CN109486684B - 一株低温秸秆降解真菌jgdw-1及其菌剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株低温秸秆降解真菌JGDW‑1，分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，于2018年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.15390。本发明菌株能在CMC‑刚果红培养基上产生降解圈，能在以农作物秸秆为唯一碳源的培养基上生长。本发明菌株能产生有关纤维素和半纤维素降解的酶类，将农作物秸秆中的大分子物质转化为可供植物吸收利用的小分子物质，实现在低温条件下农业废弃物的资源化利用，具有广阔的应用前景。实验表明，水稻秸秆接种孢子悬液后，10℃条件下170r/m液体发酵培养7d，水稻秸秆的降解率为47.3％。

Description

一株低温秸秆降解真菌JGDW-1及其菌剂与应用

技术领域

本发明属于农业资源环境领域，具体属于固体废弃物资源化利用领域，涉及一株低温(10～20℃)秸秆降解真菌JGDW-1及其菌剂，该真菌JGDW-1及其菌剂专用于降解废弃作物秸秆生产有机肥料，实现农业废弃物资源化。

背景技术

我国是农业大国，每年产生大量的农业废弃物废弃物，如小麦、水稻、玉米等农作物秸秆。一方面，这些秸秆含有大量植物生长所必需的营养元素，如C，但其主要以纤维素的方式存在，由于分子量较大而不能被植物直接利用。另一方面，近几十年化肥的施用严重破坏了土壤环境的健康，降低了土壤中的有益微生物的多样性。所以如何将农业废弃物有效利用，同时在产量不降低的前提下代替部分化肥的施用量已是当下的难题之一。利用纤维素降解菌处理废弃秸秆，具有环保、节能、高效等特点，且符合可持续发展的要求。

低温微生物是指在低温环境下具有生长繁殖能力的所有微生物，它们可以分布在各种低温的环境中。按照最适生长温度和生长的温度的不同，大致可以分为两大类：嗜冷型微生物和耐冷型微生物。其中嗜冷型微生物主要是指最适生长温度≤15℃，生长温度不能超过20℃的微生物群体；耐冷型微生物是指生长温度在0℃左右，最适生长温度超过20℃的微生物群体。

微生物可产纤维素酶以降解环境中废弃的纤维素，不仅避免了秸秆焚烧造成的大气污染，同时又可以充分利用农业废弃物中的纤维素资源。目前秸秆降解菌的研究主要集中在中、高温纤维素降解微生物，而对低温纤维素降解微生物的研究相对较少。中、高温纤维素降解菌必须在一定的温度条件下才能工作，对温度有一定的限制，而低温纤维素降解菌生命活动对温度的要求远较中、高温菌低，尤其适合解决中国北方冬季时间长、气温较低、纤维素降解较慢、发酵周期长的问题。因此，低温纤维素降解菌具有很大的应用前景，通过接种秸秆降解菌剂，可以加快底物中木质纤维素类物质的分解，且真菌产生的胞外纤维素分解酶活性远远高于细菌产生的纤维素分解酶活性。若能筛选到相应的高效功能真菌菌株，将其用于废弃秸秆的降解和生物有机肥生产，将会有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在低温(10～20℃)条件下高效分解农业废弃秸秆的真菌出芽短梗霉JGDW-1，其能高效分解农业废弃秸秆，使得农田中的废弃秸秆资源化，确保可持续农业的顺利发展。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株低温秸秆降解真菌JGDW-1，分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，于2018年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.15390。其生物学特性为：在10℃，PDA培养基平板上，初期菌落呈灰黑色，最终变为黑色，菌落质地柔软，周围坚硬，不易挑起，菌落边缘呈明显的根状。

JGDW-1能在CMC-刚果红培养基上生长并产生透明的水解圈。CMC-刚果红培养基配方为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

本发明的一个目的提供所述的低温秸秆降解真菌JGDW-1在降解农作物秸秆方面的应用。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述的低温秸秆降解真菌JGDW-1的真菌菌剂，孢子含量不低于10⁷个/mL。

本发明所述的真菌菌剂的制备方法，包括：将菌株JGDW-1接种至秸秆粉液体培养基中，10～20℃静止培养3～7d，加无菌水，放在摇床上震荡30min，用纱布过滤培养物后得到孢子悬液，即为真菌菌剂。

所述的无菌水和水稻秸秆粉培养基的体积比为3:5。

粗酶液制备方法，包括：真菌菌剂按1％的接种量接种于水稻秸秆粉液体培养基中，10℃条件下，170r/m培养7d，离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶液。

所述的水稻秸秆粉培养基：水稻秸秆粉末10g，KH₂PO₄ 3.0g，NaNO₃ 3.0g，CaCl₂0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，ZnSO₄·7H₂O 0.002g，CoCl₂ 0.003g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

所述的水稻秸秆粉液体培养基：水稻秸秆粉末20g，(NH₄)₂SO₄ 1.4g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，胰蛋白胨1g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄·H₂O0.0025g，ZnSO₄ 0.002g，CoCl₂ 0.003g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

所述的水稻秸秆粉末为水稻烘干至含水量1％以下，粉碎，过40目筛。

本发明所述的含有真菌JGDW-1的真菌菌剂在降解农作物秸秆方面的应用。

所述的农作物秸秆为水稻、小麦、玉米等农作物秸秆。

本发明的有益效果：

本发明菌株JGDW-1能在CMC-刚果红培养基上产生水解圈，可以在农业废弃物秸秆(水稻、小麦、玉米等秸秆)为唯一碳源的培养基上生长。

本发明菌株JGDW-1产生大量的有关纤维素和半纤维素降解的酶类，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶。经液体发酵后，过滤菌丝和固体杂质得到粗酶液，其内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶的活力分别为4.11U/ml粗酶液、240.59U/ml粗酶液、359.72U/ml粗酶液、43.91U/ml粗酶液和360.85U/ml粗酶液，为其高效快速的降解不同秸秆底物提供了基础，确保秸秆降解真菌JGDW-1在低温条件下将废弃农业秸秆发酵分解后制成小分子有机物料，加速秸秆还田腐熟，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，具有广阔的应用前景。

试验表明，水稻秸秆接种(1％的10⁷个孢子/mL)含有真菌JGDW-1孢子悬液后，10℃条件下170r/m液体发酵培养7d，水稻秸秆的失重率为47.3％；20℃条件下170r/m液体发酵培养7d，水稻秸秆的失重率仍可达到45.0％。

附图说明

图1为真菌JGDW-1的菌落形态。

图2为普通光学显微镜观察到的JGDW-1孢子形态。

图3为真菌JGDW-1在CMC-刚果红平板上产生的水解圈。

图4为真菌JGDW-1的系统发育进化树。

图5为水稻秸秆降解前后对比图，A为降解前的水稻秸秆，B为10℃降解7天后的水稻秸秆。

图6为真菌JGDW-1在不同温度下的水稻秸秆降解率。

生物保藏信息

JGDW-1，分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，于2018年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.15390。

具体实施方式

实施例1秸秆降解真菌菌株JGDW-1的分离与鉴定

降解真菌菌株JGDW-1是从山东省潍坊市某秸秆堆积处筛选得到。利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的土壤样品的悬液涂布到CMC-刚果红平板，10℃培养筛选纤维素降解菌。挑选在CMC-刚果红平板上产生透明圈较大并生长较快的菌株纯化分离，将它们接种至以水稻秸秆为唯一碳源的水稻秸秆粉培养基上，10℃培养，比较各菌株生长速度和生长情况，最终得到能在低温条件下高效降解水稻秸秆的真菌菌株JGDW-1。

CMC-刚果红培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。

水稻秸秆粉培养基：水稻秸秆粉末(过40目筛，含水量1％以下)10g，KH₂PO₄ 3.0g，NaNO₃ 3.0g，CaCl₂ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，ZnSO₄·7H₂O 0.002g，CoCl₂ 0.003g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。所述的水稻秸秆粉末为水稻烘干至含水量1％以下，粉碎，过40目筛。

如图1，JGDW-1生物学特性为：在PDA平板上，初期菌落呈灰黑色，最终变为黑色，菌落质地柔软，周围坚硬，不易挑起，菌落边缘呈明显的根状。

如图2，通过普通光学显微镜观察，JGDW-1的孢子呈椭圆形。

如图3，真菌JGDW-1在CMC-刚果红培养基上产生水解圈。

采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行ITS测序，所得序列经BLAST比对，发现与Aureobasidium pullulans strain RChB004有99％的相似度。选取和它相近的一些菌株绘制系统发育进化树(如图3)，结合菌落和形态学特征，鉴定菌株JGDW-1为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。

实施例2秸秆降解菌JGDW-1菌剂

将菌株JGDW-1接种至装有50mL水稻秸秆粉培养基(同实施例1)的三角瓶中，10℃条件下静止培养7d，加30mL无菌水去三角瓶中，放在摇床上震荡30min，用纱布过滤培养物，即为孢子悬液。孢子悬液按1％的接种量接种于液体培养基中，10℃条件下，以170r/m培养7d，离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶液。其中，液体培养基：水稻秸秆粉末20g，(NH₄)₂SO₄1.4g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，胰蛋白胨1g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，ZnSO₄ 0.002g，CoCl₂ 0.003g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min。水稻秸秆粉末为水稻烘干至含水量1％以下，粉碎，过40目筛。

测定粗酶液中内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活，见表1。

表1低温秸秆降解菌株菌JGDW-1的酶活

从表1中可以看出，菌株JGDW-1能够产生大量的有关纤维素和半纤维素降解的酶类，为其高效快速的降解不同秸秆底物提供了基础。

实施例3

采用三角瓶液体发酵的方法研究菌株JGDW-1对水稻秸秆的降解效果。

每个250mL三角瓶分装经2％NaOH溶液预处理后经50℃烘干的、剪碎至2-3cm长的水稻秸秆3.00g、液体培养基150mL。每瓶接种1.5mL 10⁷个孢子/mL浓度的孢子悬液，混匀后置于10℃、20℃、30℃、40℃恒温摇床170r/m培养，以接种等量无菌水作为空白对照。定期观察水稻秸秆的形态变化，7d后，洗去秸秆上的菌体，烘干至恒重，测定其降解率。

结果表明，分别在10、20℃接种24h后培养液开始变为灰黑色，此时，水稻秸秆开始变软，崩解分散。至48h之后已经完全变为黑色。空白对照处理中秸秆无明显变化，依然完整没有很明显的分解。如图6，在10℃接种JGDW-1的秸秆降解率为47.3％，随着温度上升，秸秆降解率下降，20℃时秸秆降解率仍能维持在45.0％，30℃时秸秆降解率高于30.0％，至40℃时秸秆降解率降低至15％，与空白对照处理的降解率(仅为13％)没有显著性差异。

由此可知，接种降解菌JGDW-1可以在低温(10～20℃)条件下显著加快秸秆的分解和其中成分的转化，加速底物的分解和转化。

Claims (10)

1.一株秸秆降解真菌JGDW-1，分类命名为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans，于2018年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 15390。

2.权利要求1所述的秸秆降解真菌JGDW-1在降解农作物秸秆中的应用。

3.一种含有权利要求1所述的秸秆降解真菌JGDW-1的真菌菌剂。

4.根据权利要求3所述的真菌菌剂，其特征在于孢子含量不低于10⁷个/ mL。

5.权利要求3所述的真菌菌剂的制备方法，其特征在于包括：将菌株JGDW-1接种至水稻秸秆粉培养基中，10～20℃静止培养3～7d，加无菌水，放在摇床上震荡，用纱布过滤培养物后得到孢子悬液，即为真菌菌剂。

6.根据权利要求5所述的真菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的无菌水和水稻秸秆粉培养基的体积比为3:5。

7.根据权利要求5所述的真菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的水稻秸秆粉培养基的组分为：水稻秸秆粉末10g，KH₂PO₄ 3.0g，NaNO₃ 3.0g，CaCl₂ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄·H₂O 0.0025g，ZnSO₄·7H₂O 0.002g，CoCl₂ 0.003g，琼脂20g，去离子水1000 mL，pH自然，121℃高压灭菌20 min。

8.根据权利要求7所述的真菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的水稻秸秆粉末为水稻烘干至含水量1%以下，粉碎，过40目筛。

9.权利要求3所述的真菌菌剂在降解农作物秸秆中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的农作物秸秆为水稻、小麦、玉米的秸秆。

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