CN109580485A - 一种用于红细胞超分辨成像的固定装置和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于红细胞超分辨成像的固定装置和使用方法，其属于微加工技术与生物成像交叉的技术领域。该装置使红细胞被固定并贴近玻璃表面，实现了对表面光滑的红细胞进行物理固定，使得全内反射超分辨成像观测十分的方便，达到了全内反射超分辨成像过程中对样品贴壁的要求。该装置不需要进行任何化学修饰和处理，使用简单方便，制作成本廉价。每一个红细胞固定腔室的尺寸很小，在一块面积小于一元硬币的固定装置上可以布置很多重复单元，可以同时对多个红细胞进行超分辨拍摄，另外在一个固定装置上可以布置几条微沟道，也就是在同一个固定装置上可以同时对几种来源不同血样中的红细胞进行超分辨成像，大大提高了实验通量。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于红细胞超分辨成像的固定装置和使用方法，其属于微加工技术与生物成像交叉的技术领域。
背景技术
超分辨成像技术是近几年飞速发展的领域,它由于可突破光学衍射极限，在纳米尺度观察生物样本，现在成为细胞分析的有力工具。但目前的单分子定位超分辨成像，大多基于全内反射技术，该技术要求观察的生物样本贴近玻璃片表面进行观察，对于贴壁细胞较容易实现，但是对于红细胞等表面光滑且不贴壁的细胞进行观察，很难实现。
本发明提出的用于红细胞超分辨成像的固定装置，利用弹性材料PDMS将红细胞固定在腔室内，该芯片可以实现基于全内反射的超分辨成像，而且具有高通量的特点。
发明内容
本发明提出一种用于红细胞超分辨成像的固定装置，其由多条微沟道组成，每条微沟道连接多个红细胞固定腔室，每个红细胞固定腔室包含一段入口沟道与红细胞固定腔室。红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，这样红细胞被吸入红细胞固定腔室后被单层固定。
本发明提出的用于红细胞超分辨成像的固定装置，其装置加工材料为PDMS（聚二甲基硅氧烷）以及玻片，PDMS材料多孔透气且有弹性，用于在红细胞固定腔室中将红细胞压住，靠近玻璃片基底，进行超分辨成像。
该用于红细胞超分辨成像的固定装置，红细胞固定腔室高度为0.8至1.2um，不超过红细胞线度的一倍；大小为30um*30um到80um*80um之间，用于富集多个红细胞。每个微通道具有多个重复单元，可以实现高通量的进行红细胞超分辨成像。
一种用于红细胞超分辨成像的固定装置，该装置包括设置在玻片上的PDMS微腔室，PDMS微腔室中设置多条微沟道结构，所述微沟道结构采用样品入口和培养液入口连接至入口主通道，入口主通道呈弯曲状排布，入口主通道连通多个红细胞固定腔室单元后经出口主通道连接出口；所述红细胞固定腔室单元采用固定腔室主通道上的红细胞固定腔室入口连接红细胞固定腔室，固定腔室主通道连通入口主通道和出口主通道；所述红细胞固定腔室的厚度不超过红细胞线度的一倍，红细胞固定腔室的厚度为0.8-1.2um，红细胞固定腔室的大小为30um*30um到80um*80um之间。其中，PDMS微腔室为聚二甲基硅氧烷微腔室。
每个芯片的不同通道还可以通入不同的血样，可以同时对不同血样中的红细胞进行超分辨成像比较实验。
该红细胞超分辨成像的固定装置的实现方法，包括以下步骤：
（1）通过软光刻的方法及打孔制备PDMS微腔室结构；
（2）PDMS微腔室结构通过等离子处理后,图形面冲下,放于干净的玻片上；
（3）将血样震荡均匀后通入芯片中，由于PDMS在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，血液自动被吸收入红细胞固定腔室；
（4）由于红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，因此红细胞在细胞固定腔室中被单层固定；
（5）载有红细胞的微流控芯片置于显微镜上进行超分辨成像。
用于红细胞超分辨成像的固定装置，其在全内反射超分辨成像中的应用。
有益效果：该固定装置由多条微沟道组成，每条微沟道连接多个红细胞固定腔室，每个红细胞固定腔室包含一段入口沟道与红细胞固定室。利用PDMS材料在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，主通道加入血样后，红细胞会被自动吸入并固定在红细胞固定腔室。血液填满细胞腔室的时间约为2-3分钟，之后更替主通道的培养液，也不会把细胞腔室的细胞带出。
由于红细胞被固定并贴近玻璃表面，使得全内反射超分辨成像观测十分的方便；解决了由于红细胞表面光滑难以在超分辨成像过程中保持不动的问题，非常适用于红细胞相关的超分辨成像的研究工作。该固定装置可以实现对表面光滑的红细胞进行物理固定，能够解决全内反射超分辨成像过程中对样品贴壁的要求。该装置不需要进行任何化学修饰和处理，使用简单方便，制作成本廉价。利用该固定装置可以对成人血样中的红细胞、肺炎幼儿血样的红细胞、久置的成人血样红细胞的形态进行超分辨拍摄和分析，还可以对红细胞溶胀过程中红细胞表面形成的微孔进行超分辨成像拍摄。每一个红细胞固定腔室的尺寸很小，在一块面积小于一元硬币的芯片上可以布置很多重复单元，可以同时对多个红细胞进行超分辨拍摄，另外在一个固定装置上可以布置几条微沟道，也就是在同一个固定装置上可以同时对几种来源不同血样中的红细胞进行超分辨成像，大大提高了实验通量。
附图说明
图1是一种用于红细胞超分辨成像的固定装置的结构图。
图2是固定装置的微沟道结构图。
图3是红细胞固定腔室单元的主视图。
图4是红细胞固定腔室单元的侧视图。
图5是使用固定装置对成年人红细胞进行超分辨成像图。
图6是肺炎幼儿红细胞的超分辨成像图。
图7是成人红细胞表面溶胀位置的超分辨成像图。
图8是久置成人红细胞的超分辨成像图。
图中：1、玻片，2、PDMS微腔室，3、微沟道结构，4、样品入口，5、培养液入口，6、入口主通道，7、红细胞固定腔室单元，7a、红细胞固定腔室，7b、固定腔室主通道，7c、红细胞固定腔室入口，8、出口主通道，9、出口。
具体实施方式
实施例1
图1-图4为用于红细胞超分辨成像的固定装置的结构图。该固定装置中有四条微沟道3，分别用红色和蓝色表示，每条通道上有90个红细胞固定腔室重复单元。每个红细胞固定腔室的厚度为1um，腔室大小50um*50um。实验过程如下，通过软光刻的方法及打孔制备PDMS微腔室结构，PDMS微腔室结构通过等离子处理后图形面冲下放于干净的玻片上，将血样震荡均匀后通入样品入口4中，由于PDMS微腔室2在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，血样自样品入口4进入到入口主通道6连通至固定腔室主通道7b，再通过固定腔室入口7c连通至红细胞固定腔室7a。由于红细胞固定腔室的厚度不超过红细胞线度的一倍，因此红细胞在细胞固定腔室7a中被单层固定。载有红细胞的固定装置置于显微镜上进行超分辨成像。
实施例2
图5为使用本发明提出的固定装置对成年人红细胞进行超分辨成像图。其中，图a是普通宽场成像的5个红细胞，图b是超分辨成像的5个红细胞，图c表征超分辨成像定位精度20nm，图d表明该芯片可以在80s内保持红细胞不动，进行超分辨成像，两种染料dii和c180都可以实现。比例尺2um。
实施例3
该固定装置可用于肺炎幼儿红细胞的超分辨成像
（1）通过软光刻的方法及打孔制备PDMS微腔室结构；
（2）PDMS微腔室结构通过等离子处理后,图形面冲下,放于干净的玻片上；
（3）将肺炎幼儿的血液震荡均匀后通入芯片中，由于PDMS在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，血液自动被吸收入红细胞固定腔室；
（4）由于红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，因此红细胞被吸入红细胞固定腔室后被单层固定；
（5）载有红细胞的微流控芯片置于超分辨显微镜上进行成像观察。这里展示其中三个肺炎幼儿的红细胞超分辨图像，如图6所示。
实施例4
使用本发明提出的固定装置用于成人红细胞表面溶胀位置的超分辨成像。将成人红细胞固定在芯片中后，在芯片主通道中通入水，水会通过红细胞入口扩散进入红细胞固定腔室，红细胞会受到渗透压的影响，发生溶胀，使用超分辨成像，可以拍摄红细胞溶胀时细胞膜表面的小孔，如图7所示。
实施例5
该固定装置还可用于久置成人红细胞的超分辨成像
（1）通过软光刻的方法及打孔制备PDMS微腔室结构；
（2）PDMS微腔室结构通过等离子处理后,图形面冲下,放于干净的玻片上；
（3）将冷藏3个月（久置）的成人的血样震荡均匀后通入芯片中，由于PDMS在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，血液自动被吸收入红细胞固定腔室；
（4）由于红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，因此红细胞被吸入红细胞固定腔室后被单层固定；
（5）载有红细胞的微流控芯片置于超分辨显微镜上进行成像观察。这里展示其中三个久置的成人红细胞超分辨图像，如图8所示。
以上实验内容得到了国家青年科学基金项目（项目号：21804016）和中央高校基本科研业务费（项目号：DUT17LK43）的支持。
Claims (3)
1.一种用于红细胞超分辨成像的固定装置，其特征在于：该装置包括设置在玻片（1）上的PDMS微腔室（2），PDMS微腔室（2）中设置多条微沟道结构（3），所述微沟道结构采用样品入口（4）和培养液入口（5）连接至入口主通道（6），入口主通道（6）呈弯曲状排布，入口主通道（6）连通多个红细胞固定腔室单元（7）后经出口主通道（8）连接出口（9）；所述红细胞固定腔室单元（7）采用固定腔室主通道（7b）上的红细胞固定腔室入口（7c）连接红细胞固定腔室（7a），固定腔室主通道（7b）连通入口主通道（6）和出口主通道（8）；所述红细胞固定腔室（7a）的厚度不超过红细胞线度的一倍，红细胞固定腔室（7a）的厚度为0.8-1.2um，红细胞固定腔室（7a）的大小为30um*30um到80um*80um之间。
2.根据权利要求1所述的一种用于红细胞超分辨成像的固定装置的使用方法，包括以下步骤：
（1）将血样震荡均匀后通入样品入口（4）中，由于PDMS微腔室（2）在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，血样自样品入口（4）进入到入口主通道（6）连通至固定腔室主通道（7b），再通过固定腔室入口（7c）连通至红细胞固定腔室（7a）；
（2）由于红细胞固定腔室的厚度不超过红细胞线度的一倍，因此红细胞在细胞固定腔室（7a）中被单层固定；
（3）载有红细胞的固定装置置于显微镜上进行超分辨成像。
3.根据权利要求1所述的一种用于红细胞超分辨成像的固定装置的应用，其特征在于：该装置应用于全内反射超分辨成像中。
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