CN105784858B - 环境土壤中PPCPs的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种环境土壤样品中PPCPs的测定方法，包括样品提取步骤、富集净化步骤、分离净化步骤、分析检测步骤，其中，所述的样品提取步骤还包括向其中加入N种同位素内标提取液，其中N为大于1以上16以下的整数，优选4～16，更优选8～15。本发明涉及检测PPCPs的领域，特别是涉及一种在土壤和底泥样品中测定16种PPCPs含量的方法。通过本发明，改进原有分析方法，建立多同位素内标的分析方法，做到大多数目标物都有对应的同位素标记物作为内标，对应无法购买同位素标记物的目标物，选择结构、性质相近物质的同位素标记物作为内标。建立灵敏度更高、检测限更低、稳定性更强的多同位素内标的分析方法。

Description

环境土壤中PPCPs的测定方法

技术领域

本发明涉及检测PPCPs的领域，特别是涉及一种在土壤和底泥样品中测定16种PPCPs含量的方法。

背景技术

药物和个人护理品(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)包括治疗疾病、保障健康的人用和兽用药物，洗浴、护肤等个人护理用品以及香薰、消毒剂等日用化学品，是一类对生态环境和人体健康具有潜在危害的新兴污染物，其环境存在、风险评价和毒理学等方面的研究引起了环境科学领域的广泛关注。环境中PPCPs的来源非常广泛，制药厂、医院、畜禽养殖场、人类日常生活产生的废水和固体废物中都含有大量的PPCPs，并以污水、固体废物等形式进入环境。污水处理厂也是PPCPs进入环境的一个重要途径，PPCPs大都主要通过吸附至污泥的方式从水体中去除，如果污泥被当作肥料用于土壤，则PPCPs可能进入土壤和地下水中。

在目前的相关研究中，PPCPs通常使用超声提取、固相萃取和液相色谱串联质谱(SPE-LC-MS/MS)法分析，方法主要基于EPA 1694优化获得。现有的检测法规和大多数实验室，均使用典型的内标法对几种或十几种目标物进行分析，内标和目标物之间存在结构和性质差异，在前处理过程中的损耗、色谱保留行为及响应强度均存在较大差异，导致分析方法检出限较高、稳定性较差，无法对低浓度PPCPs准确定量。并且一些PPCPs本身具有稳定性差的特点，使用内标法进行测定时，样品的保存时间较短，对分析检测要求较为苛刻：采集的样品需避光低温保存，尽量在3天内完成前处理、45天内完成仪器分析检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种环境样品中16种PPCPs的分析方法，尤其是适用于土壤和泥底环境中的可以准确测定环境样品中的PPCPs含量，并有效补偿PPCPs因降解而导致的浓度变化。从而解决现有的测定方法无法准确测定环境样品中的PPCPs含量和延长保存时间的问题。

为解决上述技术问题，本发明引入更多的同位素内标，改进原有分析方法，建立多同位素内标的分析方法，做到大多数目标物都有对应的同位素标记物作为内标，对应无法购买同位素标记物的目标物，选择结构、性质相近物质的同位素标记物作为内标。建立灵敏度更高、检测限更低、稳定性更强的多同位素内标的分析方法。

本发明的目的在于提供一种环境土壤样品中PPCPs的测定方法，其特征在于，包括样品提取步骤、富集净化步骤、分离净化步骤、分析检测步骤，其中，所述的样品提取步骤包括，加入n种同位素提取内标的步骤，其中，n为1以上且16以下的整数，优选4～16，更优选8～15。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的样品提取步骤包括向样品中加入磷酸盐缓冲盐，调节pH后加入提取内标液后，再加入乙腈重复超声提取，合并提取液，旋蒸浓缩。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的富集净化步骤为将提取液用超纯水稀释、玻璃纤维滤纸过滤后，用固相萃取柱富集，优选亲水亲脂型固相萃取小柱。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的富集净化步骤中，在富集之前，将小柱用甲醇、高纯水、pH4～5的高纯水淋洗。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述分析检测步骤采用HPLC-MS/MS仪器，对所述净化试样进行分析检测。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的分析检测步骤还包含：将得到的所述净化试样经浓缩后体积比为1:4的甲醇/水定容至500μL，加入¹³C-Atrazine的进样内标后涡旋混合均匀，用0.22μm的尼龙针筒过滤器过滤后，作为待仪器检测的净化试样。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述分析检测步骤还包括采用HPLC-MS/MS仪器对所述净化试样分别进行分析测定，采用的测定参数为：

HPLC检测条件为进样体积10μL；柱温30℃，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为3.5μm×3.0mm×150mm，POS模式时的流动相为含0.01％的甲酸高纯水和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为含10mMol/L的醋酸铵的高纯水和甲醇，流速为0.35mL/min；质谱条件为电喷雾电离源ESI，多反应监测模式MRM。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述的PPCPs选自喹诺酮类、磺胺增效剂、抗高血压药、抗癫痫药、驱虫药、抗抑郁药、抗高血压药、兴奋剂、氯霉素类、消炎止痛药、调血脂药中任意一种以上。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述PPCPs为，萘啶酸、甲氧苄啶、普萘洛尔、卡马西平、避蚊胺、舒必利、美托洛尔、咖啡因、氯霉素、双氯芬酸、吲哚美辛、甲芬那酸、酮洛芬、苯扎贝特、氯贝酸、吉非罗齐。

本发明所述的测定方法，其特征在于，所述环境样品为土壤和底泥样品中的任一种。

详细而言，本发明的具体操作步骤如下：

(1)样品提取步骤：称取一定量冻干研磨后的样品，加15mL磷酸盐缓冲盐，用NaOH或HCl溶液调节pH至4～5后，加入13C标记的提取内标液；再加入20mL乙腈后，超声重复提取三次，合并提取液，旋蒸浓缩。

(2)富集净化步骤：将上述所述提取液用超纯水稀释、玻璃纤维滤纸(450℃灼烧4小时)过滤后，用亲水亲脂型固相萃取柱富集，得到含有PPCPs的萃取小柱；富集前萃取柱使用前依次用10mL甲醇、6mL高纯水、高纯水6mL(pH＝4～5)淋洗，达到活化填料和去除杂质的目的，富集小柱规格为200mg，6mL。

(3)分离净化步骤：将所述含有PPCPs的萃取小柱，用10mL高纯水清洗，抽真空至填料完全干(约需1～2小时)，再加入8mL甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，浓缩定容后得到净化试样；将得到的所述净化试样经浓缩后甲醇/水(体积比为1:4)定容至500μL，加入¹³C-Atrazine的进样内标后涡旋混合均匀，用0.22μm的尼龙针筒过滤器过滤后，作为待仪器检测的净化试样。所述浓缩采用的是氮吹浓缩至恰好吹干，干浴温度优选为35℃。

(4)分析检测步骤：采用HPLC-MS/MS仪器，对所述净化试样进行分析检测，采用的测定参数为：HPLC检测条件为进样体积10μL；柱温30℃，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为3.5μm×3.0mm×150mm，POS模式时的流动相为含0.01％的甲酸高纯水和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为含10mmol/L的醋酸铵的高纯水和甲醇，流速为0.35mL/min；质谱条件为电喷雾电离源ESI，多反应监测模式MRM。通过各目标物的保留时间、定性离子对进行定性分析；通过同位素的峰面积比值进行定量分析，得出对所述净化试样中PPCPs含量的测定结果。

本发明的有益效果是：

(1)由于目标物和对应的同位素内标具有近乎完全相同的化学性质和状态，在样品过滤、净化、浓缩等前处理过程中，同位素标记物和目标物具有相同的损耗特性，可以有效补偿PPCPs因降解而导致的浓度变化，延长了样品的保存时间；

(2)仪器测定时，两者在色谱柱中的吸附行为、在质谱中的响应强度同样具有很好的一致性，尤其在对低浓度样品测定时，即使存在较高的仪器噪音或者背景干扰，两者的仪器响应强度和浓度之间仍然具有较好的对应关系，有效降低了仪器和基质干扰对测定结果的影响，提高了低浓度样品的检测准确度，降低了方法检测限。

(3)通过采用HPLC-MS/MS仪器，可以对土壤和泥底中16种PPCPs中的一种或多种，即萘啶酸、甲氧苄啶、普萘洛尔、卡马西平、避蚊胺、舒必利、美托洛尔、咖啡因、氯霉素、双氯芬酸、吲哚美辛、甲芬那酸、酮洛芬、苯扎贝特、氯贝酸、吉非罗齐同时进行测定，定量精准，灵敏度高。

附图说明

图1为测定方法流程图；

图2a-2b为对净化试样正负离子模式下测定的色谱图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供一种环境样品中PPCPs(药物和个人护理品)的测定方法，是一种对土壤和底泥中PPCPs含量测定的方法，如图1所示，该方法包括以下步骤：

(1)样品提取步骤：称取一定量冻干研磨后的样品至于50mL PP离心管中，加15mL磷酸盐缓冲盐，用NaOH或HCl溶液调节pH至4～5，加入50ng13C标记的提取内标液，混合均匀，老化30min；加入20mL乙腈，涡旋、超声30min，离心后取上清液；重复提取三次，合并提取液，35℃以下旋蒸至20-30mL。

(2)富集净化步骤：将上述所述提取液用超纯水稀释至500mL，盛放于棕色玻璃材质或高密度聚乙烯(HDPE)材质的采水瓶(使用前用高纯水和甲醇清洗并晾干)中，将稀释液用玻璃纤维滤纸(450℃灼烧4小时)过滤；NaOH或HCl溶液调节pH至4～5；依次用10mL甲醇、6mL高纯水、6mL高纯水(pH＝4～5)冲洗固相萃取小柱，达到活化填料和去除杂质的目的；将过滤后的稀释液通过小柱，流速控制在5～10mL/min；随后用10mL高纯水清洗小柱，抽真空至填料完全干(约需1-2小时)。

(3)浓缩净化步骤：用4mL甲醇洗脱小柱两次，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中；最后将洗脱液氮吹浓缩(干浴温度为35℃)至恰好吹干，加入500μL含0.025％甲酸的甲醇/水(体积比1:1)和50ng进样内标液，涡旋混合均匀，用0.22μm的针筒过滤器过滤后，保存于自动进样样品瓶中，进行仪器分析；

(4)分析检测步骤：采用HPLC-MS/MS仪器，对所述净化试样进行分析检测，得出对所述净化试样中PPCPs含量的测定结果。上述测定方法中的测定步骤包括：

采用HPLC-MS/MS仪器对所述净化试样进行分析检测，采用的MRM条件为：电喷雾电离源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，分别采用正离子电离模式(POS)和负离子电离模式(NEG)分析。

HPLC条件为：色谱柱为C18液相色谱柱规格为3.5μm×3.0mm×150mm，进样体积10μL；柱温30℃；POS模式时的流动相为高纯水(含0.01％的甲酸)和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为高纯水(含10mmol/L的醋酸铵)和甲醇，流速为0.35mL/min，梯度洗脱程序见下表。

本发明的测定方法，在样品富集过程中去除杂质，将样品中的PPCPs吸附在SPE柱上，最后用淋洗液将目标物洗脱下来，再使用具有高灵敏性的HPLC-MS/MS检测器，通过同位素内标法进行定量，从而建立准确度、灵敏度高的精准测定样品中PPCPs含量的方法，该测定方法克服了现有的检测法，均使用同种内标物定量的方式，由于PPCPs物质的结构和性质差异较大，其不同降解特性导致的浓度变化不同，用同一种内标物来衡量，从而导致定量不准确。目前除特殊污染场地外一般环境介质中的PPCPs含量极低，内标法定量方式不能满足这类物质的定量需求,在付出了难以想象的劳动之后，申请人终于发现了一个出乎意料地好的测定参数，使其再加入多种同位素内标后，能够同时检测出环境土壤中存在的16种痕量PPCPs。。

下面结合具体实施例对本发明实施例的测定方法作进一步地详细描述。本发明提供一种土壤和底泥中PPCPs的测定方法，包括以下步骤：

(1)样品提取步骤：称取一定量冻干研磨后的样品，加15mL磷酸盐缓冲盐，用NaOH或HCl溶液调节pH至4～5后，加入13C标记的提取内标液；再加入20mL乙腈后，超声重复提取三次，合并提取液，旋蒸浓缩。

(2)富集净化步骤：将上述所述提取液用超纯水稀释、玻璃纤维滤纸(450℃灼烧4小时)过滤后，用亲水亲脂型固相萃取柱富集；分离净化步骤：用4mL甲醇洗脱小柱两次，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中；最后将洗脱液氮吹浓缩(干浴温度为35℃)至恰好吹干，加入500μL含0.025％甲酸的甲醇/水(体积比1:1)和50ng进样内标液，涡旋混合均匀，用0.22μm的针筒过滤器过滤后，保存于自动进样样品瓶中，作为仪器的净化试样；

(3)HPLC-MS/MS测定：使用美国Dionex的高效液相色谱仪UltiMate 3000和AB三重四极杆串联质谱仪API 3200测定，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为3.5μm×3.0mm×150mm，质谱条件为：电喷雾电离源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，HPLC条件为：进样体积10μL；柱温30℃；POS模式时的流动相为高纯水(含0.01％的甲酸)和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为高纯水(含10mmol/L的醋酸铵)和甲醇，流速为0.35mL/min。通过各目标物的保留时间、定性离子对进行定性分析；通过同位素的峰面积比值进行定量分析，得出净化试样的测定结果。

实施例

本发明实施例提供一种土壤样品中PPCPs的测定方法，包括以下步骤：

样品提取步骤：称取一定量冻干研磨后的样品至于50mL PP离心管中，加15mL磷酸盐缓冲盐，用NaOH或HCl溶液调节pH至4～5，加入50ng13C标记的提取内标液，混合均匀，老化30min；加入20mL乙腈，涡旋、超声30min，离心后取上清液；重复提取三次，合并提取液，35℃以下旋蒸至20-30mL。

富集净化步骤：将上述所述提取液用超纯水稀释至500mL，盛放于棕色玻璃材质或高密度聚乙烯(HDPE)材质的采水瓶(使用前用高纯水和甲醇清洗并晾干)中，将稀释液用玻璃纤维滤纸(450℃灼烧4小时)过滤；NaOH或HCl溶液调节pH至4～5；依次用10mL甲醇、6mL高纯水、6mL高纯水(pH＝4～5)冲洗固相萃取小柱，达到活化填料和去除杂质的目的；将过滤后的稀释液通过小柱，流速控制在5-10mL/min；随后用10mL高纯水清洗小柱，抽真空至填料完全干(约需1-2小时)。

浓缩步骤：用4mL甲醇洗脱小柱两次，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中；最后将洗脱液氮吹浓缩(干浴温度为35℃)至恰好吹干，加入500μL含0.025％甲酸的甲醇/水(体积比1:1)和50ng进样内标液，涡旋混合均匀，用0.22μm的针筒过滤器过滤后，保存于自动进样样品瓶中，进行仪器分析。

HPLC-MS/MS测定：使用美国Dionex的高效液相色谱仪UltiMate 3000和AB三重四极杆串联质谱仪API 3200测定，色谱柱为C18液相色谱柱，3.5μm×3.0mm×150mm，。质谱条件为：电喷雾电离源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，HPLC条件为：进样体积10μL；柱温30℃；POS模式时的流动相为高纯水(含0.01％的甲酸)和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为高纯水(含10mmol/L的醋酸铵)和甲醇，流速为0.35mL/min。通过各目标物的保留时间、定性离子对进行定性分析；通过同位素的峰面积比值进行定量分析，得出净化试样的测定结果。如图2a-2b为净化试样的正离子模式的测定色谱图，从图中可以看出，色谱图上各目标物没有其他杂质干扰，响应较好，能够准确定量。

表1 污泥基质加标回收结果

综上所述，本发明的测定方法通过同位素内标定量，再用HPLC-MS/MS方法测定净化试样中的药物含量，避免了样品保存时间短、检出限较高、实际水体基质干扰严重等问题，建立了一套准确度、灵敏度高的检测方法。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，都应涵盖在本发明的权利要求书中的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种环境土壤样品中PPCPs的测定方法，其特征在于，包括样品提取步骤、富集净化步骤、分离净化步骤、分析检测步骤，其中，所述的样品提取步骤包括，向样品中加入磷酸盐缓冲盐，调节pH后加入提取内标液后，再加入乙腈重复超声提取，合并提取液，旋蒸浓缩，所述内标液为n种同位素净化内标以及13C内标提取液，n为4～16；

所述的富集净化步骤为将提取液用超纯水稀释、玻璃纤维滤纸过滤后，用亲水亲脂型固相萃取小柱富集；

所述的富集净化步骤中，在富集之前，将小柱用甲醇、高纯水、pH4～5的高纯水淋洗；

所述分析检测步骤采用HPLC-MS/MS仪器，对所述净化试样进行分析检测，采用的测定参数为：HPLC条件为：进样体积10μL；柱温30℃，色谱柱为C18液相色谱柱，规格为3.5μm×3.0mm×150mm，POS模式时的流动相为含0.01％甲酸的高纯水和甲醇，流速为0.30mL/min；NEG模式时的流动相为含10mmol/L的醋酸铵的高纯水和甲醇，流速为0.35mL/min；质谱条件为电喷雾电离源ESI，多反应监测模式MRM；

将得到的所述净化试样经浓缩后体积比为1∶4的甲醇/水定容至500μL，加入¹³C-Atrazine的进样内标后涡旋混合均匀，用0.22μm的尼龙针筒过滤器过滤后，作为待仪器检测的净化试样；

所述PPCPs为，萘啶酸、甲氧苄啶、普萘洛尔、卡马西平、避蚊胺、舒必利、美托洛尔、咖啡因、氯霉素、双氯芬酸、吲哚美辛、甲芬那酸、酮洛芬、苯扎贝特、氯贝酸和吉非罗齐。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述环境样品为土壤和底泥样品中的任一种。

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