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CN109477114A - 治疗癌症的针对癌胚抗原相关细胞粘附分子6的car免疫细胞 - Google Patents

治疗癌症的针对癌胚抗原相关细胞粘附分子6的car免疫细胞 Download PDF

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CN109477114A
CN109477114A CN201780044780.1A CN201780044780A CN109477114A CN 109477114 A CN109477114 A CN 109477114A CN 201780044780 A CN201780044780 A CN 201780044780A CN 109477114 A CN109477114 A CN 109477114A
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car
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cancer
seq
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黄华友
田保民
拉克什米·克里希南
贾姆什迪·坦哈
玛尼·黛安·乌格
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National Research Council of Canada
Helix Biopharma Corp
Original Assignee
National Research Council of Canada
Helix Biopharma Corp
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Abstract

本申请公开了嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体与CEACAM6、其表位或片段、或其变体结合。本申请还公开了包含所述CAR的细胞在治疗CEACAM6+癌症中的用途。

Description

治疗癌症的针对癌胚抗原相关细胞粘附分子6的CAR免疫细胞
发明领域
本发明涉及癌症免疫疗法，更具体地涉及用于治疗人类癌症的组合物和方法。本发明包括经工程化的CAR(嵌合受体抗原)和表达对癌症相关抗原具有高亲和力的此类CAR的经遗传修饰的免疫细胞。更具体地，细胞是识别实体瘤抗原的CAR-T细胞，其用途、其组合物和制备方法。本发明包括治疗CEACAM6依赖性癌症的治疗方法。
发明背景
过继性细胞转移(ACT)是将细胞转移到患者体内。在特定情况下，这涉及将患者自身的免疫细胞工程化以识别和攻击他们的肿瘤细胞。在一些方法中，将T细胞从对象收集，遗传工程化以在它们的表面上产生被称为嵌合抗原受体(CAR)的特殊受体，其允许T细胞识别肿瘤细胞上的特异性蛋白(抗原)。然后将这些经工程化的CAR-T细胞在实验室中扩增并重新引入患者体内，在那里它们检测肿瘤抗原并迅速激活，从而引发它们的细胞毒活性、在肿瘤微环境中释放细胞因子并进一步增殖。这导致杀死在它们的表面上携带有抗原的癌细胞。
迄今为止，研究的重点是鉴定和使用非实体肿瘤抗原来开发ACT疗法。CD19抗原存在于几乎所有正常和癌性B细胞的表面上，使其成为治疗淋巴瘤的良好靶标。然而，对于大多数实体癌症，肿瘤特异性抗原尚未被明确定义，使得难以选择抗原靶标。
癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)是糖基磷酸肌醇(GPI)连接的细胞表面蛋白并且是CEACAM家族蛋白的成员，所述CEACAM家族蛋白成员是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面糖蛋白。在许多实体瘤(诸如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、肝细胞癌和结肠癌)中CEACAM6的表达升高(Blumenthal等人，2007,BMC Cancer 2007；7:2.7)。此外，CEACAM6在胰腺癌组织中的过表达促进胰腺癌细胞侵袭、转移和血管生成，使得CEACAM6成为胰腺癌疗法的靶标。
虽然利用CAR细胞疗法的过继性细胞转移似乎是手术、化学疗法和放射疗法的有吸引力的替代方案，但是治疗局限于小的临床试验，并且关于其临床应用存在问题。例如，可能受限的是CAR-T细胞的体内扩增、输注后CAR-T细胞的消失和副作用(诸如细胞因子释放综合征)。最值得注意的是，对靶标癌症抗原的亲和力可能差异很大，并因此临床活性也各不相同。此外，CAR-T细胞可以不加选择地以同样的方式攻击健康细胞和肿瘤细胞，导致“中靶、脱肿瘤毒性”。如果中靶、脱肿瘤反应性破坏或损害必需组织或导致压倒性细胞因子分泌，则CAR-T细胞疗法的副作用可能是不可耐受的。因此，开发对靶标癌症抗原具有高亲和力并因此有效治疗表达此类抗原的CAR和CAR细胞将是有利的，其中证明了临床有效性并且可能的副作用是可耐受的。
本领域迫切需要使用以特异性和所期望的有效临床活性识别CEACAM6肿瘤抗原的CAR的组合物、制备此类组合物的方法以及治疗实体瘤的方法。本发明解决了这种需要。
发明概述
本发明提供了经工程化以靶向实体瘤抗原的CAR。本文所述的CAR对实体瘤抗原具有高亲和力。在一些方面，本文所述的CAR对CEACAM6依赖性癌症具有高亲和力。本文所述的CAR的独特特异性来自使用sdAb(单结构域抗体)代替经工程化的CAR的scFv。由于其尺寸小，这提供了更高的亲和力。此类抗体还具有易于重折叠的倾向和生物物理稳定性。此外，它们可以识别常规抗体不可接近的表位并且可以被工程化。
在本文所述的一些方面，sdAb是特异性针对实体瘤抗原的骆驼科单结构域抗体。在一些方面，sdAb特异性针对CEACAM6肿瘤抗原以及其片段或变体。
在一些方面，提供了表达本文所述的CAR的免疫细胞。免疫细胞通常是T细胞或CIK细胞。
在本文所述的一些方面，提供了用于制备特异性针对CEACAM6的CAR-T的方法。在一些方面，所述方法可以是病毒性的或非病毒性的。更具体地，在一些方面中的方法是包含转座子的非病毒性方法。
本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含与CEACAM6以及其变体、片段和特定表位结合的抗原结合结构域、跨膜结构域、一种或多种共刺激信号传导区以及CD3ζ信号传导结构域。在一方面，编码CAR的核酸序列包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
在一方面，CAR中的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合片段是单结构域抗体或其片段。
在一方面，CAR中的抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。在一方面，肿瘤抗原与实体瘤相关。在另一方面，肿瘤抗原选自CEACAM6、其片段、其变体及其表位。
在一方面，CAR中的共刺激信号传导区包含选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，以及其任何组合。
本发明还提供了分离的CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
本发明还提供了包含编码CAR的核酸序列的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
在一方面，包含CAR的免疫细胞选自：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CIK细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
本发明还提供了包含编码CAR的核酸序列的载体，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
本发明还提供了用于刺激哺乳动物中T细胞-介导的对靶组织的免疫应答的方法。在一方面，该方法包括向哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中选择抗原结合结构域以特异性识别靶细胞群或组织。
本发明还包括治疗患有与CEACAM6抗原表达升高相关的疾病、病症或病况的哺乳动物的方法。在一方面，该方法包括向哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含特异性针对CEACAM6的抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，从而治疗哺乳动物。
在一方面，细胞是自体T细胞。
在另一方面，细胞是同种异体T细胞。
在一方面，肿瘤抗原是CEACAM6、其变体、其片段及它们的任何组合。
本发明还包括在被诊断患有癌症的人中产生持续存在的经遗传工程化的T细胞群的方法。在一方面，该方法包括向人施用经遗传工程化以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中持续存在的经遗传工程化的T细胞群在施用后在人体内持续存在至少一个月。
在一方面，持续存在的经遗传工程化的T细胞群包含选自以下的至少一种细胞：施用至人的T细胞、施用至人的T细胞的子代，及它们的组合。
在一方面，持续存在的经遗传工程化的T细胞群包含记忆T细胞。
在一方面，持续存在的经遗传工程化的T细胞群在施用后在人体内持续存在至少三个月。在另一方面，持续存在的经遗传工程化的T细胞群在施用后在人体内持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
本发明还提供了在被诊断患有癌症的人中扩增经遗传工程化的T细胞群的方法。在一方面，该方法包括向人施用经遗传工程化以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含特异性针对CEACAM6的抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中施用的经遗传工程化的T细胞在人体内产生子代T细胞群。
在一方面，在人体内的子代T细胞包含记忆T细胞。
在一方面，T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
在一方面，免疫细胞是CIK细胞，其可以是自体的或同种异体的。
在另一方面，人对至少一种化学治疗剂有抗性。
在一方面，癌症是表达CEACAM6以及其变体或表位的任何癌症。此类癌症包括但不限于胰腺、乳腺、结肠直肠、肺、胃、卵巢和膀胱。
在一方面，子代T细胞群在施用后在人体内持续存在至少三个月。在另一方面，子代T细胞群在施用后在人体内持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
在本发明的一些方面的是嵌合抗原受体(CAR)，其与CEACAM6、CEACAM6的表位或片段、或CEACAM6的变体结合。
在一些方面，CAR包含用于与CEACAM6结合的单结构域抗体或其片段。
在一些方面，单结构域抗体或其片段属于骆驼科(Camelidae)物种。
在一些方面，CAR与CEACAM6的表位结合，所述表位包含序列NRIGYSWYKG(SEQ IDNO:6)或由序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)组成。
在一些方面，CAR包含用于与CEACAM6结合的包含GRTNSVYTMG(SEQ ID NO:1)的序列的互补决定区(CDR)1；包含IMWGAGTNTHYADSVKG(SEQ ID NO:2)的序列的CDR2；和/或包含AANRGIPIAGRQYDY(SEQ ID NO:3)的序列的CDR3。
在一些方面，CAR包含以下序列：
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)，或与SEQID NO:4具有至少90％同一性的序列。
在一些方面，CAR包含间隔分子、跨膜区和选自以下的一种或多种细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
在一些方面，CAR包含以下序列或由以下序列组成：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:5)。
在一些方面的是包含如本文所述的CAR的免疫细胞。细胞可以是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。在一些方面，免疫细胞还可以包含至少第二CAR。
在一些方面，免疫细胞包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。在一些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统(Sleeping Beauty transposon/transposase system)。在另外的方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
在另外的方面，CAR免疫细胞还可以包含自杀基因。
在另外的方面，将CAR免疫细胞作为包含药学载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物来提供。可以将该组合物冷藏、冷冻或解冻。
在本发明的一些方面的是编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含CEACAM6结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述CEACAM6结合部分与CEACAM6或其变体或片段结合。
在一些方面，CEACAM6结合部分包含针对CEACAM6或CEACAM6的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些方面，CEACAM6结合部分包含单克隆抗体的可变区。
在一些方面，免疫细胞激活部分包含以下蛋白中的任一种或多种的T细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白以及它们的变体或片段。
在一些方面，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少一种的核酸序列；和/或其与SEQ ID NO:6的序列结合。
在一些方面的是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N末端至C末端依次包含：
i)特异性针对CEACAM6抗原结合单结构域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40多肽；和
iv)细胞内信号传导结构域。
在一些方面，第一多肽包含在单结构域抗体和跨膜结构域之间插入的铰链区。
在一些方面，铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或来源于CD8的铰链。
在一些方面，细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
在一些方面，细胞内信号传导结构域包含选自CD3-ζ和ZAP70的ITAM。
在一些方面，将核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
在一些方面，将核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
在本发明的一些方面的是由如本文所公开的核酸序列编码的嵌合抗原受体(CAR)，在一些方面中，CAR特异性针对CEACAM6。
在一些方面，本发明的CAR包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些方面的是包含如本文所述的核酸分子的载体。
在一些方面的是表达如本文所述的核酸分子或CAR的宿主细胞，在一些方面，宿主细胞是免疫细胞。
在一些方面，宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞，并且在一些方面，还可以包含至少第二CAR。
在一些方面，宿主细胞还可以包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统，在一些方面，转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。在另外的方面，转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
在一些方面，宿主细胞还可以包含自杀基因。
在一些方面的是包含如本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群。
在一些方面的是包含如本文所述的免疫细胞或宿主细胞的药物组合物。
在一些方面的是治疗或预防哺乳动物中表达CEACAM6的癌症的方法，该方法包括以有效治疗或预防哺乳动物的癌症的量向所述哺乳动物施用如本文所述的免疫细胞或宿主细胞。在一些方面，肿瘤是实体瘤。在一些方面，癌症是胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌或膀胱癌。
在一些方面的是用于在对象中减少表达CEACAM6的肿瘤的生长或减小表达CEACAM6的肿瘤的大小的方法，其中该方法包括施用包含特异性针对CEACAM6抗原的CAR-T的组合物。
1.嵌合抗原受体(CAR)，其与CEACAM6、CEACAM6的表位或片段、或CEACAM6的变体结合。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含用于与CEACAM6结合的单结构域抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的CAR，其中所述单结构域抗体或其片段属于骆驼科物种。
4.如权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述CAR与CEACAM6的表位结合，所述表位包含序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)或由序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)组成。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含用于与CEACAM6结合的至少一个互补决定区(CDR)，所述互补决定区(CDR)选自CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含GRTNSVYTMG(SEQ ID NO:1)的序列；CDR2包含IMWGAGTNTHYADSVKG(SEQ ID NO:2)的序列；CDR3包含AANRGIPIAGRQYDY(SEQ ID NO:3)的序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的CAR，其包含以下序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAN RGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)，或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的CAR，其包含间隔分子、跨膜区和选自以下的一种或多种细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
8.如权利要求1至7中任一项所述的CAR，其包含以下序列或由以下序列组成：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:5)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述CAR是人源化的。
10.免疫细胞，其包含权利要求1至9中任一项所述的CAR。
11.如权利要求10所述的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。
12.如权利要求10或11所述的免疫细胞，其还包含至少第二CAR。
13.如权利要求10至12中任一项所述的免疫细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
14.如权利要求13所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
15.如权利要求13或14所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
16.如权利要求10至15中任一项所述的免疫细胞，其还包含自杀基因。
17.如权利要求10至16中任一项所述的免疫细胞，其被配制成包含药学载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。
18.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含CEACAM6结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述CEACAM6结合部分与CEACAM6或其变体或片段结合。
19.如权利要求18所述的核酸分子，其中所述CEACAM6结合部分包含针对CEACAM6或CEACAM6的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。
20.如权利要求19所述的核酸分子，其中所述CEACAM6结合部分包含所述单克隆抗体的可变区。
21.如权利要求18至20中任一项所述的核酸分子，其中所述免疫细胞激活部分包含以下蛋白中的任一种或多种的T细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白，以及它们的变体或片段。
22.如权利要求18至21中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少一种的核酸序列；和/或其与SEQID NO:6的序列结合。
23.包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N-末端至C-末端依次包含：
i)特异性针对CEACAM6的抗原结合单结构域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40多肽；和
iv)细胞内信号传导结构域。
24.如权利要求23所述的核酸分子，其中第一多肽包含在所述单结构域抗体和所述跨膜结构域之间插入的铰链区。
25.如权利要求24所述的核酸分子，其中所述铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或来源于CD8的铰链。
26.如权利要求23至26中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
27.如权利要求26所述的核酸分子，其中包含ITAM的所述细胞内信号传导结构域选自CD3-ζ和ZAP70。
28.如权利要求23至27中任一项所述的核酸分子，其中将所述核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
29.如权利要求23至28中任一项所述的核酸分子，其中将所述核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
30.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求20至29中任一项所述的核酸序列编码。
31.如权利要求30所述的CAR，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
32.载体，其包含如权利要求20至29中任一项所述的核酸分子。
33.宿主细胞，其表达如权利要求20至29中任一项所述的核酸分子，或如权利要求30或31所述的CAR。
34.如权利要求33所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
35.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞。
36.如权利要求33至35中任一项所述的宿主细胞，其还包含至少第二CAR。
37.如权利要求33至36中任一项所述的宿主细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
38.如权利要求37所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
39.如权利要求37或38所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
40.如权利要求33至39中任一项所述的宿主细胞，其还包含自杀基因。
41.细胞群，其包含至少一种如权利要求33至40中任一项所述的宿主细胞。
42.药物组合物，其包含权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞，或权利要求33至38中任一项所述的宿主细胞。
43.治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防所述哺乳动物的癌症的量向所述哺乳动物施用权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞或权利要求33至40中任一项所述的宿主细胞。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述癌症是表达CEACAM6的癌症。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌或膀胱癌。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其还包括施用化学治疗剂。
47.如权利要求42所述的药物组合物，其还包含化学治疗剂。
48.制备选自T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的免疫细胞的权利要求1至9中任一项所述的CAR用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的用途。
49.权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的癌症的用途。
50.权利要求17或42所述的组合物用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的用途。
51.权利要求41所述的细胞群用于制备治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的药物的用途。
52.核酸分子，其具有SEQ ID NO:9。
53.核酸分子，其具有SEQ ID NO:10。
附图简述
当结合附图阅读时，将更好地理解本文所述的典型方面的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前典型的方面。然而，应该理解，本发明不限于附图中所示方面的精确安排和手段。
图1是显示在CAR-T细胞存在下，靶细胞杀伤增加的图。RTCA使用BXPC3(CEACAM6阳性)靶细胞。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行56小时。
图2是显示在CAR-T细胞的存在下，没有杀伤CEACAM6阴性细胞的图。RTCA使用Pan02a(对CEACAM6呈阴性)靶细胞。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行36小时。
图3A是显示干扰素γ分泌水平以显著和CAR-T特异性方式增加的图。3B显示了针对IFN-γ分泌测定产生的标准曲线。
图4A是显示IL-2分泌水平以显著的CAR-T特异性方式增加的图。4B是显示针对IL-2分泌测定产生的标准曲线的图。
图5显示抗Fab抗体与CAR-T细胞的结合，其表明转导效率>26％。
图6显示了表明CEACAM-6 CAR-T细胞对靶标BxPC-3细胞的增强的细胞毒性效应的RTCA。效应细胞：靶细胞的比率＝10:1。A.用于注射#1的CAR-T细胞，第1天；B.用于注射的CAR-T细胞，第8天。C.用于注射#3的CAT-T细胞，第15天。
图7是显示CEACAM-6 CAR-T细胞在体内显著降低BxPC3异种移植肿瘤生长的图。每组N＝5只小鼠。箭头表示注射日(第1、8、15日)。显示平均值+/-标准误差。计算p值，并且在第29天，CAR-T组相对于PBS和对照模拟T细胞组，差异显著，p<0.001。
图8显示了在注射CEACAM-6-CAR-T和T细胞后小鼠的体重。
图9显示了在BxPC3细胞注射后，在第30天收集的肿瘤。CEACAM-6处理的小鼠具有显著减小的肿瘤尺寸并且一个肿瘤被完全消除。
图10显示了流式细胞术分析，其表明用慢病毒CAR有效转导T细胞，并表达CEACAM-6 scFv。CD3-APC染色检测到高百分比的T细胞。
图11显示了使用胰腺癌BXPC3(CEACAM6阳性的)靶细胞的RTCA的结果。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行26小时。数据显示在CEACAM-6 CAR-T细胞存在下，靶细胞的杀伤增加。
图12显示了使用结肠癌S174-T(CEACAM6阳性的)靶细胞的RTCA的结果。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行26小时。数据显示在CEACAM-6 CAR-T细胞存在下，靶细胞的杀伤增加。
图13显示了使用乳腺导管癌HCC-1954(CEACAM6阳性的)靶细胞的RTCA的结果。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行26小时。数据显示在CEACAM-6 CAR-T细胞存在下，靶细胞的杀伤增加。
图14显示了使用肺癌A549(CEACAM6阳性的)靶细胞的RTCA的结果。效应细胞与靶细胞的比率为10:1。在引入效应细胞后，RTCA数据收集再进行26小时。数据显示在CEACAM-6CAR-T细胞存在下，靶细胞的杀伤增加。
图15显示了表明CEACAM-6 CAR-T细胞对靶BxPC-3细胞的增强的细胞毒性效应的RTCA的结果。效应细胞：靶细胞的比率＝10:1。在第13天加入T细胞和CAR-T细胞。A.用于注射#1的CAR-T细胞。B.用于注射#2的CAR-T细胞。C.用于注射#3的CAR-T细胞。
图16显示了CEACAM-6 CAR-T细胞在体内显著降低建立的BxPC3异种移植肿瘤的生长。每组N＝5只小鼠。箭头表示注射日。显示平均值+/-标准误差。
图17显示了注射PBS、CEACAM-6-CAR-T细胞和T细胞后小鼠的体重。
图18显示了在BxPC3细胞注射后，在第34天收集的肿瘤的图像。CEACAM-6处理的小鼠具有显著减小的肿瘤尺寸，并且两个肿瘤被完全消除。
详述
定义
除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以将与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料用于测试本发明的实践中，但本文描述了典型的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述特殊方面的目的，而不是意在为限制性的。
在本文中使用冠词“一个/种(a/an)”是指冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)的语法对象。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
当涉及可测量值(诸如数量、时间持续时间等)时，如本文所用的“约”意在涵盖相对于指定值的±20％或±10％、更通常为±5％、甚至更通常为±1％和更通常为±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用的“激活”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫细胞(诸如CIK细胞或T细胞)的状态。激活还可能与诱导的细胞因子产生以及可检测的效应物功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”，在本领域中也被称为“免疫球蛋白”(Ig)，在本文中用于指代由成对的重多肽链和轻多肽链构建的蛋白；存在多种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。当抗体正确折叠时，每条链折叠成许多不同的球状结构域，所述球状结构域由更线性的多肽序列连接。例如，免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域，而重链折叠成可变(VH)结构域和三个恒定(CH、CH2、CH3)结构域。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域具有本领域技术人员熟悉的已经确定的结构。
轻链可变区和重链可变区负责结合靶标抗原，并因此可以在抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的免疫事件。抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，并因此决定抗体对其靶标抗原的特异性。大多数序列可变性发生在六个高变区中，每个可变重链和轻链各三个；高变区结合以形成抗原结合位点，并有助于结合和识别抗原决定簇。抗体对其抗原的特异性和亲和力是由高变区的结构以及它们呈现给抗原的表面的尺寸、形状和化学性质决定的。存在用于鉴定高可变性区的多种方案，两种最常见的是Kabat的那些方案以及Chothia和Lesk的那些方案。Kabat等人(1991a；1991b)基于VH和VL结构域的抗原结合区的序列可变性限定了“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987)基于VH和VL结构域中结构环区的位置限定了“高变环”(H或L)。由于这些单独的方案限定了相邻或重叠的CDR和高变环区，因此抗体领域的技术人员通常可互换地利用术语"CDR"和“高变环”，并且它们可以如此在本文中使用。由于这个原因，形成抗原结合位点的区域，在包含VH和VL结构域的抗体的情况下，被称为CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、CDR H3；或者在重链或轻链的抗原结合区的情况下，被称为CDR1、CDR2，CDR3。CDR/环在本文中根据被开发以帮助可变结构域的比较的IMGT编号系统(Lefranc等人，2003)被提及。在该系统中，保守氨基酸(诸如Cys23、Trp41、Cys104、Phe/Trp118和在位置89处的疏水性残基)总是具有相同的位置。此外，提供了框架区(FR1：位置1至26；FR2：39至55；FR3：66至104；和FR4：118至128)和CDR(CDR1：27至38，CDR2：56至65；和CDR3：105至117)的标准化的界定。
如本文所提及的“抗体片段”可以包括本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或者可以通过操作天然存在的抗体或通过使用重组方法获得。例如，抗体片段可以包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由用肽接头连接的VL和VH组成的分子)、Fab、F(ab')2、单结构域抗体(sdAb；由单个VL或VH组成的片段)，以及这些中任一种的多价呈现。
如本文所用的术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如通过如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子产生并且其DNA分子表达抗体蛋白的抗体，或指定抗体的氨基酸序列，其中使用本领域可获得的并且众所周知的合成DNA或氨基酸序列的技术获得DNA或氨基酸序列。
在非限制性实例中，抗体片段可以是来源于天然存在的来源的sdAb。骆驼科来源的重链抗体(Hamers-Casterman等人，1993)缺乏轻链，并因此它们的抗原结合位点由一个称为VHH的结构域组成。在鲨鱼中也观察到了sdAb，并被称为VNAR(Nuttall等人，2003)。可以基于人Ig重链和轻链序列工程化其他sdAb(Jespers等人，2004；To等人，2005)。如本文所用的，术语“sdAb”包括通过噬菌体展示或其他技术从任何来源的VH、VHH、VL或VNAR储库直接分离的那些sdAb，来源于上述sdAb的sdAb，重组产生的sdAb，以及通过人源化、亲和力成熟、稳定化、增溶(例如骆驼化)或其他抗体工程化方法进一步修饰此类sdAb而产生的那些sdAb。本发明还涵盖了保留sdAb的抗原结合功能和特异性的同源物、衍生物或片段。
SdAb是新型抗体分子的优良构建模块，由于它们具有高热稳定性、高洗涤剂抗性、对蛋白酶的相对高抗性(Dumoulin等人，2002)和高产率(Arbabi-Ghahroudi等人，1997)；也可以通过从免疫文库中分离(Li等人，2009)或通过体外亲和力成熟(Davies&Riechmann，1996)，将它们工程化以具有非常高的亲和力。
本领域技术人员将熟知单结构域抗体的结构(参见，例如，蛋白质数据库中的3DWT、2P42)。sdAb包含保留免疫球蛋白折叠的单个免疫球蛋白结构域；最值得注意的是，仅三个CDR形成抗原结合位点。然而并且如本领域技术人员所理解的，并非所有CDR都可能是结合抗原所需的。例如并且不希望是限制性的，CDR中的一个、两个或三个可以有助于通过本发明的sdAb结合和识别抗原。sdAb或可变结构域的CDR在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3，并且如Kabat等人(1991b)所限定编号。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被限定为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)，都可以作为抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且以多种组合排列这些核苷酸序列以引发所期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以被合成或可以来源于生物样品。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”或“癌症治疗”是指可以通过减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、降低肿瘤生长速率、减少转移数量、稳定的疾病、增加预期寿命或改善与癌症病况相关的各种生理症状来证明的生物学效应。“抗肿瘤效应”也可以通过本文所述的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来证明。
根据本发明，术语“自体抗原”意指被免疫系统错误地识别为外来的任何自身抗原。自体抗原包含但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用的，术语“自体的”意指来源于相同个体的任何材料，其随后将被重新引入个体。
“同种异体的”是指来源于相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”是指来源于不同物种的移植物。
“同系同种”是指来源于相同个体的移植物。
如本文所用的术语“癌症”被限定为以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原提呈细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外，还介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其涵盖与存在于T细胞上的共刺激分子(诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体)特异性结合的抗体。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而通过T细胞介导共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的，“共刺激信号”是指与主要信号(诸如TCR/CD3连接)组合引起T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
如本文所用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(诸如基因、cDNA或mRNA)用作在具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质和由此产生的生物学性质。因此，如果在细胞或其他生物系统中，对应于基因的mRNA的转录和翻译产生蛋白，则基因编码蛋白。可以将编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(被用作基因或cDNA转录的模板)两者称为编码此基因或cDNA的蛋白或其他产物。
如本文所用的，“内源性的”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
如本文所用的，术语“外源性的”是指从生物体、细胞、组织或系统之外引入或在生物体、细胞、组织或系统之外产生的任何材料。
如本文所用的，术语“表达”被限定为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供用于表达的其他元件。表达载体包括掺入重组多核苷酸的本领域已知的所有那些表达载体，诸如粘粒、质粒(例如裸露的或被包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源的”是指两条多肽之间或两条核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据(例如如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据)时，，那么分子在此位置处是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两条序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。通常，当比对两条序列时进行比较以给出最大同源性。
“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(诸如例如宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷、“C”是指胞嘧啶、“G”是指鸟苷、“T”是指胸苷和“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，其程度为编码蛋白的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；它们可以将大量遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
“转座子”或“可转座元件”是可以改变其在基因组内的位置，有时产生或逆转突变并改变细胞基因组大小的DNA序列。转座经常导致转座子的复制。存在两种不同类型的转座子：II类转座子，它由直接从一个地方移动到另一个地方的DNA组成；和I类转座子，其是逆转录转座子，它首先将DNA转录成RNA，然后使用逆转录酶制备RNA的DNA拷贝以插入新的位置。转座子通常与介导转座子移动的转座酶相互作用。转座子/转座酶系统的非限制性实例包括睡美人、Piggybac、青蛙王子(Frog Prince)和白马王子(Prince Charming)。
如本文所用的，术语“调节”意指在不存在治疗或化合物的情况下，与对象中的应答水平相比和/或与在其它方面相同但未经治疗的对象中应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而在对象(通常是人)中介导有益的治疗应答。
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，将第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则将启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区域(例如患者的特定组织或器官内的实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射，或输注技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等可以在本文中互换使用，并且是指适合于本文所述的方法的任何动物或其细胞(无论是体外还是原位)。
此外，术语“患者”、“对象”和“个体”包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。在某些非限制性方面，患者、对象或个体是哺乳动物并且包括人、狗、猫、小鼠、大鼠，以及它们的转基因物种。
如本文所用的，术语“多核苷酸”被限定为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员通常知道核酸是多核苷酸，其可以被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段(即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)，和通过合成手段。
如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白序列或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括通过肽键彼此连接的包含两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如本文所用的，该术语是指短链(其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体)，并且是指较长的链(其通常在本领域被称为蛋白，其有很多种类型)。“多肽”包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
如本文所用的，术语“启动子”被限定为启动多核苷酸序列特异性转录所需的，由细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。
如本文所用的，术语“启动子/调控序列”意指与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是，例如，以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下引起基因产物在细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才引起基因产物在细胞中产生。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生。
如本文关于抗体使用的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一种物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一种或多种物种的抗原结合。但是，此类交叉物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，此类交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，可以将术语“特异性结合”或“特异性地结合”用于指抗体、蛋白或肽与第二化学物种的相互作用，以意味着相互作用取决于化学物种上特殊结构(如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合至特定的蛋白结构而不是蛋白。如果抗体是特异性针对表位“A”的，则含有表位A的分子(或游离的、未标记的A)在含有标记的“A”和抗体的反应中的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合而与非后者的结合丧失。
术语“刺激”意指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，诸如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β下调和/或细胞骨架结构重组等。
如本文使用的术语“刺激分子”意指T细胞上的分子，其与抗原提呈细胞上存在的同源刺激配体特异性结合。
如本文所用的“刺激配体”意指这样的配体：当其存在于抗原提呈细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，从而由T细胞介导初级应答，包括但不限于激活、启动免疫应答、增殖等。刺激性配体是本领域众所周知的，并且尤其涵盖载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
如本文所用的，“基本上纯化的”细胞是基本上无其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从与在它天然存在状态下通常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经从与在它们的天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
如本文所用的，“治疗”或“疗法”是获得有益的或期望的临床结果的方法。出于本文所述的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)的疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。如果不接受治疗或疗法，“治疗”和“疗法”也可以意味着与预期的存活相比延长存活。因此，“治疗”或“疗法”是意在改变病症的病理而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防、减缓或否则减少疾病或病症(诸如癌症)的病理，或者可以使细胞对通过其他治疗剂的治疗或疗法更易感。
如本文所用的，术语“治疗的”意指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得的治疗效果。
术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的将引起组织、系统或对象的生物学或医学应答的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括这样的化合物的量：当施用时足以预防正在治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状的发展或将正在治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状减轻到一定程度。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度和待治疗对象的年龄、体重等而变化。
如本文使用的，术语“治疗”疾病意指降低对象经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。
此外，具有治疗有效量的对象的治疗方案可以由单一施用组成，或者可替代地包括一系列施加。治疗期的长度取决于多种因素，诸如疾病的严重程度、对象的年龄、试剂的浓度、患者对试剂的应答性或它们的组合。还应理解，用于治疗的试剂的有效剂量可以在特殊治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以得到剂量的变化并且变得显而易见。在一些方面，可以在用用于所讨论的疾病或病症(诸如癌症)的常规疗法治疗之前、期间或之后施用本文所述的抗体。
如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指通过其将外源性核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括主要的主题细胞及其子代。
如本文所用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制通过RNA聚合酶的转录启动和多核苷酸的表达。
“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且可以被用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应BEI解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
范围：贯穿本公开，可以以范围形式呈现本文所述的各方面。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本文所述的范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。例如，应该认为对诸如1至6的范围的描述具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的个别数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
应当理解，被描述为“包含”某些组分的任何方面也可以“由……组成”或“基本上由……组成”，其中“由……组成”具有封闭式或限制性含义并且“基本上由……组成”意指包括指定的组分但不排除其他组分，除了作为杂质存在的物质、作为被用于提供组分的过程的结果而存在的不可避免的物质，以及为了达到本文所述的技术效果之外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由......组成”限定的组合物涵盖任何已知的药学上可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物将包含少于5重量％、通常少于3重量％、更通常少于1重量％的未指定组分。
应当理解，可以通过附带条件或否定限制从要求保护的发明中明确排除本文中限定为被包括的任何组分。
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并发的)施用和以任意顺序连续施用。
术语“药学上可接受的”意指化合物或化合物组合与药物用途的制剂的其余组成部分相容，并且通常根据既定的政府标准(包括由美国食品和药品管理局(the UnitedStates Food and Drug Administration)颁布的那些标准)向人类施用是安全的。
术语“药学上可接受的载体”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和/或吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的使用是众所周知的。
分离的：“分离的”生物组分(诸如蛋白质)已经基本上从在其中组分天然存在的生物体细胞中的其他生物成分(即染色体和染色体外DNA和RNA、其他蛋白和细胞器)分离或纯化。已经被“分离的”的蛋白和肽包括通过标准纯化方法纯化的蛋白和肽。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白和肽，以及化学合成的蛋白和肽。
如本文所用的，“肿瘤”是指所有赘生的细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)以及所有癌前和癌性细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。待治疗的癌症可以是任何类型的恶性肿瘤，并且在一个方面，是肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如腺癌))、胰腺癌、结肠癌(例如结肠直肠癌，诸如例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、食管癌、口腔鳞癌、舌癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴谱系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤)、霍奇金氏病、骨髓性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)或慢性骨髓性白血病(CML))、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、甲状腺滤泡状癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间充质来源的肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠道间质肉瘤、恶性外周神经鞘肿瘤(MPNST)、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、间充质软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、脑肿瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、良性皮肤肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、肾胚细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌(包括晚期疾病和激素难治性前列腺癌)、睾丸癌、骨肉瘤、头颈癌、表皮癌、多发性骨髓瘤(例如难治性多发性骨髓瘤)或间皮瘤。在一方面，癌细胞来源于实体瘤。典型地，癌细胞来源于乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌或前列腺癌。更典型地，癌细胞来源于前列腺癌、肺癌、乳腺癌或黑素瘤。
“化学治疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派、CYTOXANTM环磷酰胺；烷基磺酸酯类，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；乙酸原化合物(acetogenins)，诸如布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone)；喜树碱类，诸如拓扑替康；苔藓抑素；callystatin；CC-1065及其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物；隐藻素类(cryptophycins)，诸如隐藻素1和隐藻素8；多拉司它汀(dolastatin)；duocarmycins，诸如合成类似物KW-2189和CB1-TM1；艾植塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；sarcodictyins；海绵抑制素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素类，例如卡奇霉素(calicheamicin)、尤其卡奇霉素γ1I和刺孢霉素ωI1，达内霉素(包括达内霉素A)，二膦酸盐类诸如氯膦酸盐，埃斯波霉素，新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团；阿克拉霉素；放线菌素；安曲霉素；重氮丝氨酸；博来霉素；放线菌素C(cactinomycin)；卡柔比星(carabicin)；洋红霉素；嗜癌菌素；色霉素；放线菌素D(dactinomycin)；道诺霉素；地托比星；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸；ADRIAMYCINTM多柔比星，包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星；表柔比星；依索比星；伊达比星；麻西罗霉素；丝裂霉素类，诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，诸如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类，诸如美登新和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSKTM多糖复合物；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类，诸如T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；紫杉烷类，诸如TAXOLTM紫杉醇、ABRAXANETM紫杉醇的无克列莫佛的白蛋白工程化纳米颗粒制剂、TAXOTERETM和多西他赛；苯丁酸氮芥；GEMZARTM吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；长春新碱；NAVELBINETM长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康，诸如CPT11；拓扑异构酶抑制剂，诸如RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A类，诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
该限定还包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如它莫昔芬(包括NOLVADEXTM它莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和FARESTON托瑞米芬；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂(其调控肾上腺中的雌激素产生)，诸如例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASETM醋酸甲地孕酮、AROMASINTM依西美坦、福美司坦、法倔唑、RIVISORTM伏氯唑、FEMARATM来曲唑和ARIMIDEXTM阿那曲唑；以及抗雄激素类，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧茂烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号传导通路中基因表达的那些，诸如例如，PKC-α、Ralf和H-Ras；核糖酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYMETM核糖酶)和HER2表达抑制剂；抗体，诸如抗VEGF抗体(例如，AVASTINTM抗体)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTINTM疫苗、LEUVECTINTM疫苗和VAXIDTM疫苗；PROLEUKINTMrIL-2；LURTOTECANTM拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXTMrmRH；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些方面，本文所述的抗体与其他常规抗癌治疗相加或协同作用。
本文提及许多专利申请、专利和出版物以帮助理解所述的方面。这些参考文献中的每一篇均通过引用整体并入本文。
本发明涉及用于治疗癌症(在一些方面为实体瘤)的组合物和方法。本发明涉及经转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞的过继性细胞转移策略。CAR是将对所期望抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域组合以产生展现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。经基因修饰的T细胞疗法包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入T细胞，其中CAR对肿瘤细胞的表面抗原具有特异性并且具有激活离体生长的T细胞的能力，由此获得的引入基因的T细胞，然后将细胞输注至患者体内。
本发明通常涉及此类经遗传修饰以稳定表达特异性针对实体瘤抗原(更具体地表达CEACAM6抗原、其片段和/或表位以及这些的变体的实体瘤)的CAR的T细胞的用途，。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR-T细胞或CAR修饰的T细胞。在本发明的一些方面，将T细胞进行遗传修饰以稳定表达CAR，其将特异性针对CEACAM6的sdAb的抗原识别结构域与一种或多种细胞内共刺激结构域以及信号传导结构域组合成单个嵌合蛋白。
嵌合抗原受体(CAR)
在一方面，本文描述了经工程化的CAR。CAR包含与CEACAM6、其表位、其片段或上述变体结合的CEACAM6结合部分，并且还包含免疫细胞激活结构域。当由免疫细胞表达时，CEACAM6结合部分是细胞外结构域或是细胞外结构域的一部分，并且免疫细胞激活结构域是细胞内信号传导结构域或是细胞内信号传导结构域的一部分，通常是T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的一部分。共刺激信号传导区也可以被包括在细胞内结构域中，并且是除了抗原受体或它们的配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。间隔部分(也被称为铰链部分)通常被包括在细胞外结构域中以允许CEACAM6结合部分有效地结合至其表位。细胞内和细胞外结构域通过跨越细胞质膜的跨膜结构域连接。
本发明的CAR的代表性非限制性结构包含识别肿瘤细胞的CEACAM6表面抗原的单结构域抗体、跨膜结构域和激活T细胞的TCR复合物CD3ζ的细胞内结构域(被称为第一代CAR)。如本领域技术人员所理解的，可以通过多种方法获得此类单结构域抗体的核酸序列。表达CAR的T细胞直接识别肿瘤细胞的表面抗原，不依赖于肿瘤细胞上主要组织相容性抗原I类的表达，并同时激活T细胞，从而表达CAR的T细胞可以有效杀伤肿瘤细胞。
为了增强第一代CAR激活T细胞的能力，可以制备第二代CAR，凭借作为T细胞的共刺激分子的CD28的细胞内结构域与第一代CAR连接。还可以制备第三代CAR，凭借来源于(例如)为肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的细胞内结构域与第一代CAR串联连接。因此，在本发明中包括许多靶向CEACAM6的CAR分子。
CEACAM6结合部分
在典型的方面，本文所述的CAR对癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)、其片段、其表位和任何前述的变体有特异性。CEACAM6在本领域中也被称为非特异性交叉反应抗原(NCA)或CD66c。本发明的CEACAM6结合部分使其与细胞/肿瘤表面上携带的CEACAM6以所期望的亲和力结合，导致其中提供CEACAM6结合部分的免疫细胞激活，以在肿瘤微环境中引发细胞毒性活性并释放细胞因子，并进一步扩增。
CEACAM6的序列可以是，但不限于SEQ ID NO:7，或与其基本同一的序列。
SEQ ID NO:7：
MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDGPTISPSKANYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI。
在具体的方面，抗体和/或表位可以是US 9,066,986(其通过引用整体并入本文)中描述的抗体和/或表位。具体地，CEACAM6结合结构域可以包含2A3抗CEACAM6抗体或其片段或变体。不希望受理论束缚，据信该抗体/表位相互作用具有有利的亲和力水平(不太高且不太低)，使得抗体可以结合第一细胞上的表位并激活细胞并激活细胞杀伤，然后继续结合第二或其他细胞上的其他表位并激活其他细胞杀伤。
因此，本文还描述了CAR，其在CEACAM6结合部分内包含含GRTNSVYTMG(SEQ ID NO:1)序列的互补决定区(CDR)1；包含IMWGAGTNTHYADSVKG(SEQ ID NO:2)序列的CDR2；和包含AANRGIPIAGRQYDY(SEQ ID NO:3)序列的CDR3，其中抗体或其片段是特异性针对CEACAM6的。如刚刚描述的CEACAM6结合部分可以识别并结合至包含序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)或由NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)组成的表位。
在具体的非限制性实例中，抗体或其片段可以包含SEQ ID NO:4的序列或与其基本同一的序列。
SEQ ID NO:4:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS。
术语“抗体”和“抗体片段”(“其片段”)如上所限定。如前所述，抗体或其片段可以是sdAb。sdAb可以是骆驼科来源的(例如，来自物种骆驼科)或来源于骆驼科VHH，因此可以基于骆驼科框架区；可替代地，可以将上述的CDR移植到VNAR、VHH或VL框架区上。在另一个替代方案中，可以将上述高变环移植到其他类型的抗体片段(Fv、scFv、Fab)的框架区上。
本方面还涵盖使用本领域已知的任何合适方法(例如但不限于CDR移植和镶面)“人源化”的抗体片段。抗体或抗体片段的人源化包括用如在人类共有序列中发现的它的人对应物替代序列中的氨基酸，而不丧失抗原结合能力或特异性；当引入人类对象中时，这种方法降低了抗体或其片段的免疫原性。在CDR移植的过程中，可以将本文限定的一个或多于一个的重链CDR融合或移植到人可变区(VH或VL)或其他人抗体片段框架区(Fv、scFv、Fab)。在此类情况下，保留了所述一个或多于一个的高变环的构象，并且还保留了sdAb对其靶标(即毒素A和B)的亲和力和特异性。
CDR移植在至少以下专利中被描述：美国专利第6,180,370号、美国专利第5,693,761号、美国专利第6,054,297号、美国专利第5,859,205号和欧洲专利第626390号(它们的公开内容在此通过引用整体并入)。镶面，在本领域中也称为“可变区表面重修”，涉及人源化抗体或片段的溶剂暴露位置；因此，保留可能对CDR构象重要的隐藏的非人源化残基，同时最小化针对溶剂暴露区的免疫反应的潜力。镶面在至少以下专利中被描述：美国专利第5,869,619号、美国专利第5,766,886号、美国专利第5,821,123号和欧洲专利第519596号(它们的公开内容在此通过引用整体并入)。本领域技术人员将充分熟悉制备此类人源化抗体片段的方法。
基本同一的序列可包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可以产生与参考序列相比在生理、化学或功能性质上没有实质变化的突变肽；在此类情况下，参考序列和突变序列被认为是“基本同一的”多肽。保守氨基酸突变可以包括氨基酸的添加、删除或取代；保守氨基酸取代在本文中被限定为将氨基酸残基取代为具有类似化学性质(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基。
在非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。此类保守的氨基酸取代可以将碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代为同一组中的另一种。术语“碱性氨基酸”意指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带正电荷。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指具有在生理pH下不带电荷，但其具有至少一个键的侧链的亲水性氨基酸，在所述至少一个键中两个原子共享的电子对被其中一个原子更紧密地保持。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)意指包括根据Eisenberg(1984)的标准化共有疏水性标度展现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、蛋氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。“酸性氨基酸”是指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
将序列同一性用于评价两条序列的相似性；通过计算当比对两条序列以获得残基位置之间的最大对应性时相同的残基百分比来确定。可以使用任何已知方法来计算序列同一性；例如，计算机软件可用于计算序列同一性。不希望受到限制，可以通过软件计算序列同一性，诸如由瑞士生物信息学研究所(the Swiss Institute of Bioinformatics)维护(以及在ca.expasy.org/tools/blast/中找到)的NCBI BLAST2服务、BLAST-P、Blast-N或FASTA-N，或本领域已知的任何其他合适的软件。
本发明的基本上同一的序列可以是至少85％同一的；在另一个实例中，基本上同一的序列可以是在氨基酸水平上与本文所述的序列至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％(或其间的任何百分比)同一的。重要地是，基本上同一的序列保留了参考序列的活性和特异性。在非限制性方面，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变导致的。
本发明的单结构域抗体或其片段还可以包含另外的序列以帮助重组抗体或其片段的表达、检测或纯化。可以使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如，并且不希望是限制性的，抗体或其片段可以包含靶向或信号序列(例如但不限于ompA)、检测标签、示例性标签盒包括Strep标签或其任何变体；参见，例如，美国专利第7,981,632号，His标签、具有序列基序DYKDDDDK的Flag标签、Xpress标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、HA标签、Myc标签、，Nus标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、CREB结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、硫氧还蛋白标签或它们的任意组合；纯化标签(例如但不限于His5或His6)，或它们的组合。
在另一个实例中，另外的序列可以是生物素识别位点，诸如Cronan等人在WO 95/04069中或Voges等人在WO/2004/076670中描述的。还如本领域技术人员所知的，可以将接头序列与另外的序列或标签结合使用。
更具体地，标签盒可以包含细胞外组分，其可以高亲和力或亲合力与抗体特异性结合。在单链融合蛋白结构内，标签盒可以位于(a)紧邻连接子区的氨基末端，(b)插入在接头模块之间并连接接头模块，(c)紧邻结合结构域的羧基末端，(d)插入在结合结构域(例如scFv)与效应子结构域之间并将结合结构域(例如scFv)与效应子结构域连接，(e)插入结合结构域亚基之间并连接结合结构域亚基，或(f)在单链融合蛋白的氨基末端。在某些实施方案中，可以将一个或多个连接氨基酸设置在标签盒与疏水性部分之间并将标签盒与疏水性部分连接，或者设置在标签盒与连接子区之间并将标签盒与连接子区连接，或者设置在标签盒与接头模块之间并将标签盒和接头模块连接，或设置在标签盒与结合结构域之间并将标签盒和结合结构域连接。
跨膜结构域
在具体的方面，CAR包含跨膜结构域，其与CAR的细胞外结构域和细胞内结构域融合。在一方面，使用天然地与CAR中的一个结构域相缔合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，来最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具体使用的跨膜区可以来源于(即包含其至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。通常，本文所述的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。
可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。通常，在合成的跨膜结构域的每个末端都会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，通常长度为2至10个氨基酸的短的寡肽接头或多肽接头，可以形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
间隔结构域
在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域，也被称为铰链结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常意指任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域与多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域连接，并且从细胞表面提升CEACAM6结合结构域。间隔结构域可以包含多达300个氨基酸，通常为10至100个氨基酸，且最通常为25至50个氨基酸。间隔区可以包含以下之一，例如：人IgG1Fc结构域、IgG1铰链、IgG1铰链-CD8茎、CD8茎、IgG1铰链-CD28茎和CD28茎。
细胞质结构域
本文所述的CAR的细胞质结构域或另外的细胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白的部分。虽然通常可以利用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用此类截短部分代替完整链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本文所述CAR的细胞内信号传导结构域的典型实例包括协同作用以在抗原受体参与后启动信号转导的T细胞受体(TCR)的细胞质序列和共同受体，和这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
一级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。
含有在本发明中具体使用的一级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括来源于以下的那些ITAM：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。特别典型的是，本文所述的CAR中的细胞质信号传导分子包含来源于CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在典型的方面，可以将CAR的细胞质结构域设计为自身包含CD3-ζ信号传导结构域，或者包含与在本文描述的CAR的上下文中有用的任何一个或多个其他期望的细胞质结构域组合的CD3-ζ信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分以及一个或多个共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
可以以随机或指定的顺序将本文描述的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列彼此连接。任选地，通常长度在2和10个氨基酸之间的短寡肽接头或多肽接头可形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一方面，细胞质结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一方面，细胞质结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一方面，细胞质结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域以及CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一方面，本文所述的CAR中的细胞质结构域被设计为包含CD28和/或4-1BB的信号传导结构域以及CD3-ζ的信号传导结构域。
载体
本文描述了其中插入本发明的DNA的载体。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒的载体)是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于来源于肿瘤逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞(诸如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的额外优势。
简而言之，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接并将构建体掺入表达载体中来实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。载体可适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控所期望的核酸序列表达的启动子。
使用标准基因递送方案，也可以将本发明的表达构建体用于核酸免疫接种和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，它们通过引用整体并入本文。在另一方面，本发明提供了基因疗法载体。
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，可以以病毒载体的形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知知的，并且例如描述于Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号，它们的公开内容在此通过引用整体并入)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至对象的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域中已知的。在一些方面，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一方面，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至隔开50bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、劳斯肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本文描述的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其当需要此类表达时能够启动其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以含有选择标志物基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标志物可以在单独的DNA片段上被携带并被用于共转染程序。可以将选择标志物和报告基因两者侧接适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
将报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达并且编码多肽的基因，其表达通过一些易于检测的特性(例如酶活性)表现出来。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBSLetters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并可以被使用已知技术制备或商业上获得。通常，显示报告基因最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。可以将此类启动子区与报告基因连接，并被用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并将其表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入宿主细胞的典型方法是磷酸钙转染。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体并且特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如人类细胞)中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，可以将核酸与脂质缔合。可以将与脂质相缔合的核酸包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸相缔合的连接分子与脂质体连接，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，作为脂质中的悬浮液含有，含有胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或具有“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(诸如脂肪酸类、醇类、胺类、氨基醇类和醛类)的化合物类。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)；可以从K&K实验室(普莱恩维尤,N.Y.)获得磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)；可以从Calbiochem-Behring获得胆固醇(“Choi”)；可以从Avanti Polar Lipids公司(阿拉巴马州伯明翰)获得二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质。可以将脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单一和多层脂质媒介物。可以将脂质体表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有通过水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本文所述范围内的试剂。
转座子/转座酶系统
用于将DNA引入细胞的典型方法包括DNA缩合试剂(诸如磷酸钙、聚乙二醇等)、含脂质的试剂(诸如脂质体、多层囊泡等)以及病毒介导的策略。
然而，所有这些方法都有其局限性。例如，存在与DNA缩合试剂和病毒介导的策略相关的尺寸限制。此外，可以转染到细胞中的核酸的量在病毒策略中受到限制。并非所有方法都有助于将递送的核酸插入细胞核酸中，并且虽然DNA缩合方法和含脂质的试剂相对容易制备，但是将核酸插入病毒载体中可能是劳动密集型的。此外，病毒介导的策略可以是细胞类型或组织类型特异性的，并且当在体内使用时，使用病毒介导的策略可以产生免疫学问题。
为了克服这些问题，一种合适的工具是转座子。转座子或可转座元件包括其上游和下游具有末端重复序列的(短)核酸序列。活跃的转座子编码促进核酸切除和插入靶DNA序列的酶。
目前，已知两类转座子，即I类和II类转座子。
I类转座子，又被称逆转录转座子或逆转录子，包括逆转录病毒样逆转录转座子和非逆转录病毒样逆转录转座子。它们通过复制自己并将拷贝粘贴回基因组的多个位置的来起作用。最初，逆转录转座子将自身复制为RNA(转录)，但不是被翻译，而是通过逆转录酶(通常由转座子本身编码)将RNA复制为DNA并插回到基因组中。I类转座子的典型代表包括例如Copia(果蝇)、Ty1(酵母)、THE-1(人类)、Bs1(玉米)、F-元件、L1(人类)或Cin4(玉米)。
作为第一步，必须使用标准方法(例如病毒感染等)将II类转座子转染到细胞中。之后，该Il类转座子(也被称为“仅DNA转座子”)通过剪切和粘贴机制而不是通过复制和粘贴来移动，并在该机制中使用转座酶酶。不同类型的转座酶可能以不同的方式起作用。一些可以与DNA分子的任何部分结合，并且靶位点可以位于任何位置，而其他位点与特定序列结合。然后转座酶剪切靶位点以产生粘性末端，释放转座子并将其连接至靶位点。典型的Il类代表包括P元件(果蝇)、Ac-Ds(玉米)、TN3和IS1(大肠杆菌(E.coli))、Tam3(金鱼草)等。
特别地，使用II类转座子，元件编码的转座酶催化转座子从其原始位置的切除并促进其插入基因组中的其他位置(Plasterk,1996 Curr.Top.Microbiol.Immunol.204,125-143)。转座子家族的自主成员可以表达活跃的转座酶(转座的反式作用因子)并因此能够自行转座。非自主元件具有突变的转座酶基因，但可保留顺式作用DNA序列。这些顺式作用DNA序列也被称为反向末端重复序列(IR)。一些反向重复序列可以包括一条或多条直接重复序列。通常将这些序列嵌入元件的末端反向重复序列(IR)中，这是在存在来自另一元件的互补转座酶的情况下动员所需的。到目前为止，除了Tol2(见下文)之外，没有从脊椎动物中分离单个自主元件；所有转座子样序列都是有缺陷的，显然是由于一个叫做“垂直失活”的过程导致的(Lohe等人，1995Mol.Biol.Evol.12,62-72)。根据一种系统发育模型(Hartl等人，1997Trends Genet.13,197-201)，真核基因组中非自主元件与自主元件的比率由于转座的反式互补性质而增加。该过程导致其中基因组中活跃的转座酶产生拷贝的最终消失是不可避免的状态。因此，DNA转座子可以被视为基因组的暂时组成部分，为了避免消失，必须找到在新宿主中建立自己的方法。实际上，物种之间的水平基因传递被认为是转座子进化中的重要过程之一(Lohe等人，1995，同上和Kidwell,1992.Curr.Opin.GenetDev.2,868-873)。
可以在实验室条件下模拟水平基因转移的自然过程。在植物中，Ac/Ds和Spm家族的转座子已经被常规转染到异源物种中(Osborne和Baker，1995Curr.Opin.Cell Biol.7,406-413)。然而，在动物中，由于需要天然宿主产生的因子，将活跃的转座子系统从一个物种转移到另一个物种的主要障碍有转座的物种特异性。
如上所讨论的转座子系统可能发生在脊椎动物和无脊椎动物系统中。在脊椎动物中，经由DNA中间体移动的DNA转座子移动元件的发现是相对较近的(Radice,A.D.等人，1994.Mol.Gen.Genet.244,606-612)。从那时起，已经从不同的鱼物种、非洲爪蟾属和人类基因组中分离出真核转座子的Td/水手以及hAT(hobo/Ac/Tam)超家族的无活性、高度突变的成员(Oosumi等人，1995.Nature 378,873；Ivies等人，1995.MoI.Gen.Genet.247,312-322；Koga等人,1996.Nature 383,30；Lam等人,1996.J.MoI.Biol.257,359-366和Lam,W.L.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 93,10870-10875)。
无脊椎动物和脊椎动物转座子都具有模式生物体中转基因和插入诱变的潜力。特别地，同一物种中的可替代转座子系统的可用性为遗传分析开辟了新的可能性。例如，piggyβac转座子可以在稳定插入的P元件存在下在果蝇中被动员(Hacker等人，(2003),Proc Natl Acad Sci U S A 100,7720-5.)。因为基于P元件和基于piggyBac的系统显示出不同的插入位点偏好(Spradling等人(1995),Proc Natl Acad Sci U S A 92,10824-30，Hacker等人(2003),Proc Natl Acad Sci U S A 100,7720-5)，可以大大增加可以被转座子插入失活的苍蝇基因数量。P元件载体也已经被用于通过稳定的种系转化将水手转座子(the mariner transposon)的组分插入黑腹果蝇(D.melanogaster)的基因组中。在这些转基因苍蝇中，可以研究水手转座而不会意外地动员P元件(Lohe和Hartl，(2002),Genetics160,519-26)。
在脊椎动物中，目前已知并使用了三种活跃的转座子：青鳉(medaka)中的Tol2元件，以及重构的转座子睡美人(SB)和青蛙王子(FP)。脊椎动物中另一个有趣的转座子系统是PiggyBac转座子系统(Ding等人，Cell,2005)。
Tol2元件是青鳉中hAT转座子家族的活跃成员。它是通过引起日本青鳉(Oryziaslatipes)(东亚的小型淡水鱼)的白化表型的隐性突变发现。发现该突变是由于在酪氨酸酶基因的第五个外显子中插入4.7-kb长的TE导致的。该元件的DNA序列(命名为To/2)类似于hAT家族的转座子，包括果蝇的hobo、玉米的Acoi和金鱼草的Tam3。
睡美人(SB)是来自鱼类的Tc1/水手样元件，并且在多种脊椎动物培养的细胞系、胚胎干细胞以及体内小鼠体细胞和生殖谱系细胞中展现出高转座活性。
青蛙王子(FP)也是一种Tc1/水手样元件，其最近从北部豹蛙(美洲豹蛙(Ranapipiens))的基因组转座子拷贝中被重新激活。使用开放阅读框捕获方法鉴定不间断的转座酶编码区，并且这些序列的多数规则共识揭示了活跃转座酶基因。因此，与SB的“复活”程序相反，美洲豹蛙中相对年轻的基因组元件状态使得基于对来源于单一物种的转座子拷贝的多数规则共识成为可能。SB和FP转座子明显不同，在它们的转座酶序列中仅共享-50％的同一性。
如上所述的转座子，特别是Tol2、SB和FP，以及piggyback(Ding等人，Cell 2005)不相互作用，并因此可以在其他的存在下被用作遗传工具，这显著扩大了这些元素的实用性。这些转座子插入表达基因而非非编码DNA的偏好以及对基因内插入位点的偏好可能是显著不同的。如果是这样的话，可以以互补的方式利用这些转座子系统的不同插入模式。例如，可以使用不同的转座子系统将几个转基因依次转染到细胞中，而不会意外地和不需要地动员已经插入的转基因。此外，通过在全基因组筛选中组合不同的转座子系统，可以通过转座子载体诱变的靶基因座的数量可以显著增加。
除了宿主中转座活性的变化以及靶位点特异性的差异之外，各种元件的不同结构特性在某些应用中也可能是有利的。例如，可以利用转座子插入来错误表达基因并寻找功能获得表型。Rorth,P.(1996,A modular misexpression screen in Drosophiladetecting tissue-specific phenotypes.Proc Natl Acad Sci U S A 93,12418-22.)使用携带从该元件指向的诱导型启动子的经修饰的P元件转座子以迫使宿主基因在转座子插入位点附近表达，并检测组织特异性表型。此类实验设置的先决条件是转座子IR允越过IR通读转录/翻译。
如上已经解释的，DNA转座子已被开发为无脊椎动物模型生物中的基因转移载体，并且最近在脊椎动物中也是如此。它们还成为人类基因疗法中逆转录病毒系统的强有力竞争对手。如上所述，用于遗传分析和治疗方法的最有用可转座元件(TE)是经由“剪切和粘贴”机制在宿主基因组中移动的II类TE，因为它们易于实验室处理和有可控性质。睡美人(以下简称为“SB”)属于“剪切和粘贴”转座子的TcI/水手家族。这些移动DNA元件被简单地组织，在它们侧接有反向末端重复序列(ITR)的基因组中编码转座酶蛋白。ITR携带转座所必需的转座酶结合位点。通过将转座酶来源与携带ITR的可转座DNA分开，可以很容易地控制它们的活性，从而产生非自主的TE。在此类双组分系统中，转座子只能通过补充转座酶蛋白的fr3/75来移动。实际上，根据实验需要，可以在ITR元件之间定位任何目标序列。转座将导致从载体DNA中切除元件并随后将单拷贝整合到新的序列环境中。
一般来说，转座子介导的染色体进入似乎比病毒方法更有优势，因为一方面如果与病毒系统相比，转座子不那么有利于活跃基因和5'调控区，并因此不太容易诱变，另一方面由于它们的染色体进入目标基因的特殊机制在生理上受到更多的控制。
SB已被证明是几种脊椎动物模型生物体中功能基因组学的有价值的工具(Miskey,C,Izsvak,Z.,Kawakami,K.和Ivies,Z.(2005)；DNA transposons in vertebratefunctional genomics.Cell MoI.Life.Sci.62:629-641)并显示出人类基因治疗应用的前景(Ivies,Z.和Izsvak,Z.(2006).Transposons for gene therapy；Curr.Gene Ther.6:593-607)。然而，对于所有这些应用，系统的转座活性是可用性和效率的关键问题。尽管如今通常已知和描述为有功能性和有价值，转座酶活性可能是仍然导致SB系统达到其极限的因素之一。因此，转座活性的显著改善可能在两个方向上突破当前实验障碍。
在一些方面，将SB10转座酶的极度活跃的变体用于本文所述的方法中。在具体的方面，极度活跃的变体可以是通过WO 2009/003671(其通过引用整体并入本文)描述的变体。例如，选自SB10转座酶的变体的多肽包含与根据SEQ ID No.8的天然SB10转座酶的序列差异1至20个氨基酸的氨基酸序列，所述1至20个氨基酸包括选自以下的以下突变或突变组中的至少一个：K14R、K13D、K13A、K30R、K33A、T83A、I100L、R115H、R143L、R147E、A205K/H207V/K208R/D210E；H207V/K208R/D210E；R214D/K215A/E216V/N217Q；M243H；M243Q；E267D；T314N和G317E。
SEQ ID NO:8如下所示：
MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRVLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY
“一个突变”或“多个突变”在本文中被限定为已知氨基酸序列的1个或多个氨基酸分别被1个或多个其他氨基酸交换，并且如果特别指出，也可以是“一个突变组”或“多个突变组”。“一个突变组”或“多个突变组”在本文中被限定为组的交换，例如来自原始序列的3或4个氨基酸分别在指定位置处被3或4个其它氨基酸交换。作为限定，将以下代码用于识别上述突变。"X编号Z"表示位于“编号”位置的原始氨基酸序列的氨基酸“X”被交换为氨基酸“Z”，而"X编号Y/X'编号'Z'/X"编号"Z""旨在表示在该突变中，在"编号"位置处的氨基酸"X"、在"编号"'位置中的氨基酸"X'"和在"编号""位置中的氨基酸"X""分别同时被交换为氨基酸"Z"、"Z'"和"Z""。如果限定“突变组合”，则使用"//"来分隔和指示该组合中的“同时突变”，否则与单个斜线"/"相同。
在另一个典型方面，变体相差至少2、或至少1至8、通常为2至7个上述突变或突变组，甚至更典型地相差以上列出的突变或突变组的至少4至7个。
在另一个中，SB10转座酶的变体选自包含以下突变组合的变体：
·变体1：K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q；
·变体2：K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体3：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体4：K13D/K33Λ/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q；
·变体5：K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q；
·变体6：K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E；
·变体7：K14R/T83A/M243Q；
·变体8：K14R/T83A/1100L/M243Q；
·变体9：K14R/T83A/R143L/M243Q；
·变体10：K14R/T83A/R147E/M243Q；
·变体11：K14R/T83A/M243Q/E267D；
·变体12：K14R/T83A/M243Q/T314N；
·变体13：K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体14：K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体15：K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体16：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；
·变体17：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243 H/T314N；
·变体18：K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；
·变体19：K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体20：K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；
·变体21：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；
·变体22：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；
·变体23：K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；
·变体24：K14R/K33A/R1 15H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体25：K14R/K33A/R1 15H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；
·变体26：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；
·变体27：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；
·变体28：K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；
·变体29：K14R/T83A/M243Q/G317E；
·变体30：K13A/K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q
在典型的方面，转座酶是SB100X转座酶，其在上面的列表中被标记为变体27。
免疫细胞
在本文所述的免疫细胞的扩增和遗传修饰之前，从对象获得免疫细胞的来源。应当理解，可以使用任何免疫细胞来源，并且它们可以是自体的、同种异体的、同系同种的或异种的。在典型的方面，免疫细胞是自体的或同种异体的。
例如，PBMC可以通过任何已知方法来获得，然后被刺激成为CIK细胞，如例如WO2016/071513中所述，其通过引用整体并入。然后可以将CIK细胞制成CIK CAR细胞。可替代地，T细胞可以通过任何已知方法来获得，并且随后被用于产生CAR-T细胞。
无论是在免疫细胞的遗传修饰之前还是之后表达如本文所述的CAR，通常可以使用如以下中描述的方法来激活和扩增免疫细胞：例如美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；美国专利申请公开第20060121005号；和WO 2016/071513(它们通过引用整体并入本文)。
治疗应用
本文所述的CAR和表达CAR的免疫细胞可以阻断CEACAM6抗原并降低其侵袭性。结合还激活CAR-T细胞或CIK CAR细胞并刺激免疫细胞杀伤癌细胞。这些抗体优于用于化学疗法的药物的优点在于它们对过表达CEACAM6抗原的肿瘤更具特异性。因此，这可能导致总体细胞毒性和癌细胞化学抗性降低。另外，由于它们的小尺寸，本文所述的CAR具有组织穿透能力。
本发明涵盖用慢病毒载体(LV)转导或用转座子转染的细胞(例如T细胞)。例如，LV或转座子编码CAR，其将特定抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或它们的任意组合的细胞内结构域组合。因此，转导的T细胞引发CAR介导的T细胞应答，因此可以帮助减少肿瘤生长和诱导细胞杀伤。
本发明提供了CAR用于将原代T细胞的特异性重定向至肿瘤抗原的用途。因此，本发明还提供了用于刺激哺乳动物中T细胞介导的对靶细胞群或组织的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物施用表达CAR的T细胞的步骤，其中CAR包含与预定靶标特异性相互作用的结合部分、含有例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号传导区。
在一方面，本发明包括一种类型的细胞疗法，其中对T细胞或CIK细胞进行遗传修饰以表达CAR，并将CAR-T或CIK-CAR细胞输注给有此需要的接受者。输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-T和CIK-CAR细胞能够在体内复制，导致可以引起持续的肿瘤控制的长期持久性。
在一方面，本文所述的CAR-T或CIK-CAR细胞可以经历稳健的体内细胞扩增，并可持续延长的时间。在另一方面，本文所述的CAR-T细胞进化成特异性记忆T细胞，其可以被重新激活以抑制任何其他的肿瘤形成或生长。不希望受任何特定理论的束缚，CAR-T细胞一经遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，可以在体内分化成中枢记忆样状态。
此外，通过CAR修饰的T或CIK细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫疗法方法的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱导特异性针对CAR中抗原结合部分的免疫应答。例如，CEACAM6特异性CAR-T或CIK细胞引发特异性针对表达CEACAM6的细胞的免疫应答。
在一方面，本文描述的CAR的抗原结合部分部分被设计用于治疗表达特定抗原的特定癌症。例如，本文描述的CAR通常对CEACAM6有特异性，并且可以被用于治疗与CEACAM6相关的癌症和病症，诸如胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌和结肠癌。
本文所述的CAR修饰的T细胞还可以用作用于哺乳动物离体免疫接种和/或体内疗法的疫苗类型。通常，哺乳动物是人。
关于离体免疫接种，在将细胞施用给哺乳动物之前，体外发生以下中的至少一种：i)细胞扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域众所周知的，并在下面更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(通常是人)分离细胞，并用表达本文公开的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用给哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，并且CAR修饰的细胞相对于接受者可以是自体的。可替代地，相对于接受者，细胞可以是同种异体的、同系同种的或异种的。
用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于通过引用并入本文的美国专利第5,199,942号中，所述程序可以被应用于本文所述的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子，其他因子(诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体)可以被用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫接种的组合物和方法，以引发针对患者中的抗原的免疫应答。
具体地，本文所述的CAR修饰的T细胞被用于治疗表达CEACAM6的癌症。在某些方面，本文所述的细胞被用于治疗有发展成表达CEACAM6的癌症风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防表达CEACAM6的癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文所述的CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR修饰的T细胞可以被单独施用，或作为与稀释剂和/或与其他组分(诸如IL-2)或其他细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群。此类组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)；抗氧化剂；螯合剂(诸如EDTA或谷胱甘肽)；佐剂(诸如氢氧化铝)和防腐剂。通常配制本发明的组合物用于静脉内施用。
可以将本发明的药物组合物以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，施用的量和频率将由诸如患者状态以及患者疾病的类型和严重性等此类因素确定，。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑患者(对象)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移程度以及状态的个体差异确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以以104至109个细胞/kg体重、通常为105至106个细胞/kg体重的剂量、包括那些范围内的所有整数值的剂量施用包含本文所述的T细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些方面，可能需要根据本发明将活化的T细胞施用给对象，然后随后重新抽血(或进行单采血液成分术)，从中激活T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞再输注患者。该过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的抽血来激活T细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血来激活T细胞。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可用于选出某些T细胞群。
可以任何方便的方式进行主题组合物的施用，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。可以皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内将本文所述的组合物施用给患者。在一方面，通过皮内或皮下注射将本发明的T细胞组合物施用给患者。在另一方面，通常通过i.v.注射施用本发明的T细胞组合物。可以将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位内。
在本发明的某些方面，将使用本文所述的方法或本领域已知的其他方法激活和扩增的细胞(其中将T细胞扩增至治疗水平)，与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述相关治疗方式包括但不限于化学疗法，放射，免疫抑制剂诸如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫清除剂(immunoablative agents)诸如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun 73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993)。在另一方面，将本发明的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂(诸如氟达拉滨、外部束照射疗法(XRT)、环磷酰胺)或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法联合(例如，之前、同时或之后)施用给患者。在另一方面，将本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的试剂如美罗华)后施用。例如，在一方面，对象可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后，对象接受本文所述的扩增的免疫细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待施用给患者的上述治疗的剂量将随着正在治疗病况的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来进行人施用剂量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量将通常在1至约100mg的范围内，通常每天施用一次，持续1至30天的时间段。典型的每日剂量为每天1至10mg，但在某些情况下，可以使用每天高达40mg的较大剂量(描述于美国专利第6,120,766号中)。
在本发明的一些方面，包含本发明的CAR-T的组合物可以冷藏储存直至使用或冷冻(然后解冻)直至需要使用。可以将该组合物配制并作为CAR-T细胞的“库”提供，以用于CEACAM6癌症的治疗性治疗。
在本发明的实施方案中，用于细胞疗法的细胞以试剂盒提供，并且在一些情况下，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。试剂盒可包含制备所期望的细胞的试剂和材料。在具体的实施方案中，试剂和材料包括用于扩增所期望的序列的引物、核苷酸、合适的缓冲液或缓冲试剂、盐等，并且在一些情况下，试剂包括载体和/或编码如本文所述的CAR的DNA和/或其调控元件。
在具体的实施方案中，试剂盒中有一个或多个适于从个体中提取一个或多个样品的装置。该装置可以是注射器、手术刀等。
在本发明的一些情况下，除细胞疗法实施方案外，试剂盒还包括第二种癌症疗法，诸如例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。可以针对个体的特定癌症定制试剂盒，并且包括针对个体的相应的第二癌症疗法。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且除非另有说明，否则不旨在为限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的典型方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
发现概述
CEACAM6在许多类型的人类癌症(诸如乳腺腺癌、胰腺腺癌、结肠直肠腺癌和非小细胞肺腺癌)中过表达，并且是整体存活和无疾病存活的独立预测因子。在某些动物模型中，通过抗体靶向该分子减缓了肿瘤进展。2A3是从整个癌细胞免疫的美洲驼文库中分离的骆驼科单结构域抗体。抗体以高亲和力(如通过SPR测量为5nM)与CEACAM6抗原特异性结合至，并在体外抑制表达CEACAM6的癌细胞的增殖。在该研究中，通过转导2A3抗体序列以产生与嵌合CD3-ζ融合的修饰的嵌合CD28信号传导结构域来将嵌合抗原受体(CAR)T细胞工程化成靶向人CEACAM6抗原。通过流式细胞术验证了2A3抗体的转导效率和表达。CEACAM6特异性CAR-T(CEACAM6-CAR-T)细胞与表达CEACAM6的胰腺细胞系BxPC-3的共孵育导致增加的细胞毒性和细胞因子(IL-2和IFN-γ)释放，表明潜在的CAR-T细胞的抗癌活性。与天然T细胞相比，来自实时细胞分析的数据显示CEACAM6-CAR-T细胞导致的BxPC-3细胞细胞毒性显著增加。然而，CEACAM6-CAR-T细胞对阴性对照细胞系显示出低得多的细胞毒活性。在体内检查CEACAM6-CAR-T细胞在异种移植模型中的功效。将BxPC3细胞皮下接种到CIEA NOG小鼠的后胁腹中。然后在第1天、第8天和第15天，三组小鼠分别静脉注射PBS、天然T细胞或CEACAM6-CAR-T细胞。数据证明CEACAM6-CAR-T细胞对胰腺癌异种移植物的非常高的功效。与天然T细胞(p值＝0.00025)和PBS(p值＝7.91×106)相比，CEACAM6-CAR-T细胞显著降低BxPC-3异种移植物的生长。基于体重测量没有观察到毒性作用。结果强烈支持CEACAM6-CAR-T细胞可以被用作针对表达CEACAM6的癌症的有效免疫治疗剂，并且骆驼科单结构域抗体可以容易地倍用于CAR-T型疗法。
实施例1
将CAR克隆到慢病毒质粒Lenti CMV-MCS-EF1a-puro(Alstem,里士满,CA)的XbaI和EcoRI克隆位点。在合成和克隆后对所有质粒插入物进行序列验证。将每个CAR质粒转化到大肠杆菌BL21细胞中，用于在产生慢病毒原种之前产生和分离转染就绪的DNA。通过基因组慢病毒RNA的qRT-PCR分析检测病毒滴度。待转导的人T细胞来源是通过Ficoll-Paque梯度从全血中分离的外周血单个核细胞(PBMC)
实时细胞测定(RTCA)方案
第1天：
A.制备(贴壁)靶细胞：
1.从长颈瓶中吸出旧培养基
2.向长颈瓶中加入5-10mL常规培养基(无血清)以冲洗掉任何血清残余物。然后，吸出培养基。
3.向长颈瓶中加入0.5mL-1mL的0.05％胰蛋白酶-EDTA以分离细胞。
4.向长颈瓶中加入4.5mL-9.5mL的培养基(含FBS)，并将培养基上下吸移至长颈瓶底部以将细胞破碎成单细胞溶液。
5.将悬浮的细胞悬浮液转移到15mL管中。
6.取出10uL细胞悬浮液，并用血细胞计数器计数以确定细胞浓度。
7.在25℃下以1000rpm(或300x g)离心细胞悬浮液5分钟。
8.离心后，吸出上清液，并将细胞沉淀重新悬浮于培养基(含FBS)中，直至浓度为1×105个细胞/mL
B.制备RTCA板：
1.仅将50uL培养基(用于细胞悬浮液的相同培养基)加入待测量的孔中。
2.将E板(ACEA生物科学公司，目录号：JL-10-156010-1A)放回工作站。
3.启动RTCA 2.0软件
a.输入布局信息：
i.至少选择所有孔并单击“应用”。这激活了孔
b.输入时间表：
i.步骤1＝背景测量。不变化。
ii.步骤2＝监测细胞
iii.步骤3＝短期细胞毒性
iv.步骤4＝长期细胞毒性(检查“自动”框)
**您可以更改每个步骤的循环数以及每个循环之间的间隔**
4.单击“步骤1”，并且按开始命名实验并测量来自培养基的背景
5.在“步骤1”完成后，从工作站上移出E板。
6.从A部分向孔中加入100uL细胞悬浮液(不要去除先前的培养基。每个孔的最终总量应为150uL)
7.使细胞在罩中静置5分钟
8.将E板放回工作站
9.单击“步骤2”，并且按开始以恢复记录
第2天–处理：
A.制备CAR-T效应细胞：
1.从6孔板中取出所有悬浮的CAR-T细胞并充分混合。
2.取10uL细胞悬浮液，并使用血细胞计数器确定细胞浓度
3.在25℃下以1000rpm(或300x g)离心细胞悬浮液5分钟
4.吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于2mL细胞毒性缓冲液(RPMI1640无酚红(Invitrogen)+1％P/S(Invitrogen)+5％人AB血清(Gemini Bioproducts；100-318)
5.重复步骤3
6.吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于细胞毒性培养基(无酚红RPMI1640(Invitrogen)加5％AB血清(Gemini Bioproducts；100-318))中，得到1×106个细胞/mL的终浓度
B.制备RTCA板：
1.在A部分完成后，按快进到第3步。
2.从工作站移出E板
3.小心地从每个孔中吸出上清液
4.向每个孔加入100uL细胞毒性培养基
5.重复步骤3
6.向每个孔加入50uL细胞毒性培养基
7.按设计将100uL CAR-T细胞悬浮液(1×105个细胞)从A部分分配到所期望的孔中。
8.将E板放回工作站
9.单击“步骤3”，并按开始以恢复记录
CAR的序列：第二代CEACAM-6 scFv-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:5)：
用于流式细胞术的方案
洗涤细胞并悬浮于FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)加0.1％叠氮化钠和0.4％BSA)中。然后将细胞分成1×106个等分试样。
用正常山羊IgG(LifeTechnologies)阻断Fc受体。向每个管中加入100μl的1:1000稀释的正常山羊IgG，并在冰中孵育10min。
向每个管中加入1.0ml FAC缓冲液，充分混合并以300xg离心5min。
添加生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(Life Technologies)以检测CD19scFv；添加生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(Life Technologies)以用作同种型对照。(1:200稀释，反应体积为100μl)。
将细胞在4℃下孵育25分钟并用FACS缓冲液洗涤一次。
通过向每个管中加入100μl的1:1000稀释的正常小鼠IgG，将细胞悬浮于FAC缓冲液中并用正常小鼠IgG(Invitrogen)阻断。在冰中孵育10min。用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬于100μl FACS缓冲液中。
然后用藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(BD Pharmingen,圣地亚哥,CA)和别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3(eBiocience,圣地亚哥,CA)对细胞染色。将1.0μl PE和APC各自加入管2和3中。
用BD FacsCalibur(BD Biosciences)进行流式细胞术采集，并用FlowJo(Treestar,公司，亚什兰,OR)进行分析。
SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11如下。
2A3，其被克隆至哺乳动物表达载体作huFc融合蛋白(C-末端Fc)：
2A3第2代CAR构建体，“pCD510-FMC63-2A3-hu28z”：
2A3与C-末端CD28(铰链，跨膜(TM)，刺激结构域)以及CD3ζ(刺激结构域)的融合
SEQ ID NO：10
实施例2
使用针对人CEACAM6的抗骆驼科特异性抗体产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。这些CAR-T最初显示出表现出有效的针对展示CEACAM6靶标抗原的细胞的细胞毒活性，并且开始另外的研究以观察针对多种PBMC供体的细胞毒性效应的可变性。
数据表明抗CEACAM6 CAR-T在T细胞的一系列人供体中是有效的。
抗CEACAM6 CAR慢病毒产物：
病毒原种 CAR构建体 病毒滴度(IFU/mL)
A 抗CEACAM6 2.86±0.19×10<sup>8</sup>(对于供体1)
B 抗CEACAM6 3.08±0.13×10<sup>8</sup>(对于供体2和3)
将被制备以供应多个独立T细胞群的转导的过量病毒原种和未被立即使用的病毒储存在-80℃。转导发生的感染复数(MOI)为5:1(病毒比细胞的比率)。
将供体1PBMC用于产生初始抗CEACAM6数据。检查了另外三个供体，但是来自另外一个供体的PBMC在激活和转导后的扩增中反复出现困难。因此，三个另外的供体中只有两个被用于后续实验，并且包括本报告中讨论的“供体2”和“供体3”。因此，将病毒原种A用于转导供体1PBMC，和病毒原种B分别用于转导来自供体2和供体3的PBMC。
实时细胞测定(RTCA)，CAR-T细胞的细胞毒性
将用于图1和2中的细胞毒性测定的细胞在使用前扩增至14-15天(将来自供体1的细胞扩增至第14天，而将来自供体2和3的细胞扩增至第15天)。将BXPC3用作阳性靶细胞系，而将Pan02a细胞用作阴性靶细胞系。将靶细胞以每(96孔板的)孔1×104个细胞铺板，并孵育24hr。将抗CEACAM6 CAR-T细胞用作效应细胞，同时将未转导的CAR-T细胞作为阴性对照。在用抗CEACAM6 CAR转导并扩增后，从冷冻原种中引入抗CEACAM6 CAR-T细胞。将CAR-T细胞以10:1的比率加入到含有靶细胞的适当孔中。
如通过RTCA细胞指数值所展示的，BXPC3的数据表明特异性且几乎相同的细胞毒性谱，并证实初始抗CEACAM6 CAR-T细胞毒性数据。
Pan02a细胞(人CEACAM 6表达呈阴性的小鼠胰腺细胞系)不受CEACAM6 CAR-T细胞的影响。
细胞因子分泌测定
将用于细胞因子分泌测定的细胞扩增至15天。用1×104个靶细胞对在(96孔板的)每孔铺板，以效应细胞比靶细胞的比率为1:1添加效应细胞，并且一起孵育大约18hr，然后去除上清液用于分别测定IFN-γ、IL-2的浓度(图3A和4A)。标准曲线显示在图3B和4B中。
实施例3
在体内测试CEACAM-6-CAR-T细胞在胰腺癌细胞BxPC3异种移植物中的功效。在先前的实验中，已经证明了在体外CEACAM-6-CAR-T细胞对BxPC3细胞的细胞毒性高。在该实施例中，将CIEA-NOG小鼠(Taconic)皮下注射BxPC3细胞到后胁腹中(2×106个细胞/小鼠)。三组小鼠：PBS，模拟(T细胞)和CEACAM-6 CAR-T细胞(每组5只小鼠)，在第1、8和15天接受静脉内(iv)注射PBS或1×107个T细胞或CAR-T细胞。
数据证明使用异种移植小鼠模型的CEACAM-6 CAR-T细胞的非常高的功效。相对于模拟T细胞(p值＝0.00025)和相对于PBS组(p值＝7.90984E-06)，CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低胰腺细胞BcPC3异种移植肿瘤生长。数据表明CEACAM-6 CAR-T细胞对胰腺癌具有高治疗潜力。
在CEACAM-6 CAR-T细胞的体外T细胞激活、转导和扩增后验证转导效率
待转导的人T细胞来源是通过Ficoll-Paque梯度从全血中分离的外周血单个核细胞(PBMC)(见附录)。
将细胞以1×106个细胞/mL用IL-2(300IU/mL)悬浮，用CD28/CD3微珠激活，并在激活后24hr用相应的重组慢病毒原种转导。然后以2-3天的间隔传代细胞，其中huIL-2浓度保持在300IU/m。每周用新的慢病毒转导制备新鲜的CEACAM-6 CAR-T细胞。从相同的DNA制备新鲜慢病毒(用PCR测定滴度并且等于3.40+/-0.31*108IFU/mL)并且在3周内每周用于转导以产生CAR-T细胞，以用于在BxPC3胰腺癌细胞注射(2×106个细胞/小鼠，皮下)后在第1天、第8天和第15天以每只小鼠1×107个细胞的浓度的3次静脉内(iv)注射至小鼠中。还培养对照T细胞用于在注射的同一天以相同浓度模拟对照注射至小鼠中。
通过流式细胞术检测CEACAM-6在CAR-T细胞中的表达，使用抗小鼠Fab抗体检测CEACAM-6 scFv。将未转导的T细胞用作阴性对照。抗CD3抗体也被用于检查群体内CD3阳性细胞的总体分布。在图5中显示了流式细胞术数据，并证明转导效率>26％。
对BxPC3细胞的高CEACAM-6 CAR-T细胞毒性
RTCA测定
通过实时细胞分析(RTCA)测量每批CAR-T细胞(#1、2和3)的CEACAM-6-CAR-T细胞对BxPC3靶细胞的细胞毒性(图6A、B、C)。
迄今为止，RTCA在使用贴壁细胞系时提供了可靠的数据。我们的靶细胞是BxPC3细胞，并且效应细胞是CAR-T细胞，比率为1:10。
RTCA实验样品包括以下：
(i)靶标BxPC3
(ii)正常的、未转导的CAR-T细胞(阴性效应细胞对照)
(iii)CEACAM-6-CAR-T细胞，用CEACAM-6 CAR慢病毒转导的人T-细胞(阳性效应细胞)。
简而言之，在引入CEACAM-6 CAR-T效应细胞之前24hr，将细胞以每孔1×104个细胞进行铺板。从这一点开始记录跨越E板的阻抗值。一旦细胞汇合，就洗涤孔并加入适当数量的CAR-T细胞，这取决于所期望的效应细胞：靶细胞的比率。
数据(图6)清楚地显示与阴性对照T细胞相比，CEACAM-6-CAR-T对BxPC3细胞的细胞毒性显著增加。T细胞具有一些先前在一些供体中观察到的细胞毒活性。
CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低体内BxPC3异种移植肿瘤生长.
从Taconic Bioscience(哈德逊,NY)获得5周龄的CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac)雌性小鼠。将胰腺BxPC3癌细胞(2×106个细胞/小鼠)皮下注射到NOG小鼠的后胁腹中。在BxPC3细胞注射PBS后第二天，将T细胞或CEACAM-6-CAR-T细胞静脉内注射到小鼠(1×107)/小鼠)中的小鼠静脉尾部。用卡尺每周测量肿瘤大小和小鼠体重两次，并使用以下公式计算肿瘤体积：长度×宽度2)/2。
CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低体内异种移植物BxPC3肿瘤生长(p值相对于PBS＝7.9E-06；p值相对于模拟对照T细胞＝0.00025，学生t检验)(图7)。
CEACAM-6 CAR-T细胞不影响小鼠体重.
图8证明CEACAM-6-CAR-T细胞对小鼠体重没有毒性作用，并且所有小鼠在3次注射CEACAM-6-CAR-T细胞后均存活(在3次注射期间注射总共3×107个细胞，等于3×1010人剂量)。
在实验结束时，收集异种移植肿瘤用于生物化学和遗传分析。
图9证明在CEACAM-6处理的小鼠中肿瘤重量降低和一个肿瘤完全消除。
结论
CEACAM-6-CAR-T细胞显著降低体外BxPC3胰腺癌细胞生长并显著降低体内BxPC3胰腺癌异种移植肿瘤生长。
结果强烈支持CEACAM-6可以被用作针对胰腺肿瘤的新型且有效的免疫疗法治疗。
附录A
A1.NOG小鼠中的异种移植肿瘤生长.
表：研究设计
程序
1)从Taconic Bioscience(哈德逊,NY)获得5周龄的雌性CIEA NOG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)小鼠。
2)一经收到，小鼠将在动物设施中适应5天。
3)将BxPC3细胞系用于注射。
·在植入当天(第0天)，将BxPC3细胞离心，用PBS洗涤一次，并以2×107个细胞/mL重悬于PBS中。
·以0.10mL体积皮下注射200万个细胞(2×106个)
4)在植入后的天(第1天、第8天和第15天)，通过静脉内静脉尾部注射PBS、模拟-T和CAR-T细胞。
·在治疗当天，将模拟-T和CAR-T细胞离心，洗涤一次，并以5×107个细胞/mL重悬于PBS中。
·以0.20mL体积经由尾静脉静脉内注射一千万个细胞(1×107个)。
i.组1接受PBS。
ii.组2接受模拟T细胞
iii.组3接受CAR-T细胞
5)每天观察所有动物的一般活动水平以及发病率和行走不便的临床症状。每周记录两次体重和肿瘤测量值。
·使用以下公式计算以mm3计算的肿瘤体积：
·(长度×宽度2)/2
6)当肿瘤体积达到终点肿瘤体积(600-1000mm3)时，对动物实施安乐死并收获肿瘤。一经安乐死，收获整个肿瘤，储存在组织盒中，快速冷冻，并在-80℃下储存。
A2.统计学分析.
完成学生t检验以测量组间的显著差异。P值<0.05被认为是显著的。在异种移植肿瘤生长第29天的实验结束时，认为是显著差异的，其中p值<0.001。
实施例4
在RTCA(实时细胞毒性测定)分析中，针对乳腺导管癌HCC1954细胞系、结肠腺癌LS-174T细胞系和肺癌A549细胞系测试CEACAM6 CAR-T细胞。将BxPC3胰腺癌细胞系用作阳性对照。数据显示抗CEACAM6 CAR-T在所有分析的三种细胞系中都高度有效。
通过流式细胞术进行的CAR-T细胞的产生、CAR的表达
将新鲜制备的CEACAM6 CAR-T细胞扩增13天，并被用于用抗美洲驼抗体和第二抗兔FITC抗体进行的流式细胞术中。如图10所示，用第一兔抗美洲驼抗体和同种型IgG阴性对照进行流式细胞术分析，然后进行抗兔FITC抗体染色，显示用慢病毒CAR有效转导T细胞，并表达CEACAM-6 scFv。CD3-APC染色检测到高百分比的T细胞。实时细胞测定(RTCA)，CAR-T细胞细胞毒性
将新鲜制备的CAR-T细胞扩增13天用于RTCA测定中。将BXPC3用作阳性靶细胞系。将靶细胞以(96孔板的)每孔1×104个细胞铺板，并孵育24hr。将抗CEACAM6 CAR-T细胞用作效应细胞，同时使用未转导的CAR-T细胞作为阴性对照。将CAR-T细胞和未转导的T细胞以10:1的比率(效应细胞比靶标细胞)加入到含有靶细胞的适当孔中。
BxPC-3细胞的结果如图11所示，LS-174-T细胞的结果如图12所示，HCC1954细胞的结果如图13所示，并且A549细胞的结果如图14所示。在每种情况下，显然CEACAM6 CAR-T细胞对癌细胞具有高细胞毒活性。
这些数据显示针对所有四种细胞系的特异性和高CEACAM-CAR-T细胞毒活性：胰腺癌BxPC3细胞；乳腺癌HCC1954细胞；结肠癌LS174T细胞和肺癌A549细胞。可以将所有这些癌细胞系用作用CEACAM-CAR-T细胞的体内研究的模型细胞。这些数据表明CEACAM6 CAR-T细胞对任何表达CEACAM6的癌症具有细胞毒性活性。
实施例5
在体内测试CEACAM-6-CAR-T细胞在已建立的胰腺癌BxPC3异种移植物中的功效。在上述实施例中，当在肿瘤细胞注射后第一天首次注射CAR-T细胞时，证明了CEACAM-6-CAR-T细胞在体外和体内对BxPC3细胞的高细胞毒性。在该实施例中，使用CIEA-NOG小鼠(Taconic)并用BxPC3细胞皮下注射到后胁腹中(2×106个细胞/小鼠)。三组小鼠：PBS；模拟(T细胞)；和CEACAM-6 CAR-T细胞(每组5只小鼠)，在第12天(当异种移植肿瘤达到体积100mm3时)、第20天和第26天用静脉内(i.v)注射1×PBS或1×107个T细胞或CAR-T细胞处理。
该数据证明了使用已建立的异种移植小鼠模型的CEACAM-6 CAR-T细胞的非常高的功效。相对于PBS对照组，CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低胰腺癌细胞BxPC3异种移植肿瘤生长(p值<0.002)。数据显示CEACAM-6 CAR-T细胞对胰腺癌的高治疗潜力，并证实和再现上述体内研究结果。这些结果表明CEACAM-6-CAR-T细胞可用于未来的临床试验和治疗方式中。
RTCA测定
通过实时细胞分析(RTCA)来测量每批CAR-T细胞(#1、2和3)的CEACAM-6-CAR-T细胞对BxPC3靶细胞的细胞毒性(图15、16和17)。迄今为止，RTCA在使用贴壁细胞系时提供了可靠的数据。靶细胞是BxPC3细胞，并且效应细胞是CAR-T细胞，比率为1:10。
RTCA实验样品包括以下：
(i)靶标BxPC3细胞；
(ii)正常的、未转导的CAR-T细胞(阴性效应细胞对照)；和
(iii)CEACAM-6-CAR-T细胞，用CEACAM-6 CAR慢病毒转导的人T细胞(阳性效应细胞)。
简而言之，在引入CEACAM-6 CAR-T效应细胞之前24hr，将细胞以每孔1×104个细胞铺板。从这一点开始记录跨越E板的阻抗值。一旦细胞汇合，就洗涤孔并以10:1的靶细胞比率加入适当数量的CAR-T细胞。
与阴性对照T细胞相比，数据(图15A、B和C)清楚地显示CEACAM-6-CAR-T细胞对BxPC3细胞的细胞毒性显著增加。对照T细胞具有一些先前在一些供体中观察到的细胞毒活性。
CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低体内建立的BxPC3异种移植肿瘤生长
从Taconic Bioscience(哈德逊,NY)获得5周龄的CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac)雌性小鼠。将胰腺BxPC3癌细胞(2×106个细胞/小鼠)皮下注射到NOG小鼠的后胁腹中。当肿瘤体积达到100mm3时，在第12天、第20天和第26天将PBS、T细胞或CEACAM-6-CAR-T细胞静脉内注射(1×107个/小鼠)到小鼠尾静脉中。用卡尺每周测量两次肿瘤大小和小鼠体重，并使用以下公式计算肿瘤体积：(长×宽2)/2。
CEACAM-6 CAR-T细胞显著降低体内已建立的异种移植BxPC3肿瘤生长(p值相对于PBS＝0.0386，p值相对于模拟T细胞＝0.0005，第3天，单项方差分析与Tukey多重比较检验)(图16)。
CEACAM-6 CAR-T细胞减小肿瘤大小
没有观察到CEACAM-6-CAR-T细胞对小鼠体重的毒性作用(图17)，并且所有小鼠在3次注射CEACAM-6-CAR-T细胞后都存活(在3次注射期间注射总共3×107个细胞，这大约相当于3×1010人剂量)。在CEACAM-CAR-T组中没有异常的总体观察结果，而在对照组中由于肿瘤生长存在异常的总体观察结果。如图18所示，CEACAM-6 CAR-T处理的小鼠具有减小的肿瘤大小和两个肿瘤的完全消除。
CEACAM-6-CAR-T细胞在体外显著降低BxPC3胰腺癌细胞生长并显著降低体内建立的BxPC3胰腺癌异种移植肿瘤生长。该结果与上述那些结果组合强烈支持CEACAM-6可以被用作针对表达CEACAM-6的肿瘤的新型且有效的免疫疗法治疗。

Claims (53)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其与CEACAM6、CEACAM6的表位或片段、或CEACAM6的变体结合。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含用于与CEACAM6结合的单结构域抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的CAR，其中所述单结构域抗体或其片段属于骆驼科(Camelidae)物种。
4.如权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述CAR与CEACAM6的表位结合，所述表位包含序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)或由序列NRIGYSWYKG(SEQ ID NO:6)组成。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含用于与CEACAM6结合的至少一个互补决定区(CDR)，所述互补决定区(CDR)选自CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含GRTNSVYTMG(SEQ ID NO:1)的序列；CDR2包含IMWGAGTNTHYADSVKG(SEQ ID NO:2)的序列；CDR3包含AANRGIPIAGRQYDY(SEQ ID NO:3)的序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的CAR，其包含以下序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)，或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的CAR，其包含间隔分子、跨膜区和选自以下的一种或多种细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。
8.如权利要求1至7中任一项所述的CAR，其包含以下序列或由以下序列组成：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:5)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述CAR是人源化的。
10.免疫细胞，其包含权利要求1至9中任一项所述的CAR。
11.如权利要求10所述的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。
12.如权利要求10或11所述的免疫细胞，其还包含至少第二CAR。
13.如权利要求10至12中任一项所述的免疫细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
14.如权利要求13所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
15.如权利要求13或14所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
16.如权利要求10至15中任一项所述的免疫细胞，其还包含自杀基因。
17.如权利要求10至16中任一项所述的免疫细胞，其被配制成包含药学载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。
18.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含CEACAM6结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述CEACAM6结合部分与CEACAM6或其变体或片段结合。
19.如权利要求18所述的核酸分子，其中所述CEACAM6结合部分包含针对CEACAM6或CEACAM6的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。
20.如权利要求19所述的核酸分子，其中所述CEACAM6结合部分包含所述单克隆抗体的可变区。
21.如权利要求18至20中任一项所述的核酸分子，其中所述免疫细胞激活部分包含以下蛋白中的任一种或多种的T细胞信号传导结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白，以及它们的变体或片段。
22.如权利要求18至21中任一项所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的至少一种的核酸序列；和/或其与SEQ IDNO:6的序列结合。
23.包含编码嵌合抗原受体(CAR)的一条或两条多肽链的核苷酸序列的核酸分子，其中所述CAR从N-末端至C-末端依次包含：
i)特异性针对CEACAM6的抗原结合单结构域抗体；
ii)跨膜结构域；
iii)共刺激多肽，其中所述共刺激多肽是4-1BB多肽和/或OX-40多肽；和
iv)细胞内信号传导结构域。
24.如权利要求23所述的核酸分子，其中第一多肽包含在所述单结构域抗体与所述跨膜结构域之间插入的铰链区。
25.如权利要求24所述的核酸分子，其中所述铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或来源于CD8的铰链。
26.如权利要求23至26中任一项所述的核酸分子，其中所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
27.如权利要求26所述的核酸分子，其中包含ITAM的所述细胞内信号传导结构域选自CD3-ζ和ZAP70。
28.如权利要求23至27中任一项所述的核酸分子，其中将所述核苷酸序列与T细胞特异性启动子可操作地连接。
29.如权利要求23至28中任一项所述的核酸分子，其中将所述核苷酸序列与NK细胞特异性启动子可操作地连接。
30.嵌合抗原受体(CAR)，其由权利要求20至29中任一项所述的核酸序列编码。
31.如权利要求30所述的CAR，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
32.载体，其包含权利要求20至29中任一项所述的核酸分子。
33.宿主细胞，其表达权利要求20至29中任一项所述的核酸分子，或权利要求30或31所述的CAR。
34.如权利要求33所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
35.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自T细胞和细胞因子诱导的杀伤CIK细胞。
36.如权利要求33至35中任一项所述的宿主细胞，其还包含至少第二CAR。
37.如权利要求33至36中任一项所述的宿主细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。
38.如权利要求37所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。
39.如权利要求37或38所述的宿主细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。
40.如权利要求33至39中任一项所述的宿主细胞，其还包含自杀基因。
41.细胞群，其包含至少一种如权利要求33至40中任一项所述的宿主细胞。
42.药物组合物，其包含权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞，或权利要求33至38中任一项所述的宿主细胞。
43.治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防所述哺乳动物的癌症的量向所述哺乳动物施用权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞或权利要求33至40中任一项所述的宿主细胞。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述癌症是表达CEACAM6的癌症。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌或膀胱癌。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其还包括施用化学治疗剂。
47.如权利要求42所述的药物组合物，其还包含化学治疗剂。
48.制备选自T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的免疫细胞的权利要求1至9中任一项所述的CAR用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的用途。
49.权利要求10至17中任一项所述的免疫细胞用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的用途。
50.权利要求17或42所述的组合物用于治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的用途。
51.权利要求41所述的细胞群用于制备治疗表达CEACAM6、其表位或片段、或其变体的癌症的药物的用途。
52.核酸分子，其具有SEQ ID NO:9。
53.核酸分子，其具有SEQ ID NO:10。
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