CN100552019C - 一株脱氮副球菌及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株脱氮副球菌及其培养方法与应用。该菌株为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673。该菌株对有机污染物具有很高的降解能力，可用于含吡啶、苯、二甲苯、喹啉、氰化物等有机污染物的废水的生物治理与被污染的土壤修复，特别是对吡啶具有很高的降解活性。

Description

一株脱氮副球菌及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一株脱氮副球菌及其培养方法与应用。

背景技术

受启于地球“自净”过程的生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，生物治理技术现已成为污染治理技术中的首选方案之一，如现已产生良好效果的可用于污水/废水处理的活性污泥法、氧化沟法等。决定生化处理工艺成功、有效、适用的因素，除了工艺条件和操作管理外，用于污染物降解、转化等过程的功能微生物群体的作用也是十分重要的。因此，对特种微生物的分离、筛选，功能基因的分离、提取，以及借此构建各种环境工程菌已成为环境科学、生命科学中的研究热点。

应运而生的生物强化技术(Bioaugmentation，简称BA技术)、基因强化技术(Gene-Enhanced-Technology，简称GET技术)是向污染体系中投加人工培育的功能菌株/菌群，导入功能基因，以增强体系中目标底物的降解、转化。美国、日本、英国等一些国外的科研机构，现已成功开发出商品化的环境生物制剂，其中著名的有日本的EM制剂，美国的AM制剂。

吡啶是化工产业中广泛使用的化合物，用作化学合成单体，因此是一种常见的有毒污染物，是焦化废水、农药废水等工业废水的特征污染因子。近年来，吡啶是非常重要的化工合成单体，目前市场调查表明，全球吡啶需求坚挺，因此，外商争相在中国建厂，如世界著名的Nepera公司与Reilly工业公司，分别在北京、南京已经建成或正在筹建吡啶的生产厂。据此推测，在不久的将来，吡啶的有机污染以及在吡啶的生产、应用、销售过程中造成的相关泄漏、污染的处理等问题，可能会显得越来越突出与严重。另外，随着除草剂用量的增大，其生产合成工业的迅速发展，尤其是免耕/减耕等非耕农业技术的提倡，百草枯因其独特的化学特性如1)速效；2)只对植物地上部分有效，对根及根茎无效；3)与土壤迅速结合失去活性，因此，该农药的生产、使用与销售均呈持续上升趋势，在美国百草枯的销售量每年约增加5-10％。百草枯是吡啶的主要衍生物之一，约占吡啶用量的30％。因此，对该污染物的生物降解的系统研究是十分必要的。

虽然，关于吡啶的生物降解的研究早在20世纪70年代就有相关报道，但是，由于吡啶本身属于难降解有机杂环化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，故至今各国仍将吡啶作为污染体系中的优先控制污染物和难降解有机化合物加以重点研究和处理，希望找到一些有效的微生物对其加以控制，从而保证各种排放的工业废水中吡啶含量不至于对环境造成污染。

脱氮副球菌是自然界中相当常见一种微生物，在土壤、水体中普遍存在，也是一种研究得比较透彻的模式微生物，关于生理生化、代谢途径等方面的研究已经相当广泛。目前，研究重点主要集中在氮代谢方面，并且成为氮代谢研究中的模式微生物。

我国的污染情况与其它国家明显不同，现有的商品化生物制剂对“三废”难以起到有效的治理效果，严重的污染情况亟待解决。生物修复的方法解决污染具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株可有效降解有机污染物吡啶并用于环境污染治理的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12。

本发明所提供的用于环境治理的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12已于2006年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1673。

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673可在普通细菌LB培养基及无机盐加吡啶(1.96g/L吡啶)筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，边缘光滑，光学显微镜下观察其为G^-短杆菌，单个或成对，不运动。好氧，呼吸代谢；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长。接触酶、氧化酶阳性。

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC №1673可用LB培养基或含有吡啶的筛选培养基在30℃～35℃下培养；所述含有吡啶的筛选培养基为每1000mL中含1.96g/L吡啶，Na₂HPO₄·2H₂O 7.0g，KH₂PO₄ 3.0g，NaCl 0.25g，MgSO₄·7H₂O0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.02g，FeCl₃·6H₂O 0.045g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，ZnSO₄·7H₂O0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.002g，CoCl₂·6H₂O 0.003g，NiCl₂·6H₂O 0.003g，Na₂MoO₄·2H₂O0.002g，pH 7-8。

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在LB培养基中30℃～35℃，150rpm，培养18-22h，活细胞数可达10⁹～10¹⁰cfu/ml；在含有吡啶的筛选培养基中30℃～35℃，150rpm，培养38h～42h，活细胞数可达10⁸～10⁹cfu/ml，吡啶降解达到99％。

本发明的第二个目的是提供脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC№1673的一种特别培养方法，该培养方法将焦化废水作为其唯一碳源、能源、氮源。

本发明所提供的培养脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC №1673的方法，是将焦化废水作为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC №1673的培养基进行培养。

所述焦化废水的pH为7.0-7.5，COD为1680mg/L。

所述培养方法中的培养温度可为30℃～35℃。

所述培养方法中的培养时间可为3～5天。

本发明的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673可降解吡啶、苯、二甲苯、喹啉、氰化物，特别是对吡啶有很高的降解活性，实验表明，该菌株对吡啶降解达到99％，并且不受环境中微生物的影响，这在脱氮副球菌这一类微生物中是比较少见的，因此，对该菌的系统、深入研究，可以丰富该模式微生物生理生化方面的内容。实验表明，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673还可利用焦化废水作为其唯一碳源、能源、氮源进行生长。

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673一方面可以在有氧条件下对吡啶具有有效的降解活性，另一方面又可以在无氧条件下有效地代谢含氮化合物，而众所周知，焦化废水的治理的几个重要方面包括：1)有机污染物如苯酚、吡啶、喹啉等的生物降解；2)氨氮及其他含氮元素物质的脱除；因此，从微生物的生理生化功能而言，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673是非常适合用于焦化废水的生物治理，可作为焦化废水生物治理工艺中的生物强化剂。脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对有机污染物具有很高的降解能力，可用于含吡啶、苯、二甲苯、喹啉、氰化物等有机污染物的废水的生物治理与被污染的土壤修复，并借此开发出相应的环保生物制剂，具有较高的研究、应用及市场价值。

附图说明

图1为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的电镜照片。

图2为污染废水中脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的吡啶降解曲线及菌体生长曲线

图3为污染泥浆中脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的吡啶降解曲线

图4为焦化废水中脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的生长曲线

图5为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的质粒提取电泳图。

具体实施方式

下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。

BS无机盐培养基：每1000mL水中含：Na₂HPO₄·2H₂O 7.0g，KH₂PO₄ 3.0g，NaCl0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.02g，FeCl₃·6H₂O 0.045g，MnSO₄·4H₂O0.01g，ZnSO₄·7H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.002g，CoCl₂·6H₂O 0.003g，NiCl₂·6H₂O0.003g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.002g，pH 7.5，(固体培养基添加15g琼脂)。

吡啶的检测方法采用高效液相色谱(HPLC)法：

样品处理：在好氧降解过程中，每隔一定时间取样，水样在8000rpm下离心10min，上清用于吡啶的HPLC定量分析。

色谱仪为岛津SHIMADZU，LC-VP系列，色谱柱为Diamosil(TM)钻石C18柱，250mm×4.6mm，粒度为5μm；流动相为80％(v/v)甲醇水溶液，流动相流速为1.0ml/min。测定波长254nm。

实施例1、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的分离、纯化

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12是从清华大学环境工程系采用有毒、有害工业废水进行长期驯化培养的活性污泥中分离、纯化得到的一株G^-细菌，具体富集、分离、纯化过程如下：

在选择压力吡啶2000mg/L的条件下，也就是以吡啶作为唯一碳源与氮源，从长期驯养的活性污泥中，经过富集、分离、筛选、纯化等步骤得到脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12 CGMCC No.1673。

具体分离过程如下：将采集的样品接种到含液体BS吡啶选择培养基(在BS无机盐溶液中添加2000mg/L吡啶作为唯一碳源与氮源)的摇瓶中，35℃，120rpm下振荡培养一周。将富集液稀释涂布到固体BS吡啶选择培养基上，35℃，恒温培养，直至长出明显可见的菌落。挑取单菌落，移接到液体BS吡啶选择培养基中，35℃，120rpm下振荡培养，直至细胞浓度达到10⁷-10⁸个细胞/mL。再次稀释涂布固体平板，检测纯度，直至获得以吡啶为唯一碳源与氮源生长的纯种菌株。对获得的菌株进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明该菌株可在普通细菌LB培养基及无机盐加吡啶(1.96g/L吡啶)筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，边缘光滑，光学显微镜下观察其为G-短杆菌，长约0.9μm，直径约0.3μm。(图1)，单个或成对，不运动。好氧，呼吸代谢；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长。接触酶、氧化酶阳性。此外又对菌体的16srRNA进行了测序，并与数据库中的序列进行了比对，最后结合形态特征、生理生化特征和核苷酸序列特征，将该菌株鉴定为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)。将该菌株命名为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12。该菌株已于2006年04月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1673。

实施例2、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的污染物降解谱与抗性谱

1)脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的污染物降解谱

BS无机盐培养基作为基本培养基，以表1所示的有机污染物作为唯一添加的能源、碳源、氮源，采用固体培养的方式，在30℃、静置培养一周，观察菌落形成的情况。对苯、苯酚、甲苯、二甲苯、吡啶、氰化物、喹啉、咪唑等化合物的测试结果如表1所示。结果表明，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673具有较宽的降解谱，可以利用多种有机污染物生长，尤其是对吡啶具有较高的降解活性。

表1  W12对有机污染物的降解利用情况

	吡啶	二甲苯	苯	苯酚	甲苯	喹啉	CN<sup>-</sup>	咪唑
									浓度	1.96g/L	1.72g/L	4.39g/L	50mg/L	1.72g/L	0.5g/L	200mg/L	50g/L
降解特性	√	++	+	-	-	+	+++	-

注：表中“+”表示菌体在相应的污染物平板上生长，“+”越多表示菌长得越好；“-”表示菌体在相应的污染物平板上不长，“√”表示菌体在相应的污染物平板上生长旺盛，污染物对菌没有任何作用。

2)脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的抗性检测

将该菌分别接种于含如表2所示不同浓度(50mg/L-100mg/L)的羧苄霉素、卡那霉素、壮观霉素、氯霉素、潮霉素、四环素、头孢霉素、氨苄霉素或利福平抗生素的LB固体培养基中，在30℃、静置培养一周，观察菌体在培养基表面上形成菌落的情况。结果如表2所示。结果表明，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673除了对壮观霉素和潮霉素有抗性外，对其余抗生素都敏感。

表2  W12对抗生素的耐受性情况

注：表中“+”表示菌体在相应的抗性平板上生长，“+”越多表示菌长得越好；“-”表示菌体在相应的抗性平板上不长。

另外考察了脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对重金属的抗性，以Pb为例，将该菌接种于含不同浓度Pb(NO₃)₂的LB固体培养基中，在35℃下培养，结果表明，菌体对Pb耐受浓度可达到50mg/L，故具有较高的重金属抗性。

实施例3、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对污染物的生物降解

1)脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对吡啶污染废水的生物降解

从斜面挑取2环脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673菌接种于含有50ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，35℃，180rpm振荡培养36h，8000rpm离心10min收集菌体，再用无菌生理盐水洗涤该菌液，再离心，如此反复两次，离心条件也为8000rpm，10min。最后将所得菌体用加有吡啶的BS培养液重悬，并接入含有50ml加吡啶的废水的300ml三角瓶中，吡啶浓度分别约为50mg/l，100mg/l，200mg/l，400mg/l，900mg/l，1400mg/l；35℃，150rpm，进行好氧降解，以不接菌的相应废水为空白对照，分别在培养了0h、10h、20h、30h、40h、45h、47h、60h后检测各瓶中的吡啶含量，并测定菌体生物量，绘制降解动力学曲线，结果表明脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对含有各个浓度吡啶的废水中的吡啶均有较好的降解效果，在25h～45h内对所试浓度吡啶的降解率均达到99％以上。其中，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在含1400mg/l浓度吡啶的废水中对吡啶的降解动力学曲线如图2所示，图2表明，前20h由于菌体处于延滞期，故吡啶几乎没有降解，20h后随着菌体的生长，吡啶开始迅速降解，直到45h后，吡啶几乎降解完全。将延滞期排除后对脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673降解曲线进行拟和，结果发现在快速降解阶段吡啶降解曲线基本符合零级反应动力学规律。其动力学方程为：y＝-55.894x+2735R²＝0.9132；y是吡啶浓度，单位mg/l；x为反应时间，单位h。

结果表明，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对于吡啶污染废水中的吡啶降解有很好的效果，基本可以在很短的时间内将吡啶降到可以排放的标准，表明脱氮副球菌W12具有用于污染体系中吡啶等杂环化合物生物降解的巨大潜力。

2)脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对吡啶污染泥浆的生物修复

从斜面挑取2环脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673接种于含有50ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，35℃，180rpm振荡培养36h，将菌液分别接入5g经高温高压灭菌后烘干的土壤和5g不经灭菌的自然土壤中，使最终土壤投菌量为5.6×10¹⁰CFU/g土壤，然后分别加入浓度为8266mg/l吡啶溶液各1ml使污染水平约为1.5mg/g土壤，再分别加入9ml无菌水，最后混匀并装入150ml三角瓶做成泥浆污染处理反应器。然后将三角瓶置于190rpm，35℃下进行好氧降解实验。在0h、10h、20h、22h、25h、30h、45h时取样分析吡啶浓度，每次取样后补充相应的无菌水，保持三角瓶内含水量不变。最后绘制出脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12 CGMCC No.1673在灭菌的和天然的泥浆体系中对吡啶的降解曲线(图3)。图3表明，在好氧条件下脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673能够有效地利用泥浆中的吡啶，在20小时内基本上将泥浆中的吡啶降解完全。而且天然泥浆中的微生物对脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673降解吡啶的效果没有明显的影响。

该试验表明脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673对于吡啶污染泥浆中的吡啶降解有很好的效果，可以在很短的时间内将吡啶降到非污染的标准，这显示脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673可以用于吡啶污染泥浆或土壤的生物修复。

3)脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在焦化废水中的生长情况

脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673是利用一定的选择压力(如利用在BS无机盐组分中添加吡啶作为唯一底物)从自然界中分离、纯化出来的多功能降解菌，对其进行如下实验：

从保藏菌株的LB培养基上挑两环菌接入装有30ml LB液体培养基的300ml三角瓶中，35℃，180rpm，振荡培养过夜。待菌体进入对数期后，吸取1ml菌液接入装有30ml经过滤除菌的首钢焦化废水的300ml三角瓶中，35℃，150rpm，振荡培养5d，每天测一次OD₆₀₀，最后绘制出生长曲线，结果表明，脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12 CGMCC No.1673可以较好地利用首钢的焦化废水进行生长、增殖，利用焦化废水对脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673进行振荡培养，培养一定时间之后(4d～5d)，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在培养液中的细胞浓度可达到10⁹cfu/mL，OD₆₀₀＝1.2。其生长曲线结果如图4所示，结果表明，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673在焦化废水中生长的前2d，基本处于延滞期，菌体浓度较低；2d～3d进入对数期，菌体浓度很快增加；到第4d开始进入稳定期，菌体浓度基本不变。脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在焦化废水中虽然生长较慢，但是菌体在3d内可以达到很高的浓度，说明脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673可以在焦化废水中很好的生长，有望用于焦化废水的生化处理。

实施例4、关于脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673分子生物学特征的初步研究

细菌中质粒赋存情况及吡啶降解基因的初步研究

采用改进的碱变性法，从脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCCNo.1673的培养液中提取质粒，具体的质粒提取过程如下：

1、所用材料：

1)培养基：LB

2)质粒提取所用溶液：

TE：50mM Tris，20mM Na₂EDTA，pH8.0；

裂解液：3％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.2mol/L NaOH；

TS：1M Tris，4M NaCl，pH7.0；

TES：50mM Tris，5mM Na₂EDTA，50mM NaCl，pH8.0。

2、质粒提取：采用改进的碱变性法，具体步骤如下：

1)菌体生长到OD₆₀₀为1.6～1.7时，取4ml菌液室温6000rpm离心10min，倒掉上清；

2)将菌体悬浮于1mlTE溶液中，尽可能混匀，不要有成块的菌体；

3)加入2ml裂解液，缓慢颠倒，在室温或冰浴中裂解细胞7min，待裂解液清亮；

4)加入1mlTS液，于冰浴放置1h，8000rpm离心20min；

5)收集上清液，加入等体积冷的无水乙醇，-20℃静置30min

6)倾去上清液，35℃烘干乙醇；

7)将沉淀溶于0.1mlTES溶液中，再加入等体积氯仿混匀；

8)7000rpm离心3min，吸取上清质粒溶液，加入RNase，以除去RNA；

9)电泳检测

其提取产物的凝胶电泳检测如图5所示，由图表明脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)W12 CGMCC No.1673携带一个片段较大的质粒，大小约为100kb，图5中泳道1的箭头表示该菌所含的大质粒，大小约为100Kb，泳道M为分子量标准(1Kbplus DNA Ladder)。质粒消除初步试验结果表明，吡啶的降解与质粒之间不存在对应关系，推测编码吡啶降解酶的基因可能不在质粒上，而有可能在基因组上。通过接合试验发现脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673不具有接合功能。

Claims (9)

1、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673。

2、一种培养脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673的方法，是将焦化废水作为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC №1673的培养基进行培养。

3、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述焦化废水的pH为7.0-7.5，COD为1680mg/L。

4、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养方法中的培养温度为30℃～35℃。

5、根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养方法中的培养时间为3～5天。

6、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673在降解有机污染物中的应用；所述有机污染物为吡啶、苯、二甲苯、喹啉或氰化物。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述有机污染物为吡啶。

8、根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述有机污染物为废水有机污染物或土壤有机污染物。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述废水为焦化废水。

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