CN101255403A - 一株吡啶降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株吡啶降解菌及其应用。该吡啶降解菌为Shinella zoogloeoidesBC026 CGMCC №.2224。利用本发明的Shinella zoogloeoides BC026用于污水体系中吡啶的降解，不仅具有很高的降解效率，同时本发明的Shinella zoogloeoides BC026为具有自絮凝的特性，污水处理中可发挥重要的作用，增强系统的耐冲击性。

Description

一株吡啶降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株吡啶降解菌及其应用。

背景技术

吡啶在常温下是一种无色有刺激性气味的液体，是目前杂环芳烃中开发应用范围最广的品种之一。吡啶有毒，致癌、致畸、致突变，且易在生物体内富集。可通过吸入、摄取或皮肤接触对人体产生危害，能麻醉中枢神经系统，对眼及上呼吸道有刺激作用。长期吸入出现头晕、头痛、失眠、步态不稳及消化道功能紊乱，可发生肝肾损害，引起皮炎。吡啶是一种良好的溶剂，在工业上可用作变性剂、助染剂，以及其它一系列产品，包括农药、医药、染料、日用化工、香料、饲料添加剂、橡胶助剂等的合成起始物。很多工业废水中都含吡啶，如焦化废水、染料废水、制药废水等。

焦化废水等含吡啶工业废水的处理方法一般有物化法、高级氧化法和生物法。相比而言，生物法处理量大，成本低，条件温和，不需要特殊的仪器设备，具有降解彻底和不产生二次污染的优点，是最经济实用的污染处理方法。然而传统的生物处理技术很难达到处理效果，已不能满足环保需求。20世纪70年代出现的生物强化技术可以在不改变现有处理设施的基础上，大大提高污水处理的范围和能力，因而近年来受到了广泛的关注。

生物强化技术是通过向废水处理系统中投加从自然环境中筛选出来的高效降解菌或者经过基因重组而得到的基因工程菌，去除某种或某几种污染物，以增强废水处理系统的处理能力、提高处理效率。用生物强化法处理含吡啶废水有诸多优势，已成为研究的热点。

生物强化技术的核心是所投加的具有高效降解特性的微生物。人们已经分离出了很多吡啶降解菌株，其中大部分是细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、戈登氏菌(Gordonia nitida)芽孢杆菌(Bacillus)等，也有放线菌和真菌，例如嗜盐放线菌(Nocardioides sp.)和白腐真菌。这些研究大多停留在实验室阶段，由于水质水力条件及土著菌的竞争等各种原因，一些生物强化系统实际应用效果不理想。因此开发有利于污水处理实际应用的降解菌株及其使用方法十分必要。本发明的高效降解菌株提取自焦化废水，因此在实际应用中可较好适应废水处理运行模式。

国际上对Shinella zoogloeoides菌的研究很少，目前未见其降解吡啶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株吡啶降解菌及其应用。

本发明所提供的吡啶降解菌为Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224。

所述Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224来源于首钢焦化厂污水处理系统二沉池回流污泥，经驯化、分离、纯化得到。该菌株是阴性革兰氏杆菌，好氧，有运动性，在固体培养基中是黄褐色、表面光滑的圆形小菌落，在液体培养基中有自絮凝现象。Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、壮观霉素有抗性，对氯霉素、四环素、头孢敏感。在阿须贝无氮培养基中生长良好，携带有两个大质粒。Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224的16SrRNA序列如序列表中序列1所示。

所述Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224，已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.2224。

本发明的Shinella zoogloeoides BC026可用于污水体系中吡啶的降解，具体方法可为将Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC№.2224悬浮于含有吡啶和/或其衍生物的污水中，在20-35℃，pH值为5-9的条件下培养。

所述Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224在污水中培养的温度优选为30-35℃，最佳为30℃，pH值条件优选为pH7-pH8，最佳为pH8。

以上述Shinella zoogloeoides BC026为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。

本发明的Shinella zoogloeoides BC026，当投菌量为0.1g/L时，在30℃，180r/min，pH值为7的条件下，BC026菌可以在17h内将浓度为400mg/L的吡啶完全降解。在吡啶初始浓度为99～1806mg/L的无机盐培养基中，BC026菌均能保持较高的降解活性；降解最适温度为30℃，最适pH值为8。由氮转化实验推测，BC026菌降解吡啶的第一步是断开两条C-N链，生成氨氮和戊二醛，随后戊二醛被氧化为戊二酸，并最终转化为二氧化碳和水。整个降解过程中吡啶约有50％的氮转化成氨氮。

利用本发明的Shinella zoogloeoides BC026用于污水体系中吡啶的降解，不仅具有很高的降解效率，同时本发明的Shinella zoogloeoides BC026为具有自絮凝的特性，污水处理中可发挥重要的作用，增强系统的耐冲击性。

本发明的Shinella zoogloeoides BC026取自于废水处理单元，是废水处理系统中的优势菌种，能适应复杂的实际条件，因而该菌株的应用前景广阔。本发明的Shinellazoogloeoides BC026携带两个大质粒，可能编码吡啶降解基因，为以后基因工程菌的构造创造了条件。

附图说明

图1为BC026扫描电镜照片。

图2为BC026菌对吡啶的生物降解。

图3为BC026菌对不同浓度吡啶的降解情况。

图4为不同温度下吡啶的降解特性研究。

图5为不同pH下BC026菌对吡啶的生物降解特性。

图6为BC026菌降解过程中吡啶与氨氮的浓度变化。

图7为BC026菌对吡啶的可能代谢途径。

图8为BC026质粒电泳图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、Shinella zoogloeoides BC026的分离、纯化及其鉴定

1、Shinella zoogloeoides BC026的分离及纯化

Shinella zoogloeoides BC026是从首钢焦化厂污水处理系统二沉池的活性污泥中取样，经过驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

取首钢焦化厂废水处理系统二沉池回流污泥。在装有污泥样本的容器中滴加少量吡啶溶液(使吡啶浓度保持100-200mg/L)，间歇曝气，定期加入10mL吡啶(300mg/L)、以及50mL原焦化废水，同时加入2mL磷酸盐缓冲液(每L含8.5g KH₂PO₄，21.75gK₂HPO₄，33.4gNa₂HPO₄·7H₂O，1.7gNH₄Cl，pH为7.2)以及2mL微量元素溶液(每L含1.5g FeCl₃·6H₂O，0.024gNiCl₂·6H₂O，0.19g CoCl₂·6H₂O，0.002gCuCl₂·2H₂O，0.024g Na₂MoO₄·2H₂O，0.07g ZnCl₂，0.006g H₃BO₃)，驯化60天。

取200mL上述驯化得到的培养液于三角瓶中，加入2滴0.01％的焦磷酸钠溶液及数粒玻璃微珠，在30℃，180r/min的摇床中震荡30min充分摇匀，然后离心。将沉淀转移到100mL含500mg/L吡啶的无机盐培养基(每L中含：Na₂HPO₄·12H₂O 1.42g、KH₂PO₄1.36g、MgSO₄·7H₂O 0.216g、CaCl₂0.006g、MnSO₄·H₂O 1.69g、CoCl₂·6H₂O0.00024g、H₃BO₃0.00116g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.000024g、FeSO₄·7H₂O 0.00278g、ZnSO₄·7H₂O 0.00115g、CuSO₄·5H₂O 0.00038g)中培养，30℃，摇床180r/min培养，约4天后，取5mL菌液在无机盐培养基中相同条件下转接培养两次。此时，用灭菌去离子水将菌液稀释10^-1到10^-7倍，各取0.1mL稀释液于无机盐固体培养基(上述无机盐液体培养基中加入2％琼脂而制得)平板中涂布分离，30℃培养，长出明显菌落后，挑取有代表性的单菌落，划线分离纯化。得到7株可以在无机盐固体培养基上生长的菌株，将这些菌株的LB培养液于-70℃保存在终浓度为15％的甘油中，分别给以编号。

通过观察菌的生长速率及检测吡啶降解情况，确定一株菌株(BC026)降解吡啶的能力最强，同时该株菌在液体培养中有自絮凝的特性(菌株培养后肉眼可观察到培养液中出现絮状菌团)，这种特性将有助于其在污水处理系统中形成菌胶团，增强生物处理系统的耐冲击性，因而该菌具有较高研究价值。

BC026液体培养条件是：在250mL锥形瓶中加入100mL培养基，以500mg/L吡啶作为唯一的碳、氮源，摇床设为30℃，180r/min。LB培养基中加入500mg/L吡啶，保持细菌降解活力，防止杂菌侵入。通过离心收集菌体，离心条件为4000r/min，10min。

该BC026菌株是阴性革兰氏杆菌，好氧，有运动性，在固体培养基中是黄褐色、表面光滑的圆形小菌落，在液体培养基中有自絮凝现象。该菌对氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、壮观霉素有抗性，对氯霉素、四环素、头孢敏感。在阿须贝无氮培养基中生长良好。BC026的扫描电镜照片如图1所示。

将该BC026菌株送交微生物所进行的生理生化特征鉴定，鉴定结果如表1所示。

表1.BC026菌株的生理生化特征

实验项目	结果	实验项目	结果	实验项目	结果	实验项目	结果
								细胞形态	杆状	革兰氏染色	阴性
对照	-	D-蜜二糖	-	p-苯乙醇酸	-	L-组氨酸	+
								a-环糊精	-	甲基葡糖苷	-	衣康酸	-	羟基脯氨酸	+
糊精	+	D-阿洛酮糖	+	a-氯代丁酸	+	L-亮氨酸	-
								糖原	+	D-棉子糖	-	a-氯代戊二酸	-	L-鸟氨酸	+
Tween40	-	D-鼠李糖	+	a-氯代戊酸	-	L-苯丙氨酸	-
								Tween80	+	D-山梨醇	+	D，L-乳酸	+	L-脯氨酸	+
N-乙酰半乳糖胺	-	蔗糖	+	丙二酸	-	L-焦谷氨酸	+
								N-乙酰葡萄糖胺	+	D-海藻糖	+	丙酸	+	D-丝氨酸	-
核糖醇	+	松二糖	+	奎尼酸	-	L-丝氨酸	+

L-阿拉伯糖	+	木糖醇	-	D-己糖酸	-	L-苏氨酸	+
								D-阿糖醇	+	丙酮酸甲酯	+	葵二酸	-	D，L-肉碱	+
D-纤维二糖	+	丁二酸-甲酯	+	丁二酸	+	g-氨基丁酸	+
								i-赤藓醇	+	乙酸	+	溴代丁二酸	+	尿刊酸	+
D-果糖	+	顺-阿康酸	-	琥珀酰胺酸	+	肌苷	+
								L-果糖	+	柠檬酸	-	葡糖醛酰胺	-	尿苷	+
D-半乳糖	+	甲酸	+	L-丙氨酰胺	+	胸苷	-
								龙胆二糖	-	D-半乳糖酸内酯	-	D-丙氨酸	+	苯基乙胺	-
a-D-葡萄糖	+	D-半乳糖醛酸	-	L-丙氨酸	+	腐胺	-
								m-肌醇	+	D-葡糖酸	-	L-丙氨酰甘氨酸	+	2-氨基乙醇	+
a-D-乳糖	-	b-甲基葡糖苷	-	L-天冬酰胺	+	2，3-丁二醇	-
								Lactulose	-	D-葡糖醛酸	-	L-天冬氨酸	+	甘油	+
麦芽糖	+	a-羟基丁酸	+	L-谷氨酸	+	D，L-甘油磷酸盐	+
								D-甘露醇	+	b-羟基丁醛	+	苷氨酰天冬氨酸	+	D-葡糖-1-磷酸	-
D-甘露糖	+	g-羟基丁酸	-	苷氨酰谷氨酸	b	D-葡糖-6-磷酸	-

2、Shinella zoogloeoides BC026的16S rDNA鉴定

通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定BC026菌为Shinella zoogloeoides。具体步骤如下：

以TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取BC026菌的基因组DNA，作为PCR反应的模板，设计引物进行PCR片断基因扩增。上下游引物序列分别为：

27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’

1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’

PCR设定程序为：先94℃预变性2min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃终延伸15min，4℃保存。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶分离，纯化与回收后测序。测序结果BC026菌的16S rDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。

将BC026的16S rRNA测序结果导入GenBank中进行同源性比对，结果表明它与Crabtreella saccharophila(AB238789)、Zoogloea ramigera(X74915)、Mycoplana sp.(AB248361)的同源性均为99％。为了确认实验室的鉴定结果，委托中国科学院微生物研究所进行专业鉴定，根据该菌的多项生理生化特性，以及Biolog微生物鉴定系统的分析，确定BC026属Shinella zoogloeoides。

Shinella zoogloeoides同种异名为Crabtreella saccharophila和生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)，2006年重新分类后命名为Shinella zoogloeoides，暂无中文译名。

因此，该细菌被正式命名为Shinella zoogloeoides BC026，已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.2224。

3、Shinella zoogloeoides BC026为自生固氮菌

根据文献，生枝动胶菌是自生固氮菌。通过阿须贝无氮培养基培养，证明BC026菌是一株自生固氮菌。具体方法为：

将BC026菌涂布于阿须贝无氮培养基上，阿须贝无氮培养基组成为C₇H₁₂O₆，10g/L；KH₂PO₄，0.2g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；NaCl，0.2g/L；CaSO₄·2H₂O，0.1g/L；CaCO₃，5g/L。观察BC026菌可在培养基上良好生长，以此判断BC026菌是一株自生固氮菌。

实施例2、Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224对吡啶的生物降解效果检测

1、Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224对吡啶的生物降解能力检测

在以吡啶为唯一碳、氮源的条件下，考察BC026对吡啶的降解能力。发现BC026菌对吡啶有较好的去除效果，能在较短时间内完成降解。具体步骤如下：

1)取2mL培养至对数期的Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224的LB培养液，收集菌体沉淀，接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中，培养至对数期。

2)离心菌液，所得Shinella zoogloeoides BC026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除Shinella zoogloeoides BC026菌表面吸附的杂质，再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中，制备成菌液光密度值OD₆₀₂为1～2的Shinellazoogloeoides BC026菌悬液，作为降解实验的接种液，同时用干重法测定实际接种量。

3)将步骤2)制备的Shinella zoogloeoides BC026菌悬液以干菌体接种量为0.1g/L(干重法测定)接种于100mL含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中，用封口膜密封，在30℃，180rpm的摇床中振荡培养。设未加菌的含有400mg/L吡啶的无机盐培养基，进行同等条件下的实验作为空白对照。

4)在步骤3)所述的培养过程中，间隔1～2小时分别取在步骤3)所述的处理及空白对照的反应液，测定吡啶浓度和菌液吸光度。检测方法如下所述：

菌密度：用岛津UV2401型紫外-可见光分光光度计，在吸收波长为602nm处检测菌液吸光度。

吡啶浓度：发酵液样品由0.22μm滤膜过滤后，通过高效液相色谱(岛津LC10ADVP，SPD10AVP UV-Vis Detector；Diamonsil C18色谱柱，250×4.6mm，5μm)测定吡啶浓度。

结果如图2所示，由图2可以看出，未接种菌液的空白实验中，吡啶浓度变化较小，降低部分应为吡啶的少量挥发所致；而在接种菌液的降解实验中，随着吡啶浓度的降低，菌密度增长，当吡啶消耗完全后，菌密度快速衰减。这说明BC026菌可以吡啶为唯一碳、氮源，并且可在较短时间内将吡啶完全降解。BC026菌接种到入培养液后，立即吸附部分吡啶，使吡啶浓度在开始的4h迅速降低。在4h到6h内，菌密度增长速率开始加快，这说明BC026菌经过抑制期适应了生长环境，开始降解吡啶。6h之后，细菌达到对数生长期，吡啶降解速度加快。在15.5h，吡啶去除率达到98.7％，此时作为碳、氮源的吡啶缺乏，细菌因得不到足够的营养而死亡，因此菌密度迅速下降。图2中A为空白对照的吡啶浓度变化曲线；图2中B为BC026菌在含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中培养过程中吡啶浓度变化曲线；图2中C为BC026菌在含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中培养过程中菌密度(OD602)变化曲线。

2、Shinella zoogloeoides BC026菌在不同吡啶初始浓度下的降解特性

由不同吡啶初始浓度下的降解实验发现随着吡啶初始浓度的增加，降解抑制期变长，降解期的吡啶降解速率变快。具体步骤如下：

1)取2mL培养至对数期的Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224的LB培养液，收集菌体沉淀接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中，培养至对数期。

2)离心菌液，所得Shinella zoogloeoides BC026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除Shinella zoogloeoides BC026菌表面吸附的杂质，再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中，制备成菌液光密度值OD₆₀₂为1～2的Shinellazoogloeoides BC026菌悬液，作为降解实验的接种液。同时用干重法测定实际接种量。

3)在4个装有100mL无机盐培养基的250mL三角瓶中分别加入吡啶，其终浓度分别为99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L，然后分别将步骤2)制备得到的Shinella zoogloeoides BC026菌悬液以干菌体接种量为0.06g/L接种于上述三角瓶中，以未接种装有100mL含吡啶终浓度为1896mg/L的无机盐培养基的250mL三角瓶为空白对照，将各个三角瓶用封口膜密封，在30℃，180rpm的摇床中振荡培养。

4)在步骤3)所述的培养过程中，间隔1～2小时分别取在步骤3)所述的处理及空白对照的反应液，测定吡啶浓度和菌液吸光度。吡啶浓度和菌液吸光度检测方法如步骤1中的步骤4)所述。

结果如图3所示，其中吡啶浓度变化曲线如图3中B所示，由图3中B可以看出在吡啶初始浓度为99～1806mg/L的培养液中，Shinella zoogloeoides BC026菌都可降解吡啶，但各吡啶初始浓度条件下，抑制期的长短和降解速率不同。在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液中，Shinella zoogloeoides BC026几乎没有表现出抑制期，吡啶浓度直线下降。随着吡啶初始浓度的升高，抑制期时间变长，说明吡啶初始浓度越高，细菌适应越慢。但是一旦进入降解期，吡啶初始浓度高的培养液中微生物降解速率快，从图中看即为斜率绝对值较大，这是因为细菌完全适应了生长环境，高浓度的吡啶给细菌提供更充足的营养基质从事生命活动并大量繁殖，而细菌数量增大后，所需的碳、氮源多，吡啶的降解速率相应提高，二者相互促进。

菌液吸光度的变化曲线如图3中A所示；图3中A可以看出，四个浓度下，菌量都随着吡啶的降解而升高。在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液中，菌密度曲线很快达到最高点，与图3中B对照，表明在吡啶初始浓度为99mg/L的培养液的吡啶浓度降到20mg/L时，可利用的基质过少成为Shinella zoogloeoides BC026生长的限制因素，Shinella zoogloeoides BC026菌量开始下降。从吡啶初始浓度为1806mg/L的菌液吸光度的变化曲线可以看出：实验初期细菌生长速度较慢，吡啶的降解速率也比较慢，但随着吡啶的降解，高浓度吡啶对Shinella zoogloeoides BC026生长的抑制作用逐渐减弱；当吡啶浓度降为400mg/L左右时，Shinella zoogloeoides BC026生长进入对数期，菌量迅速增大。在不同的吡啶浓度下，所能达到的最大菌密度及所需时间各不相同，四条曲线中，最大菌密度分别为：0.217g/L、0.623g/L、0.857g/L、1.375g/L，所需时间分别为：15.5h、17.5h、27.5h和56.5h。随着吡啶初始浓度的升高，培养液中碳、氮源的量变大，最大菌密度递增。但是这种增长并不成正比，这说明，Shinella zoogloeoides BC026的生长的限制因素不仅有吡啶的浓度，还有其它的因素，例如与代谢产物的积累以及细菌对生存空间的竞争有关。图3中A中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L分别指Shinella zoogloeoides BC026在上述含吡啶浓度为99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培养基中培养过程中菌密度(OD602)的变化曲线；图3中B中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L、空白对照分别指Shinella zoogloeoides BC026在上述含吡啶浓度为99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培养基培养或上述空白对照处理过程中吡啶浓度变化曲线。

3、Shinella zoogloeoides BC026菌在不同温度下的降解特性

在不同温度下实施降解实验，发现BC026菌在30～35℃具有较高的吡啶降解效率，从实际应用的角度看，选择30℃较为适宜。具体步骤如下：

在无机盐培养基中加入终浓度为500mg/L吡啶后，将步骤2中的步骤2)制备得到的Shinella zoogloeoides BC026菌悬液以干菌体接种量为0.14g/L接种于该培养基中，分取100mL培养液分装至四个250mL三角瓶中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃的摇床中培养。将一个装有100mL未接菌、终浓度为500mg/L吡啶的无机盐培养基在35℃的摇床中同时培养，以设为空白对照。然后按照步骤1中的步骤4)所述的方法进行取样，测定培养过程中的吡啶浓度变化，绘制吡啶浓度变化曲线。

结果如图4所示，结果表明，由于实验加大了干菌体投菌量(0.14g/L)，因此细菌直接进入对数降解期。从图4可以看出，20℃时的降解速度最慢，25℃时的速度稍快，30℃和35℃时的降解速率最高。30℃与35℃的降解能力相差很小，在反应12h时的降解速率几乎同时达到85％。这说明细菌最适的生长、降解温度可能处于30～35℃之间，考虑到污水处理工艺的实际情况，BC026菌的培养温度选择30℃较为合理。图4中的标注20℃、25℃、30℃、35℃、空白对照分别是上述Shinellazoogloeoides BC026在20℃、25℃、30℃或35℃条件下培养或上述空白对照处理过程中吡啶浓度变化曲线。

4、Shinella zoogloeoides BC026菌在不同pH值下的降解特性

由不同起始pH值条件的降解实验，发现BC026菌的最适降解pH值为8。具体步骤如下：

在7个250mL三角瓶中装入相同体积的无机盐培养基，分别调节pH至4、5、6、7、8、9、10，均以接种量为0.13g/L接种步骤2中的步骤2)制备得到的Shinellazoogloeoides BC026菌悬液，并分别加入吡啶至终浓度为500mg/L，培养液终体积均为100mL。将各个三角瓶用封口膜密封，在30℃，180rpm的摇床中振荡培养。培养过程中，按照步骤1中的步骤4)所述的方法进行取样，测定培养过程中的吡啶浓度变化，绘制吡啶浓度变化曲线。

结果如图5所示，从图5分析得出，pH值为4和10时，BC026菌对吡啶没有降解作用。pH为4的培养液中，溶液很清亮，细胞凝聚成小颗粒沉淀。pH值为10时，培养基中的部分成分生成沉淀，破坏了培养基组成。实验中测定在pH值为4和10的条件下菌量略有降低。在pH为5～9的条件下，细菌都能以吡啶为唯一的碳、氮源生长，只是降解的速率不同，降解最快的pH值为8，其它依次为pH7＞pH6≈pH5＞pH9。图5中的pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9、pH＝10分别指Shinella zoogloeoides BC026在pH为4、5、6、7、8、9或10条件下培养过程中吡啶浓度变化曲线。

5、Shinella zoogloeoides BC026菌对吡啶代谢途径的检测

测定降解过程中的氨氮浓度与吡啶的变化关系，推测出BC026菌对吡啶的可能代谢途径。具体步骤如下：

1)取2mL培养至对数期的Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224的LB培养液，收集菌体沉淀接种到装有200mL无机盐培养基的三角瓶中，培养至对数期。

2)离心菌液，所得Shinella zoogloeoides BC026菌体沉淀用无机盐培养基重悬、离心三次以去除Shinella zoogloeoides BC026菌表面吸附的杂质，再转移到一定体积的灭菌无机盐液体培养基中，制备成菌液光密度值OD₆₀₂为1～2的Shinellazoogloeoides BC026菌悬液，作为降解实验的接种液。同时用干重法测定实际接种量。

3)将步骤2)制备得到的Shinella zoogloeoides BC026菌悬液以干菌体接种量为0.1g/L接种于100mL含有400mg/L吡啶的无机盐培养基中，用封口膜密封，在30℃，180rpm的摇床中振荡培养。取未加菌、含有400mg/L吡啶的无机盐培养基进行相同条件下的培养，以设为空白对照。

4)间隔2～3h取培养菌液样品，按照下述步骤测定吡啶和氨氮的浓度。间隔3～4h取培养菌液样品，按照下述步骤测定中间产物。

检测方法为：

吡啶浓度：样品由0.22μm滤膜过滤后，通过高效液相色谱(岛津LC10ADVP，SPD10AVP UV-Vis Detector；Diamonsil C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm)测定。

氨氮浓度：样品经0.22μm滤膜过滤，用水杨酸-次氯酸盐光度法(GB 7481-87)测定。

中间产物：样品经0.22μm滤膜过滤、二氯甲烷等体积萃取，然后用预先烘干的无水硫酸钠过滤，在GC/MS(Agilent 6890N GC/5973MSD，DB-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm)上定性分析。

结果如图6所示，由图6表明，降解过程中产生氨氮。吡啶开始减少的同时，氨氮的量升高，这说明吡啶降解的第一步就脱去氮原子，氮分子以氨氮的形式释放到溶液中。吡啶完全降解后，氨氮的量不再增加，这进一步证明没有其他的中间产物可以脱氮转变成氨氮。而根据文献吡啶能促使与戊二醛、戊二酸脱氢酶有关的辅酶产生，结合吡啶完全对称的结构推测，吡啶脱氮时打开了两个C-N键。当吡啶降解完全后，氨氮的量开始降低，这证明培养液中还有可以充当碳源的物质，即吡啶脱氮后的中间代谢产物。实验过程中取样由GC-MS测定，没有检出中间代谢产物，这与文献报道相同。降解过程中的pH值随着吡啶的降解而降低，吡啶完全降解后，pH值开始升高。这说明吡啶降解产生酸性的中间产物，根据文献报道，推测这种中间代谢产物有可能是戊二酸，而这种物质可能由戊二醛氧化而来。戊二醛可能并不是经由吡啶脱氮羟基化所得的产物氧化而来，因此推测吡啶脱氮后生成戊二醛，这与文献报道的吡啶中间产物为氨基乙酸和丙二酸不同。在17h左右，氨氮量不再减少，而氨氮是BC026菌可利用的一种氮源，根据文献报道，生枝动胶菌为化能异养菌，这说明培养体系中缺乏可利用的有机碳，因此可推断戊二酸进一步转化为BC026无法利用的无机碳。一般情况下，生物通过同化与异化作用将一部分碳转化为自身的生命物质外，其它碳由呼吸作用，最终以二氧化碳的形式释放，因此这种无机碳可能为二氧化碳。由吡啶和氨氮的对应关系可以看出，在降解过程中，吡啶中的氮约有50％转化为氨氮。另有50％的氮在生物体内或环境中以其他形式存在。图6中的吡啶-N是BC026培养过程中吡啶浓度变化曲线，氨氮是BC026培养过程中氮浓度变化曲线。

综上所述，推测当BC026菌以吡啶为唯一碳、氮源时的代谢途径如图7所示。继续对菌液进行培养，氨氮的量基本没有变化，当向培养液中补加灭菌葡萄糖溶液后，测定体系中的氨氮量，发现氨氮浓度快速降低至零，这是因为吡啶是培养液中的唯一碳、氮源，而吡啶的碳、氮比远小于微生物生长的最佳碳、氮比，因此证明培养后期表现出来的细菌衰亡是由缺乏碳源引起的。

6、Shinella zoogloeoides BC026菌的质粒提取

用QIAGEN试剂盒提供的方法提取BC026菌中的质粒。证明了Shinellazoogloeoides BC026中有两个大质粒，其功能还在进一步验证中。具体步骤如下：

1)在LB培养液中加入终浓度为500mg/L的吡啶，接种Shinella zoogloeoidesBC026，培养至对数后期。

2)根据QIAGEN质粒提取试剂盒的方法提取质粒。

3)用琼脂糖凝胶电泳分离。

结果如图8所示，结果表明，Shinella zoogloeoides BC026中有两个大质粒(图8中质粒1条带，质粒2条带)。图8中，泳道L1为分子量标准，泳道L2-L7为Shinella zoogloeoides BC026凝胶电泳分离图谱。

序列表

<160>1

<210>1

<211>1449

<212>DNA

<213>Shinella zoogloeoides

<400>1

agagtttgat catggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgaac     60

gccccgcaag gggagtggca gacgggtgag taacgcgtgg gaatctaccc atctctacgg    120

aataactcag ggaaacttgt gctaataccg tatacgccct tcgggggaaa gatttatcgg    180

agatggatga gcccgcgttg gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg    240

atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc    300

ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc    360

gcgtgagtga tgaaggccct agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt    420

aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct    480

agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc gggtatttaa gtcaggggtg    540

aaatcccgga gctcaactcc ggaactgcct ttgatactgg gtacctagag tatggaagag    600

gtaagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc    660

gaaggcggct tactggtcca ttactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg    720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgt tagccgtcgg catgcatgca    780

tgtcggtggc gcagctaacg cattaaacat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa    840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc    900

aacgcgcaga accttaccag cccttgacat gtcggtcgcg gattacagag atgttttcct    960

tcagttaggc tggaccgaac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat   1020

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccctta gttgccagca ttcagttggg   1080

cactctaagg ggactgccgg tgataagccg agaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc   1140

acggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg ggcagcgaga   1200

cagcgatgtc gagctaatct ccaaaagcca tctcagttcg gattgcactc tgcaactcga   1260

gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc   1320

gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggt tttacccgaa ggcgatgcgc   1380

taaccgcaag gaggcagtcg accacggtag ggtcagcgac tggggtgaag tcgtaacaag   1440

gtaaccgta                                                           1449

Claims (7)

1、Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224。

2、Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224在降解含氮杂环化合物中的应用。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含氮杂环化合物为吡啶或其衍生物。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述降解含氮杂环化合物为降解污水中的吡啶和/或其衍生物，具体方法为将Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC№.2224悬浮于含有吡啶和/或其衍生物的污水中，在20-35℃，pH值为5-9的条件下培养。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述Shinella zoogloeoides BC026CGMCC №.2224在污水中培养的温度为30-35℃，pH值条件为pH7-pH8。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述Shinella zoogloeoides BC026CGMCC №.2224在污水中培养的温度为30℃，pH值条件为pH8。

7、以Shinella zoogloeoides BC026 CGMCC №.2224为活性成分的生物菌剂。

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