胞株及质粒；

3)准备好所需的试剂及试剂盒，利用试剂抽提白细胞基因组DNA和脑组织总RNA；

4)以序列表中SEQ ID №：2作为引物，进行PCR扩增，获得与癫痫相关的SCN1A基因启动子序列，并构建该启动子的表达载体。

本发明的第二个目的还可以通过采取如下措施达到：

如前所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子的制备方法，其特征是：

利用5’-Full RACE法获得SCN1A基因5’非翻译区全长；具体步骤如下：

1)采用TRIzol试剂从正常人海马组织和大脑皮质中分别提取总RNA，加DNase I消化去除残存的DNA；

2)用Tobacco Acid Pyrophosphatase即TAP去掉mRNA的5’帽子结构；

3)再用T4 RNA Ligase将5’-Full RACE Adaptor连接到mRNA的5’端后，用SCN1A基因特异性引物WP79逆转录合成cDNA第1链；

4)使用5’-Full RACE Adaptor上的外侧引物与SCN1A基因特异性的外侧引物WP79进行第一轮RT-PCR反应，再用5’-Full RACE Adaptor上的内侧引物与SCN1A基因特异性的内侧引物WP80进行第二轮RT-PCR反应，高特异性地扩增到SCN1A基因cDNA 5’末端的全长序列。

如前所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法，其特征是：

将基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接构成具有神经细胞来源的表达盒，该表达盒的构建步骤是：

1)提取正常人白细胞的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用引物WP119和WP109进行PCR扩增；

2)获取转录起始点及其上游2.5kb片段，再以该2.5kb的PCR片段及5’-Full RACE片段作为模板；

3)用2.5kb片段上游引物WP119和5’-RACE片段的下游引物WP108，进行融合PCR，获得2.7kb长的完整启动子片段；

4)该片段用KpnI和HindIII进行双酶切反应，酶切片段克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A-5U；

5)构建一个不含5’非翻译区的启动子表达载体，以2.7kb长的完整启动子片段作为模板，用引物WP119和WP106扩增，PCR片段经KpnI和HindIII双酶切后克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A。

本发明的第三个目的可以采取如下措施达到：

与癫痫相关的SCN1A基因的启动子的临床应用，其特征是：

将SCN1A基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接起来构建成具有神经细胞来源的高效特异地表达盒，可用于癫痫和其它神经系统疾病患者的SCN1A基因启动子及5’非翻译区所有外显子突变的功能鉴定，以及在癫痫及其它神经系统疾病的基因治疗。

与癫痫相关的SCN1A基因的启动子的临床应用，其特征是：

1)筛查癫痫患者SCN1A基因的启动子，具体步骤如下：

首先，提取癫痫的外周血基因组DNA作为PCR模板；

然后，以序列表中SEQ ID №：3作为引物，将SCN1A基因启动子区及5’非翻译区外显子分为7个片段进行PCR扩增；

2)采用仪器进行测序，所述仪器可以是3137型自动型测序仪；

3)采用常规生物学软件分析癫痫患者SCN1A基因启动子的序列与正常人的差异；

4)将该突变位点引入到SCN1A基因启动子表达载体，检测该突变对启动子功能的影响，分析其与疾病的关系。

本发明的有益效果是：

本发明是现有的单独存在的核心启动子及其上游调控区序列(序列表中SEQ ID №：1中非划线部分)与5’非翻译区外显子序列连接起来，构建成一个完整的有活性功能的基因启动子。经过反复试验证明，本发明的启动子序列能使荧光素酶报告基因在神经来源的成神经纤维瘤母细胞(SH-SY5Y)中表达，而在非神经来源的人胚肾293细胞(HEK-293)中没有表达，这说明该启动子包含了神经性细胞特异转录功能基序。在SH-SY5Y细胞中，SCN1A基因启动子所启动的荧光素酶报告基因表达水平与高效启动子SV40启动子的表达水平没有显著差异，比5’非翻译区外显子缺失的SCN1A基因启动子的表达水平显著增高(n＝20，P＜0.05)，说明5’非翻译区外显子具有增强启动子转录活性的功能。本发明所鉴定的启动子区能用于癫痫患者的临床筛查。本发明将SCN1A基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接起来构建成具有神经细胞来源的高效特异地表达盒，可用于癫痫和其它神经系统疾病患者的SCN1A基因启动子及5’非翻译区所有外显子突变的功能鉴定，同时还可携带治疗基因，将在癫痫及其它神经系统疾病的基因治疗中发挥重要作用。本发明具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为通过5’-Full RACE法获得正常人的海马及大脑皮质的RT-PCR片段。

M，DNA分子量标记；1，空白对照(以不加反转录酶的反转录产物作模板)；2，海马总RNA的RT-PCR；3，大脑皮质总RNA的RT-PCR；箭头表示目标片段。

图2为正常人的海马及大脑皮质的SCN1A基因5’非翻译区(5’-UTR)结构示意图。

图3a～图3e为SCN1A基因启动子(含5’非翻译区所有外显子序列)表达载体及其它载体的示意图。

图4为SCN1A基因启动子(含5’非翻译区所有外显子序列)及构建该启动子表达载体所需要的所有引物。

图5为荧光素酶报告基因分析SCN1A基因启动子(含和不含5’非翻译区所有外显子)指导的细胞特异性表达柱状图。

具体实施方式

【实验材料】

1、组织：正常人和癫痫患者外周血；正常人海马组织及大脑皮质。

2、菌株、细胞株及质粒：菌种：大肠杆菌TOP10为本实验室保存；细胞株：SH-SY5Y，HEK293(为美国ATCC公司产品)；质粒：pGL4.10 vector，pRL-TK vector，pGL4.13(为美国Promega公司)。

3、主要试剂及试剂盒：脑组织总RNA抽提试剂TRIzol为Invitrogen产品，白细胞基因组DNA抽提试剂盒为Qiagen公司产品，5’-Full RACE Kit为TaKaRa公司产品。

4、用于构建基因启动子表达载体的引物序列：

WP79：5’-TCCTGGTGGTACAAGCACTGTTTGC-3’

WP80：5’-CTGTTTGCTCCATCTTGTCATCCTGCAC-3’

WP106：5’-AAGAAGCTTTCTGGAGGAACAGTTCC-3’(HindIII)

WP107：5’-GAAACTCATGGAACTGTTCCTCCAGA-3’

WP108：5’-ATCAAGCTTCTTGTCATCCTGCACAT-3’(HindIII)

WP109：5’-GCTCAGCTTCCTCCAGCTTCCA-3’

WP119：5’-TAGGGTACCCAGTTATGACCCATAGGC-3’(KpnI)

5、用于临床诊断检测的引物序列：

FP1：5’-CTCATGGCACAGTTCCTGTATCAG-3’

RP1：5’-GTCTGGTTTGGGATTCTTTGCC-3’

FP2：5’-GTTGGAATCATACTGTATGTCCATTTTAG-3’

RP2：5’-AAGCAAAATGGTACAGCAACTTGG-3’

FP3：5’-GTCATGGTACAGGACTTTACTGATAGC-3’

RP3：5’-CTGCACCTCTCAGCATGACTGAC-3’

FP4：5’-CTGACATTTATCGGCAACCCAC-3’

RP4：5’-GTGGGAAGAATGACCAGAAGCAT-3’

FP5：5’-GGTTCCTTCTCTATTTCTGTTACCTCAG-3’

RP5：5’-GGATATCAAATTCAGAACGTGGTGG-3’

FP6：5’-CACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG-3’

RP6：5’-CCCAAATGTGTGCAATGCAAG-3’

FP7：5’-CATTCAGCAAACACTTATTGGAGGC-3’

RP7：5’-GCCTGACATAGAGGAAGAGGTGAGTG-3’

【实施例1】鉴定SCN1A基因的转录起始点及5’非翻译区

1、5’-FULL RACE法获得SCN1A基因5’非翻译区全长

5’-Full RACE获取转录起始点的操作过程参照TaKaRa生产的试剂盒(货号：D315)说明进行。采用TRIzol试剂从正常人海马组织和大脑皮质中分别提取总RNA，加DNase I消化去除残存的DNA；然后用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构；再用T4 RNA Ligase将5’-Full RACE Adaptor连接到mRNA的5’端后，用SCN1A基因特异性引物(WP79)逆转录合成cDNA第1链；使用5’-Full RACE Adaptor上的外侧引物与SCN1A基因特异性的外侧引物(WP79)进行第一轮RT-PCR反应，再用5’-Full RACE Adaptor上的内侧引物与SCN1A基因特异性的内侧引物(WP80)进行第二轮RT-PCR反应，高特异性地扩增到SCN1A基因cDNA 5’末端的全长序列(图1)。

2、序列比较法分析SCN1A基因5’非翻译区的结构

PCR产物经测序并在NCBI BLAST程序进行对比，发现SCN1A基因5’非翻译区分成三个外显子(图2)：大小分别为86bp，92bp和49bp，分布在第一个编码外显子上游75kb片段内，第一个非编码外显子与第二个非编码外显子相之间的内含子长约为71kb，而第二个非编码外显子与第三个非编码外显子之间的内含子长约4kb，第三个非编码外显子紧邻第一个编码外显子。SCN1A基因的转录起始点位于第一个编码外显子上游约75kb处，转录起始点附近存在一个转录起始子(其一致序列为：5’-YYCARR-3’)。

【实施例2】SCN1A基因启动子的构建及其活性鉴定

1、启动子表达盒相关载体的构建

为了研究SCN1A基因启动子的活性，提取正常人白细胞的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用引物WP119和WP109进行PCR扩增；获得转录起始点及其上游2.5kb片段，再以该2.5kb的PCR片段及5’-Full RACE片段作为模板，用2.5kb片段上游引物(WP119)和5’-Full RACE片段的下游引物(WP108)，进行融合PCR，获得2.7kb长的完整启动子片段；该片段用KpnI和HindIII进行双酶切反应，酶切片段克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A-5U(图3)。为了研究SCN1A基因5’非翻译区对表达活性的影响，构建一个不含5’非翻译区的启动子表达载体，以2.7kb长的完整启动子片段作为模板，用引物WP119和WP106扩增，PCR片段经KpnI和HindIII双酶切后克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A(如图3所示)。

2、SCN1A基因启动子的活性分析

(1)2.7kb启动子指导荧光素酶报告基因的细胞特异性表达

SH-SY5Y细胞在完全培养基(45％MEM+45％ F12+10％胎牛血清+10μg/ml链霉素)中贴壁生长，在5％CO2和37℃条件下培养；HEK-293细胞则用DMEM培养基(90％DMEM+10％胎牛血清+10μg/ml青霉素)培养。将生长良好的细胞接种于24孔培养板中，每孔加0.5ml培养液，将培养板转入CO2培养箱中培养，24小时后细胞汇合到50~80％可进行转染。转染时改用无酚红和血清的培养基培养10h后，将1μg待检测的质粒和0.1μg作为内标的pRL-TK质粒和1μl脂质体lipofectamine及4μl Plus(Invitrogen)混匀，室温放置15min形成DNA-lipofectamine复合体，用500μl无血清培养基稀释后添加到24孔板中。37℃培养5小时后换成正常含10％血清的培养基。48h后收集细胞，进行荧光素酶活性检测。用1ml的PBS缓冲液洗细胞三次，每孔加入100μl新鲜配制的细胞裂解液，室温下振摇15min，将细胞裂解液移至1.5ml离心管中，室温下12000rpm离心1min。取20μl的上清加入100μl荧光素酶反应底物温匀后，用发光计测定荧光素酶的发光值，然后加入100μl的反应终止液，测定作为内标的Renilla荧光素酶的发光值，两者的比值即为荧光素酶的相对活性。将2.7kb启动子所指导表达的荧光素酶的相对活性除以SV40启动子所指导表达的荧光素酶的相对活性即为SCN1A基因启动子相对于SV40启动子的活性，其数值为10-20次重复实验结果的平均值±标准差。

结果表明(图5示)：本发明的启动子序列能使荧光素酶报告基因在神经细胞来源的SH-SY5Y细胞中表达，其活性达到SV40启动子的85％；本发明的启动子在非神经细胞来源的HEK-293细胞中几乎没有活性，其活性仅为SV40启动子的5％。这表明本发明的启动子指导基因表达的活性具有神经来源细胞特异性。因此本发明的表达载体可应用于携带治疗基因，指导目的基因在特异地细胞中表达。以达到基因治疗的效果。同时SCN1A基因启动子序列也可应用于癫痫患者的临床筛查，并进一步进行突变启动子的功能鉴定，以证实患者的病因，从而指导临床用药。

(2)5’非翻译区外显子具有增强启动子活性的功能

质粒转染、双荧光素酶报告系统的检测及统计分析同步骤(1)。

结果如图5所示，移去5’非翻译区外显子的启动子在SH-SY5Y细胞中的活性仅为SV40的30％，为SCN1A基因完整启动子的25.5％，这说明5’非翻译区外显子含有增强启动子活性的序列。由此推断，SCN1A基因5’非翻译区外显子对于SCN1A基因的表达发挥重要作用。因此，5’非翻译区外显子及对mRNA剪接起重要作用的部分内含子序列也可应用于临床筛查，以期获得相关的致病突变。

【实施例3】癫痫患者SCN1A基因启动子区及5’非翻译区外显子区的筛查

提取患者外周血基因组DNA，将SCN1A基因启动子区及5’非翻译区外显子区分为7个片段进行PCR扩增，每个片段相互重叠150-200bp(以保证测序的完整性)。通过测序寻找患者SCN1A基因启动子的突变位点，并进一步通过定向诱变，将该突变位点引入到SCN1A基因启动子的表达载体，以证实该突变位点对启动子功能的影响，从而分析其与疾病的关系。

序列表

<110>广州医学院第二附属医院

<120>与癫痫相关的SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用

<160>3

<210>1

<211>2721

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

CAGTTATGACCCATAGGCTATAAGTTAAAATCTCTAGGGGGTTTGGGAAAGCTCTTGGAG 60

GAACCTGATTTAGCTGGCATGTGTCTTATGCCTTTTGGTCTTCCTATCCTTCTCCCTAGC 120

ATGTAGTTAGGATGCTGGAAGTGAGGCAGCCATCTCAAGACCATGAAGCAACAAATAGAA 180

GGATGAAAGTCACAAGCTGAGGATGTTTGAGAGGAAGAAAAATGAGCTTAGGCCTCTGAA 240

GACTGTGAAGTCCTACCTTCAGACTAATGTCACTTAAGAAAAACGAACTTCTATTTTGGT 300

TAAGTTAGTATATGTTTGATTATCTCTTACAAGCAGCCAAACCTATACCAAGTTGATCCA 360

ATTAGAAGAATGTGCCAAAAAAATCTTTTAACCGTTTCCAAACGTGCATTTCAGAAGCAT 420

TCATTTACTTTGGCAATTATTAAACTGATATATATTAGTAAAACATTTTTATACACTTCT 480

TAAAATGACTCCTCCAAATAACTCTACTAGGCCATACTCTATGCACTTCCTATACAGGGA 540

GGGACACATTATGAATACTTTTCATCCCTCCATTGATTCATTCAGCAAACACTTATTGGA 600

GGCCCAGAAAGCATTGTGCTAGGGGCAGGGATGCAAGAATGAAAAACACACACCTGATTA 660

CAAAAGGCTTAGTTTATTTGAAAAGAATAAGACAGAATATTTTTTAAAAACATTCTATTT 720

TCCAGTTCTTTGCTTCCTGAGGGTTGTTTGTTTCACATACATTAGCTCTCCAAGGGATAG 780

AGAAGCCTAGCACCATAATCAACATCAATAAAATAAAAGGATCTGAGCCAACAAATTGGT 840

GTACATAGCTTAATGTTCAGAACACAAATTCATCATTGAATATTTAATTAAATGTTGCAC 900

CAATGTGTTCATTACTGTTGTGAGAAATAACTGAAGAAAGTTTCTCATTCCAATCAGTAC 960

AGAACTTGTTTTTCCAAAATCAGACTACTGCTAAAAGCAGATATTTAGTACTACTCCACT 1020

TTTTTTTTCTGTCATTTGTATGATATAAAAAAATCACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG 1080

TATCAAAAGACAATTATTCATTGCAGTATAGCTGACAAAATAACAAGTTAGTGTCAGGAA 1140

AACCATTTTTCACTCACCTCTTCCTCTATGTCAGGCATATCATCTAACTTCTTTCTACCT 1200

CAGTTTCCTTATGAGTTAAGTAATGGGTTGGAATTAGATCACTGTGTTCCCTCATAGATC 1260

TAAATTCTCTTATTTCCTCACTCTACTTAGTGTGATGCATTAGCAGATAGGTTTCCCAGC 1320

TAAGAGCAGAACATTAAGATTATTTTTAAATGATGTGTGGTTCCTTCTCTATTTCTGTTA 1380

CCTCAGGAATTATACATATTAGCCAACAACTCATATCAAACCACAATTTTATATATAATT 1440

AAACAATATAATGTCATCTTTTATTAATAATACTATATCACCATACTCAAAATCAGAATA 1500

GAAGACTGGTTTTATTATTTCTAGCTTTTAAAAGCATAACTTGCATTGCACACATTTGGG 1560

ATAATTGAAAGAAAATTAGATGGAGTGTACATTGTTTTAAATTTGCTGTTCACATTATCC 1620

CCCAGATATCTAGGAGTAAGTCTAACACAGATTATCTCAAAAGCACAGCAATCCTCTTGC 1680

TCCATTATAAGAAATTATTTTCAGAGTCTAAAAGATTGATTATATGCAAAATCTGAAAGC 1740

TAAAATTAAGATCTTATTTTTCAGTATAGACAATAGAAGTAATTAATTAACACATCTGAC 1800

ATTTATCGGCAACCCACCATAGGCAGAGATCTGCTTTCTTATTAGTTGCATAAGATTTTC 1860

AGAAGTTGAAATACATTAAATACAACCAGTTTAACCCACCACGTTCTGAATTTGATATCC 1920

TATTACCTTGCTCACAAACAAGATCTTTAAGGAACATAAACACTCTTTACAAATCCTTTA 1980

GTTACCATCCTGCAAAACAACTCACACCCCCAATAATAATCTCATTACATATATACATAT 2040

TTCCCTCTACTCACCACAATGAGTTAAAGGTGGACAAAAGCCCTCGGTGACTGTCTTTGA 2100

GTTATTACTTTGCTTTACCATTTCCTTCCTTTTAGGTGTCATGGTACAGGACTTTACTGA 2160

TAGCAATTCATTCTTGTTAGGTTTACTGCAAACACCAAAAGAGGTGTCTTGCACTTGCTG 2220

GAAGACTTAGCTTTTATGCTTCTGGTCATTCTTCCCACAAAAAGAATGAGACCAGTTTCT 2280

GAGCTATTCTTAACTCGCCTTCCAAAATATTTCAAAAGAGGAAGACAAGAAAGACTTCAT 2340

GATTTCCATGCAAACTCCCAGCCTGCCTGGCTGCCTGCTGCTGCCAATACTTCTTGCTCT 2400

TGCTGGTGATGACATTCAGAGAGCTCCCCAGCACTGGTGCTTCGTTATGTAAGGCTGTCT 2460

AGGTCAAGTGTAGGAGACACACTGCTGGCCTGTGGAAACTCATGGAACTGTTCCTCCAGA 2520

TTAACACTTCAGGGGTTATGGAAGCTGGAGGAAGCTGAGCTTTTACTACATCTTTTGGGG 2580

GTTTGGGCAATTATGAATAAGGCTGCTGTATACATCCGTGTGCAGGATTTTGTGTGGACA 2640

TAAGTTTTCAACTCCTTTGGTTAAATCCTAAGAAATTTCATATGCAGAATAAATGGTAAT 2700

TAAAATGTGCAGGATGACAAG 2721

210>2

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为了构建启动子表达载体而设计的引物，用作PCR扩增。

<400>2

WP79：5’-TCCTGGTGGTACAAGCACTGTTTGC-3’；

WP80：5’-CTGTTTGCTCCATCTTGTCATCCTGCAC-3’；

WP106：5’-AAGAAGCTTTCTGGAGGAACAGTTCC-3’(Hind III)；

WP107：5’-GAAACTCATGGAACTGTTCCTCCAGA-3’；

WP108：5’-ATCAAGCTTCTTGTCATCCTGCACAT-3’(Hind III)；

WP109：5’-GCTCAGCTTCCTCCAGCTTCCA-3’；

WP119：5’-TAGGGTACCCAGTTATGACCCATAGGC-3’(Kpn I)

<210>3

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为了诊断检测而设计的引物，用作PCR扩增。

<400>3

FP1：5’-CTCATGGCACAGTTCCTGTATCAG-3’

RP1：5’-GTCTGGTTTGGGATTCTTTGCC-3’

FP2：5’-GTTGGAATCATACTGTATGTCCATTTTAG-3’

RP2：5’-AAGCAAAATGGTACAGCAACTTGG-3’

FP3：5’-GTCATGGTACAGGACTTTACTGATAGC-3’

RP3：5’-CTGCACCTCTCAGCATGACTGAC-3’

FP4：5’-CTGACATTTATCGGCAACCCAC-3’

RP4：5’-GTGGGAAGAATGACCAGAAGCAT-3’

FP5：5’-GGTTCCTTCTCTATTTCTGTTACCTCAG-3’

RP5：5’-GGATATCAAATTCAGAACGTGGTGG-3’

FP6：5’-CACTGTACATCAAGCCTTTACTCCAG-3’

RP6：5’-CCCAAATGTGTGCAATGCAAG-3’

FP7：5’-CATTCAGCAAACACTTATTGGAGGC-3’

RP7：5’-GCCTGACATAGAGGAAGAGGTGAGTG-3’

Claims

1.与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：

1）基因启动子的核苷酸序列为序列表中 SEQ ID №：1的DNA序列；

2）由核心启动子及其上游调控区序列和5’非翻译区外显子序列构成，其中，序列表中 SEQ ID №：1的DNA序列的非划线部分为核心启动子及其上游调控区序列，序列表中 SEQ ID №：1的DNA序列的划线部分为5’非翻译区外显子序列。

2.如权利要求1所述与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：5’非翻译区由三个外显子构成，三个外显子通过转录后加工组成成熟mRNA的5’非翻译区；外显子大小分别为86 bp, 92 bp和49 bp，分布在第一个编码外显子上游75 kb片段内，第一个非编码外显子与第二个非编码外显子相之间的内含子长约为71 kb，第二个非编码外显子与第三个非编码外显子之间的内含子长约4 kb，第三个非编码外显子紧邻第一个编码外显子。

3.如权利要求1所述与癫痫相关的SCN1A基因启动子的应用，其特征是：将SCN1A基因启动子构建成具有神经细胞来源的高效特异表达盒。