CN100489112C - 切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：a)使扩增引物与核酸靶分子杂交；b)用DNA聚合酶合成双链核酸；c)所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口；d)DNA聚合酶以切口为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点；和e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤，以扩增出靶核酸序列。本发明还公开了利用海藻糖提高切口酶反应温度使其能够与热稳定DNA聚合酶配合使用的方法。本发明还公开了用于扩增靶核酸序列的试剂盒及试剂盒在检测传染病病原体中的用途。利用本发明可制成操作简单，低成本，便携式的仪器，从而普及核酸诊断试剂。

Description

切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及核酸序列的扩增方法，更具体地说，涉及利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法，本发明还涉及了用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。

现有技术状况

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的发明和普遍使用在生命科学中引起了一场革命。由于该技术能特异性地扩增DNA(基因)的片段，研究者可以获取足够量的DNA片段用于研究或其他目的。与PCR相关的其他技术和方法的不断发明和发展，使PCR的应用范围远远超出了单纯的DNA扩增，而成为现代分子生物学不可或缺的基本工具之一。

PCR技术的原理是通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤：变性(如95℃)，引物杂交(如58℃)，DNA合成(如72℃)。这种温度变化的循环重复(如重复35次)，通常由精密而复杂的仪器(PCR仪)来控制。

与此不同的是近年来陆续出现的恒温扩增技术。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下(如37℃)，实现核酸(DNA或RNA)的扩增。国际上已有的恒温扩增技术如下：

链置换扩增术(Strand Displacement Amplification，SDA)

核酸序列扩增术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)

转录酶扩增术(Transcription Mediated Amplification，TMA)

滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)

圆环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)

解链酶扩增技术(Helicase Dependant Amplification，HAD)

此外，一些非特异性的全基因组DNA扩增方法目前已经进入商品化阶段。这些核酸扩增术的对象有些是DNA，还有些是RNA。核酸恒温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在同一温度下进行，而不象PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。恒温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的实际应用价值。

恒温扩增核酸诊断试剂在国外已发展多年并应用在传染病诊断中。Becton Dickinson公司的ProbeTech自动诊断仪，是这个领域内最先进的诊断仪器。它是以SDA恒温扩增技术为基础的。该产品是为高通量的专业诊断大公司而设计的自动化仪器。核酸序列扩增术(NASBA)是目前国际上最成熟的RNA恒温扩增技术，在研究领域广泛应用。但由于该技术未能与较好的检测方法相结合，使其至今未能在临床检验领域达到实用的阶段。

与本发明有关的是链置换扩增术(SDA)在US 5270184、US 5712124和US 5648211中披露。

SDA技术基于以下五个步骤：

1)特别设计的扩增引物与DNA靶分子特异性杂交。该引物尾部带有一段特异性核酸内切酶的辨认序列；

2)DNA聚合酶合成DNA新链。硫基修饰过的“dCTP-thio”在合成过程中被引入到新合成的DNA分子中；

3)限制性核酸内切酶辨认特异性DNA序列。由于其中的一股链在合成过程中被修饰，该酶只能在未被修饰的一条链上切开一个缺口，暴露其3’末端；

4)DNA聚合酶以切口的3’末端为起点，合成新链，并将“旧链”剥离。被剥离的单股DNA又可以作为模板，与SDA引物结合，指导新一轮的合成。新合成的双股DNA又恢复了半修饰的核酸内切酶位点，核酸内切酶将在此位点重新切开一个缺口，延长、剥离等步骤又重新开始；

5)上述各反应步骤在恒温的条件下反复、连续地进行。DNA靶分子呈指数扩增，直到原料耗尽或酶活性丧失。在优化的条件下靶分子可被扩增数十亿倍或更高。

关于链置换扩增技术(SDA)的基本原理参见附图1。

然而，采用SDA技术存在一些技术上的缺陷，SDA选用的核酸内切酶在正常情况下会切断DNA双链，从而使扩增反应中断。

为使核酸内切酶只切割一条链，SDA反应中必须使用经过化学修饰的单核苷酸，如硫基dCTP(Thio-dCTP)。而使用化学修饰的单核苷酸常带来以下问题：

1.不能合成较长的DNA片段。由于硫基dCTP不是DNA聚合酶的天然底物，DNA聚合酶易从模板上脱落，从而使合成较长的产物成为不可能。这就大大地限制了SDA技术的应用。

2.反应速度慢。同样由于硫基dCTP不是DNA聚合酶的天然底物，致使DNA合成的速率降低。据估计使用硫基dCTP的合成速度只有使用普通dNTP的三十分之一。

3.成本高。化学修饰的单核苷酸的价格比普通的单核苷酸高许多倍。此外，为克服非天然底物给SDA酶系统(核酸内切酶和DAN聚合酶)带来的困难，SDA反应要求的单核苷酸和酶的浓度大大高于使用普通单核苷酸的DNA合成反应。所有这些都使SDA试剂的价格偏高。

4.反应条件要求严酷。为使使用非天然底物的反应体系有效，反应条件极为重要。SDA反应体系比较复杂，各成份间的比例均需细心优化。稍微偏离最佳条件，扩增的效果即受明显影响。因此该技术在实际应用中受到一定的限制。

发明内容概述

本发明人利用近几年来新发现的切口酶(Nicking Enzyme，限制性核酸内切酶的一种，通过辨认特异DNA序列，在特定位点切断DNA分子双链中的一条链)，经长期研究，发展出一种新的恒温扩增技术：切口酶核酸恒温扩增术(Nicking Enzyme Mediated Amplification，NEMA)。并与其他相关技术结合，开发出能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域的新的恒温扩增技术产品。

一方面，本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

a)使扩增引物与核酸靶分子杂交，其中所述引物的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；

b)用DNA聚合酶合成双链核酸；

c)所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；

d)DNA聚合酶以切口为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点；

e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤，以扩增出靶核酸序列。

更具体地说，本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)使双链核酸靶分子变性，使第一正向引物F1，第二正向引物F2与核酸靶分子负链杂交，其中所述第二正向引物F2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二正向引物F2的浓度应高于第一正向引物F1的浓度；使第一反向引物R1，第二反向引物R2与核酸靶分子正链杂交，其中所述第二反向引物R2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二反向引物R2的浓度应高于第一反向引物R1的浓度；此后负链和正链进行相同的扩增步骤；以下仅以负链为例说明扩增过程；

2)DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

3)DNA聚合酶延长第一正向引物F1，同时剥离第二正向引物F2的延长链(正链)；

4)第一反向引物R1，第二反向引物R2与步骤3)的正链产物4杂交，DNA聚合酶延长引物R2；

5)DNA聚合酶延长第一反向引物R1，同时剥离第二反向引物R2的延长链(负链)，本步骤的产物6为两端固定的负链；本步骤的第一反向引物R1的延长产物12为双链DNA；

6)第二正向引物F2与产物6负链杂交，DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

7)恢复DNA双链结构；在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链，此步骤产生的产物9为正链和负链DNA的混合物；步骤5)的延长产物12经步骤12)-14)产生产物8，重回步骤8)以后的扩增过程；

8)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2；

9)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；

10)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2；和

11)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物10相同，因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应，重复进行切割、延伸和剥离的步骤，形成循环扩增。

另一方面，本发明提供了利用新近发现的切口酶Nb.BbvC I或Nt.BbvC I扩增靶核酸序列的方法。Nb.BbvC I和Nt.BbvC I切口酶的辩认序列为7个碱基对，多于N.BstNB I的5个碱基对和SDA恒温扩增技术中Bso BI的6个碱基对。较多的辩认序列碱基对能更好地排除非特异性反应，从而使切口酶恒温扩增反应更有效，更特异。

另一方面，本发明提供了利用海藻糖(Trehalose)提高切口酶反应温度的方法，使得原本最佳活性温度为37℃的Nb.BbvC I或Nt.BbvC I切口酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性，从而能与最佳活性温度为60-65℃的Bst DNA聚合酶配合使用，高效完成切口酶恒温扩增的反应。

另一方面，本发明提供了利用海藻糖提高DNA聚合酶反应温度的方法，使得原本最佳活性温度为37℃的Klenow DNA聚合酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性，从而能与最佳活性温度为55-60℃的N.Bst NB I切口酶配合使用，高效完成切口酶恒温扩增的反应。

另一方面，本发明提供了利用海藻糖提高DNA聚合酶和切口酶反应温度的方法，这使得原本最佳活性温度为37℃的Klenow聚合酶和Nb.BbvC I或Nt.BbvC I切口酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性，在高温条件下以更高效率完成切口酶恒温扩增的反应。

另一方面，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒，其含有切口酶、DNA聚合酶、引物、海藻糖、dNTP和牛血清白蛋白(BSA)。

另一方面，本发明提供上述试剂盒在检测传染病病原体中的用途。

附图简要说明

本发明的上述各个方面、特征和其它优点将通过如下详细描述并结合附表和附图更清楚地理解，其中：

附图1是关于链置换扩增技术(SDA)的基本原理说明；

附图2是关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理的简单说明

附图3是关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理的详细说明；

附图4是关于实施例1检测结果的说明；

附图5是关于实施例2检测结果的说明；

附图6是关于实施例3检测结果的说明；

附图7是关于实施例4检测结果的说明；和

附图8是关于实施例5检测结果的说明。

有关附图的详细说明参见如下详细描述部分的内容。

发明内容详述

在一项实施方案中，本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

a)使扩增引物与核酸靶分子杂交，其中所述引物的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；

b)用DNA聚合酶合成双链核酸；

c)所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；

d)DNA聚合酶以切口为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点；

e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤，以扩增出靶核酸序列。

关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理如附图2中所示。

更具体地，本发明提供利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)使双链核酸靶分子变性，使第一正向引物F1，第二正向引物F2与核酸靶分子负链杂交，其中所述第二正向引物F2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二正向引物F2的浓度应高于第一正向引物F1的浓度；使第一反向引物R1，第一反向引物R2与核酸靶分子正链杂交，其中所述第二反向引物R2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二反向引物R2的浓度应高于第一反向引物R1的浓度；此后负链和正链进行相同的扩增步骤；以下仅以负链为例说明扩增过程；

2)DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

3)DNA聚合酶延长第一正向引物F1，同时剥离第二正向引物F2的延长链(正链)；

4)第一反向引物R1，第二反向引物R2与步骤3)的正链产物4杂交，DNA聚合酶延长第二反向引物R2；

5)DNA聚合酶延长第一反向引物R1，同时剥离第二反向引物R2的延长链(负链)，本步骤的产物6为两端固定的负链；本步骤的第一反向引物R1的延长产物12为双链DNA；

6)第二正向引物F2与产物6负链杂交，DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

7)恢复DNA双链结构；在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链，此步骤产生的产物9为正链和负链DNA的混合物；步骤5)的延长产物12经步骤12)-14)产生产物8，重回步骤8)以后的扩增过程；

8)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2；

9)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；

10)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2；和

11)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物10相同，因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应，重复进行切割、延伸和剥离的步骤，形成循环扩增。

关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的具体说明参见附图3。

根据本发明的优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述核酸为DNA或RNA。

在一方面，根据本发明的优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvC I、N.BstNB I或Nb.Bsm I以及类似的其他切口酶。根据最新的资料，目前已知的切口酶如表1。

根据本发明的更优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述切口酶为N.BstNB I、Nb.BbvC I或Nt.BbvC I。

另一方面，根据本发明的优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶以及类似的其他聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

另外，根据本发明的更优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvC I、N.BstNB I或Nb.Bsm I，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的最优选实施方案，在利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述切口酶为Nb.BbvC I、Nt.BbvC I或N.BstNB I，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

另一方面，本发明还提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒，其含有切口酶、DNA聚合酶、引物、海藻糖、dNTP和牛血清白蛋白(BSA)。

在一方面，根据本发明的优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvC I、N.BstNB I或Nb.BsmI。

根据本发明的更优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述切口酶为N.BstNB I、Nb.BbvC I或Nt.BbvC I。

另一方面，根据本发明的优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

另外，根据本发明的更优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvC I、N.BstNB I或Nb.Bsm I，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的最优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述切口酶为Nb.BbvC I、Nt.BbvC I或N.BstNB I，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶，所述海藻糖浓度为0.01-2M。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测传染病病原体中的用途。

本发明申请书所使用的技术术语解释：

切口酶：又称切刻内切酶，限制性核酸内切酶的一种。通过辨认特异DNA序列，在特定位点切断DNA分子双链中的一条链。

核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。

核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。

链置换：某些DNA聚合酶具有的生物化学特性，其特点是该酶在合成DNA的过程中，以一条链为模板，合成新链，而将原双链分子中的另一条链剥离。

引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3末端开始。

杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。

探针：探测靶核酸(DNA或RNA)的单链寡核苷酸。通常有可检测的信号分子标记，如半抗原，荧光等。

标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶连的方法。

抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原(Hapten)。半抗原常被用于标记探针。

抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。

复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。

免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。

如上所述，链置换扩增技术(SDA)是近年来开发的恒温扩增技术，，SDA主要基于如下五个步骤：

1)特别设计的扩增引物与DNA靶分子特异性杂交。该引物尾部带有一段特异性核酸内切酶的辨认序列，如BsoBI的辨认序列CACGGG；

2)DNA聚合酶合成DNA新链。硫基修饰过的“dCTP-thio”在合成过程中被引入到新合成的DNA分子中；

3)限制性核酸内切酶辨认特异性DNA序列。由于其中的一股链在合成过程中被修饰，该酶只能在未被修饰的一条链上切开一个缺口，暴露其末端；

4)DNA聚合酶以切口的3’末端为起点，合成新链，并将“旧链”剥离。被剥离的单股DNA又可以作为模板，与SDA引物结合，指导新一轮的合成。新合成的双股DNA又恢复了半修饰的核酸内切酶位点，核酸内切酶将在此位点重新切开一个缺口，延长、剥离等步骤又从新开始；

5)上述各反应步骤在恒温的条件下反复、连续地进行。DNA靶分子呈指数扩增，直到原料耗尽或酶活性丧失。在优化的条件下靶分子可被扩增数十亿倍或更高。

切口酶是近年来发现的一类特异性核酸的内切酶。根据最新的资料，目前已知的切口酶如附表1所示。与常见核酸内切酶相同，切口酶也通过辨认特异的核苷酸序列(如GAGTC)来切割双链DNA的特定位点。不同的是，切口酶并不切断DNA分子的双链，而只切断双链中的一条链。DNA聚合酶以切口的3’末端为起点，以未被切断的单链为模板，合成新链，并将“旧链”剥离。如下所示。

切口酶核酸恒温扩增技术的基本原理(以N.BstNB I切口酶为例)：1)使双链核酸靶分子变性，使第一正向引物F1，第二正向引物F2与核酸靶分子负链杂交，其中所述第二引物F2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二正向引物F2的浓度应高于第一正向引物F1的浓度；使第一反向引物R1，第二反向引物R2与核酸靶分子正链杂交，其中所述第二反向引物R2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二反向引物R2的浓度应高于第一反向引物R1的浓度；此后负链和正链进行相同的扩增步骤；以下仅以负链为例说明扩增过程；

2)DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

3)DNA聚合酶延长第一正向引物F1，同时剥离第二正向引物F2的延长链(正链)；

4)第一反向引物R1，第二反向引物R2与步骤3)的正链产物4杂交，DNA聚合酶延长第二反向引物R2；

5)DNA聚合酶延长第一反向引物R1，同时剥离第二反向引物R2的延长链(负链)，本步骤的产物6为两端固定的负链；本步骤的第一反向R1的延长产物12为双链DNA；

6)第二正向引物F2与产物6负链杂交，DNA聚合酶延长第二正向引物F2；

7)恢复DNA双链结构；在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链，此步骤产生的产物9为正链和负链DNA的混合物；步骤5)的延长产物12经步骤12)-14)产生产物8，重回步骤8)以后的扩增过程；

8)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2；

9)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；

10)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向R2；和

11)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物10相同，因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应，重复进行切割、延伸和剥离的步骤，形成循环扩增。

上述各反应步骤在恒温的条件下反复、连续地进行。DNA靶分子呈指数扩增，直到原料耗尽或酶活性丧失。在优化的条件下靶分子可被扩增数十亿倍或更高。

适用于本发明的恒温扩增核酸序列方法的切口酶如附表1中所示，其中优选的切口酶如下：

酶                       辨认序列

N.Alw I           5’...GGATCNNNNN...3’

                  3’...CCTAGNNNNN...5

Nb.BbvC I         5’...GCTGAGG...3’

                  3’...CGACTCC...5’

Nt.BbvC I         5’...CCTCAGC...3’

                  3’...GGAGTCG...5’

N.BstNB I               5’...GAGTCNNNNN...3’

                        3’...CTCAGNNNNN...5

或

Nb.Bsm I                5’...GAATGCN...3’

                        3’...CTTACGN...5’

其中，优选用于本发明的恒温扩增核酸序列方法的切口酶是Nt.BbvC I，Nb.BbvC I和N.BstNB I。

这些切口酶在商业上可由例如美国的New England Biolabs获得。

用于本发明的恒温扩增核酸序列方法的有剥离功能的DNA聚合酶是BstDNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶等。其中优选的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶。

这些DNA聚合酶在商业上可由例如美国的New England Biolabs获得。

如上所述，SDA选用的核酸内切酶在正常情况下会切断DNA双链，从而使扩增反应中断。为使核酸内切酶只切割一条链，SDA反应中必须使用经过化学修饰的单核苷酸，如硫基dCTP(Thio-dCTP)。使用化学修饰的单核苷酸常带来不能合成较长的DNA片段、反应速度慢、成本高、反应条件要求苛刻等问题。

由于切口酶核酸恒温扩增技术在扩增反应中不使用化学修饰的单核苷酸，以上SDA的缺点均可克服。与SDA技术相比，NEMA技术有以下优点：

1)可以合成长链DNA，扩大恒温扩增技术的应用范围。

2)加快反应速度，缩短反应时间。这对于快速诊断试剂十分重要。反应时间的缩短，使得核酸诊断试剂可前所未有地用于现场诊断，即患者可当场获得临床检验结果，医生可当场决定治疗方案。目前，免疫试剂已能做到现场诊断的快速，而核酸试剂的现场诊断仍未见报道。

3)可大幅度降低成本。目前核酸诊断试剂，特别是萤光定量PCR试剂，价格居高不下。这是核酸试剂难以普及的原因之一。本发明的应用可以大幅度降低核酸试剂的成本，为普及核酸试剂的应用创造条件。

4)切口酶核酸恒温扩增技术对反应条件的要求相对宽松，使得以本发明为基础的产品对操作人员的素质没有特殊的要求，这也为核酸试剂的普及创造了条件。

如上所述，本发明的一个独创性是利用切口酶扩增靶核酸序列。切口酶核酸恒温扩增技术在扩增反应中不使用化学修饰的单核苷酸，使得本发明相对于SDA技术有了进一步发展。

本发明另一个独创性是利用切口酶N.BstNB I，Nb.BbvC I或Nt.BbvC I扩增靶核酸序列。Nb.BbvC I和Nt.BbvC I切口酶的辩认序列均为7个碱基对，多于SDA恒温扩增技术中Bso BI的6个碱基对。较多的辩认序列碱基对能更好地排除非特异性反应，从而使切口酶恒温扩增反应更有效，更特异。这使得本发明相对于SDA技术又更进一步有所发展。

本发明另一个独创性是利用海藻糖提高切口酶反应温度的方法。这使得原本最佳活性温度为37℃的Nb.BbvC I或Nt.BbvC I切口酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性，从而能与最佳活性温度为60℃左右的Bst DNA聚合酶配合使用，高效完成切口酶恒温扩增的反应。海藻糖常出现在应激状态(如热震荡，Heat Shock)下的生物细胞中。海藻糖可能帮助维持生物细胞酶系统在应激状态下的稳定性，使其在高温状态下仍具备活性，甚至更高的活性，以帮助生物细胞更好地应对应激状态。有人曾利用海藻糖提高某些核酸内切酶和逆转录酶(MMLV RT)反应温度，从而在逆转录反应(Reversetranscription)中合成更长的互补DNA(cDNA，如：Piero Carninci等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.95，pp.520-524，1997)。本发明独创性地把海藻糖应用于NEMA，使原本因活性温度不同而不能匹配的切口酶和DNA聚合酶得以匹配，使切口酶恒温扩增技术又更进一步有所发展。所述海藻糖在商业上可由市售获得。

本发明另一个独创性是利用海藻糖提高DNA聚合酶反应温度的方法。这使得原本最佳活性温度为37℃的Klenow聚合酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性，从而能与最佳活性温度为55-60℃左右的N.BstNB I切口酶配合使用，高效完成切口酶恒温扩增的反应。

本发明另一个独创性是利用海藻糖提高DNA聚合酶和切口酶反应温度的方法。这使得原本最佳活性温度为37℃的Klenow聚合酶和Nb.BbvC I或Nt.BbvC I切口酶均可在50-60℃的反应条件下具备高活性，在高温条件下以更高效率完成切口酶恒温扩增的反应。

此外，本发明另一个独创性是将切口酶恒温扩增与核酸薄膜层析(核酸试纸条，参见本发明人的另一项专利，申请号：200610003429.1)结合，共同组成快速核酸诊断试剂盒。与聚合酶链反应(PCR)相比，切口酶核酸恒温扩增试剂盒不需要任何复杂的仪器，只需要一台简单的加热器，如普通的水浴锅或以电或电池为能源的加热器。可制成操作简单，低成本，便携式的仪器。这一重要性质是普及核酸诊断试剂的前提。

总之，将本发明的技术与其它相关技术结合，能提供一套快速、简单、低价、好用的核酸诊断(基因诊断)产品。这些高新技术产品不仅可用于大医院，也可适用于农村，边远地区和基层医院。

随着人类基因组核酸测序的完成，科学家们开始把注意力放在了与人类生存和健康紧密相关的物种上，越来越多的病原体微生物的基因序列测试已由世界各国的科学家完成。病原体微生物基因组核酸序列是诊断传染性疾病的基础。所有这些核酸序列测定都是各国科学家共同努力的结果，是人类共同拥有的资源。我们充分认识到这一资源的价值，发展出新的核酸快速诊断技术平台，利用这一巨大的资源“金矿”，开发出传染病和人类遗传病的临床快速诊断。

目前，体外诊断试剂可分为两大类：蛋白质诊断试剂和PCR核酸诊断试剂。这两类诊断试剂各有其优缺点：蛋白质诊断试剂历史较长，技术成熟，使用简便。阻碍蛋白质层析诊断技术发展主要原因之一是特异性单克隆抗体的制备。单克隆抗体的制备复杂费时，使得蛋白质层析诊断的产品研制周期长，不能很快行成系列产品，难以形成有效的覆盖面。而且其检验的灵敏度和特异性有时不够理想。核酸诊断试剂代表着体外诊断试剂的发展方向，具有灵敏度高、特异性好的特点。PCR诊断试剂已在国内外得到广泛的应用，尤其在美国，核酸诊断试剂已获得快速发展。但以PCR为基础的核酸诊断试剂，由于PCR技术本身的缺陷，如复杂、费时、前期投入费用大(需要设立几个隔离区)，易受实验室污染而假阳性率高等因素的限制，使得该技术未能普及到条件较差的基层医院。尽管目前核酸诊断试剂因其自身的某些限制，在市场份额上未能与蛋白质类诊断试剂相匹敌，但其潜力不容忽视。

以免疫反应为基础的酶联试剂已发展得相当成熟，并已有相当规模的市场，此类产品以其简易、可靠，已经进入了各医院的检验科甚至普通人的家庭，给人们诊断疾病带来了许多方便之处，但其产品研制周期长，和检验的灵敏度和特异性有时不够理想，限制了免疫检测的发展。

目前已有越来越多的公司致力于遗传病、传染病等的临床诊断试剂的研发，如开发性病相关的PCR-ELISA诊断试剂盒。但是一般采用的是常规PCR扩增双链病原体DNA，扩增产物必须经过变性，才能进行后续的杂交反应，而且操作时间较长。本发明人经过长期的研究，将恒温扩增-核酸杂交-核酸免疫层析(纤维膜试纸条)技术结为一体，并采用双探针杂交保证了检测的高特异性。这些技术平台组成的系列产品将以其快速，新颖，实用，低成本，高质量等特点而具有广阔前景。

恒温扩增-试纸条核酸诊断技术的应用对人类疾病的诊断将会带来一次新的技术革命。该产品将综合多项高新技术，但在用户手中则简单易行。产品可以推广到乡镇级医院，卫生院和诊所。在不远的将来甚至可以进入普通家庭。这对传染性疾病的早期发现和控制具有很大的意义。更为重要的是可成为我国战略性技术手段储备，在将来发生突发公共卫生事件时，可以迅速找到病原体，掌握主动权。该产品还可以广泛用于遗传性疾病，血缘鉴定，法医学，食品卫生以及农牧业等方面。

实施例

如下实施例仅用来举例说明本发明的技术方案，并不构成对本发明范围的任何限制。本发明的范围由所附的权利要求书说明。

实施例1：以Bst DNA聚合酶，N.BstNB I切口酶和PUC19质粒为模板 的简单NEMA反应系统

本实施例是一个不含有干扰因素的简单反应系统。它以PUC19质粒为模板，排除了生物样本中可能带来的复杂生物化学环境。本实施例用于对本发明基本构想的初步验证。酶体系为N.BstNB I切口酶和Bst DNA聚合酶。扩增产物以琼脂糖凝胶电泳为确认手段。

反应条件：

N，N-氮羟乙基二苷酸                   1摩尔/5微升

氯化钾                                300毫摩/5微升

磷酸缓冲液PH 7.6                      680毫摩/5微升

甘油                                  60％/8.75微升

二甲基亚砜(DMSO)                      3.25微升

dNTP(A，C，G，T)                      2毫摩/2.5微升

人的DNA                               1400纳克/微升，2.5微升

牛血清蛋白                            2000纳克/微升，2.5微升

醋酸镁                                80毫摩/2.5微升

PUC19质粒                              4纳克/微升，1微升

引物Mix(2对)                           5微摩/0.5微摩，5微升

Bst DNA聚合酶                          0.5微升

切口酶N.BstNB I                        0.5微升

超纯水                                 7.0微升

总量50微升

54℃，30分钟

扩增物经百分之2.5的琼脂糖凝胶电泳，EB染色拍摄。

实施例1的检测结果示于附图4中。

从附图4的结果可以看出，扩增产物随切口酶和DNA聚合酶的比例而有变化。其中全长扩增物为未经切割的产物，半长扩增物为经一次切割的产物，短扩增物为经两次切割的产物，如图所示。

实施例2：以BstDNA聚合酶，N.BstNBI切口酶和淋球菌克隆DNA为模板 的NEMA反应。

扩增产物以核酸薄膜层析(核酸试纸条，参见本发明人的另一项专利，申请号：200610003429.1)为确认手段。酶体系为N.BstNB I切口酶和Bst DNA聚合酶。本实施例进一步用本发明的方法扩增特异性的DNA序列(克隆的淋球菌DNA质粒)。扩增时间分别为30分，45分和60分钟。

反应条件：

管1：

反应缓冲液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，pH7.9＠250C)

                                             1微升

两对引物P1，2/S1，25微摩/0.5微摩/            2微升

超纯水                                       5微升

模板淋球菌质粒(1千拷贝/微升)                 2微升

--------------------------------------------------------

                                             10微升

95℃，5分钟变性，然后自然冷却至室温

管2：

反应缓冲液10×(1000mM NaCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，pH7.9＠25℃)

                                        1微升

dNTP  2毫摩                             2微升

牛血清蛋白  100纳克/微升                2微升

切口酶N.BstNB I  10个单位/微升          0.5微升

Bst DNA聚合酶8个单位/微升               0.25微升

超纯水                                  4.25微升

---------------------------------------------------------

                                        10微升

管1加上相应的管2混匀，在54℃金属浴放置1小时

取其中5微升加上带生物素和荧光素标记的探针，95℃，5分钟变性，然后自然冷却至室温后检测板检测。

实施例2的检测结果示于附图5中。

在附图5中，质控线为试纸条的质量检验线，无论阳性或阴性均应出现。检测线为实际检测线，其出现与否及强度由样本病原体拷贝数决定。以下各图均同此。

图5的结果显示，在样本拷贝数较低的情况下，60分钟扩增效果较好。本实施例的成功使本发明更进一步接近实用。

实施例3：以Bst DNA聚合酶，Nb.BbvC I切口酶和处理后的淋球菌为 模板的NEMA反应。

扩增产物以核酸薄膜层析为确认手段。酶体系分别为Nb.BbvC I，BstDNA聚合酶或Nt.BbvC I切口酶，Bst DNA聚合酶。在本实施例反应体系中引入海藻糖，以提升Nb.BbvC I和Nt.BbvC I切口酶的反应温度。本实施例是对传染病病原体的直接检测。该反应系统以培养的淋球菌作为检测对象，用于验证本发明恒温扩增技术的特异性和灵敏性。

反应条件：

N，N-氮羟乙基二苷酸                    1摩尔/5微升

氯化钾                                 300毫摩/5微升

磷酸缓冲液PH7.6                        680毫摩/5微升

二甲基亚砜(DMSO)                       3.25微升

海藻糖                              2摩尔/7微升

dNTP(A，C，G，T)                    2毫摩/2.5微升

人的DNA                             1400纳克/微升，2.5微升

牛血清蛋白                          2000纳克/微升，2.5微升

醋酸镁                              80毫摩/2.5微升

裂解淋球菌                          2000/1微升，2微升

淋球菌特异性引物Mix(2对)            2微摩/0.2微摩，5微升

淋球菌特异性探针(2条)               0.1微摩/5微升

Bst DNA聚合酶                       8个单位/微升，0.25微升

切口酶Nb.BbvC I                     10个单位/微升，0.5微升

超纯水                              2微升

总量50微升

59℃，30分钟，然后95℃，2分钟。

将扩增物自然冷却至室温后直接滴于检测板检测。

实施例3的检测结果示于附图6中。其中，图6-1是酶浓度优化，即切口酶和DNA聚合酶的用量及比例；图6-2是反应时间对扩增效率的影响；图6-3是反应温度对扩增效率的影响；图6-4是正反向引物比例对扩增效率的影响；在附图6-5中，海藻糖浓度的变化对扩增效率的影响。

用Nt.Bbv CI切口酶的反应体系与上述相同，结果相似。

从图6的结果可以看出：

1.优化的酶浓度为2单位Nt.BbvC I切口酶，1单位Bst DNA聚合酶。

2.扩增时间为15分，30分，45分和60分钟。优化的时间为45分。

3.优化的温度为60摄氏度。

4.Nb.BbvC I切口酶扩增体系。优化的引物比例为1：1。

5.Nb.BbvC I切口酶扩增体系。优化的海藻糖浓度为0.5摩尔。

实施例4：以Klenow DNA聚合酶，Nt.BbvC I切口酶和处理后的淋球 菌为模板的NEMA反应。

裂解淋球菌(4000个)：                                       2微升

淋球菌特异性引物Mix(2对，5微摩/0.5微摩)                    1微升

10倍缓冲液                                                 2微升

(100mM Tris-HCL，10mM DTT，50mM MgCl₂，500mM NaCl，pH7.9＠25℃)

淋球菌特异性探针(2条，各0.2微摩)                     2微升

7微升，95℃，5分钟

2.取出后室温自然冷却，加入：

3.95℃变性5分钟，取10微升产物试纸条检测。

实施例4的检测结果示于附图7中。

从附图7的结果可以看出，4000个淋球菌在本实施例的反应体系中可获得较强的阳性线条显示。

实施例5：本发明用于扩增RNA样本

本实施例将本发明用于扩增李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspotvirus)RNA。李坏死环斑病毒是一种植物RNA病毒，是国家海关检疫严格控制的二类植物病毒。

我们用从商业途径获得的逆转录酶试剂盒将病毒RNA转化为cDNA(方法按产家提供的说明书)，然后以与实施例3相同的操作和实验条件将cDNA扩增并检测。

实施例5说明如将本发明与商业途径容易获得的逆转录酶试剂相结合，可以扩增和检测RNA病原体。

实施例5的检测结果示于附图8中。从附图8的结果可以看出，阳性样本所得结果为阳性，阴性样本所得结果为阴性。

附表1：已知的切口酶

(辨认序列未定：---，任何单核苷酸：N)

酶                            辨认序列

1.Nt.AlwI                   　GGATCNNNN-

2.V.ApeKI                     ---

3.V.AspEBORF6339P             ---

4.Nb.BbvCI                    CCTCAGC

5.Nt.BbvCI                    CCTCAGC

6.V.BchI                      ---

7.V.BfrORF3681P               ---

8.Nt.BhaIIIP                  GAGTCNNNN-

9.Nb.Bpu10I                   CCTNAGC(-/-2)

10.Nt.Bpu10IB                 CCTNAGC-

11.Nb.BsaI                    GGTCTC-

12.Nt.BsaI                    GGTCTCN-

13.Nb.BsmI                    GAATGC(-/-1)-

14.Nb.BsmAI                   GTCTC-

15.Nt.BsmAI                   GTCTCN-

16.Nt.BsmBI                   CGTCTCN--

17.Nt.BspD6I                  GAGTCNNNN-

18.V.BssHIII                  ---

19.Nt.Bst9I                   GAGTCNNNN

20.Nb.BstNBIP                 GAGTC-

21.Nt.BstNBI                  GAGTCNNNN

22.Nt.BstSEI                  GAGTCNNNN-

23.V.BsuRI                    ---

24.V.CauJORFC117P             ---

25.V.CcrMORF3626P             ---

26.Nt.CviARORFMP              CCD-

27.Nt.CviPII                  CCD-

28.Nt.CviQXI                  RAG--

29.V.DvuORF2842P              ---

30.V.EcoCFTDcmP               ---

31.V.EcoKDcm                  ---

32.V.EcoKO157DcmP             ---

33.V.EcoO157DcmP              ---

34.V.EsaSS12P                 ---

35.V.EsaSS13P                 ---

36.V.EsaSS20P                 ---

37.V.EsaSS192P                ---

38.Nt.EsaSS1198P              GASTC--

39.V.EsaSS1346P               ---

40.V.EsaSS1353P             ---

41.V.EsaSS1810P             ---

42.V.EsaSS1815P             ---

43.V.EsaSS1816P             ---

44.V.EsaSS1921P             ---

45.V.EsaSS2016P             ---

46.V.FacORFC156P            ---

47.V.HpaII                  ---

48.V.IloORF2528P            ---

49.V.Kpn19097ORFFP          ---

50.V.LpnFORF1078P           ---

51.V.LpnLORF145P            ---

52.V.LpnPORF1236P           ---

53.V.McaTORF1616P           ---

54.Nt.MlI                   GAGTCNNNNN-

55.V.MmaGORF278P            ---

56.V.MmaMORFC170P           ---

57.V.MthHORF495P            ---

58.V.MthTI                  ---

59.V.NaeI                   ---

60.V.NfaORF2340P            ---

61.V.NgoAORF302P            ---

62.V.NgoAORF1175P           ---

63.V.NlaL17ORFAP            ---

64.V.NmeAIP                 ---

65.V.NmeDIP                 ---

66.V.NpoORFAP               ---

67.V.OihORF3341P            ---

68.V.PaeIMORF3201P          ---

69.V.PluTDcmP               ---

70.V.PsuNI                  ---

71.V.RpaORF349P             ---

72.V.RshORFC282P            ---

73.V.RsoORF3438P            ---

74.Nb.SapI                  GCTCTTC-

75.Nt.SapI                  GCTCTTC-

76.V.SenCOF1995P            ---

77.V.Sfl2DcmP               ---

78.V.SflTDcmP               ---

79.V.SmeORF3763P            ---

80.V.SptAORF878P            ---

81.V.Sso46DcmP              ---

82.V.StCDcmP                ---

83.V.StLT2DcmP              ---

84.V.StTDcmP                ---

85.V.TdeDORF1810P              ---

86.V.TspRI                     ---

87.V.XorII                     ---

88.V.XorKORF607P               ---

Claims (8)

1、利用切口酶扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)使双链核酸靶分子变性，使第一正向引物(F1)，第二正向引物(F2)与核酸靶分子负链杂交，其中所述第二正向引物(F2)的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二正向引物(F2)的浓度应高于第一正向引物(F1)的浓度；使第一反向引物(R1)，第二反向引物(R2)与核酸靶分子正链杂交，其中所述第二反向引物(R2)的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列；其中所述第二反向引物(R2)的浓度应高于第一反向引物(R1)的浓度；此后负链和正链进行相同的扩增步骤；

2)DNA聚合酶延长第二正向引物(F2)；

3)DNA聚合酶延长第一正向引物(F1)，同时剥离第二正向引物(F2)的延长链；

4)第一反向引物(R1)，第二反向引物(R2)与步骤3)的正链产物(4)杂交，DNA聚合酶延长第二反向引物(R2)；

5)DNA聚合酶延长第一反向引物(R1)，同时剥离第二反向引物(R2)的延长链，本步骤的产物(6)为两端固定的负链；本步骤的第一反向引物(R1)的延长产物(12)为双链DNA；

6)第二正向引物(F2)与产物(6)负链杂交，DNA聚合酶延长第二正向引物(F2)；

7)恢复DNA双链结构；在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链，此步骤产生的产物(9)为正链和负链DNA的混合物；步骤5)的延长产物(12)经步骤12)-14)产生产物(8)，重回步骤8)以后的扩增过程；

8)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物(F2)和第二反向引物(R2)；

9)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；

10)引物杂交，DNA聚合酶分别延长第二正向引物(F2)和第第二反向引物(R2)；和

11)恢复DNA双链结构；重建内切酶辩认位点；所述切口酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口，暴露其3’末端；DNA聚合酶从切口处合成DNA新链，同时剥离旧链；此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物(10)相同，因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应，重复进行切割、延伸和剥离的步骤，形成循环扩增。

2、根据权利要求1的方法，其中所述核酸为DNA或RNA。

3、根据权利要求1的方法，其中所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvCI、N.BstNB I或Nb.Bsm I。

4、根据权利要求3的方法，其中所述切口酶为Nb.BbvC I、Nt.BbvC I或N.BstNB I。

5、根据权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶选自N.Bst DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

6、根据权利要求5的方法，其中所述DNA聚合酶为N.Bst DNA聚合酶或KlenowDNA聚合酶。

7、根据权利要求1的方法，其中所述切口酶选自N.AlwI、Nb.BbvC I、Nt.BbvCI、N.BstNB I或Nb.Bsm I，所述DNA聚合酶选自N.Bst DNA聚合酶、KlenowDNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

8、根据权利要求7的方法，其中所述切口酶为Nb.BbvC I、Nt.BbvC I或N.BstNB I，所述DNA聚合酶为N.Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

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