CN101111606B - 通过化学修饰胞嘧啶而简化微生物核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于简化微生物基因组或微生物核酸的方法，包括用修饰胞嘧啶的试剂处理微生物基因组或核酸以形成衍生的微生物核酸以及扩增该衍生的微生物核酸而产生该微生物基因组或核酸的简化形式。
Description
技术领域
本发明涉及用于微生物检测的核酸检测分析(Detection assay)。本发明还涉及用于化学处理核酸以降低微生物基因组复杂性的方法以及用于微生物检测的特异性配体的应用。
背景技术
目前存在多种方法可用于特异核酸分子的检测。这些方法通常依赖于靶核酸与核酸探针之间的序列依赖性杂交，其中核酸探针的长度范围可以是从短寡核苷酸(20个碱基或更短)至许多千碱基(kb)的序列。
从大量核酸序列中扩增特异序列，最广泛采用的方法为聚合酶链式反应(PCR)(Dieffenbach，C and Dveksler，G.eds.PCR Primer：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Press，Plainview 
。在该扩增方法中，使用在互补DNA链上且在待扩增区域的任一端处的长度通常为20-30个核苷酸的寡核苷酸，用来在变性的单链DNA上引导DNA合成。变性、引物杂交以及利用热稳定的DNA聚合酶的DNA链合成的连续循环使得引物之间的序列呈指数扩增。RNA序列的扩增可首先利用反转录酶的复制而生成互补DNA(cDNA)拷贝。扩增的DNA片段可通过多种手段检测，包括凝胶电泳、用标记的探针杂交、采用允许后续鉴定(例如通过酶联反应)的标签引物、以及采用一旦与靶DNA杂交即产生信号的荧光标记引物(例如Beacon或TaqMan系统)。
如同PCR，人们已经开发了多种其它技术用于检测和扩增特异核苷酸序列，一个实例就是连接酶链式反应(1991，Barany，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，189-193)
另一个实例是等温扩增，1992年首次被描述(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.lsothermal in vitro amplification of DNAby a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS89：392-396(1992))并命名为链置换扩增(SDA)。从那时起，已经描述了大量的其它等温扩增技术，包括转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，其中利用RNA聚合酶以复制RNA序列而非相应的基因组DNA。(Guatelli JC，Whitfield KM，Kwoh DY，Barringer KJ，Richmann DD and Gingeras TRlsothermal，invitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled afterretroviral replication.PNAS87：1874-1878(1990)：Kievits T，van Gemen B，van Strijp D，Schukkink R，Dircks M，Adriaanse H，Malek L.Sooknanan R，Lens P.NASBA isothermalenzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1infection.JVirol Methods.1991Dec；35(3)：273-86).
其它基于DNA的等温技术包括滚环扩增(RCA)，其中DNA聚合酶延伸(扩展)针对环状模板的引物(Fire A andXu SQ.Rolling replication of short circles.PNAS92：4641-4645(1995)，利用用于目标检测的环状探针的分枝扩增(RAM)(Zhang W，CohenfordM，Lentrichia B，lsenberg HD，Simson E，Li H，Yi J，Zhang DY.Detection of Chlamydiatrachomatis by isothermal ramification amplification method：a feasibility study.J ClinMicrobiol.2002Jan；40(1)：128-32.)以及最近的螺旋酶依赖性等温DNA扩增(HDA)，其利用螺旋酶代替加热以使DNA链解旋(Vincent M，Xu Y，Kong H.Helicase-dependent isothermal DNAamplification.EMBO Rep.2004Aug；5(8)：795-800.)
最近，描述了DNA扩增的等温方法(WalkerGT.Little MC，Nadeau JG and Shank D.lsothermal in vitro amplification of DNA by arestriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS89：392-396(1992)传统的扩增依赖于每轮扩增反应中靶分子变性和复性的连续循环。DNA的热处理导致DNA分子一定程度的剪切，因此，当DNA是限制性的，例如从来自发育中的胚泡的少量细胞分离DNA时，或者特别是在当DNA已经是如在组织切片、石蜡块和古代DNA样品中的片段形式的情况下，这种加热-冷却循环可能进一步破坏DNA并造成扩增信号的丢失。等温方法不依赖于模板DNA的连续变性而产生单链分子以用作进一步扩增的模板，而是依赖于通过特异性限制性内切核酸酶在恒温下酶促切割DNA分子。
这种命名为链置换扩增(SDA)的技术依赖于某些限制性酶切割半修饰DNA的未修饰链的能力以及缺少5’-3’外切核酸酶的聚合酶扩展和置换下游链的能力。然后通过偶联正义和反义反应而实现指数扩增，其中来自正义反应的链置换用作反义反应的模板(Walker GT，Little MC，Nadeau JG and Shank D.lsothermal in vitro amplification ofDNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.PNAS89：392-396(1992)。这些技术已经用于分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Walker GT，Little MC，Nadeau JG andShank D.lsothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNAoolvmerase system.PNAS89：392-396(1992)，HIV-1，Hepatitis C and HPV-16NuovoG.J.，2000)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(Spears PA，Linn P，Woodard DL and Walker GT.Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence PolarizationDetectionof Chlamydia trachomatis.Anal.Biochem.247：130-137(1997).的成功扩增。
至今，SDA的应用依赖于修饰的硫代磷酸酯核苷酸，以便生成半-硫代磷酸酯DNA双链，其在修饰的链上对酶切具有抗性，导致酶切代替消化以推动所述置换反应。然而，最近，已经设计改造了多种“切口酶(核酸内切酶，nickase)”。这些酶不以传统的方式切割DNA，而是在其中DNA链之一上形成一个切口。“切口酶”包括N.Alw1(Xu Y，Lunnen KD and Kong H.Engineering a nickingendonuclease N.Alw1by domain swapping.PNAS98：12990-12995(2001)N.BstNB1(Morgan RD，Calvet C，Demeter M，Agra R，Kong H.Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonucleaseN.BstNBI.Biol Chem.2000Nov；381(11)：1123-5.)以及Mly1(Besnier CE，Kong H.Converting Mly1endonuclease into anicking enzyme by changingits oligomerization state.EMBO Rep.2001Sep；2(9)：782-6.Epub 2001 Aug 23)因此，这些酶的应用将简化SDA步骤。
另外，SDA已经通过采用热稳定的限制酶(Aval)和热稳定的外-聚合酶(Bst聚合酶)的组合而得到改善。已表明这种组合可以将反应的扩增效率从108倍扩增增加到1010倍扩增，因此有可能利用该技术来扩增独特的单一拷贝分子。利用热稳定聚合酶/酶组合得到的扩增因子是109的数量级(MillaM.A.，Spea rs P.A.，Pearson R.E.and Walker G.T.Use of the Restriction Enzyme Aval andExo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques 1997 24：392-396).
迄今，所有的等温DNA扩增技术均要求初始双链模板DNA分子在扩增开始前被变性。另外，扩增从每一次引导行为仅启动一次。
对于直接检测，靶核酸最通常是根据大小通过凝胶电泳进行分离，并转移到固体载体上，然后用与靶序列互补的探针杂交(DNA印迹和RNA印迹法)。该探针可以为天然核酸或类似物，如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)或嵌入核酸(INA)。该探针可以被直接标记(例如用32P)，或者可以采用间接检测方法。间接方法通常依赖于将“标签”例如生物素或地高辛(digoxigenin)并入该探针中，然后通过诸如酶联底物转化或化学发光的方式来检测该探针。
另一种广泛应用的直接检测核酸的方法是“夹心”杂交。在该方法中，将捕获探针连接于固体载体，并且靶核酸(在溶液中)与结合的探针杂交。洗去未结合的靶核酸，并利用杂交于靶序列的另一种探针来检测结合的核酸。检测可利用上述列出的直接或间接方法。这些方法的实例包括“分枝DNA”信号检测系统，其是一个利用夹心杂交原理的实例(1991，Urdea，M.S.，et al.，Nucleic Acids Symp.Ser.24，197-200)一个迅速发展的将核酸杂交用于直接检测核酸序列的领域是DNA微阵列领域，(2002，Nature Genetics，32，[Su pplement]；2004，Cope，L.M.，etal.，Bioinformatics，20，323-331；2004，Kendall，S.L.，et al.，Trends in Microbiology，12，537-544)。在这个过程中，将单个核酸物种以格子模式固定于固体载体或者在固体载体上光刻地加以合成，其中的单个核酸物种的范围可能为从短寡核苷酸(在Affymetrix系统中通常为25个碱基)至较长的寡核苷酸(在Applied Biosystems和Agilent平台中通常为60个碱基)，甚至更长的序列例如cDNA克隆。然后将标签或标记的核酸群与该阵列杂交并将阵列中每个点的杂交水平加以定量。最常见的是将放射性标记的或荧光标记的核酸(例如cRNA或cDNA)用于杂交，尽管也可采用其它检测系统例如化学发光。
一个迅速发展的将核酸杂交用于直接检测核酸序列的领域是DNA微阵列领域(Young RA Biomedical discoverywith DNA arrays.Cell102：9-15(2000)；Watson A New tools.A new breed of high techdetectives.Science289：850-854(2000))。在这个过程中，将单个核酸物种以格子模式固定于固体载体，其中的单个核酸物种的范围可能为从寡核苷酸至较长的序列如互补DNA(cDNA)克隆体。将标签或标记的核酸群与该阵列杂交并将阵列中每个点的杂交水平加以定量。最常见的是将放射性标记的或荧光标记的核酸(例如cDNA)用于杂交，尽管也可采用其它检测系统。
用于检测微生物如细菌、酵母和真菌的传统方法包括在选择性营养培养基上培养微生物，然后根据大小、形状、芽孢产生、诸如生物化学或酶促反应以及如在常规光学显微镜下可观察到的特异染色特性(如Gram染色)的特征进行分类。病毒物种必须在专门的组织或细胞中生长，然后根据其由电子显微镜确定的结构或大小进行分类。这些技术的主要不足在于并非所有的微生物在常规培养或细胞条件下均可生长，从而限制了这些方法的有用性。以细菌为例，例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(均引起脑膜炎，其中脑膜炎奈瑟菌既引起脑膜炎还引起暴发性脑膜炎球菌血症)，这三个物种均难以培养。每天常规检查血培养瓶，达7天，并且需要进行传代培养。流感嗜血杆菌需要既包括辅酶I又包括氧化血红素的特殊培养基且需要在巧克力琼脂板上培养。血培养基需要酪蛋白胰酶水解物大豆肉汤或者脑心浸液并加入各种添加剂如磺酸聚茴香脑钠(sodiumpolyanetholesulphonate)。对于引起严重的食物中毒和婴松软综合征的微生物如肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)，毒素的鉴定涉及到将食物提取物或培养上清液注射入小鼠体内，并于2天后使结果可视化。另外，在特殊培养基上培养可能的微生物需要花费一周时间。借助于离子交换树脂通过选择性吸收毒素或者利用单克隆抗体的反向被动乳胶凝集(Reverse Passive Latex Agglutination)，可检测到微量金黄色葡萄球菌肠毒素(食物中毒以及皮肤感染、血液感染、肺炎、骨髓炎、关节炎和脑脓肿的原因)。其相关的表皮葡萄球菌(S.epidermis)导致血液感染并污染医院里的仪器和表面以及卫生保健机器和设备。
非病毒微生物还可以根据其代谢特性而分类，例如在底物如葡萄糖、麦芽糖或蔗糖上的发酵反应过程中特异氨基酸或代谢产物的产生。可替代的，微生物可以根据其对抗生素的敏感度而分型。针对细胞表面抗原或分泌蛋白如毒素的特异抗体也被用来鉴定或分型微生物。然而，所有上面的方法均依赖于培养微生物，随后才能进行检测。微生物的培养昂贵且耗时，而且还受到较低营养要求的微生物的污染或过度生长。这些技术还相对粗糙，因为为了得到明确的诊断必须对同一样品进行多个检测试验。大多数微生物不易于在已知培养基上培养，因此当微生物的不同物种的典型混合种群存在于野外或与更高级生物一起存在时，其处于检测水平以下。
其它用于病原微生物的检测和鉴定的方法是基于血清学方法的，其中抗体响应于感染微生物而产生。例如脑膜炎球菌可根据其荚膜多糖的结构差异而分类。这些荚膜多糖具有不同的抗原性，可确定为5种主要的血清型(A、B、C、Y和W-135)。酶联免疫吸附测定(ELISA)或者放射免疫测定(RIA)可以评估这样的抗体的产生。这两种方法均检测由宿主动物在感染过程中产生的特异性抗体的存在情况。这些方法的不足在于其宿主动物产生抗体需要花费一些时间，因此常常错过极早期的感染。另外，采用这样的测定试验不能可信地区分以往和现在的感染。
最近，人们对采用分子学方法诊断感染性疾病很感兴趣。这些方法提供敏感而特异的病原微生物检测。这样的方法的实例包括“分枝DNA”信号检测系统。该方法是一个采用夹心杂交原理的实例(U rdea MS et al.Branched DNA am plification multimers for thesensitive，direct detection of human H IV and hepatitis viruses.Nucleic Acids Symp Ser.1991；(24)：197-200)
另一种用于细菌检测和分类的方法是扩增16S核糖体RNA序列。据报道，16S rRNA是用于PCR扩增分析的适合目标，用来在各种临床或环境样品中检测细菌物种，而且已经被频繁用来鉴定各种特异微生物，这是因为16S rRNA基因表现出物种特异性的多态(Cloud，J.L.，H.Neal，R.Rosenberry，C.Y.Turenne，M.Jama，D.R.Hillyard，and K.C.Carroll.2002.J.Clin.Microbiol.40：400-406)。然而，其需要细菌的纯培养物，而且为了确定该物种，在PCR扩增后，样品仍然必须测序或与微阵列分型装置杂交(Fukushima M，Kakinuma K，Hayashi H，Nagai H，lto K，Kawaguchi R.J Clin Microbiol.2003 Jun；41(6)：2605-15)。这样的方法昂贵、耗时且费力。
本发明开发了用于检测微生物的新方法，其可适合于任何微生物物种的一般检测或者初期筛选分析。
发明内容
总的来说，本发明涉及通过用修饰胞嘧啶的试剂处理微生物核酸和将所处理的核酸进行扩增而产生该基因组或核酸的简化形式来降低微生物基因组或核酸的碱基构成的复杂性。
第一方面，本发明提供了一种用于简化微生物基因组或微生物核酸的方法，包括：
用修饰胞嘧啶的试剂处理微生物基因组或核酸，以形成衍生的微生物核酸；以及
扩增该衍生的微生物核酸，从而产生该微生物基因组或核酸的简化形式。
第二方面，本发明提供了一种用于生产微生物特异性核酸分子的方法，包括：
用修饰胞嘧啶的试剂处理包含微生物来源的DNA的样品，以形成衍生的微生物核酸；以及
扩增该衍生的微生物核酸的至少一部分，以形成简化的核酸分子，相比于相应未受处理的微生物核酸，其具有的胞嘧啶总数减少，其中该简化的核酸分子包含对微生物或微生物种型特异的核酸序列。
第三方面，本发明提供了一种用于生产微生物特异性核酸分子的方法，包括：
从微生物获得DNA序列；
通过将每个胞嘧啶转换为胸腺嘧啶而实现该微生物DNA序列的转化而形成该微生物DNA序列的简化形式，使得该微生物DNA的简化形式基本上包括碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶；以及
从该微生物DNA的简化形式选择微生物特异的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种微生物特异的核酸分子，其是通过根据本发明第三方面的方法获得的。
第五方面，本发明提供了根据本发明第三方面的方法的应用，利用该方法来获得探针或引物以在测定或分析中结合或扩增该微生物特异的核酸分子。
第六方面，本发明提供了通过本发明第五方面获得的探针或引物。
第七方面，本发明提供了一种用于检测样品中微生物存在情况的方法，包括：
从怀疑包含所述微生物的样品中获得微生物DNA；
用修饰胞嘧啶的试剂处理微生物核酸，以形成衍生的微生物核酸；提供能够允许将需要的微生物特异核酸分子扩增为该衍生微生物核酸的引物；
在所述衍生的微生物核酸上实施扩增反应，以形成简化的核酸；以及
测定包含需要的微生物特异核酸分子的扩增核酸产物的存在情况，其中，检测到该需要的微生物特异核酸分子表明样品中存在该微生物。
如果基因组或微生物核酸是DNA，其可以经处理而形成衍生的DNA，随后经扩增形成DNA的简化形式。
如果基因组或微生物核酸是RNA，可以在处理该微生物基因组或核酸之前将其转化为DNA。可替代的，微生物RNA可以经处理而生成衍生的RNA分子，其随后在扩增前转化为衍生的DNA分子。将RNA转化为DNA的方法为人熟知，而且包括利用反转录酶以形成cDNA。
微生物基因组或核酸可以从噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、螺旋体或单细胞生物获得。
所述微生物基因组或核酸可选自原核生物或单细胞真核微生物的蛋白编码核酸、非蛋白编码核酸、核糖体基因区域。优选地，该核糖体基因区在原核生物中是16S或23S，而在单细胞真核微生物中是18S和28S。所述试剂可以选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，该试剂是亚硫酸氢钠。
优选地，所述试剂将互补双链微生物基因组DNA的每条链中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成两个衍生的但非互补的微生物核酸分子。在一种优选形式中，胞嘧啶是未甲基化的，如通常在微生物核酸中存在的那样。
优选地，与相应未受处理的微生物基因组或核酸相比，所述衍生的微生物核酸具有减少的胞嘧啶总数。
优选地，与相应未受处理的微生物基因组或核酸相比，所述微生物基因组或核酸的简化形式具有减少的胞嘧啶总数。
在一个优选形式中，所述衍生的微生物核酸基本上包含碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，而且与相应未受处理的微生物基因组或核酸具有基本相同的碱基总数。
在另一种优选形式中，所述微生物基因组或核酸的简化形式基本上由碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)构成。
优选地，所述扩增通过任何合适方式例如聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增或信号放大而实现。
根据本发明第二方面的方法可进一步包括：
检测所述微生物特异的核酸分子。
在一个优选形式中，微生物特异核酸分子通过以下进行检测：
提供能够结合于微生物特异核酸分子的靶区域的检测配体(detector ligand)，并有足够的时间使该该检测配体结合于所述靶区域；以及
测定该检测配体与靶区域的结合，以检测微生物特异的核酸分子的存在情况。
在另一个优选形式中，所述微生物特异的核酸分子是通过分离扩增产物并使分离的产物可视化而检测的。优选地，该扩增产物是通过电泳分离的并通过显现凝胶上的一条或多条带而检测的。
优选地，所述微生物特异的核酸分子在微生物中并非是天然存在的。
在一个优选形式中，所述微生物特异的核酸分子含有一个表明该微生物的分类水平的核酸序列。所述微生物的分类水平包括但不限于科、属、种、株、型或来自相同或不同地理或海底种群的不同种群。
在根据本发明第三方面的方法的一个优选形式中，可获得两个或多个微生物DNA序列的简化形式，并将该两个或多个微生物DNA序列进行比较而获得至少一个微生物特异的核酸分子。
在本发明第七方面的一个优选形式中，核酸分子通过以下进行检测：
提供能够结合于核酸分子的一个区域的检测配体，并有足够的时间使该检测配体结合于所述区域；以及
测定该检测配体与核酸分子的结合，以检测该核酸分子的存在情况。
在另一个优选形式中，所述核酸分子是通过分离扩增产物并使该分离产物可视化而检测的。
在微生物不含有DNA基因组或者该微生物基因组或核酸是RNA例如RNA病毒的情况下，为了用所述试剂处理DNA，RNA病毒基因组可首先转化为cDNA。也可以处理RNA并将衍生的RNA在扩增之前转化为DNA。
优选地，该衍生的核酸基本上包含碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，而且与相应未修饰的微生物核酸具有基本相同的碱基总数。重要的是，该衍生的核酸分子基本上不包含胞嘧啶(C)，前提是该微生物DNA在任何胞嘧啶都没有被甲基化。
优选地，扩增的衍生核酸基本上包含碱基A、T和G，而且与相应的衍生核酸(以及未修饰的微生物核酸)具有基本相同的碱基总数。所述扩增的衍生核酸被命名为简化的核酸。
在一个优选形式中，所述微生物特异的核酸分子含有一个表明该微生物分类水平的核酸序列。所述微生物的分类水平包括科、属、种、株、型或来自相同或不同地理或海底种群的不同种群。以细菌为例，我们可以遵循普遍公认的方案，例如细菌域、变形菌门；β-变形菌纲；奈瑟球菌目；奈瑟球菌科；奈瑟菌属。不同种群可能对单核苷酸改变或变异为多态性的，其中核苷酸改变或变异存在于以细胞内形式存在于微生物(质粒或噬菌粒)、或微生物基因组如病原岛的多态染色体区域内的DNA分子中。
本发明还可以用来识别微生物和病毒基因组的流动性，并且可以用来识别病毒基因组的嵌合特性，其可以为独立片段，因此，新出现的株可由来自不同动物的基因组区域重排所产生，例如新型人流感株为携带从其它哺乳动物或鸟类病毒基因组提取的片段的嵌合体。
应该理解，该方法可以用生物信息学方法从微生物的已知核酸序列实现，其中原始序列中的一个或多个胞嘧啶被转化为胸腺嘧啶，而获得简化的核酸。可以从转化的序列确定序列一致性。这样的生物信息学方法模拟了处理和扩增步骤。
如果已经利用该方法获得了任何特定微生物的微生物特异核酸分子，则可以设计探针或引物以确保在扩增反应中扩增感兴趣的区域。因此，如果已经设计了探针或引物，则将可能对样品实施临床或科学分析测定，以在特定分类水平检测特定微生物。
该微生物特异的核酸分子可以为唯一的，或者在一个分类水平内具有较高程度的相似性。本发明的一个优势是将例如一种微生物的分类水平之间或内部可能的碱基差异显著简化至唯一分子或具有接近的序列相似性的分子。特异引物或数目降低的简并引物可以用来扩增特定样品内的微生物特异核酸分子。
对于含有胞嘧啶的双链DNA，该处理步骤得到两个衍生的核酸(针对每条互补链各一个)，每一个均含有碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。所述两个衍生核酸从双链DNA的两条单链产生。这两个衍生核酸优选不含胞嘧啶，但仍然具有与原始未受处理的DNA分子相同的碱基总数和序列长度。重要的是，这两个衍生核酸并非彼此互补，而是形成一条上链(top strand)和一条下链(bottom strand)模板用于扩增。这些链中的一条或多条可以用作扩增的靶点以产生简化的核酸分子。在该衍生核酸的扩增过程中，上链(或下链)中的尿嘧啶被相应扩增的核酸简化形式中的胸腺嘧啶取代。随着扩增的进行，该上链(和/或下链，如果扩增的话)将被稀释，因为每个新的互补链将仅含有碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶。
应该理解，本发明的该方面还包括具有所述微生物特异核酸分子的互补序列的核酸分子，并包括可杂交(优选可以在严格条件下)于所述微生物特异核酸分子的核酸分子。
本发明可以采用表明代表性微生物类型的探针或引物，其可以用来确定特定样品中是否存在任何微生物。其它微生物型特异性探针可以用来实际检测或鉴定微生物的特定型、亚型、变种和基因型实例。
如果对任何特定微生物已经获得或鉴定了微生物特异核酸分子，可以设计探针或引物以确保在扩增反应中扩增感兴趣的区域。很重要的是注意到，可以对于引物设计分析所处理以及由此转化的基因组(下文称为“衍生的核酸”)的两条链，因为处理或转化导致序列的不对称性，因此为了检测同一座位的“上”和“下”链(也称为“Watson”和“Crick”链)需要不同的引物序列。因此，存在两个分子种群，即转化的基因组(如在转化后立即存在的)和在衍生核酸通过常规酶促方式(PCR)或通过诸如等温扩增的方法被复制后得到的分子种群。为了方便，通常针对转化的上链设计引物，但引物也可以针对下链被生成。因此，将可能对样品实施临床或科学分析以检测特定的微生物。
可以设计引物或探针以允许衍生核酸的特异区域被扩增。在一种优选形式中，该引物引起微生物特异核酸分子的扩增。
第七方面，本发明提供一种用于检测微生物特异核酸分子的试剂盒，包括根据本发明第五方面的引物或探针以及一种或多种用于扩增反应的试剂或组分。
优选地，所述微生物包括噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、螺旋体、单细胞有机体或任何其它微生物，无论分类多么不同，例如the Kingdom Protoctista by Margulis，L.，et al1990.Handbook of Protoctista，Jones and Bartlett，Publishers，Boston USA或者与人类相关的微生物，如在Harrisons Principles ofInternal Medicine，12thEdition，edited by J D Wilson et al.，McGraw Hill Inc，及其后续版本中定义的。还包括所有在OMIM，人类孟德尔遗传在线www.ncbi.go\中已经描述的与人类疾患相关的微生物。
所述微生物可以为病原体、天然存在的环境样品、水或空气生物(或在液体或气体介质中存在或携带的微生物)，以成熟形式或芽胞形式、细胞外或细胞内、或者与嵌合体生命形式相关、或者为两种或多种生命形式之间的外共生体，如与地衣相关的微生物或与菌膜相关的微生物。
可以通过首先通过反转录将其RNA基因组转化为cDNA形式、随后通过试剂修饰该cDNA而测定RNA病毒的存在情况。这就克服了RNA病毒中存在任何甲基化的问题，因为反转录酶将把甲基化视为常规胞嘧啶而加以复制。
优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，其随后在该衍生核酸的扩增过程中被替代为胸腺嘧啶。优选地，用于修饰胞嘧啶的试剂是亚硫酸氢钠。类似地修饰未甲基化胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶的其它试剂也可用于本发明的方法中。实例包括但不限于亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，一种在水存在时将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成磺酸化的胞嘧啶反应中间体，其易于脱氨，并在水存在时生成尿嘧啶亚硫酸盐。如有必要，可以在弱碱条件下去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶。因此，可能所有胞嘧啶均可被转化为尿嘧啶。然而，由于甲基化保护，任何甲基化的胞嘧啶均不能被所述修饰试剂转化。
本发明可经改造用来辅助防止发生由相同细菌种的分离体之间的大量不希望的基因组变异揭示的不断出现的问题中的一部分(2005，Tettelin，H.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102，13950-13955；Genome analysis of multiple pathogenic isolates ofStreptococcus agalacticiae：implications for the microbial“pan-genome”)。该细菌种的所有分离体具有蛋白编码基因的“核心”基因组，其代表约80％的基因库(基因源)，附加一个由部分共享且株特异性蛋白编码基因组成的非必需基因组。通过利用根据本发明的方法处理在细菌种群内存在的23S基因，本发明发明人可以处理存在于所有细菌分离体中的核心非蛋白编码组分。
本发明适用于临床、环境、法医、生物战争或微生物的科学分析试验，其中，为了首先确定该生物所属的总群，高于或处于该物种水平的初始一致性是很有用的。实例包括但不限于在任何生物中疾病(无论其为脊椎动物、无脊椎动物，原核或真核生物，例如植物和家畜的疾病、人类食物来源如渔场和牡蛎场的疾病)的诊断、环境源的筛选或取样(无论其为天然的还是污染的)、确定细胞培养物或者在体外授精处所用于生成人胚泡或用于动物繁殖的体外授精卵的污染。在法医环境或生物战争环境中的微生物检测尤其具有意义。
整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”或其变形如“包含”应理解为意指包括所述的元件、整体或步骤，或者元件、整体或步骤的组合，但不排除任何其它元件、整体或步骤，或者元件、整体或步骤的组合。
任何对包括于本说明书中的文献、法令、材料、设备、文章等的讨论仅用于为本发明提供一个背景。不应认为这些中的任何一项或全部构成现有技术领域基础的一部分或者是如在本发明形成前其存在于澳大利亚的本发明相关领域的公知常识。
为了更清楚地理解本发明，优选的具体实施方式将参照以下附图和实施例加以阐述。
附图说明
图1示出了部分脑膜炎奈瑟菌和淋病球菌的iga基因在基因组扩增前后的比对情况。可以看出，相比较而言，基因组扩增前，奈瑟菌属(74％的序列相似性)的通用检测将需要共512个探针组合，扩增形成衍生核酸(97％的序列相似性)后，仅需要2个组合。(SEQID NO列于每个序列的后面)。
图2示出了采用INA探针进一步增加简化序列的序列相似性，因为INA探针的长度可以短于标准的寡核苷酸探针。结合基因组简化步骤与INA探针，允许选择和采用与靶序列具有100％序列相似性的探针。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图3示出了基因组简化，利用来自奈瑟菌属和嗜血杆菌的iga基因的比对来区分密切相关物种。可以看出，为了产生物种特异性探针，根据本发明的方法允许基因组材料的简化。此外，尽管简化了基因组DNA，仍然可以区分奈瑟菌属和密切相关嗜血杆菌属。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图4示出了在10种不同种的链球菌中基因组简化前后的链球菌tuf基因的比对情况。处理前，tuf基因的通用引物需要共12，288个探针组合。基因组简化后，通用检测仅需要64个探针组合。此外，简化前的序列相似性仅为67.5％，而简化后增加为85％。(SEQID NO列于每个序列的后面)。
图5示出了葡萄球菌肠毒素基因在基因组简化前后的比对情况。亚硫酸氢盐处理之前，葡萄球菌肠毒素基因的通用引物需要共1,536个探针组合。基因组简化后，通用检测仅需要64个探针组合。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图6示出了各种流感株的A型和B型流感神经氨酸苷酶在基因组简化前后的比对情况。处理前，A型和B型神经氨酸苷酶基因的通用引物将需要共2,048个探针组合。基因组简化后，通用检测仅需要48个探针组合。此外，简化前的序列相似性仅为50％，而简化后增加为75％。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图7示出了轮状病毒VP4基因在基因组简化前后的比对情况。处理前，轮状病毒VP4基因的通用引物需要共512个探针组合。基因组简化后，通用检测仅需要32个探针组合。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图8示出了利用PCR从Gram阳性和Gram阴性细菌的基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物，其中恰当的扩增子作为特异长度的谱带通过琼脂糖凝胶电泳而检测。箭头表示扩增子相对于标记物泳道(M)中泳动的标准大小的标记物的预期大小。利用特异于Gram阴性细菌的引物表明仅在6个Gram阴性泳道中存在谱带(上图)。利用特异于Gram阳性细菌的引物表明仅在6个Gram阳性泳道中存在谱带(下图)。
图9示出了利用PCR从大肠埃希杆菌(泳道1)和肺炎克雷伯杆菌(泳道3)的基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。扩增的特异性通过在缺少来自其余10个细菌种的扩增产物下进行说明。
图10示出了利用特异于奈瑟菌属的引物通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。
图11示出了利用PCR从来自大肠埃希杆菌recA基因的基因组简化区域的一个蛋白编码基因获得的扩增产物。扩增子的特异性通过存在大肠埃希杆菌recA扩增子及其在其余11个种的细菌中不存在进行阐释。
图12示出了利用特异于葡萄球菌的引物，通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。
图13示出了利用特异于链球菌的引物，通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。
图14示出了通过PCR从来自于表皮葡萄球菌的recA基因的基因组简化区域的一个蛋白编码基因获得的扩增产物。两个谱带(箭头标记的)表示携带的来自第一轮(上谱带)和第二轮(下谱带)PCR扩增的扩增子。
图15示出了利用针对沙眼衣原体的基因组简化的23S核糖体基因的特异引物的扩增子的检测。
图16示出了来自表皮葡萄球菌的正常基因组以及基因组简化的23S rDNA序列。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
图17示出了大肠埃希杆菌recA基因的基因组以及基因组简化的序列。(SEQ ID NO列于每个序列的后面)。
具体实施方式
定义
如在本文中使用的，术语“基因组简化”意思为基因组(或其它)核酸从由四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)构成被修饰为基本上包含碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)但仍然具有大致相同的碱基总数。
如在本文中使用的，术语“衍生(的)核酸”意思为该核酸基本上包含碱基A，G，T和U(或一些其它非A，G或T碱基或碱基类似物)，并且含有与相应未修饰的微生物核酸大致相同的碱基总数。用该试剂处理的过程中，微生物DNA中基本上所有胞嘧啶均将转化为尿嘧啶。应该理解，改变的胞嘧啶(如通过甲基化)可以不必转化为尿嘧啶(或一些其它非A，G或T碱基或碱基类似物)。因为微生物核酸通常不含有甲基化的胞嘧啶(或其它胞嘧啶改变)，该处理步骤优选转化所有胞嘧啶。优选地，胞嘧啶被修饰为尿嘧啶。
如在本文中使用的，术语“简化的核酸”意思为扩增衍生的核酸后得到的核酸产物。衍生核酸中的尿嘧啶随后在衍生核酸扩增以形成简化的核酸分子过程中被替换为胸腺嘧啶(T)。得到的产物具有与相应未修饰的微生物核酸基本相同的碱基总数但是基本上是由三种碱基的组合(A，G和T)构成的。
如在本文中使用的，术语“简化的序列”意思为扩增衍生的核酸以形成简化的核酸后得到的核酸序列。得到的简化序列具有与相应未修饰的微生物核酸序列基本相同的碱基总数但是基本上是由三种碱基的组合(A，G和T)构成的。
如在本文中使用的，术语“未转化的序列”意思为在处理和扩增前的微生物核酸的核酸序列。未转化的序列通常是天然存在的微生物核酸的序列。
如在本文中使用的，术语“修饰”意思为将胞嘧啶转化为另一种核苷酸。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，以形成衍生的核酸。
如在本文中使用的，术语“修饰胞嘧啶的试剂”意思为能够将胞嘧啶转化为另一种化学物质的试剂。优选地，该试剂将胞嘧啶修饰为尿嘧啶，该尿嘧啶随后在衍生的核酸扩增过程中被替换为胸腺嘧啶。优选地，用于修饰胞嘧啶的试剂是亚硫酸氢钠。类似修饰胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶的其它试剂也可用于本发明的方法中。实例包括但不限于亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，一种在酸性水溶液条件下将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。亚硫酸氢钠(NaHSO3)易与胞嘧啶的5，6-双键反应，从而形成磺酸化的胞嘧啶反应中间体，其易于脱氨，并且在水存在时形成尿嘧啶亚硫酸盐。如有必要，可以在温和碱条件下去除亚硫酸盐基团，导致形成尿嘧啶。因此，可能所有胞嘧啶均将被转化为尿嘧啶。然而，由于甲基化保护，任何甲基化的胞嘧啶均不能被所述修饰试剂转化。应该理解胞嘧啶(或任何其它碱基)可以通过酶促方式加以修饰，以获得如在本发明中所述的衍生核酸。
可以通过两种主要的常用方法修饰核酸中的碱基：化学方法和酶促方法。因此，用于本发明的修饰也可以利用天然存在的酶或利用将要报道的人工构建或选择的酶而实现。化学处理，例如亚硫酸氢盐法，可以通过恰当的化学步骤将胞嘧啶转化为尿嘧啶。类似的，例如，胞嘧啶脱氨酶可以实现转化以形成衍生的核酸。据我们所知，首个关于胞嘧啶脱氨酶的报道是1932，Schmidt，G.，Z.physiol.Chem.，208，185；(还可见1950，Wang，T.P.，Sable，H.Z.，Lampen，J.O.，J.Biol.Chem，184，17-28，Enzymatic deamination of cytosinesnucleosides)。在该早期工作中，胞嘧啶脱氨酶未能独立于其它核酸脱氨酶而获得，然而，Wang等人能够从酵母或大肠杆菌(E.coli)纯化出这样的活性。因此，任何胞嘧啶的酶促转化以形成衍生的核酸，其最终导致在下一步复制过程中在该位置插入一个不同于胞嘧啶的碱基，而将产生简化的基因组。用于产生衍生物以及随后的简化基因组的化学或酶促转化适用于任何核酸-碱基，只要其为天然存在的微生物核酸中的嘌呤或嘧啶。
如在本文中使用的，术语“基因组或核酸的简化形式”意思为一种基因组或核酸，无论天然存在还是合成的，其通常含有四种常见碱基G，A，T和C，现在很大程度上仅由三种碱基G，A和T构成，因为该基因组中的大部分或全部C均已通过恰当的化学修饰以及随后的扩增步骤而被转化为T。基因组的简化形式意思为相对基因组复杂性从四碱基的基础朝向三碱基组成降低。
如在本文中使用的，术语“碱基类似物(base-like entity)”意思为通过胞嘧啶修饰的形成物。碱基类似物可以在衍生核酸的扩增过程中由DNA聚合酶识别，并且该聚合酶使A，G或T分布于新形成的互补DNA链上，处于与该衍生核酸中碱基类似物相对的位置。典型地，所述碱基类似物是从相应未处理的微生物核酸中从胞嘧啶修饰而得的尿嘧啶。碱基类似物的实例包括任何核酸-碱基，只要其为嘌呤或嘧啶。
如在本文中使用的，术语“相对复杂性降低”涉及到在两个相同大小的基因组中在特定的分子条件下的探针长度，即实现探针对特异座位的相同特异性及杂交水平所需的平均探针长度的增加，其中第一个基因组是“原样”并由四个碱基G、A、T和C组成，而第二个基因组的长度完全相同但一些胞嘧啶(理想的，为全部胞嘧啶)已被转化为胸腺嘧啶。待检测的座位在原始未转化的基因组以及转化的基因组中位于相同的位置。平均来说，11碱基探针将具有一个独特的位置，其将与由四种碱基G，A，T和C组成的4,194,304个碱基(411等于4,194,304)的常规基因组完美杂交，然而，一旦这种4,194,304个碱基的常规基因组已经被亚硫酸氢盐或其它恰当的途径转化，则现在这种转化的基因组仅由三种碱基构成，显然复杂性较低。然而，基因组复杂性降低的结果就是我们之前独特的11碱基探针不再具有可在所述简化基因组内杂交的独特位置。现在存在许多其它可能的11碱基序列的等同位置，其作为亚硫酸氢盐转化的结果而重新出现。现在其需要14碱基探针以找到并杂交于该原始座位。尽管其最初看来与直觉相反，但是人们因此需要长度增加的探针以检测现在位于简化的三碱基基因组中的原始位置，因为该基因组的看起来越相同，(其具有越相似的序列)。因此降低的相对基因组复杂性(或三碱基基因组的简单性)意思为人们必须设计更长的探针以找到原始的独特位置。
如在本文中使用的，术语“相对的基因组复杂性降低”可以用与未修饰的DNA相比，能够对微生物特异的探针长度的增加来衡量。该术语还包括了用于确定微生物存在的探针序列的类型。这些探针可以含有非常规主链，例如PNA或LNA主链或者对一个主链的修饰性插入，如在INA中所描述的那些。因此，基因组被认为具有降低的相对复杂性，与探针是否含有额外的组分例如嵌入的假核苷酸(如在INA中)无关。实例包括但不限于DNA，RNA，锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，MNA，阿卓糖醇核酸(ANA)，己糖醇核酸(HNA)，嵌入性核酸(INA)，肌醇核酸(CNA)及其混合物和杂交体，以及其磷原子修饰，例如但不限于硫代磷酸酯、膦酸甲酯(methyl phosphorate)，亚磷酰胺，二硫代磷酸酯，膦酸硒(phosphoroselenoate)，磷酸三酯以及磷酸硼(phosphoboranoate)。非天然存在的核苷酸包括但不限于以下核苷酸，包括：DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双环DNA、6-氨基-双环-DNA、5-epi-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于连接于核苷酸，例如但不限于甲基亚氨基甲基，甲酰乙酸乙酯(formacetate)，硫代甲酰乙酸乙酯(thioformacetate)以及包括酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物可能包含一种或多种嵌入假核苷酸(IPN)。IPN的存在不是核酸分子复杂性描述的一部分，其主链也不是该复杂性的一部分，例如在PNA中。
“INA”表示依照WO03/051901，WO03/052132，WO03/052133和WO03/052134(Unest A/S)中的教导的嵌入性核酸，其均结合于此供参考。INA是含有一个或多个嵌入性假核苷酸(IPN)分子的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
“HNA”表示如由Van Aetschot et al.，1995所描述的核酸。
“MNA”表示如由Hossain et al，1998所描述的核酸。
“ANA”指的是由Allert et al，1999描述的核酸。
“LNA”可以为任何LNA分子，如在WO99/14226(Exiqon)中所描述的，优选地，LNA选自WO99/14226的摘要中描述的分子。更优选地，LNA是Singh et al，1998，Koshkin et al，1998或Obika et al.，1997中描述的核酸。
“PNA”指的是肽核酸，如由Nielsen et al，1991描述的。
如在本文中使用的，“相对复杂性降低”不指碱基存在的顺序，例如序列ATATATATATATAT(SEQ ID NO：1)与相同长度的序列AAAAAAATTTTTTT(SEQ ID NO：2)之间的数学复杂性差异，也不指相对基因组长度的原始重组数据(以及推理的基因组复杂性)，其由Waring，M.& Britten R.J.1966，Science，154，791-794；andBritten，R.J and Kohne D E.，1968，Science，161，529-540以及本文中来源于Carnegie Institution of Washington Yearbook reports的早期参考资料而引入科学文献中。
如在本文中使用的，“相对基因组复杂性”指的是利用分子探针评估的两个基因组内不变位置的碱基(原始以及未转化的基因组均具有不变位置1到n的碱基)。在某个特定女性的30亿个碱基对的单倍体人类基因组中，所述不变的位置定义为从1到n，其中n是3,000,000,000。如果在序列1到n中，在原始基因组中第i个碱基是C，则在转化的基因组中第i个碱基是T。
如在本文中使用的，术语“基因组核酸”包括微生物(原核生物以及单细胞真核生物)RNA、DNA、蛋白编码核酸、非蛋白编码核酸以及原核生物或单细胞真核微生物的核糖体基因区域。
如在本文中使用的，术语“微生物基因组”覆盖了染色体以及染色体外核酸，还有该基因组的临时成员例如质粒、噬菌体和最广泛意义上的可动元件。所述“基因组”具有如通过乳链球菌(S.galactiae)例示的核心组分，以及可能还具有的在不同分离体之间变化的编码和非编码元件。
如在本文中使用的，术语“微生物来源的DNA”包括通过利用任何已知的恰当方法例如反转录酶直接从微生物或将微生物RNA转化为DNA而间接获得的DNA。
如在本文中使用的，术语“微生物”包括噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、螺旋体、单细胞生物或任何其它微生物，无论分类多么不同，例如the Kingdom Protoctista by Margulis，L.，etal1990.Handbook of Protoctista，Jones and Bartlett，Publishers，Boston USA或者与人类相关的微生物，如在由Harrisons Principles ofInternal Medicine，12thEdition，edited by J D Wilson et al.，McGraw Hill Inc，及其后续版本中定义的。还包括所有在OMIM，人类孟德尔遗传在线www.ncbi.gov中已经描述的与人类疾患相关的微生物。
如在本文中使用的，术语“微生物特异的核酸分子”是指一种分子，其已经利用根据本发明的方法确定或获得，且具有一个或多个特异于微生物的序列。
如在本文中使用的，术语“微生物的分类水平”包括科、属、种、株、型或来自相同或不同地理或海底种群的不同种群。而在细菌中，采用普遍公认的方案，例如细菌域、变形菌门；β-变形菌纲；奈瑟球菌目；奈瑟球菌科；奈瑟菌属。不同种群可能对单个核苷酸改变或变异为多态性的，所述核苷酸改变或变异存在于以细胞内形式存在于微生物(质粒或噬菌体)或微生物基因组例如病原岛的多态染色体区域内的DNA分子中。可以识别微生物和病毒基因组的流动性，包括病毒基因组的嵌合性质，其可以独立核酸片段存在，因此，新出现的株可由来自不同动物的基因组区域重排而产生，例如新的人流感株为携带其它哺乳动物或鸟类病毒基因组片段的嵌合体。
如在本文中使用的，术语“接近的序列相似性”包括上述相对序列复杂性的定义以及作为测量值的探针长度。
材料和方法
DNA提取
通常，微生物DNA(或病毒RNA)可以从任何合适的来源获得。实例包括但不限于细胞培养物、肉汤培养物、环境样品、临床样品、体液、液态样品、固态样品例如组织。来自样品的微生物DNA可以利用标准步骤获得。一个恰当的提取实例如下：将感兴趣的样品置于400μl的7M盐酸胍、5mM EDTA、100mM Tris/HClpH6.4、1％Triton-X-100、50mM蛋白酶K(Sigma)、100μg/ml酵母tRNA中。用一次性1.5ml研棒彻底均质化样品，并在60℃放置48小时。孵育后，使样品经过5个干冰5分钟/95℃的冻/融循环5分钟。然后涡旋样品并在微型离心机(microfuge)中离心2分钟使细胞碎片成团。将上清移入干净管中并稀释以降低盐浓度，然后用苯酚：氯仿抽提，乙醇沉淀并重悬于50μl10mM Tris/0.1mM EDTA中。
具体地说，从生长于标准琼脂板(具有对每一物种特异的营养要求)上的Gram阳性和Gram阴性细菌的DNA提取如下进行。
从Gram阴性细菌的DNA提取方案如下：
a)利用无菌牙签将细菌克隆体从培养板刮下，转入1.5ml无菌离心管中。
b)加入180μl硫氰酸胍提取缓冲液(7M硫氰酸胍、5mM EDTA(pH8.0)、40mM Tris/HCl pH7.6、1％Triton-X-100)，并混合样品以重悬该细菌克隆。
c)加入20μl(20mg/ml)蛋白酶K，并充分混匀样品。
d)将样品在55℃孵育3小时，以裂解细胞。
e)每个样品中加入200μl水，并将样品轻柔吹打混匀。
f)加入400μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，将样品涡旋15秒，两次。
g)然后将样品在微型离心机中以14,000r pm离心4分钟。
h)将水相移入干净的1.5ml离心管中。
i)加入400μl苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，将样品涡旋15秒，两次。
j)然后将样品在微型离心机中以14,000rpm离心4分钟。
k)将水相移入干净的1.5ml离心管中。
l)每个样品中加入800μl的100％乙醇，将样品轻柔涡旋然后置于-20℃达1小时。
m)将样品在微型离心机中以14,000r pm离心4分钟。
n)将DNA沉淀(颗粒状物)用500μl的70％乙醇洗涤。
o)将样品在微型离心机中在4℃以14,000rpm离心5分钟，弃去乙醇，将沉淀空气干燥5分钟
p)最后，将DNA重悬于100μl的10mM Tris/HCl pH8.0、1mMEDTA pH8.0中。
q)通过测定230nm、260nm、280nm的溶液吸光度，计算DNA浓度以及纯度。
从Gram阳性细菌的DNA提取的方案如下：
a)利用无菌牙签将细菌克隆体从培养板刮下，转入1.5ml无菌离心管中。
b)每个样品中加入180μl的20mg/ml溶菌酶(Sigma)和200μg的溶葡球菌酶(Sigma)，轻柔混合样品以重悬该细菌克隆体。
c)将样品在37℃孵育30分钟，以降解细胞壁。
d)随后根据用于Gram阳性细菌的QIAamp DNA小试剂盒方案处理样品并提取DNA。
从患者的细胞学样品中提取DNA
a)用手剧烈振荡样品，以重悬任何沉积的细胞，以及确保溶液的均质性。
b)将4ml的重悬细胞转入15ml Costar离心管中。
c)将离心管在甩平桶式转头中以3000xg离心15分钟。
d)小心倾倒并弃去上清，而不破坏成团的细胞材料。
e)将成团细胞重悬于200μl裂解缓冲液(100mM Tris/HClpH8.0、2mM EDTA(pH8.0)、0.5％SDS、0.5％Triton-X-100)中，充分混匀，直至溶液均质化。
f)将80μl样品转入96孔样品制备板中。
g)加入20μl蛋白酶K，将溶液在55℃孵育1小时(这步得到细胞裂解物)。
从尿样品提取DNA
根据QlAamp UltraSensTM病毒手册从起始体积1ml尿中提取DNA。
亚硫酸氢盐处理DNA样品
亚硫酸氢盐处理根据MethylEasyTM高通量DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒(Human Genetic Signatures Pty Ltd，Australia)来实施，也可见下文。
令人吃惊的是，本发明发明人已经发现没有必要将微生物DNA与其它来源的核酸分开，例如当人细胞样品中存在微生物DNA时。该处理步骤可以用于大量不同DNA类型的混合物，然而微生物特异性核酸仍然可以通过本发明鉴定。据估计，在复杂DNA混合物中检测的限值为标准PCR检测的限值，其可以低至靶核酸分子的一个单一拷贝。
样品
任何恰当的样品均可用于本发明。实例包括但不限于微生物培养物、临床样品、兽医样品、生物液体、组织培养样品、环境样品、水样品、流出物。由于本发明适用于检测任何微生物，因此不应该认为该列表是穷举的。
试剂盒
本发明可以多种试剂盒或试剂盒组合的形式实施，并根据人工、半自动或全自动平台加以例示。在一个优选的形式中，MethyEasyTM或高通量MethylEasyTM试剂盒(Human GeneticSignatures Pty Ltd，Australia)可利用自动化平台例如EpMotion在96或384孔板中实现核酸的转化。
亚硫酸氢盐处理
以下列出了一个有效的亚硫酸氢盐处理核酸的示例性方案。该方案可保留基本上全部处理的DNA。本文中该方法也称为人类遗传印记(Human Genetic Signatures(HGS))法。应该理解样品或试剂的体积或量可以变化。
优选的亚硫酸氢盐处理方法可以在US10/428310或PCT/AU2004/000549查到，二者均结合于此供参考。
对于2μg DNA(如果需要可以用恰当的限制酶预消化)，以20μl的终体积加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g/50ml水，新鲜制备)。该步骤将双链DNA分子变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应。该混合物在37℃孵育15分钟。在高于室温的温度孵育可以用来提高变性效率。
孵育后，依次加入208μl2M焦亚硫酸钠(7.6g/20ml水，与416ml的10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜制备)以及12μl的10mM对苯二酚(0.055g/50ml水，BDH AnalR#103122E；新鲜制备)。对苯二酚是一种还原剂，有助于将氧化状态的试剂还原。还可以使用其它还原剂，例如二硫代苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(对苯二酚)或其它合适的还原剂。样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖可以防止试剂的挥发和氧化，但并非必需。随后样品在55℃孵育过夜。可替换的，该样品可以在热循环仪中进行如下循环：如下孵育约4小时或整夜：第一步，在PCR仪中循环55℃/2小时；第二步，95℃/2分钟。第一步可以在约37℃至约90℃之间的任何温度实施，时间长度可从5分钟至8小时之间变化。第二步可以在约70℃至约99℃之间的任何温度实施，时间长度可从1秒钟至60分钟或者更长之间变化。
用焦亚硫酸钠处理后，将油去除，如果DNA浓度低则加入1μl tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，并且可以用来通过与靶DNA共沉淀而提高所获得的DNA产量，尤其是DNA以低浓度存在时。当核酸量<0.5g时，则通常需要使用添加剂作为载体以更加有效的沉淀核酸。
异丙醇提纯处理如下进行：将800μl水加入样品中，混匀，然后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应管中的亚硫酸氢盐浓度降低到该盐不随感兴趣的靶核酸一起沉淀的水平。稀释度通常为约1/4至1/1000，只要将盐浓度稀释至低于如本文中所披露的预期范围即可。
将样品重新混匀，并置于4℃达至少5分钟。样品在微型离心机中离心10-15分钟，并将沉淀用70％ETOH洗涤2次，每次均涡旋。该洗涤处理除去任何与核酸一起沉淀的残余盐。
将沉淀干燥并重悬于恰当体积(例如50μl)的T/E(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5中。已经发现pH10.5的缓冲液特别有效。在悬浮核酸需要的情况下，将样品在37℃至95℃孵育1分钟至96小时。
在WO2005021778(结合于此供参考)中可以查到另一个亚硫酸氢盐处理的实例，其提供了将胞嘧啶转化为尿嘧啶的方法和材料。在某些具体实施方式中，将核酸例如gDNA与亚硫酸氢盐以及多胺催化剂(例如三胺或四胺)反应。可选的，该亚硫酸氢盐包括酸式亚硫酸镁。在其它具体实施方式中，核酸与酸式亚硫酸镁反应，可选地在多胺催化剂和/或季胺催化剂存在下进行。还提供了可以用来实施本发明的方法的试剂盒。可以理解，这些方法也适合于本发明的处理步骤。
扩增
PCR扩增利用Promega PCR master mix，在25μl包括2μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA以及6ng/μl的每种引物的反应混合物中进行。将链特异性巢式引物用于扩增。第一轮PCR扩增利用引物1和4进行(见下)。第1轮扩增后，将1μl扩增的物质转移至含PCR引物2和3的第2轮PCR预先混合液中，并如前所述进行扩增。PCR产物的样品在ThermoHybaid PX2热循环仪中进行扩增，条件如下：95℃/4分钟的1个循环；随后是95℃/1分钟、50℃/2分钟以及72℃/2分钟，共30个循环；72℃/10分钟的1个循环。
多重扩增
如果检测需要多重扩增，则可实施以下方法：
将1μl亚硫酸氢盐处理的DNA加入到在25μl反应体积中的下列组分中：x1Qiagen多重标准混合物(master mix)、5-100ng每种第一轮INA或寡核苷酸引物1.5-4.0mM MgSO4、400μM每种dNTP以及0.5-2单位的聚合酶混合物。所述组分随后在热盖热循环仪中进行如下循环。典型的，在每个扩增反应中可以存在多达200个单独的引物序列：第1步：94℃ 15分钟 1个循环
第2步：94℃ 1分钟
50℃ 3分钟 35个循环
68℃ 3分钟
第3步：68℃ 10分钟 1个循环
然后在1μl转移到包含酶反应混合物和恰当的第二轮引物的第二轮反应管的第一轮扩增的等分试样上进行第二轮扩增。然后实施如上循环。
引物
任何合适的PCR引物均可用于本发明。引物通常具有与待扩增的序列互补的序列。引物通常是寡核苷酸，但可以为核苷酸类似物。
探针
探针可以为任何合适的核酸分子或核酸类似物。实例包括但不限于DNA、RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入性核酸(INA)、肌醇核酸(CNA)及其混合物和杂交体，以及其磷原子修饰物，例如但不限于硫代磷酸酯、膦酸甲酯，亚磷酰胺，二硫代磷酸酯，膦酸硒，磷酸三酯以及膦酸硼。非天然存在的核苷酸包括但不限于DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双环DNA、6-氨基-双环-DNA、5-epi-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、2’-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用于连接于核苷酸例如但不限于甲基亚氨基甲基，甲酰乙酸乙酯，硫代甲酰乙酸乙酯以及含有酰胺的连接基团。特别地，核酸和核酸类似物可能包含一种或多种嵌入性假核苷酸(IPN)。
优选地，探针可以为含有一个或多个内部IPN形成INA的DNA或DNA寡核苷酸，其。
电泳
样品电泳根据E-gel系统用户指南(www.invitrogen.doc)进行。
检测方法
存在有多种可能的检测系统用来确定期望样品的状态。应该理解，任何已知的用于检测核酸分子的系统或方法均可用于本发明。检测系统包括但不限于：
I.恰当标记的DNA杂交于微阵列型装置，其可选择10->200,000的单个组分。该阵列可以由位于任何合适的固体表面例如玻璃、塑料、云母、尼龙、珠子、磁珠、荧光珠或薄膜上的INA、PNA或核苷酸或者修饰的核苷酸阵列构成；
II.DNA印迹型检测系统；
III.标准PCR检测系统，例如琼脂糖凝胶、荧光读出例如Genescan分析。夹心杂交分析、DNA染色剂例如溴化乙锭、Syber绿、抗体检测、ELISA微板读数器型装置、荧光计装置；
iV.特异性或多种基因组扩增片段的实时PCR定量或对其的任何变更。
V.在WO2004/065625中列出的任何检测系统，例如荧光珠、酶轭合物、放射性珠等。
VI.利用扩增步骤的任何其它检测系统，例如连接酶链反应或等温DNA扩增技术例如链置换扩增(SDA)。
VII.多光子检测系统。
VIII.凝胶中电泳和可视化。
IX.用于或可用于检测核酸的任何检测平台
嵌入性核酸
嵌入性核酸(INA)为非天然存在的多核苷酸，其可序列特异性地杂交于核酸(DNA和RNA)。在基于探针的杂交分析中，INA是作为核酸探针的替换物/替代物的候选者，因为它们表现出多种合乎需要的性质。INA是多聚物，其杂交于核酸而形成比相应天然存在的核酸/核酸复合物更加热动力学稳定的杂交体。它们不是已知可降解肽或核酸的酶的底物。因此，相比天然存在的核酸片段，INA在生物样品中应该更稳定，而且具有较长的贮存期限。与非常依赖于离子强度的核酸杂交不同，INA与核酸的杂交完全独立于离子强度而且在低离子强度及非常不利于天然存在的核酸-核酸杂交的条件下，仍然有利地进行。INA的结合强度依赖于分子中设计的嵌入基团的数量以及来自双链结构中以特异性方式聚集的碱基之间的氢键的常规相互作用。INA识别DNA较之DNA识别DNA，对于序列区分效率更高。
优选地，INA是(S)-1-O-(4，4′-二甲氧三苯基甲基)-3-O-(1-异戊二烯基甲基)-丙三醇的亚磷酰胺。
INA以商业化的方式通过对标准寡核苷酸合成步骤的改造而合成。INA的完整定义及其合成可以在WO03/051901，WO03/052132，WO03/052133和WO03/052134(Unest A/S)中查到，其均结合于此供参考。
INA探针与标准核酸探针之间的确存在许多差异。这些差异可以很方便的分为生物、结构以及理化差异。如上面以及下面论及的，当在通常已采用了核酸的应用中尝试利用INA探针时，这些生物、结构以及理化差异可能导致不可预测的结果。在化学技术领域中，常常观察到不同组合物的这种不等价性。
关于生物差异，核酸是在活物种中作为遗传传递和表达因子而发挥重要作用的生物物质，已经相当充分地理解了其在体内的性质。然而INA是最近开发的完全人工的分子，由化学家思考设计且利用有机合成化学制备。其不具备已知的生物学功能。
结构上，INA也与核酸显著不同。尽管二者均可利用常规核苷酸碱基(A，C，G，T以及U)，这些分子的组成在结构上是不同的。RNA，DNA和INA的主链由重复的核糖磷酸二酯以及2-脱氧核糖单元构成。INA与DNA或RNA的区别在于具有一个或多个大的扁平分子，其借助连接分子连接于多聚体。双链结构中，该扁平分子嵌入在与INA相对的互补DNA链中的碱基之间。
INA与DNA或RNA之间的物理/化学差异也很大。INA结合于互补DNA比核酸探针结合于相同靶序列更加迅速。与DNA或RNA片段不同，INA与RNA结合很弱，除非嵌入基团位于末端位置。由于嵌入基团与互补DNA链上的碱基之间的强烈相互作用，INA/DNA复合体的稳定性高于类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合体的稳定性。
与其它核酸例如DNA或RNA片段或者PNA不同，INA不表现出自我聚集或结合的性质。
由于INA以序列特异性杂交于核酸，所以INA是开发基于探针的分析非常有用的候选物，尤其适合于试剂盒以及筛选测定。然而，INA探针并非核酸探针的等价物。因此，任何可提高基于探针的测定法的特异性、敏感性以及可靠性的方法、试剂盒或组合物在含DNA样品的检测、分析和定量中均非常有用。INA具有实现该目的的必要性能。
结果
微生物(例如细菌、病毒或真菌株)的检测常常被该物种内的大量微生物个体株所阻碍。
本发明的一般生物信息学原理是利用细菌脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、链球菌sp和葡萄球菌(图1至图5)加以讲述的。本发明的一般原理已经利用流感病毒和轮状病毒进行了讲述(图6和图7)。
用于讲述和支持本发明的基本生物化学数据利用临床相关的Gram阳性以及Gram阴性细菌在图8至图18中进行阐述。
细菌
图1示出了脑膜炎奈瑟菌中iga蛋白酶的34个核苷酸区域以及淋病奈瑟菌中的相应座位(如同这些区域存在预其天然细菌基因组中那样)(完全分类；细菌域；变形菌门；β变形菌纲；奈瑟菌属；脑膜炎奈瑟菌，Z2491血清型A和完全座位特征；iga，IgA1蛋白酶；基因ID906889。座位标签NMA0905；RefSeq登陆号NC_003116.1；P MID10761919；ParkhillJ etal.，2000，Nature，404，502-506)。在这两个奈瑟菌属的34个核苷酸序列之间存在74％的序列相似性。用来扩增两个细菌种中这些区域的基于PCR的引物要求具有512种可能组合的简并引物。用于部分PCR扩增的通用序列为34个核苷酸序列GYAATYW AGGYCGYCTY GAAGAYTAYA AYATGGC(SEQ ID NO：3)，其中用于指明不同位置的标准代码在下面给出：N＝A，G，T或C；D＝A，G或T；H＝A，T或C；B＝G，T或C；V＝G，A或C；K＝G或T；S＝C或G；Y＝T或C；R＝A或G；M＝A或C以及W＝A或T。
然而，当用亚硫酸氢盐试剂处理来自这两个物种的细菌DNA时，(导致胞嘧啶转化为胸腺嘧啶)，天然存在的序列转化为不具有编码能力而且不在自然界存在的衍生序列。所述衍生序列现在达到97％的序列相似性。用来在单一检测中扩增这些细菌座位的基于PCR的引物现在仅要求2种引物组合。所述组合基于序列GTAATTW AG GTTGTTTT GAAGATTATA ATATG GT(SEQID NO：4)，其中仅位置7处的碱基为腺嘌呤或胸腺嘧啶(表示为W)。因此，亚硫酸氢盐转化将相对基因组复杂性从512种降至2种引物类型。这种巨大的降低简化了来自相关细菌种的相同座位的扩增。
进一步的优势自然产生，可选的利用INA探针扩增来自这两种细菌种的区域，而且利用相同座位。图2图解了与图1中所描述的脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌中iga基因相同的34个核苷酸区域，其中图解了利用INA探针将探针长度和复杂性进一步降低的程度。为了检测该区域，较短的INA16碱基序列AGGYCGYCTY GAAGAY(SEQ ID NO：5)将要求16种可能的引物组合，但用亚硫酸氢盐转化后，单一引物序列AGGTTGTTTT GAAGAT(SEQ ID NO：6)已经足够。INA分子的优势在于：由于整合入其主链中的嵌合性假核苷酸，INA相对于标准寡核苷酸具有较高的Tm，因此与正确座位的杂交更易与非特异结合区分。然而，应该理解，标准寡核苷酸仍然足以发挥作用。
当密切相关的细菌物种引起相似的临床症状时，亚硫酸氢盐转化的DNA还可以用来设计较简单的探针以测定特异细菌类型的存在情况。图3示出了在三种细菌种中的iga基因的DNA比对情况，其中之一，流感嗜血杆菌来自于不同的分类群(taxonomic group)。细菌DNA的亚硫酸氢盐处理得到数量少得多的探针组合。该比较阐释了能够在一个检测中分析不相关物种的重要性。脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌均可引起脑膜炎，因此，能够在一个检测中测定分析所有引起相同临床症状的微生物，将非常有益。
本发明还有利于分析来自同一分类群的大量不同细菌种。图4示出了链球菌群的10个细菌种，即口腔链球菌(S.oralis)、缓症链球菌(S.mitis)、S.dysgalactiae、S.cristatus、S.gordonii、S.parauberis、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、猪链球菌(S.bovis)、S.vestivularis和乳房链球菌(S.uberis)。的tuf基因中40个核苷酸片段。该区域在所述10个物种之间具有大约68％的序列相似性，为了在一个检测中同时分析这10个物种则要求12,288种引物组合。在这些物种之间的亚硫酸氢盐转化序列具有85％的序列相似性，而现在仅需要64种可能的引物组合。
通过本发明还可简化属于相同细菌物种的不同株的分析。图5图解了金黄色葡萄球菌肠毒素基因se的23个核苷酸序列。该基因区域的天然序列在所有7个株之间仅具有56％的序列相似性并且需要1536种引物组合，而亚硫酸氢盐转化的序列具有74％的序列相似性，并且仅需要64种引物组合。
病毒核酸分析以及相对基因组复杂性降低
相关基因组复杂性降低的原理还适用于病毒群，例如具有DNA基因组的流感病毒、以及具有RNA基因组的病毒群，(因为RNA可以利用反转录酶转化为DNA，随后相应地进行亚硫酸氢盐处理)。为了阐明对病毒检测的应用，使用了流感病毒(正粘病毒科)株的神经氨酸苷酶以及轮状病毒株的编码表面蛋白的VP4基因，这两种病毒均具有节段性RNA基因组。流感病毒的分类非常复杂，例如根据抗原特征分为A、B和C型，又根据起源位置、分离年限、分离物编号和亚型而进一步分为亚型。这就增强了首先能够将流感病毒鉴定为一个群的需要，然后仅需要深入分析亚亚分类(sub-sub-classification)水平。
轮状病毒的分类也非常复杂。轮状病毒血清型的数量巨大，其中识别了两种主要血清型P和G血清型。最少存在14种不同的G血清型，并且对这些血清型的明确检测在儿科学中非常重要。据估计，到三岁时，世界上几乎每个儿童均感染过至少一次轮状病毒，即使这些感染为亚临床性，并且对胃肠道仅具有轻微影响。
临床水平感染流感病毒的结果众所周知，几乎每个冬天均具有显著的发病率和死亡率。然而，感染后常常出现大量继发的并发症，尤其是感染肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及金黄色葡萄菌。很显然，同时分析病毒感染和细菌感染非常有益，因为肺炎并发症可以来源于细菌和病毒混合感染的混合特性，并且迅速的抗生素处理可能是有效的治疗。
图6中示出了9种不同流感病毒株中的相关基因组复杂性降低。流感病毒的神经氨酸苷酶的20个核苷酸区域以其DNA形式示出。在这9种分离体之间存在50％的序列相似性。亚硫酸氢盐转化后，序列相似性增加为75％。在其原始形式中，分析这9种株需要2048种可能的引物组合，而亚硫酸氢盐处理后，仅需要48种引物组合。
图7中示出了3种不同轮状病毒株的VP4基因中的相关基因组复杂性降低。VP4基因的20个核苷酸区域在转化前具有52％的序列相似性，而转化后为74％。引物组合的数量从512降至32。
利用在医院和病理检测单位常常遇到的临床相关微生物种，图8至图15阐述了支持将简化微生物基因组的生物信息学途径作为一种检测微生物的方式的分子数据。
如果能够初步确定样品中存在Gram阳性还是Gram阴性细菌，则迅速检测污染的微生物是独特的优势，且为临床急需。本文中描述的方法提供了这样一个检测，其利用不同细菌种的23S核糖体基因生成一组引物，对简化基因组通过利用这些引物借助扩增反应可检测Gram阳性或Gram阴性细菌。所述23S序列用于这种高水平区分比较理想，因为其存在于所有细菌种中，不同于对某些细菌基因组是可选添加的某些蛋白编码序列，如在上文无乳链球菌(S.agalactiae)实例中观察到的。多种编码蛋白的微生物序列类似于基因组“废弃物”，并且其有用性在于区分低水平分类例如不同微生物株、型或分离体，或者在病毒情况下的不同型或新出现的突变。在图15和图16中分别给出了这两种组分的正常和简化基因组序列、非编码蛋白的核糖体RNA基因以及编码蛋白的细菌recA基因。表1中给出了用来实施23S细菌扩增子的扩增反应的引物序列。表2中给出了用来实施recA扩增子的扩增反应的引物序列。所有引物均针对亚硫酸氢盐处理的DNA而制备，并以5’至3’的方向示出。
表1列出了用于扩增来自23S核糖体RNA基因的亚硫酸氢盐简化的DNA的适合的细菌引物，其中利用比对以生成用于检测Gram阳性(Pos)、Gram阴性(Neg)的引物。此外，还设计了用于特异性检测支原体属(Myc)、葡萄球菌属(Staph)、变形链球菌属(Strep)、奈瑟菌属(NG)、衣原体(CT)以及大肠埃希杆菌和肺炎克雷伯杆菌(EC)的引物。
下列符号表示以下的碱基插入：N＝A，G，T或C；D＝A，G或T；H＝A，T或C；B＝G，T或C；V＝G，A或C；K＝G或T；S＝C或G；Y＝T或C；R＝A或G；M＝A或C以及W＝A或T。
使用的全部引物均基于亚硫酸氢盐简化的DNA序列。
表1细菌引物
(表中文字：Primer引物Sequence序列)
表2列出了用于扩增来自recA的蛋白编码基因的简化DNA的细菌引物序列，其中利用了金黄色葡萄球菌(SA)、表皮葡萄球菌(SE)、粘质沙雷菌(SM)、大肠埃希杆菌(EC)和结肠耶尔森菌(YE)的比对用于细菌统一分型。
表2用于扩增来自recA的蛋白编码基因的简化DNA的细菌引物
(Specific特异的Sequence序列)
表1示出了用于扩增来自23S核糖体RNA基因的亚硫酸氢盐简化DNA的细菌引物序列，其中利用多重比对以产生用于Gram阳性(表示为Pos)和Gram阴性(表示为Neg)细菌检测的最佳引物。此外，还设计了用于特异性检测物种的群以及用于单一物种的引物。这些细菌引物群的名称如下：大肠埃希杆菌和肺炎克雷伯杆菌(EC)、奈瑟菌属(NG)、衣原体(CT)、支原体属(Myc)、链球菌属(Strep)以及葡萄球菌属(Staph)。F和R亚名称分别指正向和反向引物。此外，当一个特定核苷酸位置需要一个以上的可能碱基时，碱基简并性由下列符号给出：N＝A，G，T或C；D＝A，G或T；H＝A，T或C；B＝G，T或C；V＝G，A或C；K＝G或T；S＝C或G；Y＝T或C；R＝A或G；M＝A或C以及W＝A或T。重申一下：所有用于本发明中的引物均基于亚硫酸氢盐简化的DNA序列。
表2示出了用于扩增来自recA蛋白编码基因的简化DNA的细菌引物，利用金黄色葡萄球菌(SA)、表皮葡萄球菌(SE)、粘质沙雷菌(SM)、大肠埃希杆菌(EC)和结肠耶尔森菌(YE)的比对用于细菌统一分型。
图8示出了通过PCR从Gram阳性和Gram阴性细菌的基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物，其具有近似大小的扩增子，通过琼脂糖凝胶电泳检测为特定长度的谱带。箭头表示扩增子相对于标准大小的标记物(在标记物泳道中泳动，M)的预期大小。利用特异于Gram阴性细菌的引物表明仅在6个Gram阴性泳道1至6中存在大肠埃希杆菌、淋病奈瑟菌、肺炎克雷伯杆菌、粘膜炎莫拉菌、绿脓假单胞菌和普通变形杆菌的谱带(上图)。利用特异于Gram阳性细菌的引物表明仅在6个Gram阳性泳道7至12中存在粪肠球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、xylosis葡萄球菌、肺炎链球菌和溶血性链球菌的谱带(下图)。
图9示出了通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物，该区域经设计以仅检测来自两种Gram阴性种，(本例中)大肠埃希杆菌和肺炎克雷伯杆菌。扩增方法学的特异性通过泳道1和3中存在表示大肠埃希杆菌和肺炎克雷伯杆菌的扩增子、泳道2以及泳道4至12中不存在扩增产物而阐释，这10个空泳道表示本检测中采用的其余10个种的细菌。
图10示出了利用特异于仅一个细菌群奈瑟菌属的引物，通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。基因组简化方法学的特异性通过仅泳道2中存在表示淋病奈瑟菌的扩增子、泳道1以及泳道3至12中不存在扩增产物而阐释，这11个空泳道表示本检测中采用的其余10个种的细菌。
为了分析单个微生物种，合适的情况下还可采用蛋白编码基因，前提是对于待检测基因序列存在与否，讨论的微生物的不同株不呈多态性。
图11示出了针对大肠埃希杆菌的细菌recA基因的引物的应用。扩增子的特异性通过泳道1中存在大小正确的扩增子、其余泳道2至12(表示其它11个种的细菌)中不存在扩增子而阐释。
图12的数据进一步阐释了表明较大细菌群例如葡萄球菌的成员的引物特异性。利用特异于葡萄球菌的引物，通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物表明仅泳道8、9和10(代表表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和xylosis葡萄球菌)中存在扩增子。泳道1至7以及泳道11和12中不存在扩增产物则证实了该反应的特异性。9个空泳道表示在本检测中采用的9个非葡萄球菌种。
图13示出了利用特异于链球菌的引物，通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物。利用特异于链球菌的引物通过PCR从基因组简化的23S核糖体基因区域获得的扩增产物表明仅泳道11和12中存在表示肺炎链球菌和溶血性链球菌的扩增产物。泳道1至10中不存在扩增产物则表明了该反应的特异性。这10个空泳道表示在本检测中采用的9个非链球菌种。
图14示出了通过PCR从来自于表皮葡萄球菌(泳道8)的recA基因的基因组简化区域的一个蛋白编码基因获得的扩增产物。两个谱带(箭头所示)表示来自第一轮(上谱带)和第二轮PCR扩增携带污染的扩增子。泳道1至7以及泳道9至12中不存在扩增产物表明该方法的特异性，强调了以来实现仅一个细菌种的检测。
图15示出了利用针对沙眼衣原体的基因组简化的23S核糖体基因的特异引物的扩增子的检测。由于初始DNA量比较小，所以PCR反应平行进行。泳道号5为从一个已知阴性个体的尿中提取的DNA。双重反应的任何一个出现条带即认为是衣原体DNA存在的阳性反应。
图16示出了来自大肠埃希杆菌的23S核糖体RNA基因的正常核苷酸序列以及在基因组简化后的相同序列，其中用于阐述目的，所有胞嘧啶用胸腺嘧啶替代。
图17示出了来自大肠埃希杆菌的recA基因的正常核苷酸序列以及基因组简化后的同一序列，其中为了说明的目的，所有胞嘧啶均用胸腺嘧啶替代。
总之，当利用基因组简化的引物扩增时，微生物来源的亚硫酸氢盐处理的DNA无论引物是寡核苷酸还是修饰的核酸例如INA，均提供一个不可越过的检测系统，用于检测样品中的任何类型微生物，无论该样品是来自人的临床样品还是来自环境例如被污染的水的另一个极端。本发明已经例证了较宽范围的不同细菌种以及一个临床相关的病毒。单细胞真核微生物的检测，例如酵母菌酿酒酵母或其亲缘酵母是本方法的一个简单延伸。该方法需要相似的基因组序列源，例如18S或28S核糖体序列，或者如已经示出的对特定种、型别、株或突变或多态特异的蛋白编码序列。
根据本发明的检测系统的实际意义也非常重要。尽管已经利用PCR扩增阐明了本文中详细描述的原理，但是人们可以通过本领域中已知的任何方法理解。随着目前对微阵列检测系统的重视，人们将能够利用基因组简化的DNA检测更广范围的微生物，因为亚硫酸氢盐处理降低了基因组复杂性，从而可以实现用较小量检测子(特征)以在微阵列上检测更多种类的微生物。
例如，如果微阵列被构建为在一次测定中检测250,000种左右的不同微生物，则现在的方法学不能提供足够实用的检测平台，因为其将受到该检测平台物理局限性的制约。然而，利用基因组简化，一个小的微阵列即可检测1000种左右的不同高水平细菌种类。随后，可以利用另一个阵列(该阵列仅包括那些在初次筛查中为阳性的组的样本)来评估这样的检测中的阳性。
本领域中的技术人员应该理解，在不背离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在特殊的具体实施方式中示出的本发明进行多种变化和/或更改。因此，应认为本发明的具体实施方式仅是为了说明而非限制性的。
Claims (61)
1.一种用于获得微生物基因组或微生物核酸的微生物特异核酸的方法，包括：
通过用修饰胞嘧啶的试剂处理所述微生物基因组或微生物核酸以产生所述微生物基因组或微生物核酸的简化形式而降低所述微生物基因组或微生物核酸的复杂性，其中所有由胞嘧啶天然占据的位置均由尿嘧啶或胸腺嘧啶占据；以及
从所述核酸的简化形式获得微生物特异的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，包括在实施所述方法前将微生物RNA转化成DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，包括对微生物RNA实施所述方法以生成简化的RNA分子，然后转化所述简化的RNA以形成简化的DNA分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中胞嘧啶由尿嘧啶取代。
5.根据权利要求1所述的方法，其中胞嘧啶由胸腺嘧啶取代。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物基因组或核酸用一种试剂处理，并扩增试剂处理后的微生物核酸以产生复杂性降低的微生物基因组或微生物核酸，其中所述试剂选自可将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增或信号放大来实施。
9.根据权利要求6或8所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物特异的核酸包括一个或多个对微生物特异的序列。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物基因组或核酸从噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类或原生动物获得。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物基因组或核酸选自蛋白编码核酸、非蛋白编码核酸、原核生物或单细胞真核微生物的核糖体基因区域。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核糖体区域是原核生物中的16S或23S以及单细胞真核微生物中的18S或28S。
14.一种用于获得微生物基因组或微生物核酸的微生物特异核酸的方法，包括：
获得所述微生物基因组或微生物核酸的核酸序列；
通过将所述序列中所有的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶以形成简化核酸序列而降低所述核酸序列的碱基复杂性，所述简化核酸序列仅包括选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的碱基；以及
获得来自所述简化核酸序列的微生物特异的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中微生物特异的核酸序列包括一个或多个对微生物特异的序列。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述微生物基因组或核酸从噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类或原生动物获得。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述微生物基因组或核酸选自蛋白编码核酸、非蛋白编码核酸、原核生物或单细胞真核微生物的核糖体基因区域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核糖体区域是原核生物中的16S或23S以及单细胞真核微生物中的18S或28S。
19.一种用于简化微生物核酸的方法，包括：
用将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂处理来自原核生物或单细胞真核微生物的核糖体基因区域的微生物核酸，形成衍生的微生物核酸；以及
扩增所述衍生微生物核酸以产生所述微生物基因组或核酸的简化形式。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述核糖体基因区域是原核生物中的16S或23S以及单细胞真核微生物中的18S或28S。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述试剂将互补的双链微生物DNA的每条链中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成两个衍生的但非互补的微生物核酸分子。
24.根据权利要求19所述的方法，其中与相应未受处理的微生物核酸相比，所述衍生微生物核酸具有减少的胞嘧啶总数。
25.根据权利要求19所述的方法，其中与相应未受处理的微生物基因组或核酸相比，所述微生物核酸的简化形式具有减少的胞嘧啶总数。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述衍生的微生物核酸含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，而且具有与相应未受处理的微生物核酸基本相同的碱基总数。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述微生物核酸的简化形式由碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)构成。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述微生物核酸的简化形式通过扩增所述衍生的微生物核酸而产生。
29.根据权利要求28所述的方法，其中扩增通过聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增或信号放大而实施。
30.一种用于生产微生物特异的核酸分子的方法，包括：
用将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂处理含有微生物来源的DNA的样品，以形成衍生的微生物核酸；以及
通过扩增所述衍生微生物核酸的至少一部分，从所述衍生的微生物核酸的至少一部分生产简化的核酸分子，所述简化的核酸分子与相应未受处理的微生物核酸相比，具有减少的胞嘧啶总数，其中所述简化的核酸分子包括特异于一种微生物或一种微生物型的核酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述微生物选自噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类或原生动物。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述微生物核酸选自蛋白编码核酸、非蛋白编码核酸、原核生物或单细胞真核微生物的核糖体基因区域。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述核糖体基因区域是原核生物中的16S或23S以及单细胞真核微生物中的18S或28S。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述试剂修饰未甲基化的胞嘧啶。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
37.根据权利要求30所述的方法，其中所述简化的核酸分子通过扩增所述衍生的微生物核酸而产生。
38.根据权利要求37所述的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增或信号放大而实现扩增。
39.根据权利要求30所述的方法进一步包括：
检测所述微生物特异的核酸分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子通过实时PCR进行检测。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子通过微阵列检测系统检测。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子检测如下：
提供能够结合于所述微生物特异核酸分子的靶区域的检测子配基，并允许所述检测子配基以足够时间结合于所述靶区域；以及
测定所述检测子配基与所述靶区域的结合，以检测所述微生物特异的核酸分子的存在情况。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子通过分离扩增产物并使所述扩增产物可视化而检测。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述扩增产物通过电泳分离并通过使在凝胶上的一个或多个谱带可视化而检测。
45.根据权利要求30所述的方法，其中所述简化的核酸分子不含有胞嘧啶。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子在所述微生物中并非天然存在。
47.根据权利要求30所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子含有一个表明所述微生物的分类水平的核酸序列。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述微生物的分类水平包括科、属、种、株、型、或来自相同或不同地理或海底种群的不同种群。
49.一种用于选择微生物特异的核酸分子的方法，包括：
从微生物获得DNA序列；
通过将每一个胞嘧啶变化为胸腺嘧啶来实施所述微生物DNA序列的转换，从而形成所述微生物DNA序列的简化形式，以使所述微生物DNA的简化形式的序列包括碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶；以及
从所述微生物DNA序列的简化形式选择微生物特异的核酸序列。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述转换在生物信息学上实现。
51.根据权利要求49所述的方法，其中获得两个或多个微生物DNA序列的简化形式，并且比较所述两个或多个序列以获得至少一个微生物特异的核酸分子。
52.根据权利要求49所述的方法的应用，用于获得探针或引物，以在测定或分析中结合或扩增所述微生物特异的核酸分子。
53.一种用于检测样品中微生物存在情况的方法，包括：
用将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂处理所述微生物核酸，以形成衍生的微生物核酸；
提供能够允许将期望的微生物特异的核酸分子扩增为所述衍生的微生物核酸的引物；
对所述衍生的微生物核酸实施扩增反应，以形成简化的核酸；以及
测定包含所述期望的微生物特异核酸分子的扩增核酸产物的存在情况，其中，检测到所述期望的微生物特异核酸分子表明存在所述微生物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述微生物选自噬菌体、病毒、类病毒、细菌、真菌、藻类或原生动物。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
57.根据权利要求53所述的方法，其中扩增通过聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增或信号放大而实现。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子通过实时PCR进行检测。
59.根据权利要求53所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子通过微阵列检测系统进行检测。
60.根据权利要求53所述的方法，其中所述微生物特异的核酸分子检测如下：
提供能够结合于所述微生物特异的核酸分子的一个区域的检测子配基，并允许所述检测子配基以足够时间结合于所述区域；以及
测定所述检测子配基与所述核酸分子的结合，以检测所述核酸分子的存在情况。
61.根据权利要求53所述的方法，其中所述核酸分子通过分离扩增产物并使所述分离的产物可视化而检测。
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