CN104593418A - 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于一种产生人源化大鼠药物评价动物模型的建立方法，本发明利用CRISPR/Cas9基因敲除技术通过显微注射的方法获得敲除多药耐药基因1(Abcb1)的基因工程大鼠，同时利用大片段转基因技术将包含人源Abcb1启动子和cDNA的153kb细菌人工染色体(BAC)片断通过显微注射的方法转入到大鼠基因组，得到稳定表达人Abcb1的转基因大鼠，将这两种大鼠杂交建立了人源化Abcb1大鼠药物评价动物模型。经过RT-PCR分析发现人源化Abcb1大鼠的Abcb1表达谱与大鼠内源Abcb1有明显的区别。本发明的有益效果在于获得一种可以表达人源Abcb1的人源化大鼠，这种大鼠不仅表达人源Abcb1基因，在表达谱方面也与人类更接近，该模型能很好地用于新开发药物的药效评价。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法。
背景技术
在平均1万至2万5千个独立化合物中才能够产生一个创新药物，成本高达10-17亿美元。导致大批先导化合物被淘汰和候选药物研发中止的原因中除了药效学不显著外，接近50％的药物研发中止归因于药物毒性作用，由于药物对患者的毒性从市场收回药物的事件也曾出不穷，不仅造成巨大的经济损失，也导致生命的损失。因此，国际制药界一直在研究在新药研发的早期阶段对新化学物进行毒性筛选的准确可靠、快速灵敏的方法体系，从而及时发现和淘汰有潜在毒性的化学物或化学结构，尽可能缩短新药研发的时间并减少成本和风险。
现在的毒性检测体系，包括对药物毒性的监测技术、细胞模型和动物模型对药物的毒性预测并不理想。这也是目前国际制药界毒性预测面临的困境之一。在动物模型方面，主要是由于动物在药物吸收、转运、代谢、清除等过程的基因与人类的种属差异，包括基因结构、表达谱、调控，以及基因数目的不同等造成的对药物毒性反应的差异。例如，曲格列酮(Troglitazone)为治疗糖尿病的口服药，动物实验结果十分理想。然而，在进入市场之后FDA很快收到多例肝毒性临床报告。该药被FDA于2000年3月撤出市场，目前仅仅在研究领域作为试验用阳性药。在2005-2010六年间，由于患者使用中的肝、肾、神经、心脏等毒性被撤回典型药物就有10起以上，不经造成了巨大的经济损失，也有生命的损失。
所以，用人类的药物吸收、转运、代谢、清除等过程的基因替代动物的对应基因，建立基因结构、表达谱和调节方式与人类相似的模型，即人源化动物模型，是解决这一问题的有效途径之一。对缩短新药研发的时间并减少成本和风险具有重要的意义。
药物相关的基因可分为药物代谢相关的酶，药物结合相关的受体、药物转运相关的膜通道，信号传导等相关基因100余种。国外一些药物公司已经开始人类药物相关基因人源化小鼠的研究，研制了CYP3ACluster，CAR，AHR等十余种药物基因人源化小鼠，并应用于药物代谢和安全评价的研究。目前这些人源化小鼠的专利都在国外一些药物公司手中，限制了我国医药研究机构的使用。另外，小鼠不是CFDA认可的药物评价动物，在表达谱的差异和基因调控方面仍然与人类有较大的差异。从药物评价的科学意义上，建大鼠等CFDA规定的人源化模型，有更广阔的需求。且随着TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑技术的成熟，基因组修饰不再依赖胚胎干细胞的基因打靶，使大鼠的人源化成为可能。大鼠再次成为生物医药研究的“宠儿”，欧美等国正在运作大规模大鼠模型资源研究，企图抢占大鼠模型的知识产权和控制由此带动的医药创新成果。
P-糖蛋白是一种相对分子量为170 000的单链跨膜糖蛋白，由多药耐药基因Abcb1(又称Mdr1)编码，最早发现于肿瘤细胞中，但随后的研究表明其广泛存在于机体的各个组织，参与药物吸收、分布、代谢及排泄等过程。P-糖蛋白能利用机体中的ATP将已进入细胞的外源性的药物毒物转运出来，降低细胞内药物毒物浓度。在生理状态下，P-糖蛋白的存在可保护机体安全，而在病理情况下，P-糖蛋白于血脑屏障的表达使得药物不能进入中枢神经系统，于肿瘤细胞中的表达致机体产生多药耐药现象，从而影响了疾病的治疗，所以控制P-糖蛋白表达的Abcb1基因与多种药物有效性和安全性相关。因此构建Abcb1基因人源化大鼠模型能很好地用于新开发药物的剂量选择和药效评价。
发明内容
本发明的目的是提供一种Abcb1基因人源化大鼠模型的构建方法。
本发明的关键在于分别利用CRISPR/Cas9基因敲除技术制备大鼠基因敲除、利用BAC大片断转基因技术构建转基因大鼠模型。
该人源化大鼠的制备方法包括下列步骤：
一：含人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA及其上下游的调控序列克隆到细菌人工染色体BAC的构建；
二：显微注射大鼠雄原核，得到阳性含人类Abcb1转基因大鼠，其包含人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA及其上下游的调控序列，命名为hAbcb1-BAC阳性大鼠；
三：用于制作Abcb1基因敲除大鼠的sgRNA质粒构建；
四：将sgRNA和Cas9 mRNA混合注射SD大鼠雄原核，得到阳性Abcb1基因基因敲除大鼠，命名为rAbcb1基因敲除大鼠；
五：将rAbcb1基因敲除大鼠雌雄互交获得rAbcb1基因敲除纯合子大鼠；
六：将hAbcb1-BAC阳性大鼠与rAbcb1基因敲除大鼠之间杂交可以得到BAC阳性且rAbcb1基因敲除杂合子大鼠；
七：将BAC阳性且rAbcb1基因敲除杂合子大鼠与rAbcb1基因敲除纯合子大鼠进行杂交，即可获得hAbcb1-BAC阳性且rAbcb1基因敲除纯合子大鼠。这种大鼠体内在基因水平上缺乏了自身Abcb1基因的表达，同时，它也携带了通过BAC技术得到的人类的Abcb1基因，即Abcb1人源化大鼠。
附图说明
图1为BAC-Abcb1细菌人工染色体的结构图。
图2为表达人的Abcb1的转基因大鼠PCR鉴定电泳图。M：Marker DL2000(Takara)；H：DNA模板为水；W：DNA模板为野生对照基因组DNA；1-15为F0代大鼠编号。
图3为Abcb1基因敲除大鼠PCR鉴定电泳图。M：Marker DL2000(Takara)；H：DNA模板为水；W：DNA模板为野生对照组基因组；1-12为通过显微注射产生的F0代大鼠编号。
图4为Abcb1基因人源化大鼠的PCR鉴定电泳图。P：DNA模板为阳性对照品。1-6：由BAC-Abcb1大鼠与Abcb1 b敲除大鼠杂交产生的子代。A：2、4、6为转基因阳性鼠；1、3、5号为转基因阴性鼠。B.1、2号为野生型大鼠；3、4号为Abcb1b基因敲除杂合子大鼠；5、6号为Abcb1b基因敲除纯合子大鼠。6号为Abcb1人源化大鼠。
图5为野生型大鼠和人源化大鼠不同组织中鼠源及人源Abcb1 m RNA表达水平。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：表达Abcb1的细菌人工染色体的转基因大鼠的制作
将人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA(4718bp)及其上下游的调控序列(上游长度为66kbp，ATG下游长度为87kbp)，克隆到细菌人工染色体BAC中，完成了表达Abcb1的BAC表达载体。将构建好的载体经过酚氯仿方法抽提后，调整浓度至1-2ng/μl，利用显微注射技术将BAC注射到SD大鼠的受精卵中，用SD大鼠作为假孕受体大鼠，制备转基因大鼠。共获得15只F0代大鼠，提取出生大鼠的基因组DNA，为检测其完整性，使用三对PCR引物分别对插入BAC的上中下游进行完整性检测，分别为：Abcb1-BAC-F1：5'-CACCAGTAAGAGCGTTGA-3'下游Abcb 1-BAC-R 1：5'-GCTGCTGGTGCTGATTGT-3'Abcb1-BAC-F2：5'-CCAAATGCTGCTCAAG-3'下游Abcb 1-BAC-R2：5'-GAGTTTATGCCACCAAGTAG-3'Abcb1-BAC-F3：5'-AGTGGTTTCAGAATGGC-3'下游Abcb 1-BAC-R3：5'-GTCAGTTACAGTAAATGGG-3'。PCR反应体系20μl。反应条件：95℃5min；(95℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环)；72℃10mins；4℃保温。扩增片段大小分别为316bp，449bp，410bp。通过鉴定，共获得4只能够表达全长的转基因大鼠通过随后将这4个首建鼠与野生型交配，分析其传代情况，发现F10不能传代，2，5，8片段完整且能稳定传代。
实施例2：Abcb1基因敲除大鼠的制作
用于Abcb1基因打靶的gRNA质粒构建：针对Abcb1基因设计了一个靶点GGAGACAAATACACAAGATT，合成一对寡聚核苷酸链(TAGGAGACAAATACACAAGATT和AAACAATCTTGTGTATTTGTCT；用于制备sgRNA.合成的寡聚核苷酸经退火(97℃6mins后自然降至室温)，连入经Bsa I酶切回收的pUC57-sg RNA表达载体，构建sgRNA表达载体。通过测序验证连入片段是否正确，选择正确的克隆，扩大培养后准备用于后期体外转录。
体外转录：Cas9表达质粒，经Age I酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。Cas9 mRNA的合成由试剂盒T7Ultra Kit(Amibion，AM1345)在体外作用T7 RNA聚合酶完成。sgRNA的表达载体经DraI酶切线性化后，经酚氯仿抽提纯化，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。sgRNA的体外合成由试剂盒MEGAshortscript Kit(Ambion，AMI354)在体外利用T7 RNA聚合酶完成。
Cas9/sgRNA的原核注射：转录好的Cas9 mRNA和sgRNA混合并且调整浓度至10 ng/μl和5ng/μl/sgRNA，显微注射法将RNA混合物注射到SD大鼠的受精卵的雄性核和细胞质中，用SD大鼠作为假孕受体大鼠，通过显微注射得到了12个只大鼠，通过基因型鉴定，从图中可以看出1，5，9三只大鼠与野生型条带相比存在明显差异。随后我们对12只大鼠靶点扩增产物进行分析，通过TA克隆、测序最后确定了CRISPR/Cas9对Abcb1造成的基因修饰情况。
实施例3：人源化Abcb1大鼠的培育
通过将得到的rAbcb1基因敲除大鼠之间杂交可以获得rAbcb1基因敲除纯合子大鼠，通过将hAbcb1-BAC阳性大鼠与rAbcb1基因敲除大鼠之间杂交可以得到BAC阳性且rAbcb1基因敲除杂合子大鼠，再通过将这种品系大鼠与rAbcb1基因敲除纯合子大鼠进行杂交，即可获得hAbcb1-BAC阳性且rAbcb1基因敲除纯合子大鼠。这种大鼠体内在基因水平上缺乏了自身Abcb1基因的表达，同时，它也携带了通过BAC技术得到的人类的Abcbl基因。
实施例4：Abcb1人源化大鼠的表达情况分析
基因型鉴定阳性的大鼠，通过与野生型交配，对其子代的基因传代情况和表达情况进行分析。颈椎脱臼法牺牲大鼠，提取三只F1代大鼠(由各首建鼠与野生型杂交所得的阳性鼠)及野生对照大鼠大鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺、脑组织的总RNA。提取的总RNA利用逆转录试剂盒(Life Technologies)逆转录成cDNA，利用引物RT-Abcb1-F：5'-GGCTATCATTACTCTTTACCTGTGAAG-3'和RT-Abcb1-R：5’-CCGGATTGACTGAATGCTG-3'扩增大小为225bp的目的片段，PCR反应体系20μl。反应条件：95℃5min；(95℃30s，62℃30s，72℃30s，24个循环)；72℃10mins；4℃保温。GAPDH作为内参，确定Abcb1在五种组织中的表达情况。
Claims (5)
1.用于制备稳定表达人Abcb1转基因大鼠所需的细菌人工染色体BAC表达载体。
2.根据权利要求1的表达载体构建体，其中基因组序列包含人类Abcb1基因的最长剪接体cDNA。
3.根据权利要求1的表达载体构建体，其中基因组序列包含人类Abcb1基因上游调控区，启动子区和下游的调控区。
4.用于制备敲除Abcb1的基因敲除大鼠所需的sgRNA表达载体，其特征在于出发质粒为PUC57。
5.根据权利要求4的载体构建体，其特征在于其中包含如下两条sgRNA序列：TAGGAGACAAATACACAAGATT和AAACAATCTTGTGTATTTGTCT。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150506 |