CN105194679A - 有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法及应用 - Google Patents
有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法及应用，有效解决兼具热疗及光动力治疗活性、肿瘤细胞靶向性以及良好生物相容性的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料的制备及实现抗肿瘤的治疗用药问题,通过水热法合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米材料，然后透明质酸以亚烷基二胺为连接臂和二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料通过酰胺键化学连接，在水介质中形成纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料，本发明方法制备的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料可同时用于肿瘤近红外成像诊断及肿瘤治疗，实现在制备肿瘤近红外成像诊断及肿瘤治疗药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)制备方法及应用。
背景技术
目前，临床上普遍釆用化疗、放疗以及手术来治疗癌症。化疗法药物全身分布广、毒副作用大且易复发。放疗利用癌细胞对放射线敏感的特性，使用高能电磁辐射线杀伤癌细胞并使肿瘤萎缩，但是在临床治疗时正常组织也会受到相应的辐射损伤。外科手术虽可切除肿瘤病灶，但对人体创伤大，且常因为癌细胞已经扩散而导致疗效较差。因此，进一步发展高效低毒的癌症治疗新技术和新方法已经成为全世界医学领域最为关注的课题。
近些年来，随着光敏物质和激光技术的不断发展，作为一种新型的微创疗法，光学治疗受到了研究者的广泛关注。光疗包括光热治疗及光动力学治疗。光动力学疗法(PDT)是一种有效用于治疗恶性肿瘤的新方法，其治疗原理是利用肿瘤组织相比其周围组织选择性低，可摄入和潴留一些染料或药物作为光敏剂，利用激光等作为光源照射光敏剂产生大量的活性氧物质(ROS)，从而有效杀伤肿瘤细胞，达到治疗目的。光热学疗法(PTT)是另一种治疗肿瘤的新方法，因其治疗时间短，治疗效果明显，材料无毒无害，对人体副作用小，因此具有很大的发展潜力。其治疗原理是利用具有高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源(一般是近红外光)的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞。
而光敏剂及光热转换剂在肿瘤内的定位及蓄积是决定光学治疗效果的一个重要因素。因此，试图将这些治疗物质定位于肿瘤组织的特定区域，使其能够特异性地杀伤肿瘤细胞，避免对健康组织或器官的损害，优化光疗效果，减小毒副作用。另外，确定光敏剂或光热转换剂到达肿瘤靶部位的时间也是影响治疗效果的一个重要因素。只有在该类物质到达靶部位并蓄积一定量后给予光照才能最大程度的发挥光疗的效果。因此发展成像监测模式下的治疗势在必行。
由于对生物体的毒性较小，光催化效果持久，二氧化钛有望成为一种更加安全的用于肿瘤治疗的新型光敏剂。已有大量实验研究证实二氧化钛在紫外光照射下，对宫颈癌、膀腕癌、白血病、胃癌、肠癌、乳腺癌等多种肿瘤都有一定的杀伤作用，是极有潜力的光动力学治疗材料。然而要实现其临床应用，仍面临诸多挑战，如：能带隙较宽，只能吸收紫外光，对可见及近红外光利用率低；光生电子和空穴易复合；表面光滑，吸附性能差，载药率极低。而氧化石墨烯(GO)有优良的电子传导能力，能实现光生电子-空穴的有效分离，提高光动力学治疗效率；二者复合后，可以作为敏化剂将吸收光谱扩展至可见及近红外光区。另外，GO为单原子层结构，具有较大的比表面积，其两面都可通过较强的物理吸附作用与芳香环类药物非共价结合，从而拥有超高的药物负荷量。同时，利用GO在近红外光下的光热转换特性可以进行肿瘤的光热治疗。
然而未经过处理的GO也有一定的缺点，如生物相容性不好；生理环境下易团聚；不具肿瘤细胞靶向性，难以实现药物的靶向转运及高效、低毒的光疗。所以往往在应用之前对其进行功能化修饰。而透明质酸(HA)是一种天然酸性黏多糖，结构中存在多种活性基团，具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，能改善GO的生物相容性及在水中的分散稳定性，通过受体介导作用，增加病灶区的药物浓度，从而实现肿瘤的靶向治疗。但至今未见有有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料及应用的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)制备方法及应用，可有效解决兼具热疗及光动力治疗活性、肿瘤细胞靶向性以及良好生物相容性的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料(Ti-GO-HA)的制备及实现抗肿瘤的治疗用药问题。
本发明解决的技术方案是，通过水热法合成二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米材料，然后透明质酸以亚烷基二胺为连接臂和二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料通过酰胺键化学连接，在水介质中形成纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)，具体由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料：称取0.25-0.75g硫酸钛，溶于10-30ml水中，加入80-240mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262-0.786g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸(HA)：称取100-200mg透明质酸(HA)加入5-20ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入200-500mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、150-310mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸(HA)溶液；冰浴下将0.5-2ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸(HA)溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸(HA)溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸(HA)，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸(HA)；
所述的溶剂为水或乙醇；
(3)合成透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)，方法是：称取45-120mg的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料，加入30-50ml溶剂分散成分散液，分别称取346-841mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、206-610mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h(过夜)，得活化反应液；称取50-150mg的氨化透明质酸(HA)，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)；
(4)、水介质中纳米层的形成：将透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)与水按重量比1-20︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10～1000纳米(nm)层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)；
所述的透明质酸的分子量为600d-400kd；
所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌和吲哚菁绿的一种。
本发明方法制备的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料可以同时用于肿瘤近红外成像诊断及肿瘤治疗，实现在制备肿瘤近红外成像诊断及肿瘤治疗药物中的应用。
附图说明
图1为本发明的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料在808nm激光照射下光热效应图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料：称取0.5g硫酸钛，溶于20ml水中，加入160mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.524g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸(HA)：称取150mg透明质酸(HA)加入12.5ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入350mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、230mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸(HA)溶液；冰浴下将1.25ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸(HA)溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸(HA)溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸(HA)，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸(HA)；
(3)合成透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)，方法是：称取83mg的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料，加入40ml溶剂分散成分散液，分别称取594mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、408mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h(过夜)，得活化反应液；称取100mg的氨化透明质酸(HA)，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)；
(4)、水介质中纳米层的形成：将透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)与水按重量比10︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10～1000纳米(nm)层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)。
实施例2
本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料：称取0.25g硫酸钛，溶于10ml水中，加入80mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸(HA)：称取100mg透明质酸(HA)加入5ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入200mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、150mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸(HA)溶液；冰浴下将0.5ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸(HA)溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸(HA)溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸(HA)，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸(HA)；
(3)合成透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)，方法是：称取45mg的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料，加入30ml溶剂分散成分散液，分别称取346mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、206mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h(过夜)，得活化反应液；称取50mg的氨化透明质酸(HA)，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)；
(4)、水介质中纳米层的形成：将透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)与水按重量比2︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10～1000纳米(nm)层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)。
实施例3
本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料：称取0.75g硫酸钛，溶于30ml水中，加入80-240mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262-0.786g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸(HA)：称取200mg透明质酸(HA)加入20ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入500mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、310mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸(HA)溶液；冰浴下将2ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸(HA)溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸(HA)溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸(HA)，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸(HA)；
(3)合成透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)，方法是：称取120mg的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料，加入50ml溶剂分散成分散液，分别称取841mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、610mg羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h(过夜)，得活化反应液；称取150mg的氨化透明质酸(HA)，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)；
(4)、水介质中纳米层的形成：将透明质酸(HA)修饰的二氧化钛-氧化石墨烯(Ti-GO)纳米复合材料(Ti-GO-HA)与水按重量比18︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10～1000纳米(nm)层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料(Ti-GO-HA)。
本发明方法易操作，稳定可靠，其产品可有效用于制备治疗肿瘤的药物，并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
1、HA修饰的Ti-GO纳米复合材料(Ti-GO-HA)的光热效应
配制一系列浓度的Ti-GO-HA水溶液，采用808nmNIR激光仪以2W/cm2的能量密度进行照射，并于0、1、2、3、4、5min测量溶液的温度，得图1，从图可知：HA修饰的Ti-GO纳米复合材料(Ti-GO-HA)在近红外激光照射下具有优良的光热转化作用，可作为光热剂用于肿瘤光热治疗。
2、HA修饰的Ti-GO纳米复合材料(Ti-GO-HA)的光动力学效应
将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板每孔加入1ml，铺板使待测细胞调密度至3×104个/孔。置于5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，加入10μg/ml的Ti-GO-HA，设置复孔为2～4个。加药4h后，光照组放置在808nm激光1.5W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后加入活性氧探针，用铝箔包裹细胞版置于CO2培养箱中孵育0.5h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用3mlPBS洗2遍，用70％冰乙醇固定0.5h，然后置于荧光显微镜下观察活性氧产生情况。
对荧光显微镜结果进行记录，结果表明，Ti-GO-HA在近红外激光照射下肿瘤细胞内可以产生大量活性氧，可作为光敏剂用于对肿瘤进行光动力学治疗。
3、负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物的制备及表征
将Ti-GO-HA复合材料5mg，溶解于5ml水中搅拌30min，冰浴条件下探头超声30min。5mg吲哚青绿溶解在水中，然后二者混合，冰浴条件下探头超声30min，室温搅拌过夜，超纯水透析1d，离心(5000rpm)10min，冷冻干燥。
Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物中吲哚青绿含量的测定
采用紫外分光光度法，于777nm波长处测定吲哚青绿的含量。以公式(1)计算样品的载药量。载药量达到75％。
4、负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物的光疗活性测定
体外抗肿瘤活性：将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10％，青链霉素混合液1％的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5％CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度至5×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度为0、0.1、0.2、0.5、1、2μg/ml的负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物，游离吲哚青绿为对照组，设置复孔为4～6个，共分为6组，具体分组如下：(1)吲哚青绿组；(2)吲哚青绿-808nm激光组；(3)Ti-GO-HA组；(4)Ti-GO-HA-808nm激光组；(5)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物组；(6)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组；其中激光组放置在808nm激光1.5W中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞版置于CO2培养箱中孵育24h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞版置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，SRB法测定抑制率。
实验证明本发明中的Ti-GO-HA作为药物载体时能介导药物进入肿瘤细胞内部，本身对肿瘤细胞的生长影响不大，但在近红外激光的照射下能够较好的抑制肿瘤细胞的增殖；其负载吲哚青绿后，联合808nm激光，有协同抗肿瘤效果出现。
体内抗肿瘤活性：取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，皮下接种于小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其中36只肿瘤体积≥100mm3昆明小鼠，随机分为7组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)吲哚青绿组；(3)吲哚青绿-808nm激光组；(4)Ti-GO-HA组；(5)Ti-GO-HA-808nm激光组；(6)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物组；(7)负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组。各组中吲哚青绿及Ti-GO-HA给药剂量相等，吲哚青绿为5mg/kg，Ti-GO-HA为10mg/kg。7组均采用静脉给药的方式，其中激光组功率均为1.5W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为2min。每2d给药一次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V＝计算肿瘤体积。
当给药Ti-GO-HA时，肿瘤体积与生理盐水对照组相比无显著性差异，但结合近红外激光后，肿瘤体积的增长明显变慢；负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物结合激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加比起吲哚青绿注射液加激光照射得到了明显的抑制；所有组中负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物-808nm激光组抑制肿瘤生长的效果最明显。
5、负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物的近红外成像试验
当小鼠的肿瘤体积达到100mm3时，将吲哚青绿溶液以及负载吲哚青绿的Ti-GO-HA药物组合物水溶液200μL分别尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内(每组3个小鼠)，使小鼠体内的吲哚青绿计量为2mg/kg。用同样的操作将200μL的PBS注射到另外三只小鼠体内作为对照组。吲哚青绿的生物分布分析可在注射后的特定时间用小动物活体成像系统(Maestro，美国)获得，在704nm激发波长和735nm过滤器中收集荧光，进行近红外成像试验。
结果显示与吲哚青绿溶液组相比，负载吲哚青绿的Ti-GO-HA抗肿瘤药物组合物组在肿瘤区域的荧光信号明显增强，说明Ti-GO-HA具有显著的肿瘤靶向性，可实现抗肿瘤药物的靶向传递。
在做上述实验的同时，还采用其它近红外光源以及抗肿瘤药物盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱和米托蒽醌做了相同或相类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，其它实验不再一一列举。实验表明，本发明易操作，方法稳定可靠，具有很强的实用性，有实在临床意义，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
(1)本发明提供的Ti-GO纳米材料，通过将二氧化钛与氧化石墨烯复合，可将二氧化钛的吸收光谱拓展至可见及近红外光区，而且GO优异的电子传导能力可避免二氧化钛中电子-空穴复合，同时GO独特的共轭结构及较大的比表面积可实现目标传递物的有效负载，另外其在近红外光下的光热转换特性使得Ti-GO纳米材料在作为载体的同时，本身又可作为光敏剂和光热治疗剂发挥多机制协同治疗的作用。
(2)本发明选择具有良好生物相容性、肿瘤细胞靶向性的天然多糖——透明质酸为修饰分子，以亚烷基二胺为连接臂，用一种简单经济和容易实现工业化生产的方法对Ti-GO复合材料进行化学修饰，条件温和、反应简单、产率高；
(3)本发明提供的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料结构较为简单，具有优良的生物相容性、水溶性和稳定性，还能够实现肿瘤特异性靶向，并保留了氧化石墨烯的高效光热治疗活性以及二氧化钛在近红外光区高效的光催化活性，实现了肿瘤靶向光热治疗联合光动力治疗；
(4)本发明提供的HA修饰的Ti-GO纳米复合材料，物理负载抗肿瘤药物吲哚青绿(ICG)，不仅可实现近红外照射下的肿瘤光疗，还可实现体内近红外成像监测模式下的肿瘤治疗。
(5)采用近红外光作为光源，不仅组织穿透性强，而且对人体危害小，可用于人体深部肿瘤的光学治疗，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。
Claims (7)
1.一种有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，通过水热法合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米材料，然后透明质酸以亚烷基二胺为连接臂和二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料通过酰胺键化学连接，在水介质中形成纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料，具体由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料：称取0.25-0.75g硫酸钛，溶于10-30ml水中，加入80-240mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262-0.786g十六烷基三甲基溴化铵，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸：称取100-200mg透明质酸加入5-20ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入200-500mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、150-310mg羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸溶液；冰浴下将0.5-2ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸；
所述的溶剂为水或乙醇；
(3)合成透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，方法是：称取45-120mg的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，加入30-50ml溶剂分散成分散液，分别称取346-841mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、206-610mg羟基琥珀酰亚胺加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h，得活化反应液；称取50-150mg的氨化透明质酸，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
（4）、水介质中纳米层的形成：将透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料与水按重量比1-20︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10~1000纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料。
2.根据权利要求1所述的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，所述的透明质酸的分子量为600d-400kd。
3.根据权利要求1所述的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌和吲哚菁绿的一种。
4.根据权利要求1所述的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料：称取0.5g硫酸钛，溶于20ml水中，加入160mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.524g十六烷基三甲基溴化铵，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸：称取150mg透明质酸加入12.5ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入350mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、230mg羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸溶液；冰浴下将1.25ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸；
(3)合成透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，方法是：称取83mg的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，加入40ml溶剂分散成分散液，分别称取594mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、408mg羟基琥珀酰亚胺加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h，得活化反应液；称取100mg的氨化透明质酸，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
（4）、水介质中纳米层的形成：将透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料与水按重量比10︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10~1000纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料。
5.根据权利要求1所述的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料：称取0.25g硫酸钛，溶于10ml水中，加入80mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262g十六烷基三甲基溴化铵，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸：称取100mg透明质酸加入5ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入200mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、150mg羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸溶液；冰浴下将0.5ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸；
(3)合成透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，方法是：称取45mg的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，加入30ml溶剂分散成分散液，分别称取346mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、206mg羟基琥珀酰亚胺加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h，得活化反应液；称取50mg的氨化透明质酸，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
（4）、水介质中纳米层的形成：将透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料与水按重量比2︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10~1000纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料。
6.根据权利要求1所述的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
(1)合成二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料：称取0.75g硫酸钛，溶于30ml水中，加入80-240mg氧化石墨烯，搅拌4h，再加入0.262-0.786g十六烷基三甲基溴化铵，搅拌12h，然后转移至反应釜中，120-150℃水浴反应48-96h，离心分离，除去水分，得粗产物，将粗产物用去离子水和无水乙醇各洗涤5次，离子交换后抽滤，得滤饼，将滤饼放入真空干燥箱中60-80℃干燥12-24h，350-450℃煅烧2-4h，得二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
(2)合成氨化透明质酸：称取200mg透明质酸加入20ml溶剂中，50℃油浴溶解，冷却至室温，再加入500mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、310mg羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min进行羧基活化，得羧基活化的透明质酸溶液；冰浴下将2ml乙二胺缓慢滴入羧基活化的透明质酸溶液中，室温反应2-6h，再加入超过羧基活化的透明质酸溶液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，析出的沉淀晶体即为氨化的透明质酸，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得氨化透明质酸；
(3)合成透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，方法是：称取120mg的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料，加入50ml溶剂分散成分散液，分别称取841mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、610mg羟基琥珀酰亚胺加入到分散液中，搅拌，室温活化反应10-18h，得活化反应液；称取150mg的氨化透明质酸，加入10ml溶剂溶解，滴加到活化反应液中，室温搅拌反应8-24h，成反应液，再加入超过反应液量的预冷丙酮，冰浴冷却，析晶，抽滤，得晶体，晶体透析冻干，得透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料；
（4）、水介质中纳米层的形成：将透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯纳米复合材料与水按重量比18︰100超声溶解，与乙醇溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质，室温搅拌24h，采用透析法或超滤法或柱分离法除去乙醇及游离药物，冻干，得有抗肿瘤药物粒径为10~1000纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料。
7.权利要求1或2-6任一项所述方法制备的有抗肿瘤药物纳米层的透明质酸修饰的二氧化钛-氧化石墨烯复合材料在制备肿瘤近红外成像诊断及肿瘤治疗药物中的应用。
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