CN101166564A - 色谱纯化的方法和装置 - Google Patents

Abstract

提出一种通过单独的色谱柱连续或准连续地纯化多组分混合物(F)的方法，所述混合物利用至少一种溶剂通过所述色谱柱进料。所述多组分混合物(F)至少包含轻杂质(A)、待纯化的中间产品(B)和重杂质(C)，并且所述柱分成至少四部分(α、β、γ、δ)，其中第一部分(α)具有至少一个溶剂入口和至少一个用于已纯化的中间产品(B)的出口，使得其将纯化的中间产品(B)洗出系统，但是使重杂质(C)保留在该部分(α)的内部，第二部分(β)具有至少一个溶剂入口和至少一个连接到第四部分(δ)的入口的出口，以便其将被重杂质(C)污染的中间产品(B)通过该出口冲洗到第四部分(δ)内，而使纯重杂质(C)保留在第二部分(β)内，第三部分(γ)具有至少一个溶剂入口和用于重杂质(C)的出口，以便其通过所述出口洗出重杂质(C)并净化色谱柱，第四部分(δ)具有至少一个用于接收第二部分(β)出口的输出的入口和至少一个用于多组分混合物(F)进料的入口以及至少一个用于轻杂质(A)的出口，以便其将轻杂质(A)洗出体系，但使中间产品(B)保留在该部分(δ)里，其中在一个转换时间(t^*)之后或之内，将第一部分(α)末尾的柱移动到第二部分(β)的第一位置，第二部分(β)末尾的柱移动到第三部分(γ)的第一位置，第三部分(γ)末尾的柱移动到第四部分(δ)的第一位置，并且将第四部分(δ)末尾的柱移动成为第一部分(α)的第一柱。

Description

色谱纯化的方法和装置

技术领域

本发明涉及多柱纯化方法及其优化的领域。

背景技术

间歇色谱是众所周知的，并常规地和制备性地用于工业生产。但是，该技术由于高溶剂消耗和昂贵的柱材料尤其对于大规模分离和纯化而言成本相当高，并且该技术需要最优使用有益的色谱设备。

对于实际生产中的大规模分离，连续法比间歇法更为经济。连续法的优点是例如产率高、溶剂消耗(回收)更少、分级和分析的成本更低、对于待纯化的量具备更好的适应性等。

实现连续色谱过程的一种方法是所谓的模拟移动床方法(SimulatedMoving Bed Process)(SMB，参见例如Markus Juza，Marco Mazzottiand Massimo Morbidelli，Simulated moving-bed chromatography andits application to chirotechnology，Trends in biotechnology，ElsevierB.V.，TIBTECH，March 2000，Vol.18，第108-118页)。这种方法可以通过调节两个入口流(进料、洗脱剂)和两个出口流(残余液、提取液)而将混合物分离成两个级分。SMB法是逆流的，使得可以在高产率下进行两组分的精确分离。在工业中，SMB技术的典型例子是手性分离，即从外消旋混合物中分离出两种对映体。如果选择性很小，则间歇法通常导致相当低的产率，而SMB却允许具有高纯度和高产率。

为了优化SMB法并使其适应特定问题，已经对SMB法提出各种改进。例如，已经提出改变入口流和出口流的单独连接和断开的瞬间，即入口流和出口流不是象在经典SMB中那样相伴转换，而是按照特定的和分阶段的方案转换(所谓的Varicol技术，参见例如WO-A-2004/039468)。

另一种变型已经由Morbidelli等人提出(参见例如”PowerFeedoperation of simulated moving bed units：changing flow-rates duringthe switching interval″by Ziyang Zhang，Marco Mazzotti，MassimoMorbidelli，Journal of Chromatography A，1006(2003)87-99，ElsevierB.V.)，其中，由于每个周期后的不连续转换，为了补偿提取液和残余液的输出浓度的时间变化，以匹配转换时间的补偿方式变化洗脱剂的流量，以便具有甚至更高的产率(所谓的Powerfeed技术)。

已经提出第三种且是准模拟的变型，其中，不改变洗脱剂的流量而是以补偿方式改变进料浓度，以达到相同目的(所谓的Modicon技术，参见例如WO 2004/014511)。

如已经提及的，尤其是大规模色谱法是工作量艰巨且昂贵的技术。其仅用于高价值分子的大规模分离。市场上最有价值的分子是生物分子，例如肽、蛋白质和抗体。这些分子通常通过溶剂梯度间歇色谱纯化。与在本申请的上下文中表示使混合物分成两个级分的术语“分离”不同，“纯化”是指所需产物是在轻和重吸附杂质之间的中间体，并且产生三个级分。一个SMB循环只能将进料流分成两个级分(分离)，但是对于纯化，需要使所需组分在中间级分中的三个级分。将需要二级或顺序SMB，以纯化含有中间所需生物分子以及重和轻杂质的多组分混合物，但是问题在于如果例如在第一级SMB中产生第一残余液和第一提取液并且在第二级SMB中将所述第一提取液分离成第二残余液(所需产物)和第二提取液，则应该已经在第一级中分离(并且应该在第一残余液中终结)的所有不希望组分无疑将在第二残余液中终结，尤其对于低浓度的所需级分，使该方法无用。

除了以上方法之外，还对SMB方案应用其它改性剂变化，例如几年来还在所谓的“溶剂梯度模式”(参见例如US 4,031,155)下操作SMB过程。所述“溶剂梯度”是指SMB包含在不同的改性剂水平下操作的部分。这种类型的梯度是“阶梯梯度”。但是，对于生物分子的纯化，需要平滑的线性梯度，如同常规应用于(线性)溶剂梯度间歇纯化中的一样。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种改进的纯化方法，其允许分离三个级分。特别考虑到大规模应用，该方法应该设置简单，并且应该允许高纯度和高产率。提出一种利用单独的色谱柱连续或准连续地纯化多组分混合物的方法，所述混合物利用至少一种溶剂通过所述色谱柱进料。本方法的目的不仅仅是分离两级分，而且其主要优点在于可以纯化真正的多组分混合物，该真正的多组分混合物至少包含轻杂质、待纯化的中间产品和重杂质，亦即可分离中间产品，并且即使该中间产品或所需产品与重和轻杂质相比仅少量存在也是如此。

本发明通过将梯度间歇色谱的可能性与模拟移动床技术的要素或逆流原理相结合来解决上述问题，由此允许不但受益于梯度间歇色谱的可能性而且受益于连续纯化。

因此，本发明的目的是根据权利要求1的方法，以及对该方法进行设置的方法和实施该方法的装置。

在所述用于多组分混合物的连续或准连续纯化的方法中，使用至少两个、优选至少三个单独的色谱柱，所述混合物利用至少一种溶剂通过所述色谱柱进料。如上所述，该多组分混合物至少包含轻杂质、待纯化的中间产品和重杂质，因此该系统用于实际分离中间级分。

现在，已经惊奇地发现可以在至少一个间歇模式步骤或位置中运行柱，其中一个柱的出口用来收集所需中间产品，以及在至少一个连续或准连续模式步骤或位置中运行柱，其中在该模式中至少一个柱的出口与至少一个其它柱的入口流体连接。必须注意的是间歇步骤也可以包括流体连接的柱，但仍有一个出口用来收集所需产品。

现在，一个关键要素是所述间歇模式和所述连续或准连续模式可以令人惊奇地同时或顺序实现，并且在一个转换时间之后或之内，柱可以沿着与溶剂的一般流动方向相反的方向移动到它们的位置中。该结构尤其适用于与梯度洗脱组合的情况，但是其不必依赖于梯度洗脱。

本发明的要点具体在于：事实上，通过连续步骤或功能与间歇步骤或功能的巧妙组合，所述组合可以顺序(以分阶段的方式)或同时(即，相伴地)以及柱逆流移动(准模拟移动床)来实施，可以最有效地纯化中间级分，因为事实上在间歇步骤或位置中，可以非常有效地实现所需级分或副级分(side fraction)的洗脱，而且因为事实上连续步骤或位置允许级分的再循环。

如本领域技术人员将容易理解的，一般概念不仅应用于上文和下文中的色谱柱，而且同样应用于与色谱柱起相同作用的膜吸附器。因此，虽然在本文中优选色谱柱，但是如果在本说明书中使用术语色谱柱，则其同样包括膜吸附器。

此外，虽然本领域技术人员清楚，但是还应该指出在待分离的级分的上下文中，名称“重”意指洗脱慢的化合物，即对固定相具有相对大的亲和力，并且其因此在所述过程中洗脱较迟，而名称“轻”意指洗脱快的化合物，即对固定相具有相对小的亲和力，并且其因此在所述过程中洗脱较早。

本发明的概念同样可应用于传统液固系统，即应用于其中在此称为“溶剂”的流动相为液体的系统，以及可应用于超临界系统，即应用于其中溶剂或流体处于超临界状态的系统(所谓的超临界流体色谱，SFC)。

与例如用有机改性剂调节溶剂强度的反相色谱不同，SFC系统的吸附性能可以通过调节流动相密度来等价控制。在SFC中密度如何影响溶质的吸附行为的技术细节可以例如从Arvind Rajendran、OliverKruchi、Marco Mazzotti、Massimo Morbidelli的题目为“Effect ofpressure drop on solute retention and column efficiency in supercriticalfluid chromatography”的论文(Journal of Chromatography A，1092(2005)149-160)中获得。

在SFC中，在转换时间期间应用压力梯度来代替溶剂浓度梯度(下文将更详细地讨论)，使得以适当的方式调节超临界溶剂的密度，以获得所需的分离。可以通过色谱柱之后的压力控制阀来调节压力梯度。在SFC中，可以以闭合回路方式操作系统，因为可以再循环溶剂。在超临界溶剂已经离开在δ部分中的装置(参见下文)后，可以容易地通过改变其压力和密度来将其重新调整。因此，如果在下文中提到浓度梯度，则在超临界溶剂的情况下，意味着包括相应的密度变化。

本发明的关键特征之一在于以下事实，根据第一优选实施方案，沿着这些路线基本提出柱或由柱(部分)实现的功能的特定布局，其在某些部分中提供逆流原理的最佳利用并避免完全闭合模拟移动床技术循环的缺点，其中所述部分以惊人简单但高效的方式相互连接，其允许使用梯度技术进行有效纯化并且不仅进行二级分的分离而且进行三级分的分离。因此，连续方法可以与梯度技术一起使用，后者在许多困难的纯化过程中是可行的唯一纯化方法。

这是通过如下方式获得的：其中所述柱分为至少四部分，其中第一部分具有至少一个溶剂入口和至少一个用于已纯化的中间产品的出口，使得其将纯化的中间产品洗出系统，但是使重杂质保留在该部分的内部。除此之外，第二部分具有至少一个溶剂入口和至少一个连接到第四部分入口的出口，以便其将被重杂质“污染”的中间产品通过所述出口冲洗到第四部分内，但使基本上纯的重杂质保留在第二部分内，第三部分具有至少一个溶剂入口和用于重杂质的出口，以便其通过所述出口洗出重杂质并净化所述色谱柱，并且第四部分具有至少一个用于接收第二部分出口的输出的入口和至少一个用于多组分混合物进料的入口以及至少一个用于轻杂质的出口，以便其将所述轻杂质洗出系统，但使中间产品保留在该部分内。在该系统中，在转换时间之后或之内，第一部分末尾的柱移动到第二部分的第一位置，第二部分末尾的柱移动到第三部分的第一位置，第三部分末尾的柱移动到第四部分的第一位置并且第四部分末尾的柱移动成为第一部分的第一柱。如果在所述转换时间之后进行转换，则在那时所有柱相伴转换。如果在所述转换时间之内进行转换，则意味着也可以应用上述Varicol技术。第二和第四部分之间的准“短路”允许中间级分“再循环”并使其保留在所述系统的区域中，在所述区域中可以提取所述中间级分而不使其迁移至重或轻级分。所述部分的功能可以同步(即，相伴地和并列地运行)或顺序地(即，以随时间(time-wise)分阶段的方式进行)来实现。在后一种情况下，优选在一个转换时间内存在包括连续或准连续洗脱的顺序步骤和包括间歇洗脱的步骤。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法明确地与梯度技术结合，即在转换时间期间进料到至少一个部分中的溶剂在组成上基本连续变化。

根据另一个优选实施方案，存在至少两个、优选至少三个单独的柱，并且所述部分的分组通过单个柱实现。这意味着这些功能是顺序实施而不是同时实施的。优选地，在一个转换时间内单独部分的功能利用优选交替的连续或准连续洗脱的步骤和具有间歇洗脱的步骤而顺序实现。

优选地，在转换时间期间，利用增加改性剂浓度，使进料到所有或至少大多数所述部分中的溶剂在组成上基本连续地变化。沿着从第四到第一部分的柱的顺序，优选增加改性剂浓度，使得柱移动后，在每个柱中的改性剂浓度基本上处于在所述柱的新位置的基准浓度，并且使得在下一次的柱移动之后，在随后的转换时间期间，在每个柱内部的改性剂浓度增加到后续位置的基准浓度。该方案应用于色谱法如反相和离子交换色谱，其中基本机理是改性剂吸附并占据树脂上的吸附位点。这意味着在这种情况下改性剂浓度越高，则(生物)分子可吸附强度越低。但是在其它系统例如HIC(疏水相互作用色谱)中，机理是在高盐浓度下，(生物)分子在液相中的溶解度小。因此，在这种情况下生物分子不再停留在液体中，而是吸附在固体上。当液体中的盐浓度(改性剂)降低时，(生物)分子可以再次溶解到液体中并从固体表面解吸附。因此，在后一种情况下，改性剂浓度不增加反而降低，但是系统在完全类似于上述的对于色谱法例如反相和离子交换色谱情况下操作除外。

如果所述系统那样运行，则当固体基本上逆着主要溶剂路径沿着系统行进时，其确实经历连续梯度。由间歇色谱可知，流动相组成尤其是改性剂浓度可以线性变化，但是其也可以准线性变化，即为适合纯化问题而在转换时间期间依照特定需要的曲线变化(甚至对可能的每个柱是单独的)。类似地，在超临界溶剂的情况下，可以相应地改变密度。

技术上，如果在每个溶剂入口处提供具有单独恒定基准浓度改性剂的溶剂，并且如果为每个入口提供具有周期性变化的组成(即，例如改性剂浓度)的溶剂流和/或流量，并且与含有单独恒定基准浓度的改性剂的溶剂混合，以沿着所述系统建立梯度，则可以最容易地实现所述梯度。类似地，在超陆界溶剂的情况下，可以相应地改变密度。

根据本方法的一个优选实施方案，至少一个部分包含至少两个柱。但是，必须指出原则上特别地还可以将第一、第二和第三部分组合为一个柱，其级分以时间顺序分离的步骤来获取，以实现相同或等价的目标。

基本上，纯化问题被分为通过第一部分实现的主要部分，并且该主要部分进行所需产品的提取。其余部分分别主要处理所需产品以及轻和重杂质之间的界面的最有效分离。由此，证明当至少部分部分、优选第二部分包含至少两个逆流、顺序连接的柱时是有利的。

实际上，第四部分是能够纯化三元混合物的关键之一。因此，可以采用更复杂的方式构造第四部分，并且可以例如包含分为三个子部分的至少三个柱或顺序地提供这些子部分的功能的更少的柱。所述第四部分的第一子部分包含至少一个用于多组分混合物进料的入口，优选其流量低于系统中的总流量，和至少一个用于使轻杂质直接移出系统或进入第三子部分入口的出口。第二子部分包含至少一个用于接收第二部分输出的入口和至少一个连接到第三子部分的至少一个输入的出口。第三子部分包含至少一个用于接收第二子部分的输出的入口和可能的至少一个用于接收第一子部分的输出的入口以及至少一个出口。而且，至于在主系统中，在转换时间之后(或者对于异步转换方法，在转换时间之内)，柱移动(或相应地，通过提供不同的连接改变同一柱的功能)，即柱从第一子部分移动到第二子部分的第一位置，第二子部分末尾的柱移动到第一部分的第一位置，第三部分末尾的柱移动到第三子部分的第一位置，并且第三子部分末尾的柱移动成为第一子部分的柱。此外，第四部分的三个不同的部分的功能可以同步或顺序实现。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述系统包含三个柱，其中所述第一、第二和第三部分的功能由一个单个的柱实现，并且其中在一个转换时间之内，所述单个柱顺序地起到所述第一部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口用于将中间产品带出系统，同时将提供所述第四部分的功能的柱串联连接并且同时通过所述第四部分的出口将轻杂质带出系统。然后，所述单个柱起到所述第二部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口直接连接到所述第四部分的第一柱，同时将提供所述第四部分的功能的柱串联连接并且同时通过所述第四部分的出口将轻杂质带出系统。然后，所述单个柱起到所述第三部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口用于收集重杂质，同时将提供所述第四部分的功能的柱串联连接，同时通过所述第四部分的出口将轻杂质带出系统，并且同时在提供所述第四部分的功能的柱之间，将多组分混合物进料到所述第四部分中。

在另一个但也是优选的实施方案中，将成对的所述顺序功能组合在一个柱内，并且在一个转换时间之内，交替进行连续或准连续洗脱的步骤和含有间歇洗脱的步骤，以顺序方式完成这些功能。

在这种情况下，优选所述第四部分包含如上所述的三个子部分，并且在整个系统中提供三个柱，所述三个柱在一个转换时间的第一部分内以连续或准连续洗脱的方式顺序连接，并在所述转换时间的第二部分内以间歇方式驱动，以取出多组分混合物的单独级分。

所述第四部分也可以包含三个子部分，并且在整个系统中可以提供四个柱，所述四个柱在一个转换时间的第一部分内以连续或准连续洗脱的方式顺序连接，并且在所述转换时间的第二部分内以间歇方式驱动，以取出多组分混合物的单独级分，其中在所述间歇方式中，所述柱之一具有接近或等于零的流量。

根据具有甚至所需柱数量减少更多的另一个优选实施方案，所述系统仅由两个柱组成，其中第四部分包含三个子部分。在这种情况下，在所述转换时间的第一部分中，将所述两个柱串联连接以连续洗脱，同时通过所述出口从系统中移出轻杂质，在所述转换时间的第二部分中，以间歇模式驱动所述柱以取出在上游柱上的中间级分和在下游柱上的轻杂质，同时将多组分混合物进料到所述下游柱中，在所述转换时间的第三部分中，将所述柱串联连接以连续洗脱，同时通过所述出口从系统中移出轻杂质，在所述转换时间的第四部分中，以间歇模式驱动所述柱以取出在上游柱上的重杂质和在下游柱上的轻杂质，其中在每个转换时间之后，所述两个柱的位置互相交换。

优选地，在具有三个子部分的第四系统的结构中，第一子部分包含至少两个平行的柱，和/或第二和/或第三子部分包含至少两个逆流的平行或顺序的柱。

优选地，原料以连续方式引入到系统中，甚至更优选地，使用周期性脉冲的浓度曲线(具有转换频率的周期)引入或使用在一个转换时间内具有一定形状的浓度曲线的方式引入。作为选择或除此之外，在一个转换时间内溶剂的流量/密度是变化的，和/或在一个转换时间内单独的入口/出口的转换是分阶段的。如果在单个柱中流量不同，则是特别有用的。

用于纯化的设备越复杂，找到用于设置所述纯化方案的参数的简易方法就变得越重要。在目前的情况下，通过首先运行进料的标准梯度间歇色谱和通过对间歇数据的简单易懂和直观的分析是可行的。

在目前情况下，可以设置参数，其中在第一步骤中，运行梯度间歇色谱，在第二步骤中将所得到的色谱分成含有轻级分的第一组、含有所需级分的第二组、含有与重级分重叠的所需级分的第三组和仅含有重级分的第四组。在所述设置的第三步骤中，随后选择所述方法的参数，使得所述第一部分完成相当于梯度间歇色谱在所述第二组的时间内的任务，所述第二部分完成相当于梯度间歇色谱在所述第三组的时间内的任务，所述第三部分完成相当于梯度间歇色谱在所述第四组的时间内的任务，所述第四部分完成相当于梯度间歇色谱在所述第一组的时间内的任务。

因此，相对于生产率的最佳转换时间优选计算为：直到轻杂质已经在梯度间歇色谱中完全洗脱的时间乘以梯度间歇色谱的流量除以所述设定的最大流量并除以运行间歇梯度直到轻杂质已经在梯度间歇色谱中完全洗脱的柱数量。优选基于所述相应的部分在所述梯度间歇色谱中所用的时间乘以所述间歇流量除以所述转换时间来确定每个柱中的流量。

除此之外，本发明还涉及用于上述给出的方法的装置。在该装置中，提供至少两个、优选至少三个单独的色谱柱的布局，但优选4、5或6个柱，利用至少一种溶剂通过所述柱使混合物进料，其中多组分混合物再次至少包含轻杂质、待纯化的中间产品和重杂质。所述装置包含泵、阀、柱间连接管、收集出口、溶剂入口和至少一个进料入口的形式的设备，所述部件允许所述柱运行，以便在至少一个间歇模式步骤或位置中，一个柱的出口用来收集中间产品，以及在至少连续或准连续模式步骤或位置中，至少一个柱的出口与至少一个其它柱的入口流体连接，其中所述间歇模式和所述连续或准连续模式可以同步或顺序实现，并且其中在转换时间之后或之内，所述柱以与所述溶剂流动一般方向相反的方向移动到其位置中。

优选并根据所述装置的第一实施方案构造所述装置，使得所述柱被分为至少四部分，其中第一部分具有至少一个溶剂入口和至少一个用于已纯化的中间产品的出口，使得其将纯化的中间产品洗出系统，但是使重杂质保留在该部分的内部，第二部分具有至少一个溶剂入口和至少一个连接到第四部分的入口的出口，以便其将被重杂质污染的中间产品通过所述出口冲洗到第四部分内，而使纯重杂质保留在该部分内，第三部分具有至少一个溶剂入口和用于重杂质的出口，以便其通过所述出口洗出重杂质并净化所述色谱柱，第四部分具有至少一个用于接收第二部分的出口的输出的入口和至少一个用于多组分混合物进料的入口以及至少一个用于轻杂质的出口，以便其将轻杂质洗出体系，但使中间产品保留在该部分内，其中提供连接或断开装置，以允许在转换时间之后或之内，第一部分末尾的柱移动到第二部分的第一位置，第二部分末尾的柱移动到第三部分的第一位置，第三部分末尾的柱移动到第四部分的第一位置，并且第四部分末尾的柱移动成为第一部分的第一柱。

在从属权利要求中概述本发明的其它实施方案。

附图说明

在附图中，示出本发明的优选实施方案，其中：

图1表示6柱线性溶剂梯度SMB的例子；

图2表示将阶梯梯度(b)和周期溶剂梯度(a)叠加的准线性梯度技术实现，在此为5柱；

图3表示分离4组分混合物的5柱溶剂梯度SMB的示意性流程图；

图4表示“短路线性溶剂梯度SMB”设置的具体例子；

图5表示“连续梯度纯化法”的通用流程图；

图6表示一个特定“连续梯度纯化法”的流程图；

图7表示另一个特定“连续梯度纯化法”的流程图；

图8表示另一个特定“连续梯度纯化法”的流程图；

图9表示定性色谱和纯化过程的部分；

图10表示演示连续过程设计的模拟梯度色谱；

图11表示在转换中间的过程模拟。可以看出柱1已经彻底净化。

图12表示转换前的过程模拟；

图13表示转换后的过程模拟；

图14表示用于最大流量为2.25ml/分钟的间歇洗脱和排成一列的7根短柱的模拟梯度色谱，纯度为79.0％，产率为100％；

图15表示用于验证和定性色谱的8柱法的流程图；

图16表示用分析用ODS-柱ZORBAX ODS SB-300对进料的梯度分析；

图17表示稍微不同的操作条件的产率和纯度之间的关系；

图18表示排成一列的两个纯化系统；

图19表示仅用3柱操作的“5柱单元”的方案，其中部分α、β、γ结合为一个柱；

图20表示具有逆流路线和间歇路线的连续6柱单元；

图21表示如图20所述的特定“连续梯度纯化法”的流程图；

图22表示根据图20的仅用三柱对特定试验值的结构的操作；

图23表示根据图20的结构的转换方案；

图24表示根据图20的明确表示仅具有三柱的结构的操作；

图25表示在用3柱操作的“6柱单元”的一个循环期间的柱状态；

图26表示根据图21的但在β部分中具有两个逆流柱的布局的可能的四柱结构；

图27表示用于逆流梯度纯化的2柱结构；

图28表示根据图27的结构，示意图中包括在底部的梯度色谱的对应的任务；和

图29表示在一个设备中的具有“CEX”、“AEX”和“HIC”的顺序准连续结构。

具体实施方式

对于制备和分析的溶剂梯度间歇洗脱，最常使用相对时间的线性统计梯度。对于具有矩形等温线的生物分子，线性梯度洗脱通常是唯一有用的洗脱类型。引入此操作的系统使用准线性梯度，其类似于在间歇系统中使用的梯度。

间歇洗脱的线性溶剂梯度可被分成恒定水平和具有一个转换时间“t^*”的周期的周期性叠加线性梯度。

该“梯度分裂(gradient split)”在如图1所示的下列实例中解释，其中图1表示6柱“线性溶剂梯度模拟移动床(SMB)”。

一次转换后，柱中的改性剂浓度为基阶(base-step)浓度as(转换后)，其由底线表示。在下一次转换时间期间，各个柱内的浓度线性地(当然也可以非线性地)变化至下一级，其由顶级浓度表示，即图1中的bs(转换前)。当系统在“t^*”处开始转换，即柱以与溶剂流相反的方向移动时，新位置的初始浓度恰恰是之前位置的终止浓度。在该情况中，转换是指柱6转换为柱5、5→4、4→3、3→2、2→1、1→6，因为溶剂或洗脱剂从左侧流到右侧。

柱内的溶质分子无法“看见”t^*时的柱转换。它们仅“注意到”改性剂浓度随时间流逝的准连续变化，这是周期部分(从恒定水平开始，所述恒定水平对于每个柱是不同的，水平如图1所示)。最后，溶质分子可以随固相从例如柱6向后行进到柱1，并且它们仅能“感觉到”改性剂浓度从C_开始线性增加到C_结束，完全类似于线性溶剂梯度间歇洗脱。

图2表示如何有效地利用准线性梯度。对于每个柱而言，作为时间的函数改变的改性剂浓度C_{改性剂，v}(例如，将强溶剂如乙腈(ACNL)加到弱溶剂如含酸的水中，但是也可以是盐或其它改性剂)(图2a)与恒定水平的改性剂浓度C_{改性剂，c}(图2b)组合或叠加/混合。如果两个浓度组合为C_改性剂，则从柱的角度出发有效梯度变为线性梯度。在图2c中，从在5柱系统中的柱的角度出发，对改性剂浓度C_改性剂绘图。

当柱处于位置5时，它“看见”最低改性剂浓度。该浓度随时间线性增加。在转换时间t^*时，柱转换为位置4。再次发生线性浓度增加，但是其从等于正好在位置5转换前的浓度的浓度开始。当柱转换为位置3、2和1时，出现同样的情况。一个周期后，柱转换回位置5，再开始同样的步骤。

对于溶质选择性大的“容易的分离”(基线分离)，可以使用如图3所示的系统。在此，每个柱i在入口处包含洗脱曲线图(elution profile)，其中所述入口处含有在下一个柱(i-1)中洗出的组分，将最高的改性剂浓度用于柱1(s.s.：强溶剂)并且浓度沿着从柱2到5的顺序下降(w.s.：弱溶剂)。在这种情况下，可分离出4个级分，即轻级分A、两个中间级分B和C以及一个重级分D。

每个柱都有3个任务(此处以3号柱为例)：1)“洗脱一个组分(此处为组分B)”，2)“保持其它组分不移动(C、D)”，和3)“捕获在下一个柱“3-1＝2”中洗脱的组分(此处为C)”。

对于容易的分离(高选择性、基线分离)而言，阶梯梯度是足够的，实际上不需要准线性梯度，它们也基本上不影响过程的产率和选择性。

但是，容易的分离很少。待纯化的混合物通常由几百种不同的组分组成，其中的某些组分可能具有非常相似的吸附行为，并且其中仅有一种或很少数的组分是所需级分。除此之外，该所需级分通常非常少并被大量意欲除去的重和轻组分遮蔽。如图1所示的SMB将处于不能纯化如在反相树脂上的多肽那样的“常规”多组分混合物的中间级分的情况。

因此，事实上，该结构的问题之一在于其仅有效地适用于存在基线分离的情形，在所有其它情况下尤其是如果所需级分(例如B)仅占不希望级分较小百分比，则很难获得高产率和良好的分离。由于任何与所需级分重叠的化合物将在下游或上游级分中损失以及以不希望顺序混合级分，这将是不可避免的。

所以，如果柱的转换发生得“迟了”，即如果不再与轻级分(例如A)重叠，则没有太多时间留给洗脱所需级分(B)并且大部分所需级分(B)将消失在随后的重级分中，因为组分B将完全地且最无疑地在级分C的出口终止。或者如果柱转换得“早了”和如果在转换时刻迁就所需级分B和轻级分A的部分重叠，则所需级分(B)将被一定量的轻级分(A)污染。必须指出，这是根据图3的分阶段或顺序SMB无法克服的本质问题。

为了克服这些和其它问题，因此开发了根据所附权利要求的方法，其被称为“短路移动床技术”。

在这个惊人有效和简单的概念背后的基本思想之一在于：尽管事实上允许柱的转换发生得“迟了”，即如果在柱转换前特定柱3几乎不再包含任何轻级分A，则可以借助“短路”利用类似于如图3中给出的过程收回所需级分。其实现主要是因为：避免与随后的重级分(在图3的情况下为级分C)的重叠，和利用“溶剂路径”的短路，即使柱2的输出端与柱4的入口直接连接，使得在根据图3结构中最终将与C混合并被从系统中取出的任意量的所需级分B被带回到柱4，并且随后由于柱的逆流转换将被带进位置3，再次洗脱。

在图1中已经介绍了如何产生准连续线性溶剂梯度。在洗脱开始之前，以溶剂梯度间歇洗脱进行不连续地进料。原料在小改性剂浓度处装载，在此处溶质的吸附非常强并且吸附位点是自由的。装载后，及时增加改性剂浓度，并且溶质开始相继洗脱。在如图1所示的梯度SMB中，连续装载不是非常有用。在转换开始时将不得不脉冲进料，使得梯度可以及时达到它的效果。

为了获得高产率，在中间组分E1出现之前，图1中的柱5需要转换到位置4。就在转换之前，柱5仍然含有一些轻杂质(残余液，R)，其将在下一个转换期间和来自柱4的液体流一起进入柱5。负面影响在于轻组分将随固体向上移动并在新的进料脉冲之后到达柱4中的位置。因此，将不可能得到高纯度的中间所需组分E1。

一旦中间组分E1在柱3的柱出口处消失，则仅有一部分纯化流以“提取液1”E1流排出SMB。由于柱3和柱4之间的液体连接，大部分流入柱4。在柱4的入口处，重组分吸附在树脂上，使得已纯化的中间E1组分与重杂质E2混合。于是，分离变得不可能。

如图4所示，短路移动柱技术解决了这些问题。柱3不与其它柱液体连接，柱2与柱4连接，并且柱5可用于连续进料，其中柱4与柱6连接。

该技术的更通用的方法如图5所示，其中图4的柱的连接的布局通常显示下面的原理。在这种情况下，将包含A(轻级分)、B(所需级分)和C(重级分)三种级分的(恒定的或周期性脉冲的/分布的)进料F引入系统。虚线箭头表示固体移动，即柱在系统中的移动。在中心处指向右侧的水平箭头表示β和δ部分之间的液体循环。

在图5所示的通用过程中，将由一个或几个色谱柱组成的四部分α、β、γ、δ以闭合回路方式(虚线箭头)与模拟固体移动连接。一段时间之后，即转换时间t^*之后，α部分末尾的柱移动到β部分的第一位置并且β部分末尾的柱移动到γ部分的第一位置。γ部分末尾的柱转换为δ部分的第一位置，并且δ部分末尾的柱变为α部分的第一柱。这使得连续地获得轻杂质A、所需中间产品B和重杂质C之间的分离。除了β到δ部分之间的连接之外，所述部分与部分之间的柱移动相对于液体流是以交叉流的方式进行的，但是在所述部分内部的柱可以相对于液体流逆流移动。

在所述部分内部的柱的数量取决于分离的困难程度。如果组分可以容易地在间歇柱中纯化，则系统不需要所述部分内部和所述部分之间的逆流移动，于是每个部分可以仅由一个柱组成并且甚至不需要β部分。但是，对于在间歇洗脱中只能获得部分纯化的困难分离，优选在β和δ部分内部有一个或多个柱，以得到高产率和高纯度。β和δ部分通过液体循环流(水平中心箭头)相互连接。除了进料可以是连续流或脉冲之外，所有入口和出口流均是连续的。在各个部分中和在所述部分内的柱中流量不必相同。该方法可以将等位的(isocratic)且线性梯度的洗脱转换为连续的、部分逆流的分离。

所述部分具有具体任务，即：

α部分：将已纯化的中间产品洗出系统，但将重杂质保留在该部分内部。

β部分：冲洗在δ部分内被重杂质污染的中间产品，但将纯重杂质保留在该部分内。

γ部分：洗出重杂质并净化该部分的色谱柱。原位净化(CIP)。

δ部分：将轻杂质洗出系统，但将所需产品保留在该部分内部。对纯化系统进料。

各个部分可以具有适于必须被解决的特定分离问题的设计。在随后的图6～8中，给出某些部分的可能的变化。

例如，在图6中，给出δ部分的特定设计，在该部分中包含5个柱。由于事实上该部分必须提供全梯度清扫，直到轻杂质已经在间歇柱中完全洗脱，并且在某一时间可以从所述间歇柱中取出纯的所需产品，直到重杂质开始出现，所以通常建议在δ部分中具有较大数量的柱。

图7表示可以在β部分中具有以逆流方式工作的多个柱，因此该部分实际上被构造为极其类似于SMB布置。

在图7和图8中，还示出δ部分的另一变型，其中使用3个柱。为了具有如图4所示的布置，图7中柱7的出口没有连接到柱8的入口。

图6表示已经被用于实验验证的8柱系统的实例。必须指出，理论上，在如图6所示的结构中，也可以连接柱2的出口与柱4的入口。

在δ部分内还可以设置特定结构。通常建议具有至少一个柱(第一子部分δ_f)，在所述情况下为柱6，其被用来装载进料并具有低流量。该柱可以将轻杂质直接移出系统或者移到δ部分的其它柱中。在δ部分内的另一第二子部分δ_g由柱4和柱5给出，其提供接纳第二部分β的输出的入口并且其输出至另外的和第三子部分δ_r，在该具体情况下，子部分δ_r由柱7和8组成。

第二子部分δ_g基本上移除所有轻杂质A并确保轻杂质A被直接转移到第三子部分。除此之外，就在转换之前，当柱4移动到位置3时第二子部分δ_g确保所需组分B完全位于柱4内，并确保全梯度必需将B输送到固体的适当位置。在本文中，必须指出，所述第二子部分负责驱动全梯度，直到最后部分的轻杂质到达该部分末尾柱的末端。因此，如果该时间特别长的话，则在该部分中的柱的数量可能是合适的。

特别地，为了避免轻杂质在固相中的错误位置处被冲洗到柱5中，建议不将柱4的输出端连接到柱5的输入端。

由柱7和8形成的第三子部分包含至少一个用来接纳第二子部分δ_g输出的入口和可能的至少一个用来接纳第一子部分δ_f输出的入口以及至少一个出口，所述出口起到确保使B保留在系统中和将轻杂质移除出系统的作用。在根据图6的结构中，柱8的出口由干净的溶剂形成。

图7表示另一个结构，其中为了更好地在β部分中分离，逆流设置三个柱。在图7和8中，δ部分中的子结构的最简单结构如在上面详述的图6的上下文中给出。在轻杂质分离困难的情况下，根据图8的结构优选为根据图4的结构。

通用的方案可以采取多种具体形式，例如：

●如果为脉冲进料，则δ部分需要比连续进料少一根柱。

●如果重杂质比中间产品的吸附强得多，则β部分不包含柱。

●对于幸运的情况，本方法甚至可以不使用溶剂梯度来操作。

还必须指出，α、β和γ部分也可以组合为一个柱，其中以随时间分阶段的方式，将等于如图5中所给出的α、β和γ部分的输出的单个级分取出并进料到图5中相应的元件的输入端。

对于在本申请中提出的可变的结构，非常重要的是具有通用和简单的方案，以设置用于运行该系统的参数，使得其适于特定的纯化问题。在目前的情况下，存在非常简单的方案和技术，其脱离梯度间歇色谱以找到用于所提出的连续方法的参数。

本方法可以容易地由以下实验(或模拟)浓度曲线图来设计。每一个部分是指如图9所示的时间间隔。α至δ部分的任务是指在间歇洗脱的相应的时间间隔中发生的事件。

演示一个具体的例子以增强对间歇纯化转变为连续纯化的理解。在该例中，实施从170g/l的ACNL(乙腈)到190g/l的ACNL的溶剂梯度(改性剂梯度)。流量为0.5ml/分钟。柱体积1.66ml。梯度在0分钟时开始并在25分钟时结束。注射25μl的1g/l的原降钙素，其中纯度是轻1(A1)为25％、轻2(A2)为5％、中间(B)为55％、重(C)为15％。

所需产率为60％、纯度为82.9％，使得中间级分在26.8～31分钟时取出。

这导致如图10给出的曲线图。

脱离所述间歇梯度色谱，设计连续方法如下：使用7个柱，其具有与单个间歇柱相同的尺寸。

对于该实例，选择图6的系统，但在模拟中脉冲注射作为进料并且没有连续进料。由于是脉冲进料，所以柱6是不必要的且不使用。

各部分的任务如下：

α部分：处理在26.8～31.0分钟之间所发生的。

β部分：处理在31.0～38.0分钟之间所发生的。

γ部分：处理在38.0～43.0分钟之间所发生的。

δ部分：处理在0.0～26.8分钟之间所发生的并收集β部分的输入。使原料进入到系统中。

所有任务都必须在一个转换时间t^*内完成。δ部分的任务需要的时间最长，这就是在该部分中具有4个柱的原因。我们定义下列设计参数，其值与色谱对应：

表1

事件	时间(分钟)	变量	在柱入口处的改性剂浓度(g/l)
				开始	0	t-开始	170
A开始洗脱	18	开始_A	184.4
				B开始洗脱	22	开始_B	187.6
分级开始	26.8	开始_分馏	190
				分级结束	31	结束_分馏	190
B结束洗脱	38	结束_B	190
				所有组分都流出	45	t_结束	190

计算转换时间的一般步骤如下：对于如图6所示的结构而言，从进料开始直到纯的所需中间产品出现的时间的梯度应被转到柱4和5。在较高流量下操作的柱限制该方法。在此提出的例子中，柱5运行该梯度的较长部分(开始_A-t_开始＝18分钟)，而柱4运行较短部分(开始_分级-开始_A＝26.8-18＝8.8分钟)。如果柱4和柱5以相同流量操作，则相对于产率来说是最佳的。

在该具体实例中，决定在柱5中运行间歇梯度部分，直到轻杂质开始洗脱。因此，现在可以计算所需转换时间：

所以，柱内的流量必须为：

Q₆≈Q_进料

其中，如上所述，向柱5中脉冲进料，因而不使用柱6。

Q₇≈Q₄

Q₈≈Q₅

溶剂梯度在特征时间时在柱入口处依照流动相组成(见表1)：利用改性剂浓度和内部流量的这些值，可以计算柱的输入端参数。

表2：在柱入口处的流动相流

柱	在t＝0时的改性剂浓度	在t＝t*时的改性剂浓度		ml/分钟
					1	任意的，但必须完成任务		此处400g/l，等位的，泵1	0.85
2	190g/l	190g/l	泵2	0.88
					3	190g/l	190g/l	泵3	0.53
4	184.4g/l	190g/l	泵4	1.10
					5	157.1g/l	184.4g/l	泵5	1.37
6	任意的，但必须完成任务		在该模拟中不使用	-
					7	任意的，但必须完成任务		与柱4的出口连接	0.0
8	任意的，但必须完成任务		与柱5的出口连接，加上0.03ml/分钟的纯乙腈，泵6	0.03

该连续过程的模拟如图11～13所示。图12、图13和图11分别表示稳态情况下转换前、转换后和转换中间部分内的浓度曲线。在左侧的Y轴上肽的浓度以g/l给出，并且在右侧的Y轴上改性剂的浓度以g/l给出。

在该模拟中，产率为约99.95％，纯度为85.2％。已经设计的连续方法与间歇方法的比较如表3所示。

表3：

	间歇	连续
			产率	60％	99.95％
纯度	82.8％	85.2％
			柱的数量	1	7
泵的数量	1(梯度泵)	6(梯度泵)
			生产率mg已纯化的产品/ml柱和分钟，	0.00070，用结束_分级＝32分钟和用2.25ml/分钟的最大流量计算	0.0002961/2.36倍
ml溶剂/mg进料	900ml/mg(不考虑平衡)	761.6ml/mg

虽然在该实例中间歇法的生产率是连续法的约2倍，但是连续方法的优点还是非常清楚。可以进一步增加溶剂消耗量。但在该实例中，由间歇色谱直接转变为连续法。然而这不是最优的。在柱4和5中的流量的微小变化可以将最小转换时间降为3分钟，使得生产率将增加33％。最优化的潜力还没有被完全发掘。

质量限制如产率和纯度变得越高，则连续法变得越有价值。这对非常昂贵的溶质如生物分子是最重要的。

众所周知，间歇法需要大量的理论级。因此，上述实例也必须使连续法与在这种情况下的间歇法比较，所述间歇柱由与连续多柱设备由相同量的树脂组成。

图14表示在2.25ml/分钟的最大流量下和在7根成一列的单柱(7倍梯级和7倍载荷)上进行的间歇洗脱。可以看出，产率为99.95％时纯度仅为79％。如果所需纯度为85.2％，则间歇法的产率是99.6％。7个柱成一列的间歇法的生产率仅为连续法的54％。参见表4。

表4：

	间歇	连续
			产率	99.95％	99.95％

纯度	79.0％	85.2％
			柱的数量	7	7
泵的数量	1(梯度泵)	6(梯度泵)
			生产率mg已纯化的产品/ml柱和分钟	0.000159，用结束_分级＝52分钟和2.25ml/分钟的最大流量计算	0.0002961.86倍
ml溶剂/ml进料	900ml/mg(不考虑平衡)	761.6ml/mg

因为色谱柱的总压力损失与柱长度成正比，所以长柱的最大流量将比短柱的最大流量小得多，这将进一步降低间歇洗脱的生产率。实验验证-降钙素的纯化

已经用如图15所示的8柱开环系统在实验上验证了所述新型方法。实验的输入参数取自模拟。下图对应于图6。色谱和溶剂梯度分担任务，由四部分α-β-γ-δ完成。该过程完全类似于梯度间歇洗脱，但使在δ部分中的和β部分和δ部分之间的不纯的副级分逆流循环。

在四个部分内的8个柱具有如下任务：

γ部分：(1个柱)

柱1.将组分C洗出系统。

β部分：(1个柱)

柱2.洗出少量有价值的被C污染的B。为了使B循环，将柱2的液体出口流冲洗入柱5.。

α部分：(1个柱)

柱3洗出已纯化的产品B。新鲜溶剂被用来保证最高的可能纯度。

δ部分：(5个柱)

柱4洗出少量的但有价值的被A污染的B。在该实例中，使用新鲜的溶剂。柱4的另一项任务是C和B之间的部分分离。在线性梯度条件下操作柱4是有意义的。为了循环，将洗脱的溶质冲洗入柱7。

柱5将大部分A洗出进入柱8。此处所用的溶剂由来自柱2(β部分)的循环溶剂和来自泵5的弱溶剂组成，需要所述弱溶剂以调节精确的改性剂浓度。柱5的另一项任务是C和B之间的部分分离。

柱6是进料柱。此处的流量应该尽量小，以得到大量的理论级和窄的负载曲线。

柱7是循环柱。其任务是：a)将A+B从柱4的出口取出；和b)使A与B尽可能好地分离。此处所用的溶剂由来自柱4的循环溶剂和来自泵P7的弱溶剂组成，需要所述弱溶剂以调节精确的改性剂浓度。

柱8也是循环柱。其任务是：a)将A+B从柱5的出口取出；和b)使A与B尽可能好地分离。此处所用的溶剂由来自柱5的循环溶剂和来自泵P8的弱溶剂组成。

在非线性吸附等温线的情况下，为获得较好的稳定性，有时有用的是在柱7和8中运行负溶剂梯度。柱2也应该在负溶剂梯度下操作(在高改性剂浓度时开始，在低改性剂浓度时结束)。

用于实验的设备由3个“kta-Explorer Basic”系统组成，其配有几个额外的多位阀和额外的梯度泵。用于三个kta机器的软件是来自Amersham的“UNICORN”，并且同时运行的三个UNICORN系统的总的控制通过软件“Genesis”实现。

待纯化的混合物是在反相纯化之前取自生产过程的分子质量为3432g/mol的多肽降钙素。原料的分析色谱如图16所示。原料由约46％降钙素、约19％重杂质和35％轻杂质组成。降钙素是中间级分“B”。

在用于纯化多肽的连续设备内部的柱填充有来自Amersham的SOURCE RPC 15。柱尺寸为100×4.6mm。流动相为水/H₃PO₄和乙腈。每个柱的理论级数为约NTP＝100。

实验参数如流量和改性剂浓度基于模拟。所选择的用于验证的实验参数为：

溶剂A：     998.5g/l的水、1.17g/l的H₃PO₄(85％)

溶剂B：     纯乙腈

原料：      溶解在A中的纯度为43％的0.9g/l的原降钙素

转换时间：  t^*＝6分钟

泵1    0.25ml/分钟，在0.73t^*中从60.0％的B到30.1％的B

泵2    0.75ml/分钟，在t^*中从24.31％的B到29.13％的B

泵3    0.13ml/分钟，在t^*中从24.31％的B到24.31％的B

泵4    0.15ml/分钟，在t^*中从24.31％的B到24.31％的B

泵5    0.13ml/分钟，在t^*中从24.31％的B到1.29％的B

泵6    0.045ml/分钟，(进料到柱6中，0.03ml/分钟的纯B进入到柱8中)

由在线UV信号和来自柱1(C)、3(B)和7(A)的出口的电导率信号显示：在约150分钟后信号开始达到周期恒定图案。该系统需要约800分钟达到稳态。

稳态时的降钙素的纯度为85％，其与由模拟预测的值相对应。产率也与模拟的相当，并具有约97％的值。

进行16次实验。这些实验的纯度和产率的表如图17所示。纯度％作为产率％的函数给出(X轴)。

顺序结构

通常，一种类型的色谱分离不足以完全纯化生物分子或不足以满足安全限制。于是，可以使用两个串联的系统，例如离子交换色谱(IEX)和其后的疏水作用色谱(HIC)。两个纯化系统可以排成一列，例如参见图17。将原料F引入到第一系统的δ1部分。将来自系统1的已纯化的中间级分装载到系统2的δ部分中。也可以将盐或有机改性剂引入系统2的δ2部分。可以在例如1/3转换内脉冲α1的出口。剩余的2/3转换可以被用来将示踪剂洗出δ2部分的装载柱。因为两种方法都是连续的，所以可以用不同的转换时间操作两个系统。系统2可以由α1部分的部分纯化的出口的色谱来设计。

还可以采用准连续或半连续的模式操作梯度纯化法。因而，可以使用至多3柱以下(即，例如少至两个或三个柱)来实现纯化任务。这与上述给出的完全连续法相比可以增加生产率，因为在完全连续法的情况下已纯化的产品流和原料流量小于其它流量。此外，由于为可靠运行系统需要几乎相同的柱，并且装填大量几乎相同的柱可能是冗繁的，所以柱数量的减少使结构简化。

α、β和γ部分的结合：

已经在上文提到用于准连续或半连续操作的最明显的结构是α、β和γ部分可以组合在一个柱中，其中以随时间分阶段的方式，将如图5中给出的等于α、β和γ部分输出的各个级分取出并进料到图5中的对应元件的输入。

具体如图5中给出的流程图但仅具有一个单个的柱作为β部分的可能的结构如图19中给出。在这种情况下，α、β和γ部分组合在一个柱中。在图19中的黑框表示存在实现所述功能的柱，阴影框表示不存在实现该位置的柱。如图19中所示的方案根据下面的路线转换：(1a-1b-1c)-(2a-2b-2c)-(3a-3b-3c)-(1a-1b-1c)-(2a-2b-2c)-...等。

该图显示各个部分的功能不必相伴实现，即由各个柱同时实现，但是很可能以分阶段的方式实现各自功能，人们可以从图19观察到，在步骤1a)～1c)中，顺序地，柱1实现α部分(步骤1a)的功能，然后实现β部分(1b)的功能，最后实现γ部分(1c)的功能。所有这些步骤1a)～1c)在一个转换时间内进行。在该第一转换时间之后，即步骤1a)～1c)之后，循环柱1～3的位置产生系统所需的逆流。

结合α、β和γ部分的概念也可以应用到其它柱结构，例如8柱结构(参见，例如图6)，使得其减少到仅6个柱。

在单个柱中部分对的结合：

另一个使用较少数量柱的非常引人注意的方法是所述部分的配对方式组合，例如部分δ+α和部分β+γ的组合或者更精确地组合为γ+β、α+δ_g、δ_f+δ_r对，或等价地β+α、δ_g+δ_f、δ_r+γ对。

图20a)表示根据图4的6个柱结构并且在该图中指出由各个单独的柱来具体实现部分。特别地，下面的任务由柱完成，编号如下：

1.使所有重杂质C离开该柱

2.使所有中间产品B离开该柱，但使重杂质C保留在该柱中

3.确保没有重杂质C离开该柱，而仅使中间产品B离开该柱

4.使所有轻杂质A离开该柱，但使中间产品B保留在该柱中

5.使原料F进入该柱并使第一轻杂质A离开该柱

6.确保没有中间产品B离开该柱并从该柱中移出示踪剂。

在图20b)中，6柱结构被分为3个互相连接的柱和3个不相连的柱，该结构与图20a)所示的6柱结构相同。具有3个互相连接的柱的路线称为“CCL”(逆流路线)，具有不相连的柱的路线称为“BL”(间歇路线)。

根据图20的结构的一般布局在图21中给出。

CCL由柱位置2、4、6(β、δ_g、δ_r)组成，间歇路线由柱位置1、3、5(γ、α、δ_f)组成。显而易见的是当6柱系统在两个状态CCL和BL之间转换时，所有CC路线的柱变为“间歇路线”的柱并且所有间歇路线的柱变为CC路线的柱。两条路线的局部转换时间等于总转换时间t^*。这使得全过程连续。间歇柱和逆流柱在同一设备中同时操作。

为了演示所述减少的效果，将讨论一个实例：在图22中，上半部分a)表示转换时间为3分钟的6柱过程。在该实例中，假设在单个柱中的最大流量为2ml/分钟。所以柱6正在限制流量和生产率。

如已经提到的，两个转换时间必须同样具有“全部时间的”连续过程。由于在两个路线BL和CCL之间没有液体流，所以路线彼此独立。

因此，引人注意的是在整个过程仅用3个柱代替6个柱并从间歇路线开始，但当3个柱转换到CC路线时时所有在间歇路线中的流量停止。对于CC路线同样有效。当3个柱转换回间歇路线时，将CC路线的流量设置为零。

因此，每个柱具备两个部分的功能，并且这些功能以随时间分阶段的方式实现，而不是同时实现这些功能。

局部过程仍然是连续的，但当另一条路线被激活时，其停止运行。因此，总的过程不再是完全连续的，而是准连续的。

在上面的例子中。假设生产率为100％。

现在，如图22b)所示，可以将间歇路线的转换时间降到例如1分钟，使得总转换时间为4分钟。于是，在间歇路线中的最高流量为1.8ml/分钟(＜2ml/分钟＝Q_最大)，其接近系统中的最大流量。

现在，存在两个独立的具有不同转换时间的交替操作的多柱转换过程。CC路线的转换时间是3分钟，间歇路线的转换时间是1分钟。

总的转换时间增加到：

t^*＝t^* _间歇+t^* _C.C

但是柱的数量从6个降到3个。因此，在该实例中，所述方法的生产率甚至增加了50％，因为生产率为P＝100％·3/(3+1)·6/3＝150％。

根据图22的结构的通用的转换方案示意性地如图23所示。

准连续或半连续操作的通用结构如图24a)所示，并且可以看出该结构被显著简化，因而需要更少的泵和更少的连接器。用每个柱之间的阀在两个路线之间转换，所述路线为如24b)所显示的两种不同的状态。

上面说明的结构的柱位置图解显示在图25中给出的图中。黑框表示存在实现上述指定功能的柱，阴影框表示不存在实现所述功能的柱。六个不同的柱状态以1a-1b-2a-2b-3a-3b-1a-1b-2a-2b-...的顺序操作。

如果需要在β和δ部分内部的逆流，可以将如21中所显示的、但在β部分具有两个或多个柱的结构转换为半连续模式。由4个柱组成的相应的半连续结构如图26所示，其中在“β”位置期间，将β部分的第一个柱的流量设置为零。

理论上，对于每个部分和几个部分，这种成双的柱都是可能的。

二柱结构：

在本发明的思路内，甚至可以将3柱半连续过程减少到仅为2柱，但是不能同时满足轻和重级分C和A的再循环，而必须是分阶段的。

由于在三个步骤(图28中的步骤2～4)中三个功能α、β、γ中仅有一个由类似于如图19所显示的情况的柱实现，所以原理类似于3柱结构(参见上文)。但是，此外，在该结构中，在一个另外的步骤(图28中的步骤1)中，除δ功能(图28中的步骤1.，δ_g和δ_r的功能)之外，没有柱实现α、β、γ的功能。

二柱结构示意性地显示在图27中。需要设计该过程，使得在柱从位置γ转换到位置δ_f之前，B不离开处于位置δ_g的柱。否则的话，有价值的产品B将在轻级分出口A中损失。

因此，如图27中所示，在上面的第一步骤(由附图标记3表示，因为在图28中更系统地显示)中，目的是再循环位置β和δ_g之间的重级分C和中间产量B并收集轻级分A(注意：闭合线由之间的阀表示)。

在随后的步骤4中，目的是收集重级分C同时也收集轻级分A。所述随后的步骤4在当只有C离开柱1时的瞬间开始。

在这两个第一步骤3和4中，第三位置没有被柱(打网格线的长方形)占据。

在所述步骤4之后，处于位置1的柱转换为位置3。所以，可以说处于位置1的上游柱和处于位置2的下游柱相互交换了位置。在随后的两个步骤中，位置1将不被柱占据。这意味着只有位置2一直被占据。

在下面的步骤1中，目的是再循环轻级分A和收集示踪剂。实施该步骤，直到纯中间产品B开始离开处于位置2的柱。

只要情况如此，就开始接下来的步骤2，即在所述步骤2中，目的是以间歇模式从柱2收集中间产品B，同时将原料装载到处于位置3的柱中，以及收集非常轻的级分A。继续所述步骤2，直到就在中间级分B以与部分重级分C的混合物的形式开始离开处于位置2.的柱之前。

在所述步骤2之后，转换柱使得柱由位置2移到位置1，和柱由位置3移到位置2。该过程以3-4-1-2-3-4-1-2-...的顺序重复，并且必须注意，一个完整循环包括如图27中给出的两个系列的模型。

图28以更系统的显示方式表示相同过程。上部给出包括一个全循环的2柱结构。下部指出用于逆流梯度纯化的梯度色谱的相应的任务，下部还指出改性剂16的浓度曲线。事实上，2柱结构尤其为梯度运行而工作。该过程重复位置：1-2-3-4-1-2-...，同时使两个柱轮换。半连续装置的顺序设置：

如上面已经讨论的，还可以在一个包括几个类型纯化的设备内组合根据本发明的纯化装置。如上面所讨论的，将每个纯化单元减少到仅有3个柱提供了例如如下指出的有吸引力的操作模式。

通用的色谱纯化方法可以包括几个步骤，例如：

●阳离子交换(CEX)

●阴离子交换(AEX)

●疏水相互作用色谱(HIC)

在图29中建议了半连续纯化方法的顺序设置，其中将“CEX”“AEX”和“HIC”组合在一个设备中。

在图29中没有考虑原位净化步骤。为了能够进行CIP，最廉价的方法是具有前向位置，其中可以“停放”柱以原位净化。

“AEX”步骤经常是负性色谱(negative chromatographic)步骤，其中产品不被吸附，但是吸附例如病毒。这样的两组分分离(从产品中移除病毒)仅需要2个柱，因此将不需要在单元2中的位置1。

单元1和单元2之间以及单元2和单元3之间的混合器的任务是在循环时使产品浓度均衡。在非线性等温线的情况下，这可能是重要细节。

附图标记

1  用于开环回路的溶剂

2  排出

3  第一短路

4  第二短路

5  第一“孤立的”柱

6  第二“孤立的”柱

11 纯C

12 循环

13 分级

14 循环

15 纯A

16 改性剂梯度

21 系统1，Iex

22 系统2，HIC或反相

23 纯化的产品

24 盐或有机改性剂

a  纯化过程的第一部分

b  纯化过程的第二部分

c  纯化过程的第三部分

d  纯化过程的第四部分

A、B、C、D  级分

A  轻级分

B  中间级分，所需产品

C  重级分

s  溶剂

E1 提取液1

E2 提取液2

R  残余液

F  原料

t  时间

t^* 转换时间

tr 示踪剂

bf 转换之前

as 转换之后

C_{改性剂，v}  可变的改性剂浓度

C_{改性剂，c}  每个位置处恒定的改性剂浓度

C_改性剂     改性剂浓度

Claims (23)

1.一种利用至少两个、优选至少三个单独的色谱柱连续或准连续地纯化多组分混合物(F)的方法，所述混合物利用至少一种溶剂通过所述色谱柱进料，

其中，所述多组分混合物(F)至少包含轻杂质(A)、待纯化的中间产品(B)和重杂质(C)，

其中，柱以如下方式运行：

处于至少一种间歇模式步骤或位置，其中一个柱的出口用来收集所述中间产品(B)，以及

处于至少连续或准连续模式步骤或位置，其中在该模式中，至少一个柱的出口与至少一个其它柱的入口流体连接，

其中，所述间歇模式和所述连续或准连续模式同步或顺序实现，和

其中，在转换时间(t^*)之后或之内，所述柱以与所述溶剂流动的一般方向相反的方向移入到其位置中。

2.一种具体根据权利要求1的利用单独的色谱柱连续或准连续地纯化多组分混合物(F)的方法，所述混合物利用至少一种溶剂通过所述色谱柱进料，

其中所述多组分混合物(F)至少包含轻杂质(A)、待纯化的中间产品(B)和重杂质(C)，

其中所述柱分为至少四部分(α、β、γ、δ)，其中

第一部分(α)具有至少一个溶剂入口和至少一个用于纯化的中间产品(B)的出口，使得其将所述纯化的中间产品(B)洗出系统，但是使所述重杂质(C)保留在该部分(α)的内部，

第二部分(β)具有至少一个溶剂入口和至少一个连接到第四部分(β)的入口的出口，以便其将被所述重杂质(C)污染的所述中间产品(B)通过所述出口冲洗到第四部分(δ)内，但使纯的重杂质(C)保留在该部分(β)内，

第三部分(γ)具有至少一个溶剂入口和用于所述重杂质(C)的出口，以便其通过所述出口洗出所述重杂质(C)并净化所述色谱柱，

第四部分(δ)具有至少一个用于接收所述第二部分(β)的出口的输出的入口和至少一个用于所述多组分混合物(F)进料的入口以及至少一个用于所述轻杂质(A)的出口，以便其将所述轻杂质(A)洗出系统，但使所述中间产品(B)保留在该部分(δ)内，

其中在转换时间(t^*)之后或之内，所述第一部分(α)末尾的柱移动到所述第二部分(β)的第一位置，所述第二部分(β)末尾的柱移动到所述第三部分(γ)的第一位置，所述第三部分(γ)末尾的柱移动到所述第四部分(δ)的第一位置并且所述第四部分(δ)末尾的柱移动成为所述第一部分(α)的第一柱，

并且其中所述部分的功能同步或顺序实现，在后一种情况下，优选在一个转换时间内存在具有连续或准连续洗脱并具有间歇洗脱的顺序步骤。

3.根据权利要求2的方法，其中在所述转换时间(t^*)期间，进料到至少所述部分(α、β、γ、δ)之一的所述溶剂在组成上基本连续变化，和/或在超临界溶剂情况下，在所述转换时间(t^*)期间，进料到至少所述部分(α、β、γ、δ)之一的所述超临界溶剂在密度上基本连续变化。

4.根据权利要求1或2的方法，其中存在至少两个、优选至少三个单独的柱，其中所述部分(α；β；γ；δ/δ_g，δ_f，δ_r)的分组通过单个柱实现，并且其中在一个转换时间内，利用优选交替的连续或准连续洗脱步骤和间歇洗脱步骤，顺序实现所述单独部分(α；β；γ；δ/δ_g，δ_f，δ_r)的功能。

5.根据权利要求3或4的方法，其中在所述转换时间(t^*)期间，通过增加或降低改性剂的浓度使进料到所有所述部分(α、β、γ、δ)的所述溶剂在组成上基本连续变化，和/或在超临界溶剂的情况下，在所述转换时间(t^*)期间，通过增加或降低密度使所述超临界溶剂在密度上基本连续变化，并且其中沿着从所述第四部分(δ)到所述第一(α)部分的柱的顺序，所述改性剂浓度(C_改性剂)/密度增加或降低，使得在所述柱移动后，在每个柱中的所述改性剂浓度(C_改性剂)/密度基本为所述柱的新位置处改性剂的基准浓度/超临界溶剂的基准密度，并且使得下一次移动之后，在随后的转换时间(t^*)期间，每个柱内的改性剂浓度(C_改性剂)/密度增加或降低到后续位置的基准浓度/密度。

6.根据权利要求5的方法，其中在所述转换时间(t^*)期间，进料到全部或部分所述部分(α、β、γ、δ)中的所述溶剂在组成和/或密度上基本连续线性或准线性或非线性变化，其中优选所述改性剂浓度以该方式变化。

7.根据权利要求5或6的方法，其中在每个溶剂入口处，提供具有单独恒定基准浓度(C_{改性剂，c})的改性剂的溶剂，并且其中为几个入口提供变化的流量和/或组成、优选变化的改性剂浓度(C_{改性剂，v})的溶剂流并且与所述具有单独恒定基准浓度(C_{改性剂，c})的改性剂的溶剂混合，以沿着所述系统建立梯度。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中至少一个部分(α、β、γ、δ)包含至少两个柱。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二部分(β)包含至少两个逆流顺序连接的柱。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第四部分(δ)包含分为三个子部分(δ_g，δ_f，δ_r)的至少三个柱或顺序提供所述子部分的功能的更少的柱，其中

第一子部分(δ_f)包含至少一个用于所述多组分混合物(F)进料的入口，所述多组分混合物(F)优选以低于系统中的总流量的流量进料，和至少一个用于使所述轻杂质(A)直接移出所述系统或进入第三子部分(δ_r)的入口的出口，其中

第二子部分(δ_g)包含至少一个用于接收所述第二部分(β)输出的入口和至少一个连接到第三子部分(δ_r)的至少一个输入的出口，其中第三子部分(δ_r)包含至少一个用于接收第二子部分(δ_g)的输出的入口和可能的至少一个用于接收第一子部分(δ_f)的输出的入口以及至少一个出口，

其中，在转换时间(t^*)之后或之内，柱从第一子部分(δ_f)移动到第二子部分(δ_g)的第一位置，第二子部分(δ_g)末尾的柱移动到第一部分(β)的第一位置，第三部分(γ)末尾的柱移动到第三子部分(δ_r)的第一位置并且第三子部分(δ_r)末尾的柱移动成为第一子部分(δ_f)的柱，

并且其中，所述部分(δ_g，δ_f，δ_r)的功能同步或顺序实现。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述系统包含三个柱，其中所述第一(α)、第二(β)和第三(γ)部分的功能由一个单个的柱实现，并且其中在一个转换时间内，所述单个柱

首先，起到所述第一(α)部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口用于收集所述中间产品(B)，同时将提供所述第四(δ)部分的功能的柱串联连接并且同时通过所述第四(δ)部分的出口收集所述轻杂质(A)，

然后，所述单个柱起到所述第二(β)部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口直接连接到所述第四(δ)部分的第一柱，同时将提供所述第四(δ)部分的功能的柱串联连接并且同时通过所述第四(δ)部分的出口收集所述轻杂质(A)，并且

然后，所述单个柱起到所述第三(γ)部分的功能，其中其具有溶剂入口并且其出口用于收集所述重杂质(C)，同时将提供所述第四(δ)部分的功能的柱串联连接，并且同时通过所述第四(δ)部分的出口收集所述轻杂质(A)并且同时在所述提供所述第四(δ)部分的功能的柱之间，将所述多组分混合物(F)进料到所述第四(δ)部分。

12.根据权利要求1～10中任一项的方法，其中将所述部分(α；β；γ；δ/δ_g，δ_f，δ_r)的顺序功能对结合在一个柱中，并且其中在一个转换时间内，交替进行连续或准连续洗脱的步骤和具有间歇洗脱的步骤，以顺序方式完成这些功能。

13.根据权利要求12的方法，其中所述第四(δ)部分包含根据权利要求10的三个子部分(δ_g，δ_f，δ_r)，并且其中在完整系统中，提供三个柱，所述三个柱在一个转换时间的第一部分内以连续或准连续洗脱的方式(CCL)顺序连接，并且在所述转换时间的第二部分内以间歇方式(BL)驱动以取出所述多组分混合物(F)的单独级分(A，B，C)。

14.根据权利要求12的方法，其中所述第四(δ)部分包含根据权利要求10的三个子部分(δ_g，δ_f，δ_r)，并且其中在完整系统中，提供四个柱，所述四个柱在一个转换时间的第一部分内以连续或准连续洗脱的方式(CCL)顺序连接，并且在所述转换时间的第二部分内以间歇方式(BL)驱动以取出所述多组分混合物(F)的单独级分(A，B，C)，其中在所述间歇方式(BL)中，所述柱之一具有接近或等于零的流量。

15.根据权利要求3～10中任一项的方法，其中所述系统由两个柱组成，其中所述第四(δ)部分包含根据权利要求10的三个子部分(δ_g，δ_f，δ_r)，其中

在所述转换时间的第一部分中，所述两个柱串联连接以连续洗脱，同时通过所述出口收集所述轻杂质(A)，其中

在所述转换时间的第二部分内，以间歇模式驱动所述柱，以收集在上游柱上的所述中间级分(B)和在下游柱上的轻杂质(A)，同时将所述多组分混合物(F)进料到所述下游柱中，其中

在所述转换时间的第三部分内，将所述柱串联连接以连续洗脱，同时通过所述出口收集所述轻杂质(A)，和其中

在所述转换时间的第四部分内，以间歇模式驱动所述柱，以收集在所述上游柱上的重杂质(C)和在所述下游柱上的轻杂质(A)，其中在每个转换时间之后，将所述两个柱的位置互相交换。

16.根据权利要求10～15中之一的方法，其中所述第一子部分(δ_f)包含至少两个平行的柱，和/或其中所述第二(δ_g)和/或所述第三(δ_r)子部分包含至少两个逆流平行或顺序的柱。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述进料在一个转换时间(t^*)内是连续的、脉冲的或具有一定形状的浓度/密度曲线，和/或其中在一个转换时间(t^*)内所述溶剂的流量是变化的，和/或其中在一个转换时间(t^*)内单独的入口/出口的转换是分阶段的。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中单个柱中的流量是不同的。

19.一种用于设置用于运行根据前述权利要求中任一项的方法的参数的方法，其中在第一步骤中，运行梯度间歇色谱，在第二步骤中将所得到的色谱分成含有轻级分的第一组、含有所需级分的第二组、含有与重级分重叠的所需级分的第三组和仅含有重级分的第四组，并且其中在第三步骤中，选择所述方法的参数，使得第一部分(α)完成相当于所述梯度间歇色谱在所述第二组的时间里的任务，第二部分(β)完成相当于所述梯度间歇色谱在所述第三组的时间里的任务，第三部分(γ)完成相当于所述梯度间歇色谱在所述第四组的时间里的任务，第四部分(δ)完成相当于所述梯度间歇色谱在所述第一组的时间里的任务。

20.根据权利要求19的方法，其中所述转换时间(t^*)计算为：直到所述所需级分开始洗脱所需纯度的时间乘以梯度间歇色谱的流量(Q_间歇)除以所述结构的最大流量(Q_最大)并除以运行所述梯度部分的第四部分(δ)中的柱的数量(N)。

21.根据权利要求19或20的方法，其中基于相应的部分在所述梯度间歇色谱中消耗的时间乘以所述间歇流量(Q_间歇)除以所述转换时间(t^*)来确定每个柱中的流量。

22.一种用于实施根据权利要求1～18中任一项的方法的装置，其中提供至少两个、优选至少三个单独的色谱柱的布局，利用至少一种溶剂通过所述柱使混合物进料，其中所述多组分混合物(F)至少包含轻杂质(A)、待纯化的中间产品(B)和重杂质(C)，其中提供泵、阀、柱间连接管、收集出口、溶剂入口和进料入口的形式的设备，所述部件使所述柱运行，以便在至少一个间歇模式步骤或位置中，一个柱的出口用来收集所述中间产品(B)，以及在至少连续或准连续模式步骤或位置中，至少一个柱的出口与至少一个其它柱的入口流体连接，其中所述间歇和所述连续或准连续模式可以同步或顺序实现，并且其中在转换时间(t^*)之后或之内，所述柱以与所述溶剂流动一般方向相反的方向移动到其位置中。

23.一种用于实施根据权利要求1～18中任一项的方法的装置，其中柱分为至少四部分(α、β、γ、δ)，其中

第一部分(α)具有至少一个溶剂入口和至少一个用于纯化的中间产品(B)的出口，使得其将所述纯化的中间产品(B)洗出系统，但是使重杂质(C)保留在该部分(α)的内部，

第二部分(β)具有至少一个溶剂入口和至少一个连接到第四部分(δ)的入口的出口，以便其将被所述重杂质(C)污染的所述中间产品(B)通过所述出口冲洗到所述第四部分(δ)内，而使纯的重杂质(C)保留在该部分(β)内，

第三部分(γ)具有至少一个溶剂入口和用于重杂质(C)的出口，以便其通过所述出口洗出重杂质(C)并净化色谱柱，

第四部分(δ)具有至少一个用于接收所述第二部分(β)的出口的输出的入口和至少一个用于所述多组分混合物(F)进料的入口以及至少一个用于轻杂质(A)的出口，以便其将轻杂质(A)洗出系统，但使中间产品(B)保留在该部分(δ)内，

其中提供连接或断开设备，使得在转换时间(t^*)之后或之内，所述第一部分(α)末尾的柱移动到所述第二部分(β)的第一位置，所述第二部分(β)末尾的柱移动到所述第三部分(γ)的第一位置，所述第三部分(γ)末尾的柱移动到所述第四部分(δ)的第一位置，并且所述第四部分(δ)末尾的柱移动成为所述第一部分(α)的第一柱，

并且其中所述部分的功能同步或顺序实现，在后一种情况下，优选在一个转换时间内存在具有连续或准连续洗脱并具有间歇洗脱的顺序步骤。

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