CN101237898A - 人胎盘胶原组合物、其制备方法、使用方法以及包含该组合物的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含人胎盘胶原的组合物、制备该组合物的方法、其使用方法以及包含该组合物的试剂盒。该组合物、试剂盒和方法例如可用于增强或代替哺乳动物的组织。

Description

人胎盘胶原组合物、其制备方法、使用方法以及包含该组合物的试剂盒

1.发明领域

本发明涉及包含人胎盘胶原的组合物、制备该组合物的方法及其使用方法。

2.发明背景

胶原是一种在身体中形成许多结构的蛋白，包含腱、骨、牙齿和支撑皮肤及内部器官的片层。胶原由以三重螺旋方式缠绕的三条链构成。这种结构源自三个氨基酸的重复。在这种螺旋中，每第三个氨基酸是甘氨酸，并且其余的氨基酸中很多是脯氨酸或羟基脯氨酸。

胶原一段时间以来已被商业上和临床上使用。目前，胶原可用于代替或增强硬或软结缔组织，如皮肤、腱、软骨、骨和间质。固体胶原已被手术移植，并且可注射的胶原制剂现在可以更方便地施用。目前，若干可注射的胶原组合物可以商业购得，包含Zyderm、Zyplast、Cosmoderm和Cosmoplast。

每种胶原组合物具有特定物理性能，这些性质对于其在特定技术中的使用可以是有利的或不利的。因此，本领域对于具有进一步的物理性能的胶原组合物仍然存在需要，从而拓宽本领域从业人员可用的组合物的选择范围。

3.发明概述

本发明部分地基于对可用于例如增强或代替哺乳动物组织的胶原组合物的发现。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物表现出有利的耐久性和可注射性。例如，在某些实施方式中，本发明的胶原组合物在注射后表现出有利的耐久性。在本发明的某些实施方式中，本发明的胶原组合物表现出有利的低毒性。在本发明的某些实施方式中，胶原组合物表现出有利的流变学性质。

在一个方面中，本发明提供了包含交联的胶原的组合物。在某些实施方式中，用交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚将所述胶原交联。在特定实施方式中，所述胶原组合物包含去端肽胶原。

在本发明的这一方面中，所述胶原起始材料可以是本领域技术人员已知的任何胶原。在某些实施方式中，所述胶原起始材料是酸溶性去端肽胶原。在特定的实施方式中，所述胶原起始材料是胎盘胶原。在进一步特定的实施方式中，所述胶原起始材料是哺乳动物胶原。一个例子是人胶原。在特定的实施方式中，所述胶原源于人胎盘。所述胶原起始材料可以根据本领域技术人员已知的任何方法制备。

在某些实施方式中，根据本发明的某些方面制备所述胶原起始材料，如下面详细讨论的那些方面。所述胶原可以是本领域技术人员已知的任何类型的胶原。在某些实施方式中，所述胶原组合物富含I型和IV型胶原。在进一步实施方式中，所述胶原组合物III型胶原降低。在某些实施方式中，所述胶原组合物富含I型和III型胶原。在进一步实施方式中，所述胶原组合物IV型胶原降低。

在另一个方面中，本发明提供制备本发明的胶原组合物的方法。在某些实施方式中，在适于形成交联的条件下，通过使胶原起始材料与交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚接触来制备本发明的胶原组合物。在特定的实施方式中，使用的1，4-丁二醇二缩水甘油醚与胶原的重量比约为4∶1。在特定的实施方式中，通过催化剂如吡啶催化交联反应。

在另一个方面中，本发明提供制备酸溶性胎盘胶原的方法。尽管所述胎盘组织的来源可以是任何哺乳动物，但在某些实施方式中使用人胎盘。所述胎盘组织可以是源于胎盘的任何部分，包含羊膜，不管是可溶的或不溶的或这两者，绒毛膜和脐带或源于整个胎盘。在某些实施方式中，所述酸溶性胎盘胶原在除去脐带后从整个人胎盘制备。

在某些实施方式中，所述方法包括胎盘组织的渗透压冲击。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信渗透压冲击可以使组织中的细胞破裂，从而有利于除去细胞、细胞成分和血液成分。渗透压冲击步骤可以产生具有有利纯度的本发明的胶原组合物。渗透压冲击可以在本领域技术人员已知的任何渗透压冲击条件下进行。在特定的实施方式中，渗透压冲击通过在高盐条件中培养，然后在水溶液中培养来进行。可以根据本领域技术人员的判断重复培养。

在渗透压冲击后，可以在酸性条件下洗涤得到的胶原组合物。所述酸性条件可以是本领域技术人员已知的任何酸性条件。醋酸是用于酸洗的有用的酸的一个例子。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信酸洗可以溶解一些多肽，同时沉淀并有利于除去可能污染所述胶原组合物的低分子量多肽(例如，30-60kDa)。

在需要去端肽胶原的某些实施方式中，所述胶原组合物与能够从胶原部分或完全地除去端肽的酶接触。对本领域技术人员显而易见的是，当不需要去端肽胶原时，则不将使用该步骤。所述酶可以是本领域技术人员已知的能够从胶原除去端肽的任何蛋白水解酶。在某些实施方式中，所述酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。通常，所述酶在本领域技术人员已知的适于除去端肽的条件下与所述胶原组合物接触。在某些实施方式中，所述酶在升高的温度下与所述胶原组合物接触。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信升高的温度可以提高最终胶原组合物中I型胶原的产率。在特定的实施方式中，所述胶原组合物在23-27℃下与胃蛋白酶接触足以除去端肽的时间。

在进一步的步骤中，可以通过盐析使所述胶原组合物纯化。所述盐析可以是本领域技术人员已知的任何盐析。然而，在某些实施方式中，初始低盐沉淀后是高盐沉淀。在这些方法中，本发明的胶原组合物所需的胶原保持在低盐沉淀的上清液中，并且在高盐沉淀中沉淀。在特定的实施方式中，所述低盐沉淀是约0.2M NaCl，而所述高盐沉淀是约0.7M NaCl。对本领域技术人员显而易见的是，在每一次沉淀中，可以通过标准技术如离心、过滤、重悬和浓缩从上清液或沉淀中回收本发明的胶原组合物。根据本领域技术人员的判断可以重复每一种盐析，并且根据本领域技术人员的判断可以在需要时洗涤沉淀物。

在某些实施方式中，可以用低分子量过滤器过滤所述胶原组合物以浓缩样品并清除内毒素。例如，可以用100kDa过滤器或30kD过滤器或这二者过滤所述胶原组合物，以浓缩和/或除去内毒素。在某些实施方式中，可以用高分子量过滤器过滤所述胶原组合物以除去病毒。如下所述，所述高分子量过滤器保留胶原，同时使病毒性颗粒通过。例如，可以用1000kDa，750kDa或500kDa过滤所述胶原组合物以除去病毒如HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、疱疹、细小病毒和本领域技术人员已知的其它病毒性传染物。

在某些实施方式中，可以通过纤维化进一步处理本发明的胶原组合物。可以通过本领域技术人员已知的使胶原纤维化的任何技术进行纤维化。在某些实施方式中，所述胶原组合物在3mg/ml胶原、30mM磷酸钠、pH 7.2中、在约32℃下纤维化约20-24小时。

在需要时，本发明的胶原组合物可以被交联。在某些实施方式中，在纤维化之后进行交联。可以使用本领域技术人员已知的任何交联剂进行交联。例如，在某些实施方式中，交联剂可以是戊二醛，并可以根据本领域技术人员已知的戊二醛交联胶原的方法进行交联。在其它实施方式中，交联剂可以是1，4-丁二醇二缩水甘油醚或京尼平(genipin)。在特定的实施方式中，交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚。可以通过对本领域技术人员显而易见的技术或本文所述的那些技术进行交联。在某些实施方式中，在催化剂如吡啶存在下使用1，4-丁二醇二缩水甘油醚进行交联。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物可以被还原。可以通过使本发明的胶原组合物与本领域技术人员已知的任何还原剂接触进行还原。在某些实施方式中，还原剂是硼氢化钠。在特定的实施方式中，在用还原剂还原之前使胶原交联。

在某些实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的机械剪切方法进一步处理胶原组合物。示例性剪切技术记载在美国专利号4,642,117中，在些引入其全部内容作为参考。在某些实施方式中，使用组织均质器剪切所述胶原组合物。

通过本发明的方法制备的胶原组合物已经表现出有利的性质。例如，本发明的某些胶原组合物包含大量的IV型胶原，在一些实施方式中为2～13％。此外，本发明的某些胶原组合物包含较小量的III型胶原，在某些实施方式中约5％。通常，本发明的组合物的其余胶原是I型胶原，在某些实施方式中约80-90％。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含大量的碳水化合物，例如按胶原重量计，至少10μg/mg碳水化合物。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信高碳水化合物浓度是由于IV型胶原的碳水化合物含量。因此，在某些方面中，本发明提供具有上述性质的胶原组合物。

在进一步实施方式中，本发明的某些胶原组合物包含0～13％的IV型胶原。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物包含约0-5％的III型胶原。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物包含约80-95％的I型胶原。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物包含大于80％、85％、90％、95％、98％或99％的I型胶原。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物基本上不含碳水化合物，例如按胶原重量计，小于约0.1、0.25、0.5、1、2、5、7.5或10μg/mg的碳水化合物。

在另一个方面中，本发明提供的本发明的胶原组合物还包含透明质酸。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信包含透明质酸可以促进纤维原细胞迁移进本发明的胶原组合物中或通过其迁移。可以通过在对本领域技术人员显而易见的任何适合的条件下使本发明的胶原组合物与透明质酸接触制备所述包含透明质酸的胶原组合物。在某些实施方式中，所述组合物的胶原被交联。在进一步实施方式中，所述组合物的透明质酸被交联。在进一步实施方式中，所述胶原和透明质酸均被交联。在特定的实施方式中，二者被交联到一起。所述交联剂可以是本领域技术人员已知的任何适合的交联剂，包含本文所述的戊二醛、京尼平和1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

在另一个方面中，本发明提供用于增强或代替哺乳动物的组织的方法，包含将本发明的胶原组合物施用至有此需要的哺乳动物。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。可以根据本领域技术人员已知的任何技术施用所述胶原组合物。在某些实施方式中，通过注射施用所述胶原组合物。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物的流变学性质是有利的。

在另一个方面中，本发明提供用于将本发明的胶原组合物使用至有此需要的哺乳动物的试剂盒。所述试剂盒通常包含便于分配给本领域技术人员的包装中的本发明的胶原组合物。所述试剂盒还可以包含用于将本发明的胶原组合物施用至哺乳动物的装置。所述装置可以是本领域技术人员已知的用于施用胶原组合物的任何装置，如注射器、注射器和针头、导管等。在某些实施方式中，所述装置用本发明的胶原组合物预填充。

如上所述和在下面部分详细所说明的，本发明的组合物、方法和试剂盒适用于将胶原组合物施用至有此需要的哺乳动物。

4.发明的具体说明

4.1定义

当在本文中使用时，以下术语具有下列含义：

术语“胶原”指本领域技术人员已知的任何胶原。

术语“去端肽胶原(atelopeptide collagen)”指本领域技术人员认识到的一种胶原的形式，其缺少一个或多个端肽区。在某些实施方式中，可以通过下面详细讨论的蛋白酶消化除去端肽区。

当在本文中使用时，“生物相容性”或“生物可相容的”指在活体组织中不产生毒性、损伤或免疫反应或排斥从而具有生物可相容的性质。当在身体中使用人造材料时，身体对未知材料的应答是主要关心的问题，因此材料的生物相容性是对这类材料而言重要的设计考量。

当在本文中使用时，“非热原的”指材料经测试并发现含有少于或等于0.5EU/mL的热原，如内毒素。一个EU是约0.1～0.2ng内毒素/毫升，并根据使用的参照而变化。

术语“个体”指动物如哺乳动物，包含但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方式中，所述个体是人。

术语“标签”指物品的直接容器上的书面、印刷或图形物显示，例如在含有药物活性剂的小瓶上显示的书面材料。

术语“标记”指任何物品或者物品的任何容器或包装上的或所述物品附带的所有标签和其它书面、印刷或图形物，例如药物活性剂的容器附带的或相关联的包装插入物或说明性录像带或DVD。

4.2发明的实施方式

本发明涉及胶原组合物、制备胶原组合物的方法、包含胶原组合物的试剂盒及其使用方法。

4.2.1本发明的胶原组合物

在一实施方式中，本发明提供例如用于增强或代替哺乳动物的组织的胶原组合物。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物具有有利的耐久性、可注射性和流变学性质。

在本发明的这一方面中，所述胶原可以是本领域技术人员已知的任何胶原。在某些实施方式中，所述胶原是哺乳动物胶原。在特定的实施方式中，所述胶原是人、牛、绵羊、大鼠或袋鼠胶原。在某些非哺乳动物实施方式中，所述胶原是鱼胶原。尽管所述胶原可以源于这些来源中的任何来源，人胶原是特别的例子。

所述胶原可以源于来源的任何部分。有用的来源包含牛皮、小牛皮、大鼠尾、袋鼠尾和鱼皮。在特定的实施方式中，所述胶原是胎盘胶原，例如牛胎盘胶原、绵羊胎盘胶原或人胎盘胶原。一个例子是人胎盘胶原。

可以以本领域技术人员已知的任何方式处理所述胶原。在某些实施方式中，所述胶原包含端肽。在进一步的实施方式中，所述胶原是去端肽胶原。为了本发明的目的，去端肽胶原包含大量的缺少一个或两个端肽的胶原。例如，按胶原重量计，去端肽胶原组合物可以包含至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的去端肽胶原。在进一步实施方式中，所述胶原可以是本领域技术人员已知的纤维状胶原。在更进一步的实施方式中，所述胶原可以是本领域技术人员已知的酸溶性胶原。制备去端肽胶原、纤维状胶原和酸溶性胶原的技术在以下章节中讨论。

所述胶原可以是本领域技术人员已知的任何类型的胶原或这些胶原的混合物。在某些实施方式中，所述胶原是包含一种或多种类型的胶原的胶原组合物形式。特定的胶原包含I型胶原、II型胶原、III型胶原和IV型胶原。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含特定量的这些胶原。特定的组合物包含大量的I型胶原，同时也富含IV型胶原。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含1～15％的IV型胶原、2～13％的IV型胶原、3～12％的IV型胶原或4～11％的IV型胶原。同时，所述胶原组合物可以包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的I型胶原。例如，所述组合物可以包含75～95％的I型胶原、77.5～92.5％的I型胶原或80～90％的I型胶原。本发明的相同胶原组合物可以包含一定量的III型胶原，例如达到1％、达到2％、达到3％、达到4％或达到5％的III型胶原。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含2～13％的IV型胶原、80～90％的I型胶原和达到5％的III型胶原。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含0～13％的IV型胶原、80～95％的I型胶原和达到5％的III型胶原。

在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含大量的碳水化合物，例如按胶原重量计，至少10、15、20或25μg/mg的碳水化合物。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信高碳水化合物浓度是由于IV型胶原的碳水化合物含量造成的。

本发明的这些胶原组合物可以通过对本领域技术人员显而易见的任何方法得到。下面章节详细说明具体的方法。

如上所述，本发明这一方面的胶原组合物被交联。所述交联剂可以是本领域技术人员已知的任何交联剂。本发明这一方面的特定交联剂是以下结构的烷基二醇或烷基多元醇：

R¹-CH₂-O-[-X-O-CH₂-R²-]_n

其中X是C₁-C₈烷基(直链或支链的)，R¹和R²分别独立地是氢或反应性基团，其中n是1～100的整数。在特定的实施方式中，所述交联剂是多官能的交联剂。在某些实施方式中，n是1，并且所述交联剂是双官能的交联剂。在某些实施方式中，每一个R¹和R²独立地是环氧化物或醛。在某些实施方式中，R¹或R²中的至少一个是环氧化物。在某些实施方式中，所述交联剂是甘油多缩水甘油醚(EX-313 EC)或多甘油多缩水甘油醚(EX-512EC)。

在某些实施方式中，X是直链C₄烷基，R¹和R²分别是环氧化物，即所述交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

1，4-丁二醇二缩水甘油醚

进一步的示例性交联剂以及将它们用于交联胶原的方法记载在美国专利号5,880,242和6,117,979以及Zeeman等，2000，J Biomed Mater Res.51(4)：541-8；van Wachem等，2000，J Biomed Mater Res.53(1)：18-27；van Wachem等，1999，J Biomed Mater Res.47(2)：270-7；Zeeman等，1999，J Biomed Mater Res.46(3)：424-33；Zeeman等，1999，Biomaterials 20(10)：921-31中，在此引入它们的全部内容作为参考。在特定的实施方式中，所述交联剂用于交联任何来源的酸溶性去端肽胶原。在特定的实施方式中，所述酸溶性去端肽胶原源于人胎盘。

可以通过本领域技术人员显而易见的任何方法进行交联，例如，通过上述文献中记载的方法或根据本文所述的方法。在某些实施方式中，按重量计，相对于胶原的量，使用约0.1∶10～10∶0.1的1，4-丁二醇二缩水甘油醚。在某些实施方式中，该比例为1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或10∶1。在某些实施方式中，按重量计，该比例为4∶1的BDDE：胶原。在特定的实施方式中，如本文所述，通过催化剂如吡啶催化交联反应。

在进一步实施方式中，使用京尼平(genipin)交联本发明的胶原组合物。京尼平是无毒性的天然交联剂。其可以从母体化合物京尼平甙(geniposide)得到，京尼平甙可以从栀子花(Gardenia jasminoides)的果实分离出来。京尼平可以从Challenge Bioproducts有限公司，7 Alley 25，Lane 63，TzuChiangSt.404 Taichung Taiwan R.O.C.，电话886-4-3600852购得。京尼平作为交联剂的用途大量地记载在美国专利申请公开号20030049301中，在此引入其全部内容作为参考。

在进一步的实施方式中，所述胶原组合物可以用本领域技术人员已知的其它交联剂交联。例如，本发明的胶原组合物可以根据本领域技术人员已知的方法用戊二醛交联。这种方法大量地记载在例如美国专利号4,852,640、5,428,022、5,660,692和5,008,116以及McPherson等，1986，J.Biomedical Materials Res.20：79-92中，在此引入它们的全部内容作为参考。

在进一步的实施方式中，所述胶原组合物可以用本领域技术人员已知的任何酶介导的交联技术交联。例如，本发明的胶原组合物可以根据本领域技术人员已知的方法通过转谷氨酰胺酶交联。转谷氨酰胺酶在胶原的谷氨酰胺和赖氨酸残基之间催化形成酰胺交联。这种方法记载在例如Orban等，2004，J.Biomedical Materials Res.68(4)：756-62中，在此引入它们的全部内容作为参考。

可以用单一交联剂或交联剂的混合物使本发明的胶原组合物交联。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物包含用1，4-丁三醇二缩水甘油醚交联的酸溶性人胎盘胶原。在特定的实施方式中，所述胶原是去端肽胶原。

在某些实施方式中，本发明的胶原组合物还可以包含透明质酸。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信包含透明质酸可以促进纤维原细胞迁移进入或穿过本发明的胶原组合物。可以通过在对本领域技术人员显而易见的任何适合的条件下将本发明的胶原组合物与透明质酸接触制备所述包含透明质酸的胶原组合物。在某些实施方式中，所述组合物的胶原被交联。在进一步实施方式中，所述组合物的透明质酸被交联。在进一步实施方式中，所述胶原和透明质酸均被交联。在特定的实施方式中，二者被交联到一起。所述交联剂可以是本领域技术人员已知的任何适合的交联剂，包含本文所述的戊二醛、京尼平和1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

在某些实施方式中，包含透明质酸的组合物可以包含重量比0.1∶99.9～99.9∶0.1的透明质酸∶胶原。在某些实施方式中，该比例为0.1∶99.9、1∶99、5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、99∶1或99.9∶0.1。包含未交联的透明质酸的胶原组合物及其制备方法大量地记载在美国专利号4,803,075和5,137,875中，在此引入它们的全部内容作为参考。可以通过对本领域技术人员显而易见的技术或本文所述的那些技术进行交联。

4.3制备本发明的胶原组合物的方法

在另一个方面中，本发明提供了用于制备本发明的胶原组合物的方法。所述方法可用于例如制备上述的本发明的胶原组合物。

在某些实施方式中，根据本文所述的方法从人胎盘制备本发明的胶原组合物。从人胎盘制备胶原组合物的初始步骤详细地记载在美国专利号5,428,022、5,660,692和5,008,116以及美国专利申请公开号20040048796和20030187515中，在此引入它们的全部内容作为参考。

所述胎盘组织可以是源于胎盘的任何部分，包含羊膜，不管是可溶的或不溶的或这两者，绒毛膜、脐带或源于整个胎盘。在某些实施方式中，所述酸溶性胎盘胶原从除去脐带的整个人胎盘制备。

胎盘囊(placental sac)由通过疏松结缔组织紧密连接的两层构成。它们称作羊膜层和绒毛膜层。羊膜层是这两层中的最内层，并与包围胎儿的羊水接触，它们一起形成羊膜囊。羊膜层是无血管的，并由在基膜上的简单柱状上皮细胞作衬里，测得其厚度30-60微米。绒毛膜是囊的外层，其被严重细胞化。血管树在胎盘上发源，并通过绒毛膜层延伸至胎盘膜。绒毛膜层通过疏松结缔组织与羊膜层分离且结合在一起测得这两层的厚度为120-180微米。胎盘膜具有填充了大量粘多糖的胶原基质，并且认为它们主要用作正在长大的胎儿的保护囊。该膜也维持了对母体循环中的传染性和免疫性试剂的屏障。胎盘膜具有主动和被动输送方式。大多数小分子和蛋白可以通过自由地通过膜，但是大蛋白如IgM不能穿过基底层。

在特定的实施方式中，在本发明的方法中使用的胎盘在分娩出婴儿后尽快采集。在另一特定的实施方式中，所述胎盘在剖腹产分娩出正常健康婴儿后立即采集。有利的是，所述胎盘在无菌条件下收集。在一些实施方式中，在任何进一步处理之前，所述胎盘从分娩开始保存48小时。在其它实施方式中，在任何进一步处理之前，所述胎盘从分娩开始保存达到5天。

有利的是，可以将胎盘、脐带和脐带血从分娩或产房运送到另一个地点，例如实验室，以进一步处理。胎盘可以在消过毒的运输装置如消毒袋或容器中被运送，任选地，该装置是绝热的。在一些实施方式中，所述胎盘保存在室温下，直到进一步处理。在其它实施方式中，所述胎盘被冷藏，直到进一步处理，即在约2°～8℃的温度下保存。在其它实施方式中，在进一步处理之前，所述胎盘在无菌条件下保存达到5天。在特定的实施方式中，如本领域技术人员已知的，在无菌条件下处理所述胎盘。实验室可以配有HEPA过滤系统(按洁净室分类，等级为1000或更好)。在特定的实施方式中，在使用进行本发明方法的实验室之前，所述HEPA过滤系统打开至少1小时。

在某些实施方式中，所述胎盘被除血，即完全排出出生后残余的脐带血。在一些实施方式中，所述胎盘被70％除血、80％除血、90％除血、95％除血、99％除血。

本发明包含在生产之前使用本领域技术人员已知的标准技术对孕妇进行传染性疾病，包含但不限于HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV和已知会感染胎盘组织的其它病毒性病原体的筛选。有利的是，所述方法可用于按照美国联邦药物管理局的规定筛选传染性疾病。可以在生产的一个月内、特别是生产的两周内、生产的一周内或在生产时筛选孕妇(例如，出于诊断目的采集血样)。只有当捐赠者的母亲经检测对上述病原体呈阴性或非反应性时，从捐赠者收集的组织才被用于制造本发明的胶原组合物。有利的是，可以得到胎盘膜捐赠者的完备的父系史和医疗史以及社交史，包含例如详细的家庭史。

在某些实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准血清学和细菌学测试筛选捐赠者。识别病原体的任何分析或诊断测试都在本发明方法的范围内，但特定的分析是将高精度与高通量能力相组合的分析。在具体实施方式中，本发明包括使用本领域技术人员已知的标准技术筛选捐赠者的抗原和/或抗体。抗原和抗体的非限制性例子包括：抗体筛选(ATY)；丙氨酸氨基转移酶筛选(ALT)；肝炎核心抗体(核酸和ELISA)；B型肝炎表面抗原；C型肝炎病毒抗体；HIV-1和HIV-2；HTLV-1和HTLV-2；梅毒测试(RPR)；CMV抗体测试；和C型肝炎和HIV测试。使用的分析可以是本领域技术人员已知的基于核酸的分析或基于ELISA的分析。

本发明包括使用本领域技术人员已知的标准技术进一步测试新生儿的脐带血(例如参见，Cotorruelo等，2002，Clin Lab.48(56)：27181；Maine等，2001，Expert Rev.Mol.Diagn.，1(1)：1929；Nielsen等，1987，J Clin.Microbiol.25(8)：140610；在此引入它们的全部内容作为参考)。在一实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准技术测试婴儿的脐带血的细菌病原体(包含但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)和真菌。在具体实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准技术测定新生儿的脐带血的血型和Rh因子。在另一实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准方法从新生儿的脐带血得到CBC(全血计数)以及分类计数。在另一实施方式中，使用本领域技术人员已知的标准方法从新生儿的脐带血中采集需氧细菌培养物。仅有从下述捐赠者收集的组织才被用于制造本发明的胶原组合物：所述捐赠者的CBC在正常限制内(例如，没有总体上的异常或偏离正常水平)、血清学和细菌学测试呈阴性并且传染性疾病和传染测试呈阴性或非反应性。

一旦得到人胎盘组织，可以根据以下步骤处理以制备本发明的胶原组合物。尽管按顺序列出以下步骤，但是本领域技术人员应理解，几个步骤的顺序可以交换，而不会超出本发明的范围。此外，依据本发明的所需胶原组合物的性质，几个步骤可被表示为任选的。据推定，对本领域技术人员显而易见的技术，如缓冲液更换、沉淀、离心、重悬、稀释和浓缩蛋白组合物，不需要详细解释。示例性制备记载在以下实施例中。

胎盘的任何部分或整个胎盘均可以用在本发明的方法中。在某些实施方式中，胶原组合物从整个胎盘制备。然而，在某些实施方式中，胶原组合物可以从胎盘的绒毛膜或羊膜部分得到。

在这些实施方式中，本发明包括处理胎盘膜，使脐带与胎盘分离，并将羊膜与绒毛膜分离。在特定的实施方式中，在切断胎盘膜之前使羊膜与绒毛膜分离。可以从胎盘膜的边缘开始进行羊膜与绒毛膜的分离。在另一实施方式中，使用钝剥离法例如使用带手套的手指将羊膜与绒毛膜分离。在使羊膜与绒毛膜和胎盘分离之后，例如使用剪刀切断脐带头，并将其与胎盘脱离。在某些实施方式中，当在未撕裂组织的情况下不能使羊膜和绒毛膜分离时，本发明包括将羊膜和绒毛膜作为一块从胎盘切断，然后将它们剥开。

羊膜、绒毛膜或整个胎盘在用于本发明的方法之前可以保存。保存技术对本领域技术人员是显而易见的。示例性保存技术记载在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中，在此引入它们的全部内容作为参考。

在本发明的方法中，所述胎盘组织被去细胞。所述胎盘组织可以根据本领域技术人员已知的任何技术被去细胞，如详细记载在美国专利申请公开号20040048796和20030187515中的技术，在此引入它们的全部内容作为参考。

在某些实施方式中，所述胎盘组织被进行渗透压冲击。渗透压冲击步骤可以产生具有有益纯度的本发明的胶原组合物。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是认为渗透压冲击可以使组织中的细胞破裂，从而有利于细胞、细胞成分和血液成分的去除。根据本领域技术人员的判断，渗透压冲击可以是任何清除步骤之外的步骤，或可以是唯一的清除步骤。

渗透压冲击可以在本领域技术人员已知的任何渗透压冲击条件下进行。这些条件包括在高渗透势或低渗透势或交替的高和低渗透势的溶液中培养组织。高渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何高渗透势溶液，如包含NaCl(例如0.2-1.0M)、KCl(例如0.2-1.0或2.0M)、硫酸铵、单糖、二糖(例如20％蔗糖)、疏水性聚合物(例如聚乙二醇)、甘油等中的一种或多种的溶液。在某些实施方式中，高渗透势溶液是氯化钠溶液。在一些实施方式中，氯化钠溶液是至少0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M或2.5M的NaCl。在一些实施方式中，氯化钠溶液是约0.25-5M、约0.5-4M、约0.75-3M或约1.0-2.0M的NaCl。

低渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何低渗透势溶液如水，例如根据本领域技术人员已知的任何方法去离子水。

在某些实施方式中，渗透压冲击在氯化钠溶液中，然后在水溶液中进行。在一些实施方式中，氯化钠溶液是至少0.5M NaCl。在某些实施方式中，氯化钠溶液是至少0.75M NaCl。在一些实施方式中，氯化钠溶液是至少1.0M NaCl。在一些实施方式中，氯化钠溶液是至少1.5M NaCl。在一些实施方式中，氯化钠溶液是至少2.0M NaCl。在某些实施方式中，一次0.5MNaCl洗涤后进行一次水洗涤。在某些实施方式中，两次0.5M NaCl洗涤后进行一次水洗涤。在某些实施方式中，一次2M NaCl洗涤后进行一次水洗涤。可以根据本领域技术人员的判断重复这些顺序。

在某些实施方式中，获自渗透压冲击的胶原组合物可以在碱性条件下培养。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信碱洗可以除去可能污染胶原组合物的病毒性颗粒。碱性条件可以是本领域技术人员已知的任何碱性条件。特别地，可以使用已知能除去病毒性颗粒的任何pH的任何碱。碱洗用的特定碱包含生物可相容的碱、挥发性碱和本领域技术人员已知的能够容易并且安全地从胶原组合物除去的碱。碱可以是本领域技术人员已知的浓度例如为0.2-1.0M的任何有机或无机碱。在某些实施方式中，在氢氧化钠溶液中进行碱洗。氢氧化钠溶液可以是0.1M NaOH、0.25MNaOH、0.5M NaOH或1M NaOH。在特定的实施方式中，碱洗在0.1M或0.5M NaOH中进行。

在某些实施方式中，获自渗透压冲击的胶原组合物可以在酸性条件下培养。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信酸洗可以使可能污染胶原组合物的低分子量多肽沉淀和/或有利于除去低分子量多肽。酸性条件可以是本领域技术人员已知的任何酸性条件。特别地，可以使用已知能够使污染的低分子量蛋白沉淀的任何pH的任何酸。酸洗用的特定酸是生物可相容的酸、挥发性酸和本领域技术人员已知的能够容易并且安全地从胶原组合物除去的酸。酸可以是本领域技术人员已知的浓度例如为0.2-1.0M的任何有机或无机酸，如甲酸、柠檬酸、盐酸或醋酸。在某些实施方式中，酸洗在0.5M醋酸中进行。

根据本领域技术人员的判断，酸洗可以在任何温度下进行。在某些实施方式中，在约0-30℃、约5-25℃、约5-20℃或约5°-15℃下进行酸洗。在某些实施方式中，在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约30℃下进行酸洗。在特定的实施方式中，在约5-15℃下进行酸洗。

根据本领域技术人员的判断，酸洗可以进行适合长的时间。在某些实施方式中，酸洗可以进行约1-24小时、约2-20小时、约5-15小时、约8-12小时或约2-5小时。

在需要时，可以在酸洗溶液中加入酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是观察到，酸洗中的胃蛋白酶可以减少胶原组合物中的杂质。胃蛋白酶在酸洗溶液的量可以根据本领域技术人员的判断。在一些实施方式中，在酸洗溶液中有约0.1g、约0.5g、约1.0g、约2.0g或约5.0g胃蛋白酶/kg冷冻胎盘。在其它实施方式中，在酸洗溶液中有约0.1g、约0.5g、约1.0g、约2.0g或约5.0g胃蛋白酶/胎盘。在某些实施方式中，在酸洗溶液中有约0.1-2.0g/l、约0.2-1.5g/l或约0.5-1.0g/l胃蛋白酶。在一些实施方式中，在酸洗溶液中有约0.1g/l、约0.2g/l、约0.5g/l、约1.0g/l或约2.0g/l胃蛋白酶。在特定实施方式中，在约5℃-15℃下，约0.5g/l胃蛋白酶在酸洗溶液中约2-5小时。在特定实施方式中，在约5℃-6℃下，约0.5g/l胃蛋白酶在酸洗溶液中约18-24小时。

在需要去端肽胶原的某些实施方式中，将所述胶原组合物与能够部分或完全地从胶原除去端肽的酶接触。对本领域技术人员将显而易见的是，当不需要去端肽胶原时，则不将使用该步骤。所述酶可以是本领域技术人员已知的能够从胶原除去端肽的任何酶。在某些实施方式中，所述酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。用酶处理胶原组合物以除去端肽的方法详细地记载在美国专利号4,511,653、4,582,640、5,436,135和6,548,077中，在此引入它们的全部内容作为参考。通常，在本领域技术人员已知的适于除去端肽的条件下将所述酶与所述胶原组合物接触。这些条件包括例如在适合的pH下，在适合的酶浓度下，在适合体积的溶液中，在适合的温度下，使酶与胶原组合物接触适合的时间。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物可以在低pH条件下与酶接触。在某些实施方式中，胶原组合物在pH约1-3或约2-3下与胃蛋白酶接触。

在某些实施方式中，酶在升高的温度下与胶原组合物接触。尽管不意图被任何特定操作理论所束缚，但是相信升高的温度可以提高I型胶原在最终胶原组合物中的产率。在某些实施方式中，胶原组合物在约15-40℃、约20-35℃、约25-30℃、约20-30℃或约23-27℃下与胃蛋白酶接触。在特定的实施方式中，胶原组合物在约23-27℃下与胃蛋白酶接触足以除去端肽的一段时间。

根据本领域技术人员的判断，胶原组合物与酶接触足以除去端肽的一段时间。在某些实施方式中，所述胶原与胃蛋白酶接触至少5、10、15、20、25或30小时。在某些实施方式中，所述胶原与胃蛋白酶接触约5-30小时、约10-25小时或约20-25小时。在某些实施方式中，所述胶原与胃蛋白酶接触约8、16、24或32小时。

根据本领域技术人员的判断，所述胶原组合物与适于除去端肽的量的酶接触。在一些实施方式中，约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g胃蛋白酶/kg冷冻胎盘与胶原组合物接触。在其它实施方式中，约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g胃蛋白酶/胎盘与胶原组合物接触。在某些实施方式中，所述胶原组合物与约0.1-10.0g/L、约0.5-5/L、约1-2.5g/L或约0.5-1.5g/L胃蛋白酶接触。在一些实施方式中，所述胶原组合物与约0.1g/L、约0.2g/L、约0.5g/L、约1.0g/L、约2.0g/L、5g/L或10g/L胃蛋白酶接触。在特定的实施方式中，所述胶原组合物在pH约2-3的醋酸溶液中，在约23℃-27℃下，与约0.5-1.0g/L胃蛋白酶接触约16-24小时。

根据本领域技术人员的判断，所述胶原组合物在适合的溶液体积：胎盘中与酶接触以除去端肽。据观察，与胎盘的高体积比可以使胃蛋白酶的作用最大化。在某些实施方式中，使用约1、2、4或8体积的醋酸溶液/胎盘。在特定的实施方式中，使用约2体积的醋酸溶液/胎盘。

在进一步的步骤中，所述胶原组合物通过盐析纯化。盐析可以是本领域技术人员已知的任何盐析。盐可以是例如硫酸铵、KCl、NaCl或本领域技术人员已知的可用于使蛋白沉淀的任何其它盐。盐可以本领域技术人员已知的任何技术加到胶原组合物中。例如，盐可以浓缩液体盐溶液的形式加到胶原组合物中，直到得到所需浓度。在某些实施方式中，初始的低盐沉淀后进行高盐沉淀。在这些方法中，本发明的胶原组合物所需的胶原保持在低盐沉淀的上清液中，并且在高盐沉淀中沉淀。在特定的实施方式中，所述低盐沉淀是约0.2M NaCl，而所述高盐沉淀是约0.7M NaCl。在某些实施方式中，使用高盐沉淀纯化胶原组合物。在某些实施方式中，所述高盐沉淀是约0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1.0M NaCl。在特定实施方式中，所述高盐沉淀是约0.7M NaCl。在每次沉淀中，可以通过对本领域技术人员将显而易见的标准技术如离心、过滤、重悬和浓缩从上清液或沉淀中回收本发明的胶原组合物。根据本领域技术人员的判断可以重复每一种盐析，并且根据本领域技术人员的判断可以在需要时洗涤沉淀物。任何得到的沉淀物可以例如在酸性条件下再次溶解或重悬。

在某些实施方式中，所述胶原组合物可以通过色谱纯化。所述色谱可以是本领域技术人员已知的任何色谱。所述色谱例如可以是尺寸或离子交换色谱或本领域技术人员已知的可用于纯化蛋白的任何其它色谱。在某些实施方式中，所述胶原组合物通过离子交换色谱纯化。在某些实施方式中，阴离子交换和/或吸附介质可以结合杂质蛋白，并且阳离子交换介质可以结合胶原。然后，可以例如通过使用盐溶液如氯化钠溶液选择性洗脱回收胶原。

在某些实施方式中，可以用低分子量过滤器过滤所述胶原组合物以浓缩样品并清除内毒素。例如，可以用100kDa过滤器或30kD过滤器或这二者过滤所述胶原组合物，以浓缩和/或除去内毒素。在某些实施方式中，可以用高分子量过滤器过滤所述胶原组合物以除去病毒。例如，可以用1000kDa、750kDa或500kDa过滤所述胶原组合物以除去病毒如HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、疱疹、细小病毒和本领域技术人员所不希望的其它病毒性传染物。下面详细说明这些方法。

在需要时，可以通过纤维化进一步处理本发明的胶原组合物。可以通过本领域技术人员已知的使胶原纤维化的任何技术进行纤维化。在某些实施方式中，所述胶原组合物在3-3.5mg/ml胶原、30mM磷酸钠、pH 7.2中、在约32℃下纤维化约20-24小时。胶原组合物的纤维化大量地记载在美国专利号4,511,653、4,582,640和5,436,135中，在此引入它们的全部内容作为参考。如果有必要，在纤维化之前可以根据标准技术使胶原组合物浓缩。任选地，所述胶原组合物可以例如在20mM Na₂PO₄，pH 7.4、130mMNaCl中洗涤一次或多次。

在需要时，本发明的胶原组合物可以被交联。在某些实施方式中，在交联之前使胶原组合物纤维化。可以使用本领域技术人员已知的任何交联剂进行交联，例如，在以上章节中讨论过的交联剂。在某些实施方式中，交联剂可以是戊二醛，并可以根据本领域技术人员已知的戊二醛交联胶原的方法进行交联。在其它实施方式中，交联剂可以是1，4-丁二醇二缩水甘油醚或京尼平。在特定的实施方式中，交联剂是1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

可以通过对本领域技术人员显而易见的技术或本文所述的那些技术进行交联。在某些实施方式中，按重量计，相对于胶原的量，使用约0.1∶10～10∶0.1的1，4-丁二醇二缩水甘油醚。在某些实施方式中，该比例为1∶10、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或10∶1。在某些实施方式中，按重量计，该比例为4∶1的BDDE∶胶原。可以使用标准技术进行交联，例如使用BDDE在25℃下培养约24小时或直到溶液的pH达到10.0～10.5。

尽管可以在未加入催化剂的情况下进行交联，但是在某些实施方式中，使用催化剂可以有利地加速反应。可以使用本领域技术人员已知可加速交联剂上的反应性基团如环氧基团或醛基和胶原上的官能团如胺基、羧基或羟基之间的反应的任何催化剂。这样的催化剂包括路易斯酸和路易斯碱。其例子包含叔胺:三乙胺、吡啶、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。催化剂也可以是无机碱，如氢氧化钠或氢氧化钾。其它化合物，如四取代的有机硼酸盐也是适用的，如乙基三苯基溴化磷。在特定的实施方式中，通过催化剂如吡啶催化交联反应。

在一些实施方式中，交联剂和胶原之间的共价键可以被还原，例如用于提高稳定性。可以通过使本发明的胶原组合物与本领域技术人员已知的任何还原剂接触进行还原。在某些实施方式中，还原剂是硼氢化钠、亚硫酸氢钠、β-巯基乙醇、巯基乙酸、巯基乙基胺、苄硫醇、甲苯硫酚、二硫代苏糖醇或膦如三丁基膦。硼氢化钠是有用的例子。在某些实施方式中，在用还原剂还原之前将胶原交联。胶原组合物的还原和交联的胶原组合物大量地记载在美国专利号4,185,011、4,597,762、5,412,076和5,763,579中，在此引入它们的全部内容作为参考。

在某些实施方式中，如果需要包含胶原和透明质酸的组合物，可以根据本领域技术人员已知的任何技术，通过使胶原与透明质酸接触制备胶原组合物。制备进一步包含透明质酸但未交联的胶原组合物的技术大量地记载在美国专利号4,803,075和5,137,875中，在此引入它们的全部内容作为参考。如果需要交联，可以根据本文所述的方法进行交联。在某些实施方式中，在与透明质酸接触之前使所述胶原交联。在进一步实施方式中，在与胶原接触之前使透明质酸交联。在某些实施方式中，在彼此接触之前，使胶原和透明质酸交联。在某些实施方式中，使同一组合物中的胶原和透明质酸接触，然后交联。这些组合物中的任何一种可以根据本文所述的方法进一步还原，这对本领域技术人员是显而易见的。

在某些实施方式中，可以根据本领域技术人员已知的方法通过机械剪切进一步处理胶原组合物。示例性剪切技术记载在美国专利号4,642,117中，在些引入其全部内容作为参考。在某些实施方式中，使用本领域技术人员已知的组织均质器剪切所述胶原组合物。

在某些实施方式中，可以采取步骤限制本发明的胶原组合物中的蛋白酶活性。添加剂如金属离子螯合剂例如1，10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA)产生不利于多种蛋白水解酶的环境。提供蛋白酶如胶原酶的次优化条件可以有助于防止胶原组合物的降解。蛋白酶的次优化条件可以通过配制组合物以除去或限制溶液中可用的钙和锌离子的量来实现。许多蛋白酶在钙和锌离子存在下是有活性的，而在没有钙和锌离子的环境中失去大部分活性。有利的是，通过选择pH条件、降低钙和锌离子的来源、存在金属离子螯合剂和使用对胶原酶特异性的蛋白水解抑制剂，制备胶原组合物。例如，胶原组合物可以包含缓冲水溶液，pH 5.5～8或pH 7～8，没有钙和锌离子，并包含金属离子螯合剂如EDTA。另外，在处理胶原组合物过程中也可对温度和时间参数进行控制以限制蛋白酶的活性。

4.4胶原组合物的表征

4.4.1生物化学表征

本领域中已知的和本文例举的基于生物化学的分析可用于测定本发明的胶原组合物生物化学组成。本发明包括用于测定样品的总蛋白含量的基于生物化学的分析，例如基于吸光度的分析和基于比色法的分析。基于吸光度的分析包括但不限于在280nm下测量吸光度的分析(参见例如，Layne，E，Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for MeasuringProteins，Methods in Enzymology 3：447-455，(1957)；Stoscheck，CM，Quantitation of Protein，Methods in Enzymology 182：50-69，(1990)；在此引入其全部内容作为参考)，在205nm下的分析，以及基于样品的消光系数的分析(参见例如，Scopes，RK，Analytical Biochemistry 59：277，(1974)；Stoscheck，CM.Quantitation of Protein，Methods in Enzymology 182：50-69，(1990)；在此引入其全部内容作为参考)。本发明包括测定本发明的胶原组合物中特异性蛋白的总含量的方法，包括但不限于胶原(例如，I型、III型、IV型胶原)、层粘蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白和糖胺聚糖。

基于比色法的分析包括但不限于改进的Lowry分析、双缩脲分析、Bradford分析、二辛可宁酸(Smith)分析(例如参见，Stoscheck，CM，Quantitation of Protein，Methods in Enzymology 182：50-69(1990))。

在具体实施方式中，使用Bradford染料结合分析(Bradford，M.，Analytical Biochemistry，72，248(1976)，在此引入其全部内容作为参考)测量本发明的胶原组合物的总蛋白含量。本发明方法中使用的示例性Bradford分析可以包含以下分析：可以使用通过BIO-RAD，Basedmond，CA，USA得到的Bradford染料结合分析进行分析。蛋白分析是基于染料考马斯亮蓝R-250响应不同的蛋白浓度的颜色变化。该分析包含通过测量一系列已知浓度的人胶原标准的吸光度(在595纳米下)建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定胶原在待测样品例如羊膜样品中的浓度。该分析被开发成允许测量0.2-1.4mg/mL的胶原浓度的标准形式和测量蛋白浓度达到25μg的微分析。对于标准分析，将溶解在100mM柠檬酸(pH 2.4)中的胶原等份地加到1.5mL微离心管中，浓度为0.1-1mg/mL，总体积为0.1mL。向每一管中加入1mL考马斯亮蓝染料。使样品涡旋并在室温下静置10分钟。在595纳米(nm)下测量吸光度。对于微分析，将溶解在100mM柠檬酸(pH 2.4)中的胶原以0.1mL的总体积(2.5-30μg/mL)等份地加到96-孔板的孔中。向每一孔中加入10μL染料试剂。使样品涡旋，并在室温下放置10分钟，然后在595nm下在读板仪中测量吸光度。对于本发明的胶原组合物，待测样品被重复分析三次。通过参考标准曲线测定蛋白浓度。蛋白浓度计算作膜总干重的百分比。在约10％的误差范围内，每个膜中的蛋白含量基本上占膜总干重的95％或更大。水含量可以较低并在实验误差内(约10％)。

使用本领域技术人员已知的和本文例举的方法可以对本发明的胶原组合物的总胶原含量进行估计。在具体实施方式中，使用Biocolor公司，英国制造的定量的基于染料的分析试剂盒(SIRCOL)测量本发明的胶原组合物的胶原含量。该分析利用Sirius Red(或Direct Red 80)作为特异性胶原结合染料。在紫外-可见分光光度计中，结合胶原的染料在540nm下的吸光度呈现浓度依赖性增加。该分析包含通过测量一系列已知浓度的牛胶原标准的吸光度而建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定胶原在待测样品例如羊膜样品中的浓度。在示例性分析中，将胶原(1mg/mL)等份地加到1.5mL微离心管中，浓度为5-100μg/100μL。样品体积用水调节至100μL。在室温下向每一样品中加入1mL SIRCOL染料试剂。盖住样品管，在室温下放置30分钟，同时机械摇动。然后将样品在12,000×g下离心15分钟，使用吸液管排出液体。将在每一管底部的红色沉淀溶解在1mL 0.5M NaOH(氢氧化钠)中。使用Beckman DU-7400紫外-可见分光光度计在540nm下测量样品的UV吸光度。使用每一样品中胶原的浓度针对540nm下的吸光度(OD)绘制标准校正曲线。为测定实验误差，在胶原标准的一个低浓度(10μg/100μL)下重复分析(n＝10)。使用相同方法分析膜样品，样品加入后总体积为100μL。

在其它实施方式中，为测定本发明的胶原组合物的胶原类型，可以使用本领域中已知的和本文例举的标准方法，例如ELISA分析。测定本发明的胶原组合物中的胶原类型例如I型、III型和IV型胶原的示例性分析包括使用三明治型ELISA分析，例如由Chondrex公司，Redmond，WA，美国的Anthrogen-CIA胶原-I作为试剂盒提供的分析。对于III型和IV型研究，可以从Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA得到一级(捕获抗体)和二级抗体(检测抗体)和胶原标准。检测抗体是生物素化的人I型、III型或IV型胶原，其结合链霉抗生物素过氧化物酶。与发色底物和尿素及H₂O₂的酶反应产生黄色，通过紫外-可见光谱法在490nm下检测。为量化胶原类型的量，使用一系列已知浓度的人胶原标准的样品建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定羊膜待测样品中的胶原浓度。根据ELISA试剂盒的推荐建立分析方法。为建立标准校正曲线，通过加入试剂盒提供的100μL 100X-稀释的捕获抗体，用捕获抗体(抗人I型胶原抗体，非偶联的)包被96-孔板中的10-12个孔。过夜培养后，用洗涤缓冲液洗涤各孔三次，除去未结合的抗体。然后，将人I型胶原加到各孔中，浓度从0增加到5μg/mL，100μL体积。在室温下培养2小时，用洗涤缓冲液洗涤各孔三次，除去未结合的胶原。然后，将生物素化的胶原-I抗体以100μL的体积加到孔中的抗体-胶原复合体中，并允许在室温下结合2小时。用洗涤缓冲液洗涤未结合的抗体三次。通过加入试剂盒提供的酶的200X-稀释的样品并使其在室温下培养1小时，使检测酶链霉抗生物素过氧化物酶与抗体-胶原-抗体复合体结合。重复洗涤96-孔板(6次)，除去任何未结合的酶。将发色底物+尿素/H₂O₂以100μL的体积加到每一孔中。反应在室温下进行30分钟。通过加入50μL 2.5N硫酸终止反应。在490nm下测量吸光度。

在其它实施方式中，本发明包括使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的总弹性蛋白含量的分析。用于测量本发明的胶原组合物的弹性蛋白含量的示例性分析可以包含Biocolor公司，英国制造的定量的基于染料的分析试剂盒(FASTIN)。该分析利用5，10，15，20-四苯基-21，23-卟啉(TPPS)作为特异性弹性蛋白结合染料(参见例如，Winkleman，J.(1962)，Cancer Research，22，589-596，在此引入其全部内容作为参考)。在紫外-可见分光光度计中，结合弹性蛋白的染料在513nm下的吸光度呈现浓度依赖性增加。该分析包含通过测量一系列已知浓度的牛弹性蛋白标准的吸光度而建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定弹性蛋白在待测样品例如羊膜样品中的浓度。将弹性蛋白(1mg/mL)以5-100μg/100μL的浓度等份地加到1.5mL微离心管中。样品体积用水调节至100μL。在4℃向每一样品中加入1mL弹性蛋白沉淀试剂(三氯乙酸+精氨酸)，并在同一温度下保存过夜。在过夜沉淀步骤后，将样品在12,000×g下离心15分钟，使用吸液管排出液体。向每一样品中，加入1mL FASTIN染料试剂(TPPS)，以及100μL90％饱和硫酸铵。盖住样品管，在室温下培养1小时，同时机械摇动。硫酸铵用于使弹性蛋白-染料复合体沉淀。在1小时混合步骤后，将样品在12,000×g下离心15分钟，使用吸液管排出液体。将在每一管底部的棕色沉淀溶解在1mL FASTIN解离试剂中，该试剂是盐酸胍的1-丙醇溶液。使用Beckman DU-7400紫外-可见分光光度计在513nm下测量样品的UV吸光度。使用每一样品中弹性蛋白的浓度针对513nm下的吸光度(OD)绘制标准校正曲线。为测定分析中的实验误差，在弹性蛋白标准的一个低浓度(10μg/100μL)下重复分析(n＝10)。使用相同方法分析膜样品，样品加入后总体积为100μL。每一样品重复分析三次。

在其它实施方式中，本发明包括使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的总糖胺聚糖(GAG)含量的分析。通过使用由Biocolor公司，英国制造的定量的基于染料的分析试剂盒(BLYSCAN)测量本发明的胶原组合物中存在的GAG。该分析利用1，9-二甲基-亚甲基蓝作为特异性GAG结合染料。在紫外-可见分光光度计中，结合GAG的染料在656nm下的吸光度呈现浓度依赖性增加。该分析包含通过测量一系列已知浓度的牛GAG标准的吸光度而建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定GAG在羊膜待测样品中的浓度。将牛GAG(0.1mg/mL)以0.5-5μg/100μL的浓度等份地加到1.5mL微离心管中。样品体积用水调节至100μL。在室温下向每一样品中加入1mL 1，9-二甲基-亚甲基染料试剂。盖住样品管，在室温下培养30分钟，同时机械摇动。然后将样品在12,000×g下离心15分钟，使用吸液管排出液体。将在每一管底部的红色沉淀溶解在1mL染料解离试剂中。使用Beckman DU-7400紫外-可见分光光度计在656nm下测量样品的UV吸光度。使用每一样品中GAG的浓度针对540nm下的吸光度(OD)绘制标准校正曲线。为测定分析中的实验误差，在GAG标准的一个低浓度(1μg/100μL)下重复分析(n＝8)。使用相同方法分析膜样品，样品加入后总体积为100μL。每一样品重复分析三次。

在其它实施方式中，本发明包括使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的总层粘蛋白含量的分析。测定本发明的胶原组合物中的总层粘蛋白含量的示例性分析可以包含以下分析：可以使用来自Takara Bio公司，Shiga，日本的作为试剂盒提供的三明治型ELISA分析(Cat#MKIO7)。该试剂盒包含用一级抗体(捕获抗体)预包被的96-孔板，该抗体是人层粘蛋白的鼠科单克隆抗体。二级抗体(检测抗体)和人层粘蛋白标准由试剂盒提供。检测抗体是与过氧化物酶偶联的人层粘蛋白抗体。与发色底物四甲基联苯胺和H₂O₂的酶化反应产生蓝色，通过紫外-可见光谱法在450nm下检测。为量化层粘蛋白的量，使用一系列已知浓度的人层粘蛋白标准的样品(试剂盒提供)建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定羊膜待测样品中的层粘蛋白浓度。根据ELISA试剂盒的推荐建立分析方法。为建立标准校正曲线，将试剂盒提供的人层粘蛋白标准加到试剂盒提供的抗体预包被的96-孔板的各孔中，浓度从5ng/mL增加到160ng/mL，终体积100μL。在室温下培养1小时后，用洗涤缓冲液洗涤各孔三次(含有0.05％Tween的PBS)，除去未结合的层粘蛋白。然后将体积为100μL的过氧化物酶-偶联的层粘蛋白抗体加到各孔中的抗体-层粘蛋白复合体中，并允许在室温下结合1小时。重复洗涤96-孔板(4X)，除去任何未结合的酶/抗体偶联物。将体积为100μL的发色底物+H₂O₂加到每一孔中。反应在室温下进行30分钟。通过加入100μL的2.5N硫酸终止反应。在450nm下测量吸光度。在浓度1000ng/mL下测试溶解的膜样品。每个膜样品重复测试三次。如下所示，层粘蛋白浓度表示作总膜重量的浓度。

在其它实施方式中，本发明包括使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的总纤维连接蛋白含量的分析。测定本发明的胶原组合物中的总纤维连接蛋白含量的示例性分析可以包含以下分析：可以使用来自Takara Bio公司，Shiga，日本的作为试剂盒提供的三明治型ELISA分析(Cat#MK115)。该试剂盒包含用一级抗体(捕获抗体)预包被的96-孔板，该抗体是人纤维连接蛋白的鼠科单克隆抗体。二级抗体(检测抗体)和人纤维连接蛋白标准由试剂盒提供。检测抗体是与山葵过氧化物酶偶联的人纤维连接蛋白抗体。与发色底物四甲基联苯胺和H₂O₂的酶反应产生蓝色，通过紫外-可见光谱法在450nm下检测。为量化纤维连接蛋白的量，使用一系列已知浓度的人纤维连接蛋白标准的样品(试剂盒提供)建立标准校正曲线。通过参考标准曲线测定测试样品中的纤维连接蛋白浓度。根据ELISA试剂盒的推荐建立分析方法。为建立标准校正曲线，将人纤维连接蛋白标准加到由试剂盒提供的抗体预包被的96-孔板的各孔中，浓度从12.5ng/mL增加到400ng/mL，终体积为100μL。在室温下培养1小时后，用洗涤缓冲液洗涤各孔三次(含有0.05％Tween的PBS)，除去未结合的纤维连接蛋白。然后将体积为100μL的过氧化物酶-偶联的纤维连接蛋白抗体加到各孔中的抗体-纤维连接蛋白复合体中，并允许在室温下结合1小时。重复洗涤96-孔板(4X)，除去任何未结合的酶/抗体偶联物。将体积为100μL的发色底物+H₂O₂加到每一孔中。反应在室温下进行30分钟。通过加入100μL的2.5N硫酸终止反应。在450nm下测量吸光度。在浓度1000ng/mL下测试溶解的膜样品。每个膜样品重复测试三次。

4.4.2生物相容性研究

本发明的胶原组合物是生物来源的，并含有大量的胶原。然而，与动物来源(牛和猪)的胶原不同，人胶原是非免疫原性的。因为非免疫原性的人组织固有地与其它的人组织是生物可相容的，因此不需要时行若干种标准的生物相容性测试(例如，皮肤刺激和致敏，急性系统性毒性)。本发明包括用于测定本发明的胶原组合物的生物相容性的分析。当在本文中使用时，生物相容性指生物可相容的性能，在活组织中不产生毒性、损伤或免疫应答或排斥。当在身体中使用人造材料时，对未知材料的身体应答是主要关心的问题，因此材料的生物相容性是这类材料重要的设计考量。本发明中包含的生物相容性分析包括但不限于细胞毒性分析、兔眼刺激性测试、溶血分析和热原分析。本发明的生物相容性分析是基于细胞或基于无细胞的分析。

在另一个特定实施方式中，使用ISO MEM洗脱测试(实施例6.4.2.2)测定本发明的胶原组合物的细胞毒性。该研究的目的在于评价胶原组合物在培养的小鼠纤维原细胞中引起细胞毒性应答的能力。在示例性分析中，使用补充有5％胎儿牛血清(FBS)的Eagle最小量必需培养基(E-MEM)提取待测样品。这种培养基还补充有一种或多种以下物质：L-谷氨酰胺、HEPES、庆大霉素、青霉素、万古霉素和两性霉素B(fungizone)。L-929细胞(小鼠纤维原细胞)的培养物在一次性组织培养器具中，在5±1％二氧化碳的空气增湿气氛中，在37±1℃下作为单层生长并使用。使用120cm²样品和20ml-E-MEM加5％FBS的等同比例完整地提取待测样品。在E-MEM加5％FBS中，在37±1℃下，在5±1％二氧化碳中，提取待测样品24-25小时。在提取阶段后，从待测培养孔中除去维持培养基，并用1ml待测培养基/提取物和对照培养基/提取物和掺有氯化镉的阳性对照培养基代替。阳性、中间和阴性对照与待测样品平行进行。待测培养基/提取物和对照培养基/提取物和掺有氯化镉的阳性对照培养基重复装盘三次，并在含有5±1％二氧化碳的空气增湿气氛中，在37±1℃下培养72±4小时。通过在培养24、48和72±4小时的显微镜观察，评价培养物的细胞毒性作用。评价细胞毒性的标准包含细胞的形态变化，如粒化、呈圆齿状或变圆，以及通过溶解或脱离从单层消失的存活的细胞。测试的有效性要求阴性对照培养物在整个测试时间内保持健康正常的外观。毒性程度评分，如下：

0，无，分散的胞质内颗粒；没有细胞溶解。

1，轻微，不多于20％的细胞变圆、松散粘附且没有胞质内颗粒；偶尔存在溶解的细胞。

2，适度，不多于50％的细胞变圆且没有胞质内颗粒；没有大量的细胞溶解，在细胞间没有大量的空区。

3，中度，不多于70％的细胞层含有变圆的细胞和/或被溶解。

4，严重，细胞层接近被完全破坏。

根据USP，评分为“0”、“1”或“2”的待测品将被认为是非毒性的。评分为“3”或“4”的待测品将被认为是毒性的。对于有效测试而言，阳性对照样品其分值必须为“3”或“4”，并且阴性对照样品其分值必须为“0”。

已知兔子的眼部表面比人皮肤更敏感，因此使用兔眼刺激性研究评价本发明的胶原组合物的生物相容性。在示例性分析中，筛选样品的原发性眼部刺激(primary ocular irritation)。使用0.05％脱氧胆酸一水合物钠盐的水溶液(D-Cell)清洗羊膜。根据联邦危险物质法(FHSA)的规章，16 CFR 1500的指导进行测试。在示例性分析中，通过使用辅助光源的大体检查临床判断兔子的对照眼睛为正常。为检测任何预先存在的角膜损伤，使用荧光素染料处理眼睛，用0.9％USP生理盐水(PSS)冲洗，并在暗室中用紫外灯观察。根据标准技术，样品灌入每只兔子一只眼睛的下结膜囊内。每只兔子的另一只眼睛保持未被处理，并用作比较对照。在治疗后将动物送回笼中。在对每只兔子的测试眼睛给药24、48和72小时后，用辅助光源检查并适当放大，与未处理的对照眼睛作比较，对眼部刺激分级。为检测或确认角膜损伤，使用荧光素染料处理待测眼睛，用PSS冲洗，并在24小时在黑暗条件下用紫外灯观察。根据FHSA-改进的Draize评分标准对反应评分。三个动物中的一个表现出显著的阳性反应是临界结果。三个动物中的两个表现出显著的阳性反应是显著的阳性反应，并且待测物被认为是刺激性的。

本发明包含使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的溶血性能(参见实施例6.4.2.4)。溶血描述接触血液的测试样品的溶血性能。其被认作特别有意义的筛选测试，因为其测量与材料和装置接触的血红细胞膜脆性。在示例性分析中，该过程包含使测试材料接触血细胞悬浮液，然后测定释放的血红素量。该测试在静止条件下进行，测试样品与人血直接接触。使用分光光度法在540nm下同时测量阴性和阳性对照的血红细胞释放的血红素量(在转化成氰化变性血红素后)。样品和对照的溶血指数计算如下：

溶血指数＝释放的血红素(mg/mL)×100/存在的血红素(mg/mL)

其中：释放的血红素(mg/ml)＝(常数+X系数)×光密度×16。存在的血红素(mg/mL)＝稀释的血液10±1mg/mL

本发明包括使用本领域中已知的和本文例举的方法测定本发明的胶原组合物的致热性的方法(参见实施例6.4.2.5)。在一个实施方式中，通过使用例如鲎变形细胞溶解产物(LAL)测试测量本发明的胶原组合物中存在的细菌内毒素，测定本发明的胶原组合物的致热性。该测试是检测和量化细菌内毒素的体外分析。在示例性测试中，单独测试胶原组合物(n＝1/批)的98个样品的提取，每次测量1×2cm。通过在37～40℃下在30mL提取液中洗涤每个样品40～60分钟进行提取，同时在轨道震荡器上间歇地涡旋。使用pH试纸证实每个样品提取物的pH为6～8。通过动力学浊度比色测试测量热原水平，测试灵敏度0.05内毒素单位(EU)/mL。通过用检测的内毒素值(EU/mL)×30mL(提取体积/装置)×24(模拟6×8cm尺寸的装置)计算总内毒素水平/样品。

4.4.3微生物学研究

本发明包含本领域中已知的和本文例举的方法以测定本发明的胶原组合物中的微生物的存在，包含但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、白色念株菌(Candida albicans)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、草绿色链球菌(Staphylococcus viridans)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。所述方法可以在制备胶原组合物的任何步骤中使用。在处理中微生物学研究的示例性方法包含以下过程：对在处理中使用的未处理羊膜和设备的“掺有”微生物的样品的测试。样品在掺有以下8种微生物的盐水中浸渍5分钟以故意使样品污染：

1.大肠杆菌       5.白色念株菌

2.肺炎克氏杆菌   6.普通变形杆菌

3.金黄色葡萄球菌 7.草绿色链球菌

4.粪肠球菌       8.绿脓杆菌

有利的是，本发明的除细胞和漂洗方法可以减少本发明的胶原组合物上的微生物量。

本发明包含本领域中已知的和本文例举的方法以测定本发明的胶原组合物的生物负荷(bioburden)。当在本文中使用时，“生物负荷”是在给定量的材料进行工业消毒过程之前其上发现的污染生物体的量度。在示例性方法中，测定实现消毒保证水平为10-6的无菌性的最小电子束辐射量。使用Peptone-Tween溶液，通过浸渍和手动摇动提取膜。布板方法使用大豆-酪蛋白消化琼脂的膜过滤。对于需氧条件，将板在30-35℃下培养4天，然后计数。对于真菌，将板在20-25℃下培养4天，然后计数。对于芽孢益生菌，将提取部分热休克、过滤并按和需氧细菌一样布板。将板在30-35℃下培养4天，然后计数。对于厌氧菌，将板在30-35℃的厌氧条件下培养4天，然后计数。使用的微生物是梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、铜绿假单孢菌(pseudomonos aeruginosa)、枯草杆菌(Bacillus atrophaeus)。

在特定的实施方式中，对于需氧茵或和真菌，本发明的胶原组合物有小于2个集落形成单位(cfu)，对于需氧菌或和真菌有小于1或0个cfu。在其它实施方式中，对于厌氧菌和孢子，本发明的胶原组合物有小于5.1个集落形成单位(cfu)、小于2或小于1个cfu。

在特定的实施方式中，按使用本文例举的和本领域技术人员已知的方法测定，本发明的胶原组合物不是细菌抑制剂或真菌抑制剂(参见实施例6.4.3.2)。当在本文中使用时，细菌抑制剂指抑制细菌生长或复制但不会杀灭细菌的试剂。当在本文中使用时，真菌抑制剂指通过存在非杀菌化学或物理中介物防止真菌生长的试剂。

4.4.4胶原组合物的保存和处理

本发明包含在室温下(例如，25℃)保存本发明的胶原组合物。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物可以在至少0℃、至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃或至少40℃的温度下保存。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物没有被冷藏。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物可以在约2～8℃的温度下冷藏。在其它实施方式中，本发明的胶原组合物可以在任何上述温度下延长时间保存。在特定的实施方式中，本发明的胶原组合物在无菌和非氧化条件下保存。在某些实施方式中，根据本发明方法制备的胶原组合物可以在任何特定温度下保存12个月或更长，而胶原组合物的生化或结构完整性没有变化(例如，没有降解)，并且生化或生物物理性能没有任何变化。在某些实施方式中，根据本发明方法制备的胶原组合物可以保存几年，而胶原组合物的生化或结构完整性没有变化(例如，没有降解)，并且生化或生物物理性能没有任何变化。在某些实施方式中，预期根据本发明方法制备的本发明的胶原组合物可以无限期地保存。胶原组合物可以保存在适于长期保存的任何容器中。有利的是，本发明的胶原组合物可以在消过毒的双层易剥离包装袋中保存。

4.4.5消毒

可以根据本领域技术人员已知的用于消毒此类组合物的技术消毒本发明的胶原组合物。在某些实施方式中，本发明的组合物通过适合的过滤器过滤，以产生消过毒的组合物，然后在无菌条件下处理。有用的过滤器包含0.22μm和0.1μm过滤器以及消毒领域技术人员确认的其它过滤器。

此外，在本发明的某些实施方式中，过滤胶原组合物除去病毒和/或内毒素。在一些实施方式中，根据标准技术过滤本发明的胶原组合物。在进一步实施方式中，可以根据本文所述的技术过滤胶原组合物以除去病毒和/或内毒素。

在某些实施方式中，通过允许内毒素通过并保留胶原组合物的过滤器过滤胶原组合物。可以使用本领域技术人员已知的用于过滤内毒素的任何尺寸的过滤器，例如30kDa。在某些实施方式中，胶原组合物在允许内毒素通过过滤器并同时保留胶原组合物的条件下与过滤器接触。所述条件可以是本领域技术人员已知的任何过滤条件，例如，离心或抽吸。过滤器的尺寸应保留胶原，同时允许内毒素通过过滤器。在某些实施方式中，过滤器为5kDa～100kDa。在特定实施方式中，过滤器为约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa或约100kDa。过滤器可以由本领域技术人员已知的与胶原组合物相容的任何材料构成，如纤维素、聚醚砜和对本领域技术人员显而易见的其它材料。根据本领域技术人员的需要，过滤可以重复多次。可以根据标准技术检测内毒素以监测清除。

在某些实施方式中，可以过滤胶原组合物，产生没有或病毒性颗粒减少的胶原组合物。有利的是，在本发明的这些实施方式中，过滤器保留胶原组合物，同时允许病毒性颗粒通过。可以使用本领域技术人员已知的用于清除病毒的任何过滤器。例如，1000kDa过滤器可被用于清除或减少细小病毒、A型肝炎病毒和HIV。750kDa过滤器可以用于清除或减少细小病毒和A型肝炎病毒。500kDa过滤器可以用于清除或减少细小病毒。

因此，本发明提供制备没有病毒性颗粒或病毒性颗粒减少的胶原组合物的方法，包含使胶原组合物与过滤器接触的步骤，其中所述过滤器的尺寸允许一种或多种病毒性颗粒通过所述过滤器，同时保留所述胶原组合物。在某些实施方式中，胶原组合物在允许一种或多种病毒性颗粒通过过滤器并同时保留胶原组合物的条件下与过滤器接触。所述条件可以是本领域技术人员已知的任何过滤条件，例如，离心或抽吸。过滤器的尺寸应保留胶原，同时允许一种或多种病毒性颗粒通过过滤器。在某些实施方式中，过滤器为500kDa～1000kDa。在特定的实施方式中，过滤器为约500kDa、约750kDa或约1000kDa。过滤器可以由本领域技术人员已知的与胶原组合物相容的任何材料构成，如纤维素、聚醚砜和对本领域技术人员显而易见的其它材料。根据本领域技术人员的需要，过滤可以重复多次。可以根据标准技术检测病毒性颗粒以监测过滤。

本发明的胶原组合物的消毒还可以使用本领域技术人员已知的方法通过电子束辐射进行，例如，Gorham，D.Byrom(ed.)，1991，Biomaterials，Stockton Press，New York，55-122。足以杀灭至少99.9％的细菌或其它潜在的污染生物体的任何辐射量均在本发明的范围内。在特定的实施方式中，使用至少18-25kGy的剂量实现本发明的胶原组合物的最终消毒。

本发明的胶原组合物的消毒还可以通过使用本领域技术人员已知的方法使胶原组合物与碱性溶液接触来进行。碱性溶液可以是本领域技术人员已知的任何碱性溶液。特别地，可以使用已知能够除去病毒性颗粒的任何pH的任何碱。碱洗用的特定碱包含生物可相容的碱、挥发性碱和本领域技术人员已知的能够容易并且安全地从胶原组合物除去的碱。在某些实施方式中，碱可以是浓度例如为0.2-1.0M的本领域技术人员已知的任何有机或无机碱。在某些实施方式中，在氢氧化钠溶液中进行碱处理。氢氧化钠溶液可以是0.1M NaOH、0.25M NaOH、0.5M NaOH或1M NaOH。在特定的实施方式中，所述胶原组合物与0.1M或0.5M NaOH接触。

根据本领域技术人员的判断，碱处理可以在适于除去病毒性颗粒并保持胶原质量的任何条件下进行。例如，所述胶原组合物可以在适合的温度下与碱性溶液接触适合的时间。

在某些实施方式中，碱处理在约0-30℃、约5-25℃、5-20℃或5°-15℃下进行。在某些实施方式中，碱处理在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约23℃、约25℃或约30℃下进行。

根据本领域技术人员的判断，碱处理可以进行适合的时间。在某些实施方式中，碱性处理可以进行约0.25-24小时、2-20小时、5-15小时、8-12小时、2-5小时、1-4小时或0.25-1小时。

4.5胶原组合物的制剂

在某些实施方式中，本发明提供了可注射的胶原组合物。所述胶原可以是本发明的任何胶原，例如使用本文所述方法之一制备的交联的纤维化的胶原。有利的是，胶原可以在水中配制。

胶原可以是对本领域技术人员有用的任何浓度。在某些实施方式中，本发明的制剂包含0.1-100mg/ml、1-100mg/ml、1-75mg/ml、1-50mg/ml、1-40mg/ml、10-40mg/ml或20-40mg/ml的胶原。在某些实施方式中，本发明的制剂包含约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的胶原。在特定的实施方式中，本发明提供包含约35mg/ml的胶原的制剂。

在某些实施方式中，本发明的组合物可以与药物或化妆品可接受的载体混合，并作为组合物体外或体内施用。施用形式包含但不限于注射、溶液、霜剂、凝胶、移植物、泵、药膏、乳剂、悬剂、微球、颗粒、微粒、纳米颗粒、脂质体、糊状物、贴剂、片剂、经皮给药装置、喷雾、气溶胶或本领域普通技术人员熟悉的其它方式。所述药物或化妆品可接受的载体是本领域技术人员公知的。本发明的药物制剂可以使用公知和易得的成分通过本领域已知的步骤制备。例如，化合物可以用常见赋形剂、稀释剂或载体配制，并形成片剂、胶囊、悬剂、粉末等。适用于这些制剂的赋形剂、稀释剂和载体的例子包含：填料和增补剂(例如淀粉、糖、甘露醇和硅衍生物)；粘结剂(例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)；增湿剂(例如甘油)；崩解剂(例如碳酸钙和碳酸氢钠)；延迟溶解剂(例如石蜡)；重吸收加速剂(例如季铵化合物)；表面活性剂(例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯)；吸附性载体(例如高岭土和斑脱土)；乳化剂；防腐剂；甜味剂；稳定剂；着色剂；芳香剂；调味剂；润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁)；固体聚乙二醇；及其混合物。

术语“药物或化妆品可接受的载体”或“药物或化妆品可接受的运载体”用于指但不限于任何液体、固体或半固体，包含但不限于水或盐水、凝胶、霜剂、药膏、溶剂、稀释剂、流体软膏基剂、软膏、糊剂、移植物、脂质体、胶束、大胶束等，其适用于接触活的动物或人组织，而不会产生不良的生理或化妆反应，并且不以有害的方式与组合物的其它成分相互作用。可以使用本领域技术人员已知的其它药物或化妆品可接受的载体或运载体制造输送本发明分子的组合物。

可以配制制剂使得它们可能的话在一段时间内仅在或优选地在特定为点释放活性成分。例如可以从聚合物或蜡制造包衣、包膜和保护性基质。

体内施用本发明的组合物或包含所述组合物和其它材料如特别适于各种形式的本发明的载体的制剂的方法包含但不限于口服施用(例如口腔或舌下施用)、肛门施用、直肠施用、作为栓剂施用、局部应用、气溶胶应用、吸入、腹膜内施用、静脉内施用、经皮施用、皮内施用、皮下施用、肌肉内施用、子宫内施用、阴道施用、施用进体腔、在肿瘤或内部损伤位置手术施用、施用进器官的内腔或软组织和胃肠外施用。用于以上各种形式的施用的技术包含但不限于局部应用、吸入、手术施用、注射、喷雾、经皮输送装置、渗透泵、在所需位置上直接电镀或本领域普通技术人员熟悉的其它方式。应用位置可以是外部，如表皮上，或内部，例如胃溃疡、手术区或其它位置。

本发明的胶原组合物可以霜剂、凝胶、溶液、悬剂、脂质体、颗粒的形式或本领域技术人员已知的用于配制和输送治疗性和化妆性化合物的其它方式使用。胶原材料的超细粒径可被用于治疗剂的吸入给药。皮下施用的适合制剂的一些例子包含但不限于移植物、储库型药(depot)、针剂、胶囊和渗透泵。阴道施用的适合制剂的一些例子包含但不限于霜剂和套环。口服施用的适合制剂的一些例子包含但不限于：药丸、液体、糖浆和悬剂。经皮施用的适合制剂的一些例子包含但不限于凝胶、霜剂、糊剂、贴剂、喷雾和凝胶。皮下施用的适合输送机构的一些例子包含但不限于移植物、储库型药、针剂、胶囊和渗透泵。适于胃肠外施用的制剂包含但不限于水性和非水性消毒注射溶液，可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期受体的血液等渗压的溶质，以及可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性消毒悬剂。临时制成的注射溶液和悬剂可以从本领域技术人员常用的经消毒的粉末、颗粒和片剂制备。

本发明的组合物与例如一种或多种“药物或化妆品可接受的载体”或赋形剂混合的实施方式可以便利地以单位剂型提供，并可以通过常规制药技术来制备。这种技术包括将含有活性成分的组合物和药物载体或赋形剂相结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体均匀且紧密地结合来制备制剂。特定的单位剂型是含有被施用成分的剂量或单位或其适合部分的剂型。应该理解，除了上面特别提及的成分之外，包含本发明的组合物的制剂可包含本领域普通技术人员常用的其它试剂。施用的体积将依据施用的途径而变化。例如，肌肉内注射的体积在约0.1ml～1.0ml的范围内。

可将本发明的组合物施用于人或动物，从而以将产生所需的生理或药理结果的任何剂量范围提供物质。剂量将取决于被施用的物质、所需的治疗终点、在作用位点或在体液中的所需有效浓度以及施用类型。关于物质的适宜剂量的信息是本领域普通技术人员已知的且可参见参考文献，如L.S.Goodman和A.Gilman编著，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Macmillan Publishing，New York，和Katzung，Basic & ClinicalPharmacology，Appleton & Lang，Norwalk，Connecticut，(第六版1995)。根据将要施用的环境和物质的要求，所需治疗领域的临床医师可以选择特定的剂量和剂量范围和施用频率。

胶原组合物可以包含不是胶原的一种或多种化合物或物质。例如，胶原组合物可以在制造过程中或手术的准备过程中用生物分子渗透。所述生物分子包含但不限于抗生素(如氯林可霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎药、抗传染剂包含但不限于银(如银盐，包含但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、单质银，抗生素、杀菌酶(如溶菌酶)、创伤愈合剂(如细胞因子包含但不限于PDGF、TGF；胸腺素)、作为创伤愈合剂的透明质酸、创伤密封剂(如含有或不合凝血酶的纤维蛋白)、细胞趋化剂和支架试剂(如纤维连接蛋白)等。在具体例子中，可以用至少一种生长因子渗透胶原组合物，例如，纤维原细胞生长因子、上皮生长因子等。还可以用有机小分子渗透胶原组合物，如特定生物化学过程的特异性抑制剂，例如，膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等。

在其它实施方式中，本发明的胶原组合物可以与水凝胶混合。本领域技术人员已知的任何水凝胶组合物都在本发明内，例如，以下综述文献中公开的任何水凝胶组合物：Graham，1998，Med.Device Technol.9(1)：18-22；Peppas等，2000，Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)：27-46；Nguyen等，2002，Biomaterials，23(22)：4307-14；Henincl等，2002，Adv.Drug Deliv.Rev 54(1)：13-36；Skelhorne等，2002，Med.Device.Technol.13(9)：19-23；Schmedlen等，2002，Biomaterials 23：4325-32；在此引入它们的全部内容作为参考。在具体实施方式中，水凝胶组合物用在胶原组合物上，即，使用在胶原组合物的表面上。水凝胶组合物例如可以喷在胶原组合物上，在胶原组合物的表面上饱和，用胶原组合物浸，用胶原组合物泡或包被在胶原组合物的表面上。

用于本发明的方法和组合物的水凝胶可以从本领域中已知的任何与水相互作用的或水溶性聚合物制备，包含但不限于聚乙烯醇(PVA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、右旋糖苷或衍生物和其类似物。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物在与水凝胶混合之前，用一种或多种生物分子进一步渗透。在其它实施方式中，水凝胶组合物在与本发明的胶原组合物混合之前，用一种或多种生物分子进一步渗透。所述生物分子包含但不限于抗生素(如氯林可霉素、二甲胺四环素、强力霉素、庆大霉素)、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎药、抗传染剂包含但不限于银(如银盐，包含但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、单质银，抗生素、杀菌酶(如溶茵酶)、创伤愈合剂(如细胞因子，包含但不限于PDGF、TGF；胸腺素)、作为创伤愈合剂的透明质酸、创伤密封剂(如含有或不含凝血酶的纤维蛋白)、细胞引诱和支架试剂(如纤维连接蛋白)等。在具体例子中，可以用至少一种生长因子渗透胶原组合物或水凝胶组合物，例如，纤维原细胞生长因子、上皮生长因子等。有利的是，生物分子可以是治疗剂。

在一些实施方式中，水凝胶组合物与包含本发明的胶原组合物的叠层组合。

水凝胶/胶原组合物可用于医疗领域，包含但不限于治疗创伤、烧伤和皮肤病(例如治疗疤痕)，用于整容用途(例如整容手术)，以及作为移植物的任何用途。在一些实施方式中，水凝胶/胶原组合物局部应用于个体，即在皮肤表面上，例如，用于治疗创伤。在其它实施方式中，水凝胶/胶原组合物可以在个体内部使用，例如作为移植物，在身体中成为永久或半永久性结构。在一些实施方式中，水凝胶组合物配制成不可生物降解的。在其它实施方式中，水凝胶组合物配制成可生物降解的。在具体实施方式中，水凝胶组合物经配制在数天内降解。在另一个具体实施方式中，水凝胶组合物经配制在数月内降解。

在一些实施方式中，用细胞增殖本发明的胶原组合物，使得细胞是均匀和汇合的。可以用于增殖本发明的胶原组合物的细胞包含但不限于干细胞、人干细胞、人分化的成人细胞、全能干细胞、多能干细胞、多效干细胞、组织特异性干细胞、胚胎样干细胞、定向祖细胞、纤维原细胞样细胞。在其它实施方式中，本发明包含用特定类别的祖细胞增殖本发明的胶原组合物，包含但不限于软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰腺软组织细胞、成神经细胞和肌肉祖细胞。

4.6使用胶原组合物的方法

在另一个方面中，本发明提供了治疗性地、预防性地或化妆性地使用本发明的胶原组合物的方法。

本发明的胶原组合物具有广泛的潜在用途。其用途包括但不限于制造工程化的组织和器官，包括结构如组织或基质材料的贴剂或栓、修补物和其它移植物、组织骨架、创伤的修复或装饰、止血装置、用于组织修复和支撑的装置如缝合线、手术和整形螺丝、手术和整形板、合成移植物用的天然包被或成分、化妆移植物和支撑物、器官或组织用的修复或结构支撑物、物质输送、生物工程平台、测试物质对细胞、细胞培养物的作用的平台以及多种其它用途。对可能用途的讨论不意图是穷举的，并且存在许多其它实施方式。此外，尽管下面就胶原与其它材料和/或特定物质的组合提供的许多具体例子，但是可以使用材料和物质的许多其它组合。

在胶原材料中结合细胞的能力提供了使用本发明的组合物构建组织、器官或器官样组织的能力。这些组织或器官中包含的细胞可以包括起到输送物质功能的细胞、提供开始替代组织的接种细胞或这两者。许多类型的细胞可被用于产生组织或器官。在多种实施方式中使用干细胞、定向干细胞和/或分化的细胞。在这些实施方式中使用的干细胞的例子包括但不限于用于制造器官或器官样组织如肝或肾的胚胎干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞。在一些实施方式中，组合物的形状有助于将信号发送至细胞，以特定的所需方式生长和复制。其它物质，例如分化诱导物，可以加到基质中，促进特定类型的细胞生长。此外，在一些实施方式中，将各细胞类型的不同混合物加到组合物中。使用胶原材料和基质来生物工程化组织或器官的能力产生了各种生物工程化的组织替代应用。生物工程化组分的例子包括但不限于骨、牙科结构、关节、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、腱、半月板、韧带、血管、支架、心瓣膜、角膜、耳鼓、神经导管、组织或器官贴剂或密封剂、缺失组织的填料、化妆修复用的薄片、皮肤(添加了细胞以制造皮肤等同物的薄片)、喉的软组织结构如气管、会厌和声带、其它软骨结构如鼻软骨、跗节板、气管环、甲状腺软骨和杓状软骨、结缔组织、血管移植物和其组分、局部应用的薄片以及对器官如肝、肾和胰腺的修补或替代。在一些实施方式中，这些基质与本发明的药物和物质输送基质以改进移植物功能的方式组合。例如，可将抗生素、抗炎剂、局部麻醉剂或其组合加到生物工程化的器官的基质中以加速愈合过程和减轻不适。

4.6.1整形应用

人皮肤是表皮和真皮的复合材料。皮肤的表皮层的最外层是角质层。在角质层下是表皮。在表皮下是真皮的最外层，称作乳突真皮，然后是网状真皮和皮下层。

皮肤有许多作用，包括保护、吸收、色素生成、感官知觉、分泌、排泄、热调节和免疫过程调节。这些皮肤功能受到例如衰老、过度日晒、吸烟、外伤和/或环境因素的负面影响，它们引起皮肤发生结构变化并且导致皮肤的屏障功能的损伤和降低的表皮细胞更新(turnover)。受损的胶原和弹性蛋白失去适当收缩的能力，使得皮肤起皱和表面粗糙。皱纹是皮肤的变化，通常与皮肤老化相关并优先在日晒的皮肤上发展。随着衰老的进行，面部以及身体的其它区域开始表现出重力、日晒和常年的例如面部肌肉运动的影响，如微笑、咀嚼和眯眼。随着皮肤老化或变得不健康，产生了皱纹、下垂和伸展痕记，变得粗糙，并且合成维生素D的能力下降。老化的皮肤也变薄，并且由于胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖变化，具有平坦的真皮表皮界面。通常，老化的皮肤的特征在于，厚度、弹性和与下层组织的粘附下降。

由于衰老、环境因素、日晒和其它因素，如体重下降、生育、疾病(例如，痤疮和癌症)和手术对皮肤的损害经常造成皮肤轮廓缺陷和其它皮肤异常。为了校正轮廓缺陷和其它皮肤异常，人们经常借助于整形手术，如面部紧致和拉皮。然而，整形手术通常很贵，是侵入式的，并且可能在手术区域留下疤痕，且可能影响正常的生物和生理功能。因此，仍需要可替换的治疗法。

本发明提供了对患者的皮肤增强的方法。在一实施方式中，患者的皮肤增强的方法包括在患者需要增强的面部或身体区域注射或以其它方式施用本发明的胶原组合物，其中与施用胶原之前的区域相比，患者的所述面部或身体区域增强。在本发明中，“皮肤增强”指患者(例如，人)的皮肤和相关区域的自然状态由于外部作用或效果而发生的任何变化。可以通过皮肤增强而变化的皮肤非限制性区域包含表皮、真皮、皮下层、脂肪、竖毛肌、毛干、汗孔、皮脂腺或其组合。

在一些实施方式中，本发明的方法包括以注射或其它方式给患者施用本发明的胶原组合物，用于治疗眼角皱纹、鼻唇沟折叠(“笑纹”)、木偶纹(marionette lines)、眉间折叠(“眉间纹”)或其组合。本发明的胶原组合物可以帮助填充纹、起皱和其它皱纹，并恢复更光滑、更年轻的外观。本发明的胶原组合物可以单独使用或与一种或多种额外的可注射组合物、换肤过程组合使用，如激光治疗或重塑(recontouring)过程，如面部紧致。

在一实施方式中，本发明的胶原组合物也可被用于增强面部的起皱或凹陷区域和/或增加或提高患者的面部和身体区域的丰满度。需要增强的面部和/或身体区域可能是例如衰老、外伤、疾病、病症、环境因素、体重下降、生育或其组合的原因。可以被注射或以其它方式施用本发明的胶原组合物的患者的面部或身体区域的非限制性例子包含下眼、太阳穴、上颊、下颊、下巴、嘴唇、下颌外形、前额、印堂、外额、颊、上唇和鼻子之间的区域、鼻子(如鼻梁)、颈、臀部、髋、胸骨、或面部或身体的任何其它部分、或其组合。

本发明的胶原组合物可以用于治疗皮肤缺陷，包含但不限于皱纹、凹陷或其它折皱(例如，眉间纹、烦恼纹、眼角皱纹、木偶纹)、拉伸痕迹、内部和外部伤痕(如起因于损伤、创伤、事故、咬伤或手术的伤痕)或其组合。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物可以用于例如校正眼窝凹陷、造成黑眼圈的可见脉管以及可见泪槽。本发明的胶原组合物还可被用于例如校正由眼袋整复术侵略性除去眼下部脂肪块后的眼下部或校正侵略性颊部脂肪提取或自然损失后的颊下部。在一实施方式中，本发明的胶原组合物可以用于校正鼻整形术、皮肤移植或其它手术诱导的不规则如吸脂肪造成的缺口的结果。在其它实施方式中，本发明的胶原组合物可以用于校正面部或身体疤痕(例如，创伤、水痘或痤疮疤痕)。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物被注射或以其它方式施用至患者以进行面部整形。使用本发明方法的面部整形可以在具有颈松驰或具有憔悴脸、长脸、底重脸、不对称脸、圆胖脸或具有局部脂肪萎缩的脸、中脸后移、凹陷眼和/或任何其组合的患者中完成。

在一实施方式中，本发明的方法包括以注射或其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者，用于治疗皮肤缺陷，如疾病或病症如癌症或痤疮引起的皮肤缺陷。该缺陷可以是疾病或病症的直接或间接结果。例如，皮肤缺陷可以因疾病或病症引起，或可以因疾病或病症的治疗而引起。

4.6.2非整形应用

4.6.2.1空隙填充

本发明提供密封、填充和/或以其它方式处理患者身体内的空隙的方法。在一些实施方式中，本发明的方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者以填充患者身体内的空隙。例如，胶原组合物可以在空隙所在区域施用至患者。术语“空隙”意图包括因衰老、疾病、手术、先天异常或其组合造成的任何不希望的中空空间。例如，从患者的身体手术除去肿瘤或其它物质后可以产生空隙。可以用本发明的胶原组合物填充的空隙的非限制性例子包括患者身体的任何器官或组织中的裂缝、瘘管、支囊、动脉瘤、囊肿、损害或任何其它不希望的中空空间。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物可以用于完全或部分地填充、密封和/或以其它方式处理身体的组织、器官或其它结构(例如血管)内的裂隙、裂缝或瘘管，或相邻组织、器官或结构之间的接合点，以防止生物流体如血液、尿液或其它生物流体的泄漏。例如，本发明的胶原组合物可以被注射进、移植进、穿进或以其它方式施用至内脏之间的瘘管，或施用至内脏与患者身体外部之间的开口或孔。本发明的胶原组合物可以用于填充空隙或这些病态形成的其它缺陷，并刺激组织的成纤维细胞浸润、愈合以及向内生长。

在一实施方式中，本发明的方法用于填充、密封和/或以其它方式处理需要治疗的患者中的瘘管，所述方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者。通过经针注射进一个瘘管孔并填充大部分或所有的支孔，可以将本发明的胶原组合物施用至患者。或者，胶原线或胶原棒可以通过孔进入瘘管损害中，或者可将胶原通过导管导入患者中。各种类型的瘘管可以被本发明的胶原组合物或方法填充、密封和/或以其它方式处理，如肛门、动静脉、膀胱、颈动脉-海绵体、外部、胃、小肠、顶骨、唾液腺、阴道、肛门直肠瘘管或其组合。

在一实施方式中，将本发明的方法用于填充、密封和/或以其它方式处理需要治疗的患者中的支囊，所述方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者。支囊是异常生理结构，其是管状或囊状器官如小肠、膀胱等的小袋或囊，并可以使用本发明的胶原组合物填充或增强。

在另一实施方式中，将本发明的方法用于填充、密封和/或以其它方式处理需要治疗的患者中的囊肿，所述方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者。囊肿是具有膜衬里的含有气体、液体或半固体材料的异常囊。在一些实施方式中，囊肿是假囊肿，其具有例如积聚的流体，但不包含上皮或其它膜衬里。可以通过本发明填充、密封和/或以其它方式处理的囊肿的额外非限制性例子包括皮脂腺囊肿、皮样囊肿、骨囊肿或浆液囊肿或其组合。

在另一实施方式中，本发明的方法包括注射或以其它方式施用本发明的胶原组合物以完全或部分地填充因从患者手术、化学或生物除去不需要的或不希望的生长、流体、细胞或组织面产生的任何空隙。胶原组合物可以局部注射或以其它方式在空隙位置施用，从而增强余下的和周围的组织，辅助愈合过程，并使感染的危险最小。这种增强特别适用于肿瘤切除后产生的空隙位置，如在乳腺癌手术、除去肿瘤性结缔组织、骨组织或软骨组织的手术等之后。

本发明还提供这样的造成增强的方法，其通过注射或以其它方式将本发明的胶原组合物非直接地施用至身体上，在使身体包含组织、器官或器官部件之前，在体外施用至所述器官、器官组分或组织。

4.6.2.2组织填充

在一实施方式中，本发明的方法包含将本发明的胶原组合物施用至患者用于组织填充。在本发明中，“组织填充”指患者(例如人)的非真皮软组织的自然状态由于外部作用或效果而发生的任何变化。本发明包含的组织包括但不限于肌肉组织、结缔组织、脂肪以及神经组织。本发明包含的组织可以是许多器官或身体部件的一部分，包括但不限于括约肌、膀胱括约肌和尿道。

4.6.2.3尿失禁

尿失禁(包含压力性尿失禁)是指因导致腹内压力上升的活动如咳嗽、喷嚏、笑或锻炼而造成的尿突然泄漏。在这些活动中，腹内压力瞬时升到高于尿道抵抗力，因此造成突然、经常小量的尿泄漏。压力性失禁通常是膀胱储存的问题，其中尿道括约肌的强度消失，并且当腹部的压力上升时括约肌不能防止尿流。尿失禁可以是支撑膀胱和尿道的骨盆肌肉弱化的原因，或者由于尿道括约肌失灵。例如，在尿道区域的之前的外伤，神经损伤和一些药物可能弱化尿道。在绝经期、骨盆手术或生育后例如在多次怀孕和阴道分娩之后的女性，或者患有脱肛(膀胱、尿道或直肠壁伸入阴道区域)和膀胱脱落、膀胱尿道膨出或直肠脱落的女性中最常见尿失禁，并经常与前阴支撑物的缺失相关。在男性中，在前列腺手术、最常见的前列腺切除术之后观察到尿失禁，在这些手术中可能损伤外部尿道括约肌。

本发明包括控制或治疗尿失禁或因其造成的症状或病症的方法，包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至有此需要的患者，其中所述患者的括约肌组织被增强，并且患者的自制力提高或恢复。胶原组合物可被注射或以其它方式施用至尿道周围以提高尿道周围的组织填充，从而控制和/或治疗尿失禁。通过提高组织填充，从而提高对尿流出的抵抗性，可以实现对压力性失禁的改善。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物被注射或以其它方式在尿道周围区域施用至患者，例如，封闭漏尿的尿道孔，或增大尿道壁的厚度，从而当尿被阻止时将其紧紧密封。

在另一实施方式中，本发明的胶原组合物被注射或以其它方式在膀胱出口的尿道肌肉外侧施用至患者的尿道周围。加以通过皮肤、通过尿道或者在女性中通过阴道可以注射填充材料。

当使用针注射本发明的胶原组合物时，可以使用插在尿道中的膀胱镜引导针位置。可以在局部麻醉下进行尿道填充过程，但是一些患者可能需要全身性、区域性或脊椎麻醉。可以使用局部麻醉，从而在注射后患者可以站立，并可以测定是否已实现自制。如果没有恢复自制，那么可以对患者进行一次或多次随后的注射。此过程在几个月之后可能需要重复，以实现膀胱控制。通过填充尿道周围的区域，从而压迫括约肌，胶原注射会帮助控制尿漏。

4.6.2.4膀胱输尿管反流

膀胱输尿管反流(VUR)(或尿反流)的特征在于尿从膀胱到肾的逆流。未治疗的VUR可能对肾功能和患者的总体健康造成长期破坏作用。VUR的患者产生尿路感染、肾脏纤维化、肾盂肾炎、高血压和进行性肾衰竭的危险增大。

本发明提供控制或治疗VUR或因其造成的症状或病症的方法，包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至有此需要的患者，其中患者的尿管壁增强，并且VUR的症状减小或消除。使用本领域技术人员已知的任何方法，胶原组合物可被注射(例如，三角下层注射)或以其它方式(如在内窥镜导引下)施用至在尿管孔下逼尿肌背衬。

4.6.2.5胃食管反流性疾病

胃食管反流性疾病(GERD)是通常因为下食道括约肌(LES)-食道连接胃的肌瓣膜-没有适当地封闭、松弛或弱化，并且胃中内含物漏回或逆流进食道中而造成的紊乱。当胃酸或有时胆汁盐与食道接触时，会引起胃灼热烧痛感，大部分人都有过这种感觉。当逆流的胃酸接触食道的衬里时，会在胸部或喉中产生烧痛感(胃灼热)，并且在口腔的后面尝到液体(酸消化不良)。经过一段时间，胃酸的逆流损害食道的组织衬里，造成炎症和疼痛。在成年人中，长期、未治疗的GERD可能对食道造成永久性的损害，并且有时会导致癌症。任何人，包含婴儿、儿童和孕妇都可能患有GERD。

本发明提供控制或治疗GERD或因其造成的症状或病症的方法，包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至有此需要的患者，其中患者的LES增强，并且GERD的症状减轻或消除。在一些实施方式中，胶原组合物在内窥镜导引下施用至食管胃连接处的食道壁。为了阻止逆流，利用保留的材料和由此产生的组织应答造成的填充效果。可以经标准或大孔(例如大号)注射针注射本发明的胶原组合物。

4.6.2.声带和喉

本发明提供了控制或治疗疾病、紊乱(如神经性紊乱)或影响单侧或两侧声带和/或喉的其它异常的方法。喉和声带的疾病、紊乱或其它异常的非限制性例子是声门闭合不全、单侧声带瘫痪、双侧声带瘫痪、瘫痪性发声困难、非瘫痪性发声困难、突发性发声困难或其组合。在其它实施方式中，本发明的方法还可用于控制或治疗疾病、紊乱或导致声带闭合不良的其它异常，如声带的不完全瘫痪(“局部麻痹”)、全面弱化的声带例如，因年老(“presbylaryngis”)，和/或声带疤痕(例如因之前的手术或放疗)产生的弱化的声带。

本发明包括为缺少声带曾经有的填充(如在声带弓(vocal fold bowing)或萎缩中)或移动性(如在瘫痪中)的患者提供对声带支撑或填充的方法。在一些实施方式中，可以单独用本发明的胶原组合物或与其它治疗或药物组合增强声带和/或喉的其它软组织。在一实施方式中，本发明的胶原组合物对一个(或两个)声带进行增强或加入填充物，从而使其可以接触另一侧声带。

可以使用本领域技术人员公知的多种过程中的任一种将本发明的胶原组合物施用至患者的声带或喉。在一些实施方式中，使用弯曲的针通过患者的口腔注射本发明的胶原组合物。在其它实施方式中，可使用针(如较高号的短针)通过患者的皮肤和喉结直接注射本发明的胶原组合物。可以在视频监视器上使用喉镜监测患者的声带的同时将本发明的胶原组合物施用至患者。

4.6.2.7声门闭合不全

在一实施方式中，本发明提供了控制或治疗声门闭合不全的方法。可以使用本领域中已知的方法，使用针将本发明的胶原注入患者的声带，来进行经皮的喉部胶原增强。在一些情况下，患者患有发音过弱和/或声门闭合不全，其影响喉的发声功能、提高了肌肉刚性并且降低了甲杓肌的活动能力。在另一实施方式中，发音过弱是帕金森病的结果。在一实施方式中，本发明用于控制或治疗有此需要的患者的声门闭合不全的方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者的声带，其中注射增强了声带并提高了声门闭合，从而使患者中的声门闭合不全减轻或消除。在施用本发明的胶原组合物之前，患者可以具有或不具有活动的声带。

4.6.2.8发声困难

发声困难是声音的任何损害或难于讲话。发声困难可以与喉部或声带瘫痪相关或无关。本发明提供了控制或治疗发声困难如瘫痪性发声困难、非瘫痪性发声困难或突发性发声困难的方法。在一实施方式中，控制或治疗患者的发声困难的方法包括注射或将本发明的胶原组合物施用至有此需要的患者，其中与施用胶原组合物之前相比，患者的发声困难得以改善。在一些情况下，喉部胶原注射通过小的增量允许单侧或双侧声带的进一步趋中化(medialization)从而改善喉成形术(medialization thyroplasty)相关的或之后的发声。

4.6.2.9声带瘫痪

声带基本上是被粘膜覆盖的肌肉。当肌肉不再连接到神经时，肌肉萎缩。因此，通常瘫痪的声带尺寸较小并呈弓形。另外，取决于瘫痪类型，声带能够或不能够足够接近另一侧声带的中部并与其接触。当声带不能会合时，患者难于发出声音(或至少难于大声)。因此，本发明提供了在声带瘫痪的患者中增强或填充萎缩的声带的方法，其中声带到一起的能力得以改善。

单侧声带瘫痪是一个声带不能活动，通常是由于神经紊乱的原因，并且喉经常不能完全闭合。喉返神经是每个声带大部分移动的主要神经，并可被例如各种疾病、某些手术或病毒性传染损伤。在一些实施方式中，患者的声带瘫痪是甲状腺癌症、肺癌、肺结核或肉状瘤(或使淋巴节在胸腔中扩大的任何东西)、中风、神经疾病(例如，腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth)、原发性直立性低血压(Shy-Drager)和多系统萎缩)的症状或结果。

双侧声带瘫痪是两个声带均不能活动(通常接近中线)。在一些实施方式中，患者的双侧声带瘫痪是例如中风或其它神经疾病(如Arnold-Chiari畸形)、甲状腺癌症、手术(如主脑手术)或甲状腺切除术的症状或结果。

本发明提供了用于控制或治疗声带瘫痪的方法。在一实施方式中，提供了方法以控制或治疗患者中单侧或双侧声带瘫痪或与其相关症状的，该方法包括注射或以其它方式将本发明的胶原组合物施用至患者，其中患者的声带闭合得以改善。在一实施方式中，本发明的胶原组合物对一侧(或两侧)瘫痪的声带进行增强或加入填充，从而使其可以接触另一侧声带。可以通过患者的口腔或直接通过皮肤和喉结将本发明的胶原组合物注射至有此需要的患者。

4.6.2.10药物输送

本发明的胶原组合物可以用作药物例如治疗剂的可控输送的给药运载体。在一些实施方式中，胶原组合物将一种或多种治疗剂输送至个体，例如人。本发明范围内包含的治疗剂是蛋白、肽、多糖、多糖偶联物、基于遗传的疫苗、减毒活疫苗、全细胞。用于本发明的方法的药物的非限制性例子是抗生素、抗癌剂、抗菌剂、抗病毒剂；疫苗；麻醉剂；止痛剂；抗哮喘剂；抗炎药；抗抑郁剂；抗关节炎剂；抗糖尿病剂；抗精神病药；中枢神经系统刺激物；激素；免疫抑制剂；肌肉弛缓剂；前列腺素。

胶原组合物可被用作输送运载体，用于将一种或多种小分子可控输送至个体，例如人。在一些实施方式中，胶原组合物将一种或多种小分子输送至个体，例如人。当在本文中使用时，术语″小分子″和相似术语包含但不限于肽、肽模拟物、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000克/摩尔的有机或无机化合物(即，包括杂有机和有机金属化合物)、分子量小于约5,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约1,000克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约500克/摩尔的有机或无机化合物、分子量小于约100克/摩尔的有机或无机化合物以及这些化合物的盐、酯和其它药物可接受的形式。本发明也包含这些化合物的盐、酯和其它药物可接受的形式。

在某些实施方式中，用作给药运载体的本发明的胶原组合物增强了药物的吸收；改善了药代动力学，以及相对于本领域中已知的其它给药系统改善了药物的系统性分布。改善药代动力学指例如根据标准药代动力学参数测量的药代动力学分布的提高，标准药代动力学参数如获得最大血浆浓度的时间(Tmax)；最大血浆浓度的强度(Cmax)；产生可检测的血液或血浆浓度的时间(Tlag)。增强吸收指根据这些参数测量的药物的吸收得以改善。药代动力学参数的测量按本领域中的常规方式进行。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物还进一步包含一种或多种生物分子，例如，治疗剂，包含但不限于抗生素、激素、生长因子、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、疼痛药物、抗组胺剂、抗炎药、抗传染剂、创伤愈合剂、创伤密封剂、细胞趋化剂和支架试剂、酶、受体拮抗剂或激动剂、激素、生长因子、自生骨髓或其它细胞类型、抗生素、抗微生物试剂和抗体等，或其组合。在具体例子中，本发明的胶原组合物可以用一种或多种生长因子渗透，例如，纤维原细胞生长因子、上皮生长因子等。本发明的胶原组合物还可以用一种或多种小分子渗透，包含但不限于小有机分子，如特定生物化学过程的特异性抑制剂，例如，膜受体抑制剂、激素、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药物、抗生素等。

在一些实施方式中，根据预期用途，在制造过程中或在注射之前，用生物分子渗透本发明的胶原组合物。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物包含一种或多种干扰素(α-IFN、β-IFN、γ-IFN)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、淋巴毒素、表皮生长因子(EGF)、纤维原细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子、促红细胞生成素、转化生长因子(TGF)、制瘤素M、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20等)、其家族成员或其组合。在一些实施方式中，本发明的胶原组合物包含这些生长因子或其它生物分子的生物活性的类似物、片段或衍生物。

用于本发明的方法的特定活性剂包括生长因子，如转化生长因子(TGF)、纤维原细胞生长因子(FGF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织活化肽(CTAP)、生骨因子和这些生长因子的生物活性的类似物、片段和衍生物。转化生长因子(TGF)超基因家族的成员是有用的，它们是多官能的调控蛋白。TGF超基因家族的成员包含β转化生长因子(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9)；肝素-结合生长因子(例如纤维原细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF))；抑制素(例如抑制素A、抑制素B)；生长分化因子(例如GDF-1)；和活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。

4.6.2.11伤口和烧伤

预期本发明的胶原组合物部分地由于其物理性能的原因而具有增强的临床用途，其作为伤口敷料，与本领域中已知的其它生物材料相比，例如记载在美国专利号3,157,524；4,320,201；3,800,792；4,837,285；5,116,620中的生物材料，用于增强或代替硬和/或软组织修补。本发明的胶原组合物因为其保持胶原的天然四级结构，从而通过细胞向胶原基质的间隙中的迁移提供改善的组织内生。本发明的胶原组合物允许细胞贴附胶原基质并在其中生长，并且合成它们自身的大分子。由此，细胞产生允许新组织生长的新基质。这种细胞发育在其它已知形式的胶原如纤维、羊毛和可溶胶原中没有观察到。

在一些实施方式中，本发明包含通过将本发明的胶原组合物直接置于个体的皮肤上治疗伤口，即置于角质层上，置于伤口位置，从而例如使用粘合带覆盖伤口。在其它实施方式中，本发明包含使用本发明的胶原组合物作为移植物治疗伤口，例如作为皮下移植物。

本发明包括通过加入能够促进组织在本发明的胶原组合物中内生的高分子来增强伤口愈合速率。这些高分子包括但不限于透明质酸、纤维连接蛋白、层粘蛋白和蛋白多糖(例如参见，Doillon等人，(1987)Biomaterials 8：195200；和Doillon和Silver(1986)Biomaterials 7：38)。

在一些实施方式中，本发明的胶原组合物用于控制伤口，包括但不限于部分和完全厚度的伤口、压力溃疡、压力溃疡、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道性/破坏性伤口、手术伤口(例如，捐赠位置/移植、Mohs手术后、激光手术后、足病、创伤裂开)、外伤伤口(例如，磨损、破口、二度烧伤和皮肤撕裂)和排泄伤口。在某些实施方式中，本发明的胶原组合物意图一次使用。

和章节5.4.2.7中所述的皮肤给药一样，本发明还包含在本发明的胶原组合物中加入药物活性剂，包含但不限于血小板源生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、新血管生成因子、抗生素、抗真菌剂、杀精子剂、激素、酶、酶抑制剂，以及上述任何生物分子。在某些实施方式中，药物活性剂以生理有效量提供。

在一些实施方式中，在应用到伤口位点之前，胶原组合物被活细胞进一步增殖，包含但不限于异基因造血干细胞、干细胞和自体同源成人细胞。

本发明的胶原组合物特别适用于治疗伤口感染，例如手术或外伤伤口破坏后的伤口感染。在特定的实施方式中，使用治疗有效量的用于治疗伤口感染的试剂渗透胶原组合物，包括但不限于抗生素、抗微生物剂和抗菌剂。本发明的胶原组合物在对于治疗本领域中已知的任何微生物造成的伤口感染方面具有临床和治疗用途，例如，感染人体内的伤口的微生物，人体是已知的病原生物体贮存器，或是环境来源的微生物。可以通过本发明的方法和组合物降低或防止在伤口中生长的微生物的非限制性例子是金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(St.epidermis)、β-溶血型链球菌(betahaemolytic Streptococci)、大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和假单胞菌属(Pseudomonas)，以及厌氧菌中的魏氏梭状芽胞杆菌(Clostridiumwelchii)或第三梭菌(Clostridium tartium)，其是气性坏疽的病因，气性坏疽主要在深度外伤性伤口中。

在其它实施方式中，本发明的胶原组合物被用于伤口治疗，包括但不限于表皮伤口、皮肤伤口、慢性伤口、急性伤口、外部伤口、内部伤口(例如，胶原组合物在手术中可以缠绕在缝合位置周围，防止血液从缝合线泄漏并防止身体与缝合材料形成粘合)、先天性伤口(例如，营养不良型大疱性表皮松解症)。特别地，胶原组合物在治疗压力溃疡(例如褥疮溃疡)中具有增强的应用。在长期卧床的患者中经常发生压力溃疡，例如，由于局部压力作用而使皮肤损失的四肢瘫痪者和截瘫患者。产生的压力增加表现为皮肤侵蚀，并损失表皮和皮肤附属物。在其它更具体的实施方式中，将本发明的胶原组合物用于控制伤口，包含但不限于部分和完全厚度伤口、压力溃疡、静脉溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管溃疡、隧道性/破坏性伤口、手术伤口(例如，捐赠位置/移植、莫氏手术后(post-Moh’s surgery)、激光手术后、足病、伤口裂开)、外伤伤口(例如，磨损、破口、二度烧伤和皮肤撕裂)和排泄伤口。

本发明的胶原组合物也可用于治疗烧伤，包含但不限于一度烧伤、二度烧伤(部分厚度烧伤)、三度烧伤(完全厚度烧伤)、烧伤伤口感染、切除和未切除的烧伤伤口感染、移植的伤口感染、捐赠位点的感染、来自之前移植或愈合的伤口或皮肤移植捐赠位点的上皮细胞损失、以及烧伤伤口脓疱病。

4.6.2.12牙科

本发明的胶原组合物在牙科中具有特定应用，例如，牙周手术、用于使牙周组织再生的引导组织再生、引导骨再生和牙根覆盖。本发明包括使用本发明的胶原组合物促进牙周骨内缺陷的再生，包含但不限于匹配的双侧牙周缺陷、牙间骨内缺陷、深度3-壁骨内缺陷、2-壁骨内缺陷和骨内缺陷2和3。相对于本领域中已知的其它技术，预期本发明的胶原组合物对于治疗牙周骨内缺陷具有增强的治疗用途和增强的临床参数，已知的其它技术例如是使用交联的胶原膜，如记载Quteish等，1992，J.Clin.Periodontol.19(7)：476-84；Chung等，1990，J.Periodontol.61(12)：732-6；Mattson等，1995，J.Periodontol.66(7)：635-45；Benque等，1997，J.Clin.Periodontol.24(8)：544-9；Mattson等，1999，J.Periodontol.70(5)：510-7)中的那些。使用本发明的胶原组合物改进的临床参数的例子包含但不限于牙斑和齿龈指数评分、牙周袋探诊深度(probing pocket depth)、探诊附着深度(probingattachment depth)以及根叉病变和骨缺陷的分类，这些是本领域技术人员已知的。

本发明还包括使用本发明的胶原组合物治疗类II根叉缺陷，包含但不限于双侧缺陷、成对的面颊II类上颚臼齿根叉缺陷和双侧上颚根叉缺陷。本发明的胶原组合物在治疗II类根叉缺陷中的应用可以部分地通过其使根叉缺陷中失去的牙周组织再生的能力来解释。相对于治疗II类根叉缺陷领域中使用的胶原膜，预期本发明的胶原组合物具有增强的治疗和临床应用，如记载在Paul等，1992，Int.J.Periodontics Restorative Dent.12：123-31；Wang等，1994，J.Periodontol.65：1029-36；Blumenthal，1993，J.Periodontol.64：925-33；Black等，1994，J.Periodontol.54：598-604；Yukna等，1995，J.Periodontol.67：650-7中的那些。

本发明还包括在牙根覆盖过程中使用本发明的胶原组合物。本发明的胶原组合物在牙根覆盖中的应用可解释为部分地由于其基于引导组织再生原理而代替失去的、损坏的或疾病的牙龈组织的能力。与本领域中牙根覆盖传统使用的胶原膜相比，预期本发明的胶原组合物在牙根覆盖中具有增强的临床应用，如记载在Shieh等，1997J.Periodontol.，68：770-8；Zahedi等，1998 J.Periodontol.69：975-81；Ozcan等，1997 J.Marmara Univ.Dent.Fa.2：588-98；Wang等，1997J.Dent.Res.78(Spec Issue)：119(Abstr.106)中的那些，原因同上。

本发明还包括在患有牙周疾病的个体中使用胶原组合物，包括但不限于牙周病和齿龈炎。本发明的胶原组合物还具有在去垢和根面平整过程中作为附属物的临床应用。本发明包括使用本发明的胶原组合物治疗患有牙周疾病的个体。使用本发明的胶原组合物治疗患有牙周疾病的个体的示例性方法包含将胶原组合物插到个体的一个或多个牙周囊袋中例如大于或等于5mm的囊袋，其中胶原组合物可以用抗生素如葡萄糖酸氯己定渗透。有利的是，该胶原组合物可以是生物可降解的。

在牙科中使用的本发明的胶原组合物可以用一种或多种生物分子渗透，这取决于所治疗的牙科疾病的类型。本领域中已知的用于治疗牙科疾病的任何生物分子可以包含在本发明的方法和组合物中。在具体实施方式中，用于治疗与感染相关的牙科疾病的胶原组合物可以用一种或多种抗生素渗透，包括但不限于强力霉素、四环素、葡萄糖酸氯己定和二甲胺四环素。

4.6.2.13其它用途

本发明的胶原组合物也可以在卵巢或子宫角中用作手术后粘合阻挡物。胶原组合物还可以在大脑中用作粘合阻挡物(例如，预防脑膜-脑粘合)。这里，胶原组合物可以用于恢复使硬脑膜和软脑膜分离的硬膜下空间。通常，胶原组合物可以用作受损内部器官的包裹物，例如脾，或用作与肺粘合的薄片以控制手术后泄漏。胶原组合物还可用于支持鼓膜移植的手术治疗(在鼓膜穿孔中)，或用作乳状腔的衬里。胶原组合物还可以用作新阴道成形术的衬里组织。在心血管手术中，胶原组合物可以用作心包闭合材料。胶原组合物还可以用于在输精管吻合术中完成吻合。

4.7包含胶原组合物的试剂盒

在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的胶原组合物的试剂盒。例如本发明提供了用于增强或代替哺乳动物的组织的试剂盒。所述试剂盒包含用于分配给本领域技术人员的包装内的一种或多种本发明的胶原组合物。所述试剂盒可以包含关于根据本发明的方法使用胶原组合物以增强或代替哺乳动物的组织的说明的标签或标记。在某些实施方式中，所述试剂盒可以包含用于进行所述方法的组件，如用于施用胶原组合物的装置，如一或多个注射器、导管、导液管等。在某些实施方式中，所述试剂盒可以包含用于将施用所述胶原组合物的装置安全处理的组件(例如使用后的注射器的‘长针’容器)。在某些实施方式中，所述试剂盒可以在预填充的注射器、单位剂量或单位使用包装中包含组合物。

5.实施例

在下面的章节中，本领域技术人员应理解，短语“在约23℃下”可以指室温。

5.1实施例1：从胎盘分离胶原

该实施例阐明从胎盘分离胶原。

根据本文所述的方法得到冷冻胎盘。通过在Nalgene盘中用水包裹4小时使胎盘解冻。然后从塑料包裹里取出胎盘，置于0.5M NaCl(2升/胎盘)中4小时，直到解冻。从每个胎盘切下脐带片段，在约23℃下将每个胎盘切成约4条。

在约23℃下使用绞肉机研磨胎盘条批料，每批约3-4条。

将研磨过的胎盘加到含有0.5M NaCl(5L/胎盘)的50L Nalgene槽中，并使用电动混合器在75-100rpm(24小时，4℃)下混合。

24小时后，从混合物中分离组织。停止混合器，在约23℃下使组织沉降到混合器底部。在约23℃下使用蠕动泵除去流体(～50L)。或者，在约23℃下使用蠕动泵抽出组织和流体，并通过#10筛过滤，将分离出的组织放回混合槽中。

将新鲜的0.5M NaCl(5L/胎盘)加到混合物中，并在4℃下混合24小时(电动混合器，75-100rpm)。24小时后，使用上述方法分离组织。

用水(5L/胎盘)洗涤组织，并在4℃下混合24小时(电动混合器，75-100rpm)。24小时后，使用上述方法分离组织。

根据以上四段内容，再次用0.5M NaCl、新鲜的0.5M NaCl、然后水洗涤组织。

分离出没有血液成分的组织。组织呈白色。

将0.5M醋酸(1L/胎盘)加到混合槽中的清洁组织中，并在4℃下使用75-100rpm的电动混合器混合18-24小时。使用上述方法分离组织。

将新鲜的0.5M醋酸(1L/胎盘)与1g/L胃蛋白酶加到组织中。在23℃下使用75-100rpm的电动混合器混合样品24小时。24小时后，在约23℃下通过#10筛和#50-100筛过滤样品。

将NaCl加到过滤溶液中，使盐浓度为0.2M。将样品在约23℃下培养1小时，直到形成沉淀并开始沉降。使样品在10,000g下离心30分钟，通过从离心瓶小心倾析，使上清液与沉淀分离。或者，通过一系列过滤器过滤溶液(约23℃)，包含20μm、5μm、2.7μm、0.45μm，且如果需要，0.22μm。

将上清液或滤液加到高窄的透明玻璃或塑料容器中。使溶液的NaCl浓度为0.7M NaCl，其中通常形成白色沉淀。沉淀移到混合物上方。在4-23℃、无混合或摇动下将样品培养过夜。从盐沉淀吸出或排出上清液，除去尽可能多的液相(约23℃)。

将得到的沉淀溶解在5倍体积的10mM HCl中，重复上段的盐析。将得到的沉淀再次溶解在5倍体积的10mM HCl中，再次重复上段的盐析。得到的样品应在～10mM HCl中含有约5mM醋酸，胶原浓度约0.5mg/mL。

使用切向流过滤(TFF)装置(渗滤)，将样品(4℃)浓缩至3mg/mL。使用HPLC测量醋酸浓度。在浓缩样品时，再加入10mM HCl，持续浓缩，直到醋酸浓度达到＜1mM。

在醋酸浓度达到＜1mM后，持续浓缩，直到样品开始变粘稠。当根据SIRCOL^TM分析(Biocolor公司，Newtownabbey，Northern Ireland，英国)测得胶原浓度为3-4mg/mL时，停止浓缩过程。

在封闭的无菌容器中(消过毒的)，使用0.22μm和0.1μm过滤器过滤最终胶原样品。该步骤在约23℃下进行。

最终溶液保存在4℃下。

5.2实施例2：从胎盘分离胶原

该实施例阐明根据本发明从胎盘分离胶原的进一步的方法。

得到冷冻胎盘，按实施例1所述，处理组织，在4℃下用0.5M醋酸(1L/胎盘)洗涤18-24小时，并从混合物中分离组织。将0.5M醋酸(1L/胎盘)与0.5g胃蛋白酶/胎盘加到混合槽中的组织中，在约5-6℃下使用75-100rpm的电动混合器混合22-24小时。

将新鲜的0.5M醋酸(2体积的醋酸溶液/胎盘)与2g/L胃蛋白酶/胎盘加到组织中。在23℃下使用75-100rpm的电动混合器在混合槽中混合样品24小时。24小时后，在约23℃下通过#10筛和#50-100筛过滤样品。

将NaCl加到过滤溶液中，使盐浓度为0.7M，其中通常形成白色沉淀。沉淀移到混合物上方。在4-23℃、无混合或摇动下将样品培养过夜。从盐沉淀吸出或排出上清液，除去尽可能多的液相(约23℃)。

将得到的沉淀溶解在10mM HCl中，并按实施例1所述进一步处理。在该过程中，从每个胎盘中可以分离出＞1.5g的人胎盘胶原，最终胶原样品含有＞98％的胶原和＞90％的I型胶原。

5.3实施例3：从胎盘分离胶原

该实施例阐明根据本发明从胎盘分离胶原的进一步的方法。

得到冷冻胎盘，按实施例1和实施例2所述，处理组织和盐析，将得到的沉淀溶解在10mM HCl中。

以50ml/min的速率将1N氢氧化钠(NaOH)溶液(约160ml/胎盘)加到样品中，并在5-6℃下使用60-100rpm的电动混合器混合60min。

加入4M NaCl和10mM HCl，使盐浓度为0.7M，其中通常形成白色沉淀。沉淀移到混合物上方。在4-23℃、无混合或摇动下将样品培养过夜。从盐沉淀吸出或排出上清液，除去尽可能多的液相(约23℃)。

将得到的沉淀溶解在10mM HCl中，并按实施例1所述进一步处理。

5.4实施例4：制备纤维化的胶原

将10mM HCl(～3mg/ml，pH～2)中的人胎盘胶原(HPC)在4℃下保持在护套中装水并且具有搅拌能力的反应容器中。

搅拌下，将中和缓冲液(0.2M Na₂HPO₄，pH 9.2)加到胶原中，比例为1.5份中和缓冲液比8.5份胶原溶液，最终磷酸根离子浓度为30mM。根据需要将pH调节至7.2，并停止搅拌。

以1℃/分钟的速度将温度升至32℃，然后在32℃下保持20-24小时。将胶原转移至离心管中，总体积降低至少10倍。

为除去非纤维化的胶原，将纤维化的胶原悬浮液在磷酸盐缓冲盐水(20mM Na₂HPO₄和130mM NaCl，pH 7.4)中洗涤3次。

通过60目筛以2900ml/min剪切～3mg/ml的纤维化的胶原悬浮液。胶原通过筛子～75x。

通过热重分析确认胶原浓度。通过差示扫描量热法确认胶原变性温度。

纤维化的胶原悬浮液保持在4℃下。

5.5实施例5：制备交联的纤维化的胶原

在25℃下将PBS(～2.5mg/ml，pH 7.4)中的纤维化的胶原悬浮液保持在护套中装水并且具有搅拌能力的反应容器中。在剧烈搅拌纤维化的胶原悬浮液的同时加入50mM丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。使用1M NaOH调节pH，直到pH为9.5。反应在约25℃下搅拌24小时，其后洗涤得到的交联的胶原悬浮液一次，并在0.5M甘氨酸，pH 10中将其悬浮。在约25℃下搅拌24小时猝灭交联反应。用PBS洗涤得到的交联的胶原悬浮液3次。

通过热重分析确认胶原浓度。通过差示扫描量热法确认胶原变性温度。

交联的纤维化的胶原悬浮液保持在4℃下。

5.6实施例6：制备可注射的、交联的、纤维化的胶原

该实施例阐明剪切交联的纤维化的胶原以改善注射能力和耐久性。

使用组织均质器剪切交联的纤维化的胶原，并从悬浮液中筛出任何过大的颗粒。将胶原浓缩至～35mg/ml(例如，通过热重分析确认)。

5.7实施例7：病毒清除

该实施例阐明病毒性颗粒从本发明的胶原组合物中的清除。

将根据实施例4、5或6制备的3mg/mL胶原组合物溶解在5倍体积的10mM HCl，pH 2-2.3中。

然后使稀释的胶原组合物经过过滤装置。为进行过滤，将#16管连接至Minimate^TM切向流过滤装置(Pall公司，Santa Clara，加拿大)的供料和保留物口。将另一个管连接至排放口(废物收集)。将蠕动泵连接至样品和供料口之间的供料管线。泵速设置在20-30ml/分钟。将稀释的胶原组合物置于容器中，在同一容器上使用装置的供料管和保留物管。配置废物收集容器，以从排放口收集除去的流体。打开泵，并在约4-27℃下运转。浓缩样品，直到剩余胶原体积达到在稀释之前的原始体积。

将收集的胶原样品再稀释5倍，重复浓缩过程。重复稀释和浓缩过程6次以上，以得到干净的胶原组合物。

合适地，可以根据实施例3、4和/或6进一步处理干净的胶原组合物。

5.8实施例8：制备可注射的胶原组合物

将实施例6或7的胶原组合物装入带有30号针的1ml注射器中，并在4℃下保存。

5.9实施例9：从胎盘制备可注射的胶原组合物

该实施例阐明从人胎盘制备人可注射的胶原组合物。

步骤1：按实施例1-3所述从胎盘分离人胎盘胶原(HPC)，并将10mMHCl中的胶原样品保存在4℃下。

步骤2：按实施例4所述使分离的HPC纤维化。

步骤3：按实施例5所述使纤维化的HPC交联。

步骤4：按实施例6所述使交联的HPC被剪切和浓缩。

步骤5：按实施例7所述清除被剪切的HPC中的病毒性颗粒。

步骤6：按实施例8所述将干净的HPC装到注射器中，并在4℃下保存。

按此过程可以制备约26个可注射的人胎盘胶原注射针/胎盘。

在此引入本说明书所述的所有出版物和专利申请作为参考，就好象每个出版物和专利申请被具体和单独地引入作为参考一样。尽管为清楚理解，已经详细地说明和例举了上述发明，但本领域技术人员根据本发明的教导很显然可以在所附权利要求的精神和范围内作出某些变化和修改。

Claims (51)

1.1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联的酸溶性去端肽胶原。

2.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其中所述胶原是哺乳动物胶原。

3.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其是牛、绵羊或大鼠胶原。

4.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其是人胶原。

5.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其是胎盘胶原。

6.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其在交联之前被纤维化。

7.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其是人胎盘胶原。

8.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其用多官能的环氧化合物交联。

9.如权利要求8所述的交联的去端肽胶原，其用1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联。

10.如权利要求1所述的交联的去端肽胶原，其被还原。

11.如权利要求10所述的交联的去端肽胶原，其被硼氢化钠还原。

12.包含权利要求1所述的交联的去端肽胶原的组合物，其中所述组合物的至少80％的胶原是I型胶原。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物的80-90％的胶原是I型胶原。

14.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物的小于10％的胶原是III型胶原。

15.如权利要求12所述的组合物，其中所述组合物的2-13％的胶原是IV型胶原。

16.如权利要求12所述的组合物，其包含至少10μg/mg的碳水化合物。

17.如权利要求12所述的组合物，其还包含透明质酸。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述透明质酸被交联。

19.增强、填充或代替哺乳动物的组织的方法，包含将权利要求1所述的交联的去端肽胶原施用至哺乳动物的组织。

20.如权利要求13所述的方法，其中所述交联的去端肽胶原通过注射施用。

21.用于增强、填充或代替哺乳动物的组织的试剂盒，包括权利要求1所述的交联的去端肽胶原，和带有关于施用所述交联的去端肽胶原的说明的标记。

22.如权利要求21所述的试剂盒，还包含用于施用所述交联的去端肽胶原的装置。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述装置是注射器。

24.从哺乳动物的包含胶原的组织制备去端肽胶原的方法，所述方法包含以下步骤：

a)使所述组织与渗透压冲击溶液接触，以产生胶原溶液。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述渗透压冲击溶液包含渗透势比50mM NaCl小的水。

26.如权利要求24所述的方法，其中在使所述组织与至少具有0.5MNaCl溶液的渗透势的溶液接触之前或之后进行步骤(a)。

27.如权利要求24所述的方法，还包含以下步骤：

b)使所述组织与酸洗溶液接触。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述酸洗溶液包含0.5M醋酸。

29.如权利要求27所述的方法，还包含以下步骤：

c)从所述胶原除去端肽。

30.如权利要求29所述的方法，其中通过在适于除去端肽的条件下使所述胶原溶液与能够除去端肽的酶接触来除去所述端肽。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述条件包含温度为23-25℃。

33.如权利要求29所述的方法，还包含以下步骤：

d)使所述胶原与低离子强度溶液接触。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述低离子强度溶液包含0.2MNaCl。

35.如权利要求33所述的方法，还包含以下步骤：

e)用高离子强度溶液使胶原沉淀。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述高离子强度溶液包含0.7MNaCl。

37.如权利要求36所述的方法，其中重复权利要求35的步骤e)。

38.如权利要求36所述的方法，还包含过滤所述胶原的步骤。

39.如权利要求35所述的方法，还包含以下步骤：

f)使所述胶原纤维化。

40.如权利要求39所述的方法，还包含以下步骤：

g)使所述胶原交联，以产生交联的胶原。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述胶原用戊二醛、京尼平或1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联。

42.如权利要求39所述的方法，还包含以下步骤：

h)使所述交联的胶原还原。

43.如权利要求42所述的方法，其中通过使交联的胶原与硼氢化钠接触使所述交联的胶原还原。

44.如权利要求42所述的方法，还包含以下步骤：

i)剪切所述交联的胶原。

45.使酸溶性去端肽胶原交联的方法，包括在适于使酸溶性去端肽胶原交联的条件下使酸溶性去端肽胶原与1，4-丁二醇二缩水甘油醚接触的步骤。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述酸溶性去端肽胶原来自人胎盘。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述酸溶性去端肽胶原与按重量计400％的1，4-丁二醇二缩水甘油醚接触。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述酸溶性去端肽胶原在催化剂的存在下与1，4-丁二醇二缩水甘油醚接触。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述催化剂是吡啶。

50.减少病毒性颗粒在胶原组合物中的量的方法，包括使胶原组合物与过滤器接触的步骤，所述过滤器的尺寸允许一种或多种病毒性颗粒通过所述过滤器，同时保留所述胶原组合物。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述过滤器为约500kDa、约750kDa或约1000kDa。