CN109925501A - 一种用于改善皮肤屏障的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于改善皮肤屏障的组合物，所述组合物包含二十二碳六烯酸和蛋白质。

Description

一种用于改善皮肤屏障的组合物

技术领域

本发明涉及一种包含二十二碳六烯酸和蛋白质的组合物，该组合物可提高丝聚蛋白的表达，从而改善皮肤屏障。

背景技术

特应性皮炎是一种由上皮皮肤屏障和角质分化异常所导致的慢性皮肤炎症。丝聚蛋白作为皮肤屏障的重要蛋白，如若其在皮肤中若表达不足，则会导致皮肤疾病的发生，尤其是特异性皮炎。

角质形成细胞是上皮的主要细胞，角质层是角质形成细胞分化的最后阶段，是防止外界物质进入人体和体内水分丢失的主要屏障。在其分化过程中可表达丝聚蛋白(FLG)、兜甲蛋白(LOR)、内披蛋白(IVL)等，这些蛋白相交叉连接形成角质化包膜，在维持细胞皮肤上皮屏屏障中发挥着重要作用。

丝聚合蛋白又称为微丝凝聚蛋白，是一种广泛存在于皮肤表皮的碱性蛋白质。主要功能是与角蛋白中间丝相互作用，协同角蛋白的聚集，从而起到维护皮肤的屏障的功能。近几年来，随着对丝聚合蛋白基因(FLG)的研究的不断深入，越来越多的证据显示，该基因的突变与多种皮肤疾病的发生相关。明确FLG基因与其相关疾病的关系，不仅能够加深对该疾病的认识，而且还可以从基因水平改变FLG基因的表达来改善皮肤的屏障功能。

脂肪酸作为PPAR激动剂的一种，能够刺激细胞脂质的代谢，丝聚蛋白作为一种能被PPAR激动剂所激活并表达上调蛋白的同时对肌肤屏障的完整性、皮肤pH调节、UV抵抗能力和特应性皮炎发病起着举足轻重的作用。据文献报道，丝聚蛋白(FLG)蛋白表达异常引起皮肤屏障功能的破坏可能是引起婴儿皮肤病发病机制之一，脂肪酸可以从基因水平上促进屏障蛋白的表达，从而可能在改善异常的皮肤屏障功能中发挥着重要的作用。Martina S的研究显示在没有炎症的情况下FLG的损失足以改变与特应性皮炎发病机理相关的蛋白的表达水平。这些包括调节炎症，蛋白水解和细胞骨架功能的蛋白质。

现有技术报道了二十二碳六烯酸能提升FLG表达。但是二十二碳六烯酸作为活性成分单独使用时被证实在细胞毒性试验中的耐受性较差。

发明内容

本申请的发明人意外发现蛋白质能够与二十二碳六烯酸协同增效，从而提高细胞丝聚蛋白的表达。因此，发明人研发出一种包含二十二碳六烯酸和蛋白质的组合物，并证实该组合物在细胞毒性试验中相对于单独使用二十二碳六烯酸具有更好的耐受性。同时，所述包含二十二碳六烯酸和蛋白质的组合物与单独使用二十二碳六烯酸作为活性成分相比较，能够在较大程度地提升细胞丝聚蛋白的表达、提高安全性的同时，进一步提升二十二碳六烯酸在细胞丝聚蛋白表达中的效率，从而改善皮肤屏障。

贻贝粘蛋白是一种海洋贻贝的分泌足丝，也称为贻贝足丝蛋白，是海洋贝类紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝等分泌的一种特殊的蛋白质，具有高强度、高韧性和高防水性。虽然贻贝粘蛋白具有以上性能，但其产品应用领域非常有限，目前主要以贻贝粘蛋白溶液或冻干粉制剂应用于微观的细胞粘附和组织粘合剂。

本发明中使用的贻贝粘蛋白为其提取物形式，直接购自贝瑞森公司。

因此，一方面，本发明提供一种用于改善皮肤屏障的组合物，所述组合物包含二十二碳六烯酸和蛋白质作为活性成分。

根据一个优选的实施方式，所述二十二碳六烯酸的含量为0.0001％至10％(W/V)，优选0.0001％至5％(W/V)，更优选0.0001％至1％(W/V)，甚至更优选0.0001％至0.1％(W/V)，最优选0.005％至0.05％(W/V)，和其中所述蛋白质的含量为0.1％-20％(W/V)。

根据一个优选的实施方式，所述二十二碳六烯酸的含量为10μM-100μM。

根据一个优选的实施方式，所述蛋白质选自贻贝粘蛋白、贻贝粘蛋白提取物或白蛋白。所述贻贝粘蛋白提取物包含贻贝粘蛋白水解多肽和其他水解产物。

根据最优选的实施方式，本发明用于改善皮肤屏障的组合物包含二十二碳六烯酸和贻贝粘蛋白水解多肽作为活性成分。

根据一个优选的实施方式，将所述二十二碳六烯酸皂化。本发明所述的皂化反应是指二十二碳六烯酸和碱反应，生成二十二碳六烯酸盐的反应。所述皂化通过将二十二碳六烯酸与皂化剂进行。常规的皂化剂为强碱，包括KOH和NaOH。优选的皂化剂为NaOH。当二十二碳六烯酸与氢氧化钠进行皂化反应后，二十二碳六烯酸相应地生成二十二碳六烯酸的钠盐。

在本发明中，二十二碳六烯酸和蛋白质均作为活性成分用于提高细胞丝聚蛋白的表达，从而改善皮肤屏障。本发明组合物可根据不同需要制备成不同剂型，优选皮肤外用制剂，包括液体剂、凝胶剂、乳剂、霜剂、泡沫剂、贴剂等。然而，本领域技术人员理解，本发明所述组合物可以根据组合物的各种剂型添加各种所需添加剂，包括但不限于保湿剂、乳化剂、抗氧化剂和pH调节剂等。在本发明中，所述保湿剂可以选自甘油、水解透明质酸钠或透明质酸钠、聚乙二醇等；所述乳化剂可以选自PEG-40氢化蓖麻油；所述抗氧化剂可以选自生育酚、谷胱甘肽等；所述pH调节剂可以选自柠檬酸钠或柠檬酸。本发明组合物还可以根据组合物的各种剂型添加各种所需的赋形剂。例如，当本发明组合物制备成液体剂时，所述赋形剂可以选自水、生理盐水等；当本发明组合物制备成凝胶剂时，所述赋形剂可以选自纤维素衍生物、淀粉、明胶、琼脂、多糖等；当本发明组合物制备成霜剂时，所述赋形剂可以选自甘油、凡士林、石蜡等；当本发明组合物制备成泡沫剂时，所述赋形剂可以选自羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚磺酸钠等；当本发明组合物制备成贴剂时，所述赋形剂可以选自纤维素衍生物、淀粉、明胶、琼脂、多糖等。

本发明的用于改善皮肤屏障的组合物以及各种剂型可根据本领域技术人员已知的常规方法进行制备。

另一方面，本发明提供用于改善皮肤屏障的组合物在制备用于治疗特应性皮炎的药物中的用途。

出乎意料地，发明人意外发现蛋白质尤其是贻贝粘蛋白提取物能够与二十二碳六烯酸协同增效，从而提高细胞丝聚蛋白的表达，改善皮肤屏障，从而治疗特应性皮炎。

本发明用于改善皮肤屏障的组合物的优点在于：

1.在细胞毒性试验中相对于单独使用二十二碳六烯酸具有较好的耐受性；

2.与单独使用二十二碳六烯酸作为活性成分相比较，所述组合物能够在较大程度地提升细胞丝聚蛋白的表达并提高安全性；

3.所述蛋白质与二十二碳六烯酸协同增效，进一步提升二十二碳六烯酸在细胞丝聚蛋白表达中的效率。

附图说明

图1表示空白对照、二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”对单层细胞FLG基因荧光定量PCR结果的影响。

图2表示空白对照、二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”对2D细胞免疫荧光结果的影响。

图3表示空白对照、二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”的2D细胞荧光表达强度。

图4表示对照组合物A、现有技术组合物B和C、本发明组合物D和E的3D细胞涂抹结果。

图5表示对照组合物A、现有技术组合物B和C、本发明组合物D和E的3D皮肤模型的荧光表达强度。

图6表示添加不同浓度的二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”的细胞活力值。

具体实施方式

实施例1：二十二碳六烯酸+无血清牛白蛋白

在100ml磷酸盐缓冲液中配制20g 20％无血清牛白蛋白，以2000xg、4℃离心、15分钟充分溶解后，加入10μM二十二碳六烯酸，65℃水浴混匀30分钟，0.22μm膜过滤后分装入1.5ml无菌离心管备用。

实施例2：二十二碳六烯酸+贻贝粘蛋白提取物

在100ml磷酸盐缓冲液中配制20g 20％贻贝粘蛋白提取物，以2000xg、4℃离心、15分钟充分溶解后，加入10μM的二十二碳六烯酸，65℃水浴混匀30分钟，0.22μm膜过滤后分装入1.5ml无菌离心管，此混合物称为“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”。

实施例3：二十二碳六烯酸-Na的制备

取二十二碳六烯酸配置成200μM的DMSO溶液1mL，同时配置200uM的NaOH溶液1mL，将两溶液以1：1比例进行混合，在65℃、500RPM条件下混合，直至透明澄清后，冷却至室温，0.22μM膜过滤后分装入1.5mL无菌离心管，即获得二十二碳六烯酸-Na。

实施例4：二十二碳六烯酸+NaOH+贻贝粘蛋白提取物

在100ml磷酸盐缓冲液中配制20g 20％贻贝粘蛋白提取物，以2000xg、4℃离心、15分钟充分溶解后，加入10μM的二十二碳六烯酸与等摩尔体积的NaOH混合水溶液，65℃水浴混匀至溶液澄清，0.22μm膜过滤后分装入1.5ml无菌离心管，此混合物称为“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”。

实施例5：根据下表1中所示的组成(表中数据单位均为％(W/V))制备对照组合物A、现有技术组合物B和C以及本发明组合物D和E。

表1

组合物A-E的制备方法具体如下：

在调制釜中加水，加热至80℃保温。将99.5％甘油和透明质酸钠在干燥的不锈钢桶中预分散，再投入调制釜中，以30rmp搅拌30分钟使其充分溶解，期间将温度保持在75-80℃。将二十二碳六烯酸或二十二碳六烯酸-Na盐与PEG-40氢化蓖麻油和生育酚在干燥的不锈钢桶中预溶解，再投入降温至40℃以下的调制釜中，以30rmp搅拌10分钟使其溶解均匀。然后将贻贝粘蛋白提取物加入调制釜，搅拌10分钟使其溶解均匀。然后取样，在25℃下测pH＝5.5±0.50，加入柠檬酸钠和柠檬酸，0.2μm膜过滤后出料灌装。

实施例6：单层细胞基因表达试验

将空白对照、二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”与Eplife培养基(含HKGS和1.5mM氯化钙)混合后培养24小时后，用Trizol进行总RNA的提取，用RT-qPCR检测FLG的基因表达变化。具体方法：6孔板中细胞每个加1ml的Trizol试剂，反复吹打，转移至无杂核酸和核酸酶的1.5ml的ep管中，加入200μl的氯仿，涡旋1min，静置1-2min，12000g，4℃，离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的异丙醇。涡旋，12000g，4℃，10min，小心的抽掉上清，加入1ml的75％DEPC乙醇，9000g，4℃，离心5min，小心的抽掉乙醇，加入50μl的无酶水，用Qubit 3.0进行RNA定量调整浓度后，使用反转录试剂与poly(A)引物反转录为cDNA。根据实际要求，将cDNA浓度调整至25ng·μl^-1，取50ng混合所需引物，并进行荧光定量PCR。以GAPDH作为内参基因进行矫正加样误差，计算FLG mRNA的表达量(具体方法请参见Roche的FastStart Essential DNA Green Master，第6版，其可从罗氏诊断的官方网站下载获得)。

表2.用于实时荧光定量PCR的cDNA引物设计

结果见附图1。在单层细胞的荧光定量PCR的实验中，与空白对照组相比，25μM二十二碳六烯酸的施用能够将FLG基因表达提升1.78倍，并且当二十二碳六烯酸与贻贝粘蛋白混合施用后，提升效果得到进一步增强，约有2.66倍的提升。

当二十二碳六烯酸与氢氧化钠进行皂化反应后，100μM的施用剂量下能够提升FLG表达2.45倍，当施用皂化后二十二碳六烯酸的钠盐和贻贝粘蛋白组合后，表达提升亦进一步增加至2.7倍(实验用引物序列如表2所述，以GAPDH为内参进行均一化处理)。综上结果所述，与贻贝粘蛋白的联合使用能够提升二十二碳六烯酸在FLG的基因表达效率增加25％-88％。

实施例7：2D细胞免疫荧光结果

使细胞在玻璃盖玻片上生长，室温下，在4％多聚甲醛(溶于PBS中，pH 7.4)中孵育细胞10分钟。用冰PBS洗涤细胞3次。用PBS(含0.25％Triton X-100)孵育样品10分钟。Triton X-100是用于提高抗体渗透性最常用的去垢剂。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。用1％BSA、22.52mg/mL甘氨酸的PBST(PBS+0.1％Tween20)孵育细胞30分钟，封闭抗体的非特异性结合。室温下，用稀释抗体兔抗丝聚蛋白1:500稀释(溶于1％BSA的PBST中)在湿盒中孵育细胞1小时。倒出溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。室温下，用二抗山羊抗兔igG 1:5000稀释(溶于1％BSA中)避光孵育细胞1小时。倒出二抗溶液，用PBS避光洗涤细胞3次，每次5分钟。在显微镜下观察绿色荧光强度。并使用imagej进行分析。

附图2显示了2D细胞免疫荧光结果。结果表明：与空白对照组相比，二十二碳六烯酸的施用能够将FLG蛋白荧光表达提升了2.58％，并且当二十二碳六烯酸与贻贝粘蛋白混合施用后，提升效果得到进一步增强，约有30.44％的提升。

当二十二碳六烯酸与氢氧化钠进行皂化反应后，FLG蛋白荧光表达提升22.65％，当施用皂化后二十二碳六烯酸的钠盐和贻贝粘蛋白组合后，表达提升47.26％。综上结果所述，与贻贝粘蛋白的联合使用能够使二十二碳六烯酸在FLG的蛋白荧光表达效率增加24.61％-27.86％(荧光实验以DAPI染色为内参进行均一化处理)。

实施例8：3D组织免疫荧光

实验分组和处理条件进行分组并标记，每组12个模型。样品组采用表面给药的方式进行处理，给药体积为25μL/模型。阳性对照组采取液下给药，将提前配制好的Wy14643母液加入培养液，混匀，最终浓度为50μM。处理好的所有6孔板置于37℃，5％CO2，相对湿度95％的培养箱中，孵育24h。孵育24h后，从培养箱中取出6孔板，采用无菌PBS清洗不同实验组皮肤模型。每个模型清洗时间控制在1min左右，从而保证每个模型接触PBS的时间都相同。清洗15次以后，用无菌棉签轻轻吸去模型内外水分，后放置6孔板中。

免疫荧光检测：

(1)脱蜡水化：将石蜡切片置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。PBS缓冲液清洗3次，每次5min；

(2)抗原修复：将石蜡切片放入0.01M柠檬酸钠抗原修复溶液，采用高压修复，冷却后取出切片。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次；

(3)血清封闭：滴加与二抗同源的血清封闭液，37℃封闭60min，无需冲洗；

(4)一抗孵育：滴加一抗工作液(用封闭液配制)，4℃孵育过夜。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。

(5)二抗孵育：滴加二抗工作液，37℃孵育1h。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。

(6)衬染：滴加100μL稀释后的细胞核衬染液Hoechst 33342，室温孵育5min。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。

(7)封片：滴加一滴抗荧光淬灭剂，封片。

(8)拍照：室温保存，24h内使用荧光显微镜拍照并处理。

图4表示对照组合物A、现有技术组合物B和C、本发明组合物D和E的3D细胞涂抹结果，以及图5表示对照组合物A、现有技术组合物B和C、本发明组合物D和E的3D皮肤模型的荧光表达强度。

结果表明：添加二十二碳六烯酸后的组合物B、C、D和E均比对照组合物A在FLG表达上有所提升，高剂量二十二碳六烯酸组合物C较之低剂量二十二碳六烯酸组合物B有着更明显的FLG促进作用，当添加贻贝粘蛋白提取物后(组合物D和E)，促进作用再次加强(上层为FLG，下层为细胞核染色)。

因此，二十二碳六烯酸能提升人角质形成细胞中的FLG表达含量，二十二碳六烯酸或二十二碳六烯酸-Na与贻贝粘蛋白提取物的组合能增强二十二碳六烯酸类提升细胞FLGmRNA的表达。

在所有组合物中，当二十二碳六烯酸-Na与贻贝粘蛋白水解多肽组合后表达提升效果最大。同时，与贻贝粘蛋白的联合使用能够将二十二碳六烯酸在组合物中的3D细胞模型FLG蛋白荧光表达效率提高21.17％。

实施例9：细胞毒性试验

用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μl。同一般培养条件，次日加入不同浓度的二十二碳六烯酸、混合物“二十二碳六烯酸-贻贝粘蛋白提取物”、二十二碳六烯酸-Na和混合物“二十二碳六烯酸-Na-贻贝粘蛋白提取物”培养24小时。培养24小时后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20μl。继续孵育4h，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以样品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线并计算半数抑制率浓度。结果表明：在相同使用相同计量的情况下，二十二碳六烯酸-Na盐与贻贝粘蛋白的混合物细胞活力要优于二十二碳六烯酸-Na的单独使用，同时二十二碳六烯酸-Na优于二十二碳六烯酸。同时在25μM至100μM投用浓度下，贻贝粘蛋白的使用能使细胞活力实验中的细胞毒性减小约10％。

Claims (13)

1.一种用于改善皮肤屏障的组合物，所述组合物包含二十二碳六烯酸和蛋白质。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二十二碳六烯酸的含量为0.0001％至10％(W/V)，和其中所述蛋白质的含量为0.1％至20％(W/V)。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述二十二碳六烯酸的含量为0.0001％至5％(W/V)。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述二十二碳六烯酸的含量为0.0001％至1％(W/V)。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述二十二碳六烯酸的含量为0.0001％至0.1％(W/V)。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述蛋白质选自贻贝粘蛋白、贻贝粘蛋白提取物或白蛋白。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述贻贝粘蛋白提取物包含贻贝粘蛋白水解多肽。

8.根据权利要求1或2所述的组合物，其中将所述二十二碳六烯酸皂化。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述皂化通过将二十二碳六烯酸与皂化剂进行。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述皂化剂为NaOH。

11.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物还包括保湿剂、乳化剂、抗氧化剂和pH调节剂中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述保湿剂选自甘油、水解透明质酸钠或透明质酸钠；所述乳化剂选自PEG-40氢化蓖麻油；所述抗氧化剂选自生育酚；所述pH调节剂选自柠檬酸钠或柠檬酸。

13.根据权利要求1-12任一项所述的用于改善皮肤屏障的组合物在制备用于治疗特应性皮炎的药物中的用途。