CN109856268B - 一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，本发明的检测多种抗生素的方法所用的检测时间大大缩短，可同步检索出十种抗生素，其中包括磺胺类抗生素、β‑内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素。简化了检测工艺、降低了检测成本同时提高了检测效率。

Description

一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法

技术领域

本发明涉及抗生素检测技术领域，特别是涉及一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法。

背景技术

抗生素不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。但是随着科技的进步，抗生素的生产工艺日渐成熟，大量的抗生素被投入到人们的生活中被广泛的使用，据不完全统计，约有75％的抗生素是不能被人或动物所利用，而是通过尿液或粪便等以原药或代谢产物的形式排放到环境中，进而导致环境中耐药水平的提高，成为重要的新型环境污染物，严重危害生态环境安全和人类健康。

而邯郸市滏阳河和沁河水的成分复杂，抗生素多以痕量存在，因此，如何准确检测出滏阳河和沁河水样中存在的多种抗生素，以便以对其进行环境预警和有效根治是本地区的一项难题。

在专利CN107561187A中公开了一种同步检测污染水体重多种抗生素的方法，该方法采用的是高效液相色谱串联质谱法对抗生素的含量进行检测，能够同步检测20几种抗生素，该发明的采用的仪器成本高昂，同时检测时间较长，针对不断变化的待处理水体，需要提高检测效率，降低检测时间，同时提高检测的准确度。

发明内容

本发明的目的是提供了一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法。采用本发明的技术方案，利用高效液相色谱仪在14min内准确分析出多种抗生素，所述多种抗生素包括磺胺类抗生素、β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素。

本发明的一种高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，所述抗生素包括磺胺类抗生素、β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素，该方法包括以下步骤：

(1)首先选取含多种抗生素的待测水样；

(2)将待测水样进行过滤，然后加入Na₂-EDTA，并调节pH值至3；

(3)在活化后的HLB小柱中通入步骤(2)处理后的待测水样，对待测水样进行富集；

(4)利用洗脱剂对富集后的HLB小柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液进行浓缩，得到浓缩液；

(5)将浓缩液用甲醇定容至1mL，移取稀释后的待测水样，利用高效液相色谱进行检测抗生素，所述高效液相色谱采用Shim-pack GIST C18的色谱柱，柱温为40℃，进样体积为30μL，其中高效液相色谱仪采用的流动相为以浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，以乙腈为流动相C，采用梯度洗脱方式，流动相的流速为0.8mL/min；

(6)计算出水样中抗生素对应的峰面积，根据标准曲线定量计算，得出水样中多种抗生素的含量，其中所述标准曲线是精密称取甲氧苄啶、磺胺嘧啶，磺胺甲恶唑，头孢克洛，头孢克肟，头孢唑林，氟罗沙星，诺氟沙星，环丙沙星，洛美沙星，每种标准品5mg，分别用甲醇定容至10mL，配成将标准品配制成0.5mg/mL的单标储备液。取1mL单标储备液，用甲醇定容至25ml，配置成20mg/L的混标储备液备用，4℃保存，用甲醇将混标储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列：1μg/mL，0.6μg/mL，0.5μg/mL，0.4μg/mL，0.3μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL，然后按照步骤(5)的色谱程序进行检测得出的。

优选的，所述步骤(2)中采用孔径为0.45μm滤膜过滤水样，且Na₂-EDTA的加入量为0.5g/L。

优选的，所述步骤(2)中采用4mol/L的盐酸调节水样的pH。

优选的，所述步骤(3)HLB小柱的活化方法为依次用5mL甲醇，5mL质量浓度为0.1％甲酸水溶液通过HLB小柱进行活化处理。

优选的，所述步骤(3)中待测水样通过HLB小柱的速度为5mL/min。

优选的，步骤(4)对富集后的HLB小柱进行洗脱具体为：首选使用6mL质量浓度为5％的甲醇水溶液对富集后的HLB小柱进行淋洗，真空干燥20min后再使用6mL甲醇进行淋洗。

优选的，步骤(5)中洗脱液的浓缩方法为在通风橱中自然吹风至近干。

优选的，所述磺胺类抗生素为甲氧苄啶、磺胺嘧啶，磺胺甲恶唑，β-内酰胺类抗生素为头孢克洛，头孢克肟，头孢唑林，喹诺酮类抗生素为氟罗沙星，诺氟沙星，环丙沙星，洛美沙星。

优选的，步骤(6)中流动相的梯度洗脱方式为：0-6min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1；6-8min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为13:5:2；8-9min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为6:3:1；9-13min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为5:4:1；13-14min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1。

优选的，所述高效液相色谱仪的检测波长为270nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的检测多种抗生素的方法所用的检测时间大大缩短，可同步检索出十种抗生素，其中包括磺胺类抗生素、β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素。简化了检测工艺、降低了检测成本同时提高了检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用本发明对滏阳河水样进行检测的色谱分离图；

图2为头孢克洛的标准曲线图；

图3为磺胺嘧啶的标准曲线图；

图4为氟罗沙星的标准曲线图；

图5为甲氧苄啶的标准曲线图；

图6为诺氟沙星的标准曲线图；

图7为环丙沙星的标准曲线图；

图8为头孢克肟的标准曲线图；

图9为洛美沙星的标准曲线图；

图10为头孢唑林的标准曲线图；

图11为磺胺甲恶唑的标准曲线图。

具体实施方式

实施例

一种高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，所用的色谱程序如下：采用LC-2030岛津自动进样高效液相色谱系统，其中采用Shim-pack GIST C18的色谱柱，柱温为40℃，进样体积为30μL，其中高效液相色谱仪采用的流动相为以浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，以乙腈为流动相C，采用梯度洗脱方式，流动相的流速为0.8mL/min，其中梯度洗脱顺序为：0-6min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1；6-8min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为13:5:2；8-9min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为6:3:1；9-13min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为5:4:1；13-14min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1,检测波长为270nm。

利用该方法分别对邯郸市滏阳河水样和沁河水样进行检测的方法，具体如下：

(1)首先选取邯郸市滏阳河或沁河水样待测水样；

(2)将待测水样进行过滤，然后加入Na₂-EDTA，并采用4mol/L的盐酸调节水样的pH值至3，其中采用孔径为0.45μm滤膜过滤水样，且Na₂-EDTA的加入量为0.5g/L；

(3)在活化后的HLB小柱中通入步骤(2)处理后的待测水样，对待测水样进行富集，其中待测水样通过HLB小柱的速度为5mL/min，且HLB小柱的活化方法为依次用5mL甲醇，5mL质量浓度为0.1％甲酸水溶液通过HLB小柱进行活化处理；

(4)对富集后的HLB小柱进行洗脱得到洗脱液，具体为：首选使用6mL质量浓度为5％的甲醇水溶液对富集后的HLB小柱进行淋洗，真空干燥20min后再使用6mL甲醇进行淋洗得到洗脱液，并将洗脱液进行浓缩，得到浓缩液；

(5)将浓缩液用甲醇定容至1mL，移取稀释后的待测水样，利用高效液相色谱按照所述程序进行检测水样中的抗生素,图1为滏阳河水样的色谱分离；

(6)标准曲线的测定：精密称取甲氧苄啶、磺胺嘧啶，磺胺甲恶唑，头孢克洛，头孢克肟，头孢唑林，氟罗沙星，诺氟沙星，环丙沙星，洛美沙星，每种标准品5mg，分别用甲醇定容至10mL，配成将标准品配制成0.5mg/mL的单标储备液。取1mL单标储备液，用甲醇定容至25ml，配置成20mg/L的混标储备液备用，4℃保存，用甲醇将混标储备液稀释成如下梯度浓度的标准系列：1μg/mL，0.6μg/mL，0.5μg/mL，0.4μg/mL，0.3μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL。按所述色谱程序进行HPLC测定，同时以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到其线性回归方程，如图2-图11所示。

根据所述方法建立的标准曲线表明10种抗生素在0.1～1μg/mL范围内质量浓度与峰面积线性关系良好，R²>0.99，可准确检测出水样中10种抗生素的含量，并能有效分离。结合标准曲线定量分析邯郸市滏阳河和沁河水样中的抗生素，结果如表1所示。

表1

同时，该方法具有较高的精密度，准确率高，本发明移取浓度为1μg/mL的混标工作液，每次进样30μL，连续进样5次，按所述的高相色谱程序进行测定，记录各目标物质保留时间，计算精密度。10种抗生素根据保留时间计算的相对标准偏差值如表2所示。

表2

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述抗生素包括磺胺类抗生素、β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素，该方法包括以下步骤：

(1)首先选取待测水样；

(2)将待测水样进行过滤，然后加入Na₂-EDTA，并调节pH值至3；

(3)在活化后的HLB小柱中通入步骤(2)处理后的待测水样，对待测水样进行富集；

(4)利用洗脱剂对富集后的HLB小柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液进行浓缩，得到浓缩液；

(5)将浓缩液用甲醇定容至1mL，移取稀释后的待测水样，利用高效液相色谱进行检测抗生素，所述高效液相色谱采用Shim-pack GIST C18的色谱柱，柱温为40℃，进样体积为30μL，其中高效液相色谱仪采用的流动相为以浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，以乙腈为流动相C，采用梯度洗脱方式，流动相的流速为0.8mL/min；

(6)计算出水样中抗生素对应的峰面积，根据标准曲线定量计算，得出水样中多种抗生素的含量；

所述磺胺类抗生素为甲氧苄啶、磺胺嘧啶，磺胺甲恶唑，β-内酰胺类抗生素为头孢克洛，头孢克肟，头孢唑林，喹诺酮类抗生素为氟罗沙星，诺氟沙星，环丙沙星，洛美沙星；

所述步骤(5)流动相的梯度洗脱方式为：0-6min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1；6-8min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为13:5:2；8-9min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为6:3:1；9-13min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为5:4:1；13-14min，流动相A与流动相B、流动相C的体积比为8:1:1。

2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用孔径为0.45μm滤膜过滤水样，且Na₂-EDTA的加入量为0.5g/L。

3.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用4mol/L的盐酸调节水样的pH。

4.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述步骤(3)HLB小柱的活化方法为依次用5mL甲醇，5mL质量浓度为0.1％甲酸水溶液通过HLB小柱进行活化处理。

5.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述步骤(3)待测水样通过HLB小柱的速度为5mL/min。

6.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，步骤(4)对富集后的HLB小柱进行洗脱具体为：首选使用6mL质量浓度为5％的甲醇水溶液对富集后的HLB小柱进行淋洗，真空干燥20min后再使用6mL甲醇进行淋洗。

7.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，步骤(4)中洗脱液的浓缩方法为自然吹风至近干。

8.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱快速检测多种抗生素的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的检测波长为270nm。

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