CN109847062A - 一种槲皮素金属纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种槲皮素金属纳米药物及其制备方法和应用。本发明提供了一种槲皮素金属纳米药物，槲皮素和过渡金属元素通过配位键进行配位，并通过含有羰基或羟基的高分子聚合物的表面修饰，形成槲皮素金属纳米药物。该纳米药物为具有肿瘤靶向的多功能纳米材料，可抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和复发等，甚至消除肿瘤细胞，具有光热治疗、光动力治疗和放射治疗等多种模式抗肿瘤的效果。另外，该纳米药物在体内降解和代谢时，产生的槲皮素分子可更长效的发挥抗肿瘤作用，其在体内的聚集、分布和代谢情况也具有可追踪性，可形成优异的诊疗一体化纳米平台，在医药领域具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种槲皮素金属纳米药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，更具体地，涉及一种槲皮素金属纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术

传统化疗药物存在水溶性差，血液循环时间短，缺乏肿瘤选择性的缺点。而生物体内尤其是肿瘤部位的pH较低、过氧化氢含量较高的特点。由于纳米材料在生物体内具有良好的高通透性和滞留效应，具有优异的肿瘤靶向能力，使人们在纳米材料方面不断进行探索，尤其是纳米药物，已成为研究热点。

槲皮素是柚皮苷的苷元，属于二氢黄酮类化合物，具有抗炎，抗菌，清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抑制血小板凝结和抗动脉粥样硬化等作用。研究表明，槲皮素能显著抑制促癌剂的作用，抑制艾氏腹水癌细胞的DNA、RNA和蛋白质合成。槲皮素作为主要的植物营养素之一，对人体健康具有多种益处，主要来源于樱桃、茶叶、红洋葱、覆盆子和越橘等植物的果实和叶子中。因此，槲皮素具有良好的生物相容性和生物安全性。

过渡金属元素(如铁、铜、锌、锰、钒、钴、钌、锇、铱、钨、钆)中有很多是生物体必需的微量元素，铁是合成血红蛋白的原料，锌是构成生物体内锌酯蛋白的关键。过渡金属元素可以和槲皮素上的羟基进行配位，形成不同的四配位、六配位和二配位的配合物，这些配合物根据金属的不同，具有不同的光物理和光化学性质，如光热、光动力等。

聚乙烯吡咯烷酮是一种水溶性的高分子，研究表明，聚乙烯吡咯烷酮具有优异的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性，对皮肤、粘膜和眼睛不形成任何刺激。医药级的聚乙烯吡咯烷酮为国际倡导的三大药用新辅料之一，可作为片剂、颗粒剂的粘结剂、注射剂的助溶剂、胶囊的助流剂和包衣成膜剂，液体制剂的分散剂和酶及热敏药物的稳定剂，还可做低温保存剂。用于隐形眼镜、可增加其亲水性和润滑性。目前，聚乙烯吡咯烷酮30已获得国家医药管理部门的批准上市。

光热治疗(photothermal therapy，PTT)凭借其局部、高效、副作用小等优势迅速成为肿瘤治疗领域的热点。其原理是利用富集在肿瘤部位的光热试剂在近红外光激发下，利用其光热转换效应产生热量，可使肿瘤局部温度升高从而实现杀伤肿瘤细胞的作用。由于槲皮素的水溶性极差(＜7μg/mL)，药代动力学性质导致了生物利用度较低(＜3.6％)，所以槲皮素在临床上的使用受到了极大的限制。而槲皮素是金属离子的良好螯合配位体，可与许多金属离子形成多种稳定的金属配合物，故以槲皮素为先导化合物对其进行结构修饰，合成出水溶性增强、药代动力学性质改善的槲皮素金属纳米配合物，对于槲皮素的临床应用具有极其重要的意义。

现有专利CN101220014A公开了具有细胞凋亡效应的槲皮素类及其糖苷化合物的金属配合物，证明槲皮素类化合物与二价金属离子、三价金属离子形成的配合物，能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制survivin蛋白表达，激活caspase-3的活性，能作为细胞诱导剂用于制备治疗肿瘤的药物。但是，目前没有任何应用纳米级的槲皮素金属药物对肿瘤进行光热治疗的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种槲皮素金属纳米药物的制备方法及其肿瘤低温光热治疗。

本发明的第一个目的是提供一种槲皮素金属纳米药物。

本发明的第二个目的是提供一种槲皮素金属纳米药物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述方法制备得到的槲皮素金属纳米药物。

本发明的第四个目的是提供上述槲皮素金属纳米药物的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种槲皮素金属纳米药物，槲皮素和过渡金属元素通过配位键进行配位，并通过含有羰基或羟基的高分子聚合物的表面修饰，形成槲皮素金属纳米药物。

本发明的槲皮素金属纳米药物利用纳米颗粒的富集滞留效应，选择性地富集到肿瘤区域，具有生物靶向性和特异性；利用槲皮素和过渡金属配位之间产生的电子跃迁，进行光热治疗；通过槲皮素对热休克蛋白的抑制作用，实现低温光热治疗，抑制肿瘤细胞的活性甚至消除肿瘤细胞，同时又对正常的组织细胞无任何毒副作用。

本发明还提供了所述槲皮素金属纳米药物的制备方法，将槲皮素溶液、过渡金属盐溶液、含有羰基或羟基的高分子聚合物混合，搅拌，透析，即可得到槲皮素金属纳米药物。

优选地，所述槲皮素、过渡金属盐、含有羰基或羟基的高分子聚合物的质量比为0.5～1.5：2～6：10～24。

更优选地，所述槲皮素、过渡金属盐、含有羰基或羟基的高分子聚合物的质量比为0.8～1.2：3～5：10～14。

更进一步优选地，所述槲皮素、过渡金属盐、含有羰基或羟基的高分子聚合物的质量比为1：4：12。

优选地，所述过渡金属盐为铁、铜、锌、锰、钒、钴、钌、锇、铱、钨或钆的可溶性盐中的任意一种或几种。

优选地，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物的分子量为大于或等于10000。

更优选地，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物的分子量为55000。

优选地，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和/或聚氨基酸。

更优选地，聚氨基酸为聚精氨酸和/或聚赖氨酸。

更进一步优选地，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。

优选地，所述搅拌的速度为500～1000r/min。

更优选地，所述搅拌的速度为800r/min。

优选地，所述搅拌的时间为10～48h。

更优选地，所述搅拌的时间为12h。

若搅拌速度过小(小于500r/min)、搅拌时间过短(小于10h)，会使得反应体系形成沉淀，形成的纳米药物的粒径过大(大于400nm)，不利于纳米药物在活体的循环和在肿瘤区域的富集；若搅拌速度过大(大于1000r/min)、搅拌时间过长(大于48h)，则形成的纳米药物的粒径过小(小于50nm)，不利于追踪该纳米药物在体内的聚集、分布和代谢。

所述槲皮素溶液为槲皮素溶解在溶剂中得到的溶液。

优选地，所述溶剂为甲醇、乙醇或二甲基甲酰胺中的任意一种或几种。

更优选地，所述溶剂为乙醇。

优选地，所述混合的方法为：超声处理。

优选地，所述超声的频率为35～40KHZ。

更优选地，所述超声的频率为40KHZ。

优选地，所述超声的功率为40～60W。

更优选地，所述超声的功率为60W。

优选地，所述超声的时间为8～12min。

更优选地，所述超声的时间为10min。

优选地，所述透析的方法为：把反应液加入到纤维素透析袋中进行透析。

优选地，所述纤维素透析袋的截留分子量为8～10万。

更优选地，所述纤维素透析袋的截留分子量为10万。

优选地，所述透析的时间为70～75h。

更优选地，所述透析的时间为72h。

另外，上述方法制备得到的槲皮素金属纳米药物，也应在本发明的保护范围之内。

上述纳米药物在作为和/或制备抗肿瘤药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抗肿瘤药物为低温光热治疗、光动力治疗和/或放射治疗的抗肿瘤药物。

所述肿瘤为良性肿瘤或恶性肿瘤。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以槲皮素为载体，将槲皮素与过渡金属元素混合，槲皮素中的羟基和过渡金属元素形成配位键，进行配位自组装，并加入含有羰基或羟基的高分子聚合物进行表面修饰，成功制备得到槲皮素金属纳米药物；其中，高分子聚合物的加入，增加了水溶性和稳定性，有利于形成稳定的纳米结构；

(2)本发明利用生物体内尤其是肿瘤部位的pH较低、过氧化氢含量较高的特点，解决了槲皮素中的羟基与过渡金属元素的配位能力较弱的问题，肿瘤部位的以上特殊环境会使得纳米药物解体，有助于纳米药物在生物体内降解和代谢；纳米药物降解之后，形成的槲皮素分子，能够进一步发挥槲皮素的自身抗肿瘤作用，可以更长效的抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和复发等；同时，产生的过渡金属元素可应用于临床成像手段的诊断工作；另外，该纳米药物的分散性和水溶性较好，纳米颗粒的粒径基本在50～400nm，该粒径大小有利于纳米药物在活体的循环和在肿瘤区域的富集，适合应用于活体研究以及临床治疗肿瘤中；

(3)槲皮素与不同过渡金属元素配位，会产生不同的光物理特性，具有光热治疗、光动力治疗和放射治疗等多种模式的抗肿瘤效果，同时具有核磁共振成像和光声成像的能力，可通过不同的成像手段追踪该纳米药物在体内的聚集、分布和代谢情况；因此，本发明的槲皮素金属纳米药物为具有肿瘤靶向的多功能纳米材料，可形成优异的诊疗一体化纳米平台。

附图说明

图1是槲皮素金属纳米药物的合成路线图；其中，(1)代表聚乙烯吡咯烷酮，(2)代表过渡金属盐，(3)代表槲皮素，(4)代表槲皮素金属纳米药物。

图2是槲皮素金属纳米药物的光热曲线和热成像图；其中，图a)是槲皮素金属纳米药物的紫外吸收光谱图；图b)是槲皮素金属纳米药物的光热升温曲线图；图c)是槲皮素金属纳米药物的水合粒径图；图d)是不同质量比的槲皮素和过渡金属元素铁混合的光热效率图；图e)是槲皮素金属纳米药物的水溶液形态图。

图3是槲皮素铁纳米药物的低温抗肿瘤性能测试结果图。

图4是槲皮素铁纳米药物的活体成像图；其中，图(a)为槲皮素铁纳米药物的肿瘤的光声成像图；图(b)为槲皮素铁纳米药物的肿瘤的核磁成像图。

图5是槲皮素铁纳米药物的活体低温抗肿瘤效果图；其中，图a)是活体的光热成像图；图b)是槲皮素铁纳米药物的肿瘤抑制曲线图；图c)是从活体中取出的肿瘤细胞的形态图；图d)是活体的体重变化曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例1～11中槲皮素金属纳米药物的合成路线均如图1所示。

实施例1槲皮素铁纳米药物的合成

在35KHZ 40W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的七水合硫酸亚铁溶解在10mL的超纯水中，加入240mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声8min，然后通过搅拌0.5h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在500r/min转速下继续搅拌12h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素透析袋中，用超纯水透析72h后，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到黑色粉末；采用ICP进行铁含量的定量，4℃保存待用。

实施例2槲皮素钌纳米药物的合成

在40KHZ 40W的超声条件下，将10mg的槲皮素溶解在甲醇-水溶液(甲醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg三氯化钌溶解在10mL的超纯水中，加入240mg分子量为55000的聚精氨酸，共超声9min，然后通过搅拌0.5h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在600r/min转速下继续搅拌36h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为8万的纤维素透析袋中，用超纯水透析70h后，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到棕黑色粉末；采用ICP进行钌含量的定量，4℃保存待用。

实施例3槲皮素钨纳米药物的合成

在35KHZ 60W的超声条件下，将30mg的槲皮素溶解在二甲基甲酰胺溶液(二甲基甲酰胺与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的六氯化钨溶解在体积比为1：1的二甲基甲酰胺水溶液中，加入240mg分子量为55000的聚赖氨酸，共超声10min，然后通过搅拌1h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在800r/min转速下继续搅拌24h得到反应液；过滤出沉淀，把上清液加入到分子量为9万的纤维素透析袋中，透析75h后，用冷冻干燥机进行干燥，得到黑色粉末；采用ICP进行钨含量的定量，4℃保存待用。

实施例4槲皮素锇纳米药物的合成

在40KHZ 60W的超声条件下，将16mg的槲皮素溶解在甲醇-水溶液(甲醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的三氯化锇溶解在5mL的超纯水中，加入用20mL超纯水溶解的240mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声12min，然后通过搅拌1h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在1000r/min转速下继续搅拌24h得到反应液；过滤出沉淀，把上清液加入到截留分子量为10万的纤维素透析袋中，透析73h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到棕黑色粉末；采用ICP进行锇含量的定量，4℃保存待用。

实施例5槲皮素铜纳米药物的合成

在38KHZ 60W的超声条件下，将24mg的槲皮素溶解在乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的氯化铜溶解在2mL的超纯水中，然后加入25mL超纯水溶解的240mg分子量为55000的聚精氨酸，共超声11min，然后通过搅拌0.5h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在1000r/min转速下继续搅拌24h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析74h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到蓝色粉末；采用ICP进行铜离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例6槲皮素锌纳米药物的合成

在38KHZ 40W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在二甲基甲酰胺溶液(二甲基甲酰胺与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将40mg的氯化锌溶解在2mL的超纯水中，然后加入25mL超纯水溶解的240mg分子量为55000的聚赖氨酸，共超声8min，然后通过搅拌1h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在600r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为9万的纤维素的透析袋中，透析72h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到黄色粉末；采用ICP进行锌离子含量的定量，放置在中空干燥器中保存待用。

实施例7槲皮素锰纳米药物的合成

在40KHZ 50W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在甲醇-水溶液(甲醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将60mg的氯化锰溶解在4mL的超纯水中，然后加入20mL超纯水溶解的240mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声10min，然后通过搅拌2h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在800r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析70h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到棕黄色粉末；采用ICP进行锰离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例8槲皮素钒纳米药物的合成

在35KHZ 50W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在甲醇-水溶液(甲醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将100mg的四氯化钒溶解在4mL的超纯水中，然后加入20mL超纯水溶解的240mg分子量为55000的聚精氨酸，共超声12min，然后通过搅拌2h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在1000r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析75h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到棕黄色粉末；采用ICP进行钒离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例9槲皮素钴纳米药物的合成

在38KHZ 50W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将120mg的三氯化钴溶解在4mL的超纯水和2mL的二甲基甲酰胺中，然后加入20mL超纯水溶解的280mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声10min，然后通过搅拌0.5h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在800r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析70h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到黄色粉末；采用ICP进行钴离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例10槲皮素钆纳米药物的合成

在35KHZ 55W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在甲醇-水溶液(甲醇与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的二氯化钆溶解在4mL的超纯水和2mL的二甲基甲酰胺中，然后加入20mL超纯水溶解的200mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声8min，然后通过搅拌2h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在600r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析73h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到黄色粉末，采用ICP进行钆离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例11槲皮素铱纳米药物的合成

在35KHZ 45W的超声条件下，将20mg的槲皮素溶解在二甲基甲酰胺溶液(二甲基甲酰胺与水的体积比为1：1)中，得到槲皮素溶液；将80mg的三氯化铱溶解在4mL的超纯水中，然后加入20mL超纯水溶解的480mg分子量为55000的聚乙烯吡咯烷酮，共超声12min，然后通过搅拌1h混合均匀，加入以上得到的槲皮素溶液，在1000r/min转速下继续搅拌48h得到反应液；把反应液加入到截留分子量为10万的纤维素的透析袋中，透析72h，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到黄色粉末，采用ICP进行铱离子含量的定量，4℃保存待用。

实施例12槲皮素金属纳米药物的光热性能测试

1、光热性能测试实验

(1)槲皮素金属纳米药物的紫外吸收实验

1)实验方法

将实施例1～11分别制备得到的槲皮素铁、钌、钨、锇、铜、锌、锰、钴、钆和铱纳米药物进行稀释，配成3mL浓度为50μg/mL的药物溶液，在紫外吸收光谱仪上进行测试，起点从300nm，终点测到900nm，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到槲皮素金属纳米药物的紫外吸收光谱。

2)实验结果

槲皮素金属纳米药物的紫外吸收光谱如图2中的图a)所示，可以看出，槲皮素和金属配位后，在400～500nm之间会有新的吸收峰产生，这是由于金属上的电子跃迁到槲皮素的结果，证明槲皮素和金属进行了配位；另外，槲皮素铁、钌和锇的纳米药物在808nm处具有很强的紫外吸收，而808nm处的紫外吸收是做光热治疗的必要条件。

(2)槲皮素金属纳米药物的光热升温实验

1)实验方法

以实施例1～11制备得到的槲皮素铁、钌、钨、锇、铜、锌、锰、钴、钆和铱纳米药物，以金属的含量定量，配成2mL浓度为50μg/mL的测试液；然后分别用808nm的近红外激光器进行光照(以1.3W/cm²的功率)，每10s，用温度计记录1次槲皮素铁纳米药物的温度值，共照射10min，反复重复3次，作时间对温度的曲线图，即可得到槲皮素金属纳米药物的光热升温曲线。

2)实验结果

槲皮素金属纳米药物的光热升温曲线如图2中的图b)所示，可以看出，槲皮素铁纳米药物具有很好的光热效果，且升温程度受药物浓度的影响；另外，槲皮素铁纳米药物经光照后温度可以至少提高15℃，这个温度差可以有效的杀死肿瘤细胞，因此，槲皮素铁纳米药物具有良好的光热毒性。

(3)槲皮素金属纳米药物的水合粒径实验

1)实验方法

以实施例1～11制备得到的槲皮素铁、钌、钨、锇、铜、锌、锰、钴、钆和铱纳米药物，以金属的含量定量，配成2mL浓度为50μg/mL的测试液；通过布鲁克动态光散射仪进行测量，即可得到槲皮素金属纳米药物的水合粒径。

2)实验结果

槲皮素金属纳米药物的水合粒径如图2中的图c)所示，可以看出，槲皮素和过渡金属铁、钌、锇、铜、锌、锰、钴、钨、钆和铱可以形成纳米颗粒，通过控制制备纳米药物过程中的搅拌速度和搅拌时间，来控制得到的纳米颗粒的粒径，使粒径基本在50～400nm，该粒径大小有利于纳米药物在活体的循环和在肿瘤区域的富集，适合应用于活体研究以及临床治疗肿瘤中。

(4)不同质量比的槲皮素和过渡金属元素铁混合的光热效率实验

1)实验方法

分别设置槲皮素和过渡金属元素铁的质量比为1：1、0.5：1和0.25：1，合成槲皮素铁纳米药物，测定不同质量比的槲皮素和过渡金属元素铁混合的光热效率。

2)实验结果

不同质量比的槲皮素和过渡金属元素铁混合的光热效率如图2中的图d)所示，可以看出，当槲皮素和铁的质量比为0.25：1时，槲皮素铁纳米药物的光热效果最好，升温程度最大，因此，选用槲皮素和铁的质量比为0.25：1，作为合成槲皮素金属纳米药物时的槲皮素和金属的质量比。

(5)槲皮素金属纳米药物的水溶液形态实验

1)实验方法

以实施例1～11制备得到的槲皮素铁、钌、钨、锇、铜、锌、锰、钴、钆和铱纳米药物，以金属的含量定量，配成3mL浓度为50μg/mL的测试液，放入到透明的试剂瓶中，采用相机进行拍照。

2)实验结果

槲皮素金属纳米药物的水溶液形态如图2中的图e)所示，可以看出，槲皮素金属纳米药物的水溶性都比较好，可以满足临床用药的药物；且槲皮素铁、钌和锇的纳米药物呈现出黑色的溶液，这也正对应紫外吸收光谱，在808nm处有很强的近红外吸收，给光热治疗提供了可能。

实施例13槲皮素金属纳米药物的低温抗肿瘤性能测试

1、低温抗肿瘤性能测试实验

(1)以人乳腺癌细胞为研究对象，将实施例1制备得到的槲皮素铁纳米药物配制成不同浓度，浓度分别为：3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL；

(2)分别在37℃、45℃和日光条件下，孵育人乳腺癌细胞12h后，用808nm的近红外激光器照射(以0.5W/cm²的功率)20min；再孵育12h，总共孵育24h，然后应用MTT法进行细胞存活率统计。

2、实验结果

槲皮素铁纳米药物的低温抗肿瘤性能测试如图3所示，可以看出，与在37℃、45℃孵育人乳腺癌细胞相比，当以日光孵育20min的人乳腺癌细胞，并加入各个不同浓度的槲皮素铁纳米药物时，人乳腺癌细胞存活率均最低，说明槲皮素铁纳米药物具有低温抗肿瘤性能。

实施例14槲皮素铁纳米药物的核磁成像和光声成像性能测试

1、核磁成像和光声成像性能测试实验

以裸鼠为动物模型，通过皮下植瘤的方式种植人乳腺癌细胞，待肿瘤长到60cm³时，取4只裸鼠，分为2组，每组2只；其中一组的裸鼠用于做核磁成像，另外一组的裸鼠用于做光声成像；分别对每组中的1只裸鼠进行尾静脉注射实施例1制备得到的槲皮素铁纳米药物(120μL，0.8mg/kg)，然后用水合氯醛对2组裸鼠进行麻醉，分别用小动物核磁成像仪和小动物光声成像仪对肿瘤部位进行测试，每1h测量一次，总共测量4h；然后进行作图，即可得到肿瘤部位的光声成像和核磁成像效果，用于指导低温光热治疗。

2、实验结果

槲皮素铁纳米药物的活体成像如图4所示，可以看出，槲皮素铁纳米药物在肿瘤部位的富集是随时间积累的，当加入药物2h后，槲皮素铁纳米药物在肿瘤部位的富集最高，此时可以用808nm的近红外激光器照射，通过光声和磁共振双成像指导光热治疗，因此，槲皮素铁纳米药物具有很好的光热效果和核磁成像的能力。

实施例15槲皮素铁纳米药物的活体低温抗肿瘤性能测试

以实施例1制备得到的槲皮素铁纳米药物作为实验药物，以下实验共分为4组：槲皮素铁纳米药物组、槲皮素组、对照缓冲溶液(PBS)组、槲皮素铁纳米药物+日光组，通过尾静脉把相应的纳米药物加入到裸鼠体内，加入药物2h后，用808nm的近红外激光器对槲皮素金属纳米药物+日光组进行照射。

(1)活体的光热成像实验

1)实验方法

将槲皮素铁纳米药物组和PBS组，通过尾静脉把纳米药物和PBS加入到裸鼠体内，加入药物2h后，用808nm的近红外激光器对槲皮素铁纳米药物组和PBS组进行照射(功率为0.5W/cm²)，用小动物热成像仪每隔4min进行拍照，总共照射20min。

2)实验结果

活体的光热成像如图5中的图a)所示，可以看出，裸鼠肿瘤部位的温度随照射时间的增加，PBS组肿瘤部位的温度稍有增加，槲皮素铁纳米药物组肿瘤部位的温度增加的更加明显，温度可增加至高达44～45℃，这个温度刚好适合进行低温光热治疗，因此，采用功率为0.5W/cm²，照射20min进行低温抗肿瘤实验。

(2)槲皮素铁纳米药物的肿瘤抑制曲线实验

1)实验方法

以裸鼠为动物模型，通过皮下植瘤的方式种植人乳腺癌细胞，待肿瘤长到60cm³时，通过尾静脉注射上述4组中对应的药物；然后对槲皮素铁纳米药物组，用808nm的近红外激光器照射(以0.5W/cm²的功率)，每2d，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，得到肿瘤的体积，共观察20d；然后以观察天数和肿瘤体积的关系进行作图，得到肿瘤抑制曲线。

2)实验结果

槲皮素铁纳米药物的肿瘤抑制曲线如图5中的图b)所示，可以看出，PBS组裸鼠的肿瘤随时间的增加逐渐长大；与PBS组相比，槲皮素组和槲皮素铁纳米药物组肿瘤生长有所减缓，但是仍然增加明显，说明槲皮素组或槲皮素铁纳米药物组本身的化疗毒性很低，不足以用于抗肿瘤；而槲皮素铁纳米药物+日光组的肿瘤几乎没有生长，并且逐渐消融，直至消失，说明槲皮素金属纳米药物在光照的条件下具有很好的肿瘤抑制效果。

(3)活体中取出的肿瘤细胞的形态

1)实验方法

待槲皮素铁纳米药物的肿瘤抑制曲线实验结束后，处死实验裸鼠，取出肿瘤进行拍照。

2)实验结果

活体中取出的肿瘤细胞的形态如图5中的图c)所示，可以看出，PBS组的肿瘤生长的巨大；与PBS组相比，槲皮素铁纳米药物组和槲皮素组的肿瘤相对较小，但差别不大；而槲皮素铁纳米药物+日光组的肿瘤接近三分之二已经消失，三分之一的肿瘤减小的非常明显，表明槲皮素铁纳米药物具有良好的光热毒性，能够很好的抗肿瘤。

(4)活体的体重变化曲线图

1)实验方法

以裸鼠为动物模型，通过皮下植瘤的方式种植人乳腺癌细胞，待肿瘤长到60cm³时，通过尾静脉注射上述4组中对应的药物；然后对槲皮素铁纳米药物组，用808nm的近红外激光器照射(以0.5W/cm²的功率)，每2d，用体重秤对实验裸鼠的体重进行测量，共观察20d；然后以观察天数和裸鼠体重的关系进行作图，得到实验过程中裸鼠体重的变化。

2)实验结果

活体的体重变化曲线如图5中的图d)所示，可以看出，PBS组、槲皮素组、槲皮素铁纳米药物组和槲皮素铁纳米药物+日光组的裸鼠体重，随时间的增加都有所增加，说明槲皮素金属纳米药物的毒副作用较小，对裸鼠的器官损伤较小。

综上所述，槲皮素金属纳米药物具有很好的水溶性和良好的光热效果，并且粒径大小合适，适用于活体抗肿瘤，有利于纳米药物在活体的循环和在肿瘤区域的富集；该药物在用于治疗肿瘤时，具有良好的光热毒性，很好的低温光热治疗效果和完全消除肿瘤的作用。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种槲皮素金属纳米药物，其特征在于，槲皮素和过渡金属元素通过配位键进行配位，并通过含有羰基或羟基的高分子聚合物的表面修饰，形成槲皮素金属纳米药物。

2.权利要求1所述槲皮素金属纳米药物的制备方法，其特征在于，将槲皮素溶液、过渡金属盐溶液、含有羰基或羟基的高分子聚合物混合，搅拌，透析，即可得到槲皮素金属纳米药物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述槲皮素、过渡金属盐、含有羰基或羟基的高分子聚合物的质量比为0.5～1.5：2～6：10～24。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐为铁、铜、锌、锰、钒、钴、钌、锇、铱、钨或钆的可溶性盐中的任意一种或几种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物的分子量为大于或等于10000。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含有羰基或羟基的高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和/或聚氨基酸。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的速度为500～1000r/min，时间为10～48h。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述槲皮素溶液的溶剂为甲醇、乙醇或二甲基甲酰胺中的任意一种或几种。

9.权利要求2～8任一所述方法制备得到的槲皮素金属纳米药物。

10.权利要求1或9所述纳米药物在作为和/或制备抗肿瘤药物中的应用。