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CN105517572B - 用于治疗癌症的中和可溶性mic的单克隆抗体 - Google Patents

用于治疗癌症的中和可溶性mic的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了涉及结合可溶性主要组织相容性复合物I类链相关分子(sMIC)的抗体的组合物和方法。具体来说，本发明公开了设计或选择用于对从MIC+肿瘤脱落的sMIC进行抑制(例如用于对sMIC进行中和)的抗体。本发明进一步公开了使用该抗体治疗MIC阳性癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的中和可溶性MIC的单克隆抗体
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请主张2013年7月5日递交的美国临时申请No.61/843,182和2013年10月21日递交的美国临时申请No. 61/893,734的优先权，以引用的方式将以上文献的内容整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国防部颁发的W81XWH-06-1-0014以及美国国立卫生研究院颁发的R01 CA149405的政府支持下作出的。美国政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式进行了电子提交，以引用的方式将该序列表整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2014年 6月26日，命名为034186-081580-PCT_SL.txt，大小为16,528字节。
背景技术
血清可溶性NKG2D配体(可溶性sMIC)的升高与某些类型的癌症中的转移有关。在诊断患有前列腺癌的男性中，转移性疾病的发展与血清可溶性NKG2D配体(sMIC)的显著升高以及循环中的NK细胞的极度丧失相关。
发明内容
本文描述了关于对血清可溶性主要组织相容性复合物I类链相关蛋白(sMIC)进行中和是否可以作为转移性癌症的有效系统治疗的研究结果。特别是，对被设计或选择用于对由MIC+肿瘤脱落(shed)的sMIC 进行抑制(例如，对sMIC进行中和)的抗体是否可有效地治疗这些肿瘤进行了研究。本文所述的研究使用了“人源化”双转基因TRAMP/MIC 临床前模型，表明了以特异性抗体对血清sMIC进行中和通过重建NK细胞稳态、致敏(priming)并极化CD4T细胞和增强CD8T细胞功能、且不具有系统性细胞毒性的机制，使得晚期转移性前列腺癌发生消退。当前数据表明，sMIC中和疗法在治疗大范围的MIC+癌症中是有效的。因此，容易将这些结果推广至任何MIC+癌症。
附图说明
图1A-图1C表明在自发性前列腺癌的小鼠模型(TRAMP，小鼠前列腺的转基因腺癌)中，天然人MIC(B)的前列腺特异性表达促进低分化 (PD)前列腺癌和转移的发展。图1A描绘了Kaplan-Meier曲线，显示与TRAMP小鼠相比，TRAMP/MICB小鼠的存活率显著降低(p<0.001)。在分析中只考虑了肿瘤相关的死亡发生率。数字表示在所标明的存活时间内对动物进行研究。图1B表明与TRAMP同窝仔畜(n＝13)相比，24 周龄的TRAMP/MICB小鼠(n＝12)的同期组群中前列腺重量显著增加。图1C示出了来自于TRAMP/MIC(B)小鼠(代表12只小鼠中的6只)和 TRAMP同窝仔畜(代表13只小鼠中的12只)的肿瘤和相关淋巴结的大体外观的代表性图像。
图2A-图2F表明在TRAMP/MIC小鼠中加速进展为PD癌与血清 sMIC升高以及表面MIC丧失相关。图2A示出了肿瘤细胞上的表面MICB 表达的IHC评分汇总。图2B示出了定量RT-PCR，显示PD和WD肿瘤中的MICB表达在mRNA水平上具有类似水平。图2C示出了在癌症发展期间，处于不同年龄的24周TRAMP/MICB小鼠的同期组群中sMICB 的血清水平的ELISA检测。*表示p<0.01。**表示p<0.001。ns表示不显著。注意到PD癌的发展与sMICB血清水平的显著升高相关。图2D示出了24周龄的TRAMP/MICB小鼠中血清sMICB与肿瘤体积的相关性。图2E示出了定量RT-PCR，显示PD和WD肿瘤中的内源性NKG2D配体RAE-1表达在mRNA水平上具有类似水平。图2F示出了代表性的显微照片和IHC染色的汇总评分，表明TRAMP/MICB癌中内源性NKG2D 配体RAE-1表达的模式。数据代表来自于四次独立分析的结果。
图3A-图3E表明前列腺癌进展与sMIC诱导的NK细胞外周维持受损相关。图3A和图3B示出了24周龄TRAMP/MICB、TRAMP和野生型B6小鼠的同期组群中的脾CD8细胞(图3A)、NK细胞(图3B)和 NKG2D+群的比较。左侧子图为流式细胞术分析的代表性散点图。右侧子图为每个同期组群的流式细胞术分析的合并统计数据。**表示与TRAMP 小鼠相比或与发展为WD肿瘤的TRAMP/MICB小鼠相比p<0.001。图3C 表明根据对24周龄TRAMP/MICB小鼠的同期组群进行的分析，血清sMICB 与脾NK细胞群为显著负相关。图3D示出了流式细胞术分析的代表性散点图以及合并数据的统计分析，表明在发展为PD癌的TRAMP/MICB小鼠中NK细胞的系统性(iLN和BM)耗竭(depletion)。iLN表示腹股沟淋巴结。BM表示骨髓。图3E示出了流式细胞术分析的代表性散点图和统计数据，表明在来自于TRAMP/MICB小鼠的PD肿瘤中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的NK细胞显著减少。全部数据显示了来自于对至少5 只动物进行的三次独立分析的代表性结果。
图4A-图4D表明，sMIC在实验性TRAMP-C2肺转移模型中损害 NK细胞外周稳态并促进肺转移；以及以单克隆抗体(mAb B10G5)对 sMIC进行中和重建了NK细胞稳态并消除了肺转移。图4A示出了实验设计。图4B示出了肺微转移沉积的定量，表明sMIC促进了肺转移，并且以抗sMIC(mAb B10G5)进行处理抑制了肺转移。图4C示出了流式细胞术分析的代表性散点图(左侧子图)和合并统计数据(右侧子图)，表明了骨髓、淋巴结和脾中的NK细胞频率。cIgG表示中和sMIC的mAb B10G5的同种型对照IgG。*表示与抗sMIC(mAb B10G5)处理组和所有注射TRAMP-C2细胞的动物相比p<0.05。图4D示出了代表性的流式细胞术分析和5天之中脾BrdU+NK细胞积聚的定量，表明了NK细胞的更新能力。数据表示了每一亚组五只动物和三次独立实验。
图5A-图5D表明sMIC在移植的转移性TRAMP-C2-sMIC小鼠中扰乱过继转移的NK细胞的增殖。将1×107个V450标记的CD45.1+同类系脾细胞转移至植入了TRAMP-C2-sMICB或TRAMP-C2的CD45.2+小鼠中。在接受CD45.1+同类系脾细胞之前和之后，以sMICB中和抗体(mAb B10G5)或对照IgG(cIgG)对这些小鼠进行处理。同类系转移五天后对小鼠实施安乐死。图5A和图5B示出了安乐死时脾(图5A)和淋巴结 (图5B)中总的过继转移的CD45.1+群中CD45.1+NK细胞的百分比。图 5C和图5D示出了V450稀释试验的汇总，表明sMICB在脾(图5C)和淋巴结(图5D)中扰乱同类系CD45.1+NK细胞的增殖，并且使用抗sMIC (mAb B10G5)进行处理重建了NK细胞的增殖能力。每组中使用5-8 只动物。数据表示三次独立实验。
图6A-图6D表明膜限制性NKG2D配体MICB.A2在TRAMP前列腺中的表达阻止了肿瘤进展。图6A示出了Kaplan-Meier曲线，表明 TRAMP/MICB.A2小鼠(MICB.A2在前列腺上特异性表达的TRAMP小鼠)的无肿瘤存活率。数字表示所研究的动物数。图6B示出了与年龄匹配的TRAMP(n＝13)同窝仔畜相比，TRAMP/MICB.A2bi-Tg小鼠(n＝21) 中的前列腺重量显著降低。将年龄匹配的野生型B6示为正常对照。图 6C表明通过ELISA未在TRAMP/MICB.A2小鼠血清中检测到sMICB。* 表示作为检测阳性对照的来自于TRAMP/MICB小鼠的血清。图6D表明在TRAMP/MICB.A2小鼠中以抗体阻断NKG2D的功能使得前列腺重量显著升高。图6D中的数据表示两次独立实验。
图7A-图7D表明膜限制性MICB.A2在NK细胞和CD8T细胞中均维持了NKG2D抗肿瘤免疫。图7A示出了来自24周龄TRAMP/MICB.A2、 TRAMP和野生型B6小鼠的同期组群的脾NK细胞的流式细胞术分析以及NKG2D表达的相对水平。左侧子图为代表性的散点图。右侧子图为合并数据的定量。图7B和图7C表明当以RMA-RAE-1细胞持续刺激4h 时，来自于TRAMP/MICB.A2小鼠和B6小鼠的脾NK细胞具有类似水平的IFNγ产生(图7B；左侧为流式细胞术分析的代表性散点图；右侧为数据的统计汇总)和细胞溶解能力(图7C)。细胞毒性分析使用标准51Cr释放试验进行。将抗小鼠NKG2D抗体C7用作封闭抗体。图7D示出了流式细胞术分析的代表性散点图以及脾CD8T细胞群和它们的 NKG2D表达的统计。全部数据表示对至少五只动物进行的三次独立分析。
图8A-图8D表明男性中转移性前列腺癌的发展与血液中NK细胞频率的降低以及高水平的血清sMIC相关。数据显示了来自于36例初治 (treatment-)前列腺癌患者的NK细胞(CD3-CD56+)频率(图8A)、 T细胞(CD3+CD56-)频率(图8B)以及sMIC的血清水平(图8C)，其中25例被诊断为局部疾病(localized disease)(非Met)，11例被诊断为远处转移(Met)。将来自于年龄匹配的健康男性(n＝10)的样本用作对照。数据表示来自三次独立分析的结果。图8D表明来自于所有患者的血清sMIC与循环NK细胞的频率之间显著负相关。
图9A-图9D表明以p2B10G5进行处理使得原发性前列腺癌显著消退并抑制转移。图9A为对处理的描述。图9B表明了来自于抗体处理组和对照组的代表性的前列腺大体尺寸。图9C示出了来自于抗体处理组和对照组的前列腺重量的汇总。图9D示出了抗体处理组和对照组中转移发生率的汇总。
图10A-图10C表明了抗体处理的系统性效果。图10A示出了处理过程中的动物体重。图10B示出了处理终点时的血清细胞因子谱。图10C 示出了研究终点时由ELISA测定的血清sMIC。
图11A-图11C表明抗体处理增强了NK细胞稳态和功能。图11A示出了抗体处理组和对照组中的脾和LN中的NK细胞频率。图11B表明了抗体处理组和对照组中的脾和LN中的NK细胞更新或增殖。图11C 示出了响应于PMA和离子霉素刺激的NK细胞IFNγ产生。
图12A-图12B表明抗体处理增强了CD8T细胞活化和功能。图12A 表明抗体处理使NKG2D+CD8T细胞增加，这是活化提高的迹象。图12B 表明抗体处理明显增加了响应于PMA和离子霉素刺激的CD8T细胞 IFNγ产生。
图13A-图13C表明抗体处理将CD4辅助性T细胞极化为Th1和 Th17，并增强了中枢记忆性CD4T细胞的积聚。图13A示出了Th1细胞频率的汇总。图13B示出了Th17细胞频率的汇总。图13C示出了中枢记忆性CD4T细胞的汇总。
图14A-图14C表明了NKG2D配体的前列腺限制性表达不改变前列腺生理学或系统性免疫。图14A示出了前列腺特异性转基因构建体。脱落敏感的天然MICB或脱落抗性的突变MICB.A2的表达在前列腺特异性大鼠probasin启动子(-426到+28bp)的引导下发生。图14B示出了MICB 或MICB.A2的前列腺特异性表达的RT-PCR检测。PR表示前列腺。LV 表示肝。LU表示肺。MU表示肌肉。SP表示脾。图14C示出了NKG2D 配体的表达不显著影响前列腺重量。
图15A-图15D表明MIC的前列腺特异性表达不影响系统性NK细胞和CD8T细胞的数量。图15A示出了各基因型的NK1.1群(CD3-NK1.1+) 的代表性流式细胞术分析(左侧子图)和汇总数据的定量(右侧子图)。图15B示出了NK细胞上NKG2D表达的代表性柱状图。图15C和图15D 示出了CD8T细胞群的流式细胞术分析的代表性散点图。全部数据表示每个基因型至少6只动物。
图16A-图16B示出了TRAMP和TRAMP/MICB小鼠的脾和淋巴结中的NK细胞(图16A)和CD8T细胞(图16B)的绝对数量。数据显示，随着进展为PD肿瘤，NK细胞数量显著下降，而CD8T细胞数量则没有显著下降。图16C示出了显示浸润于TRAMP和TRAMP/MICB小鼠的肿瘤实质(tumor parenchyma)中的总CD8T细胞和NKG2D+CD8T 细胞的代表性散点图和合并统计数据。数据显示在总CD8T浸润中无显著差异，但是NKG2D+CD8T细胞显著降低。TIL表示肿瘤浸润淋巴细胞。
图17A-图17B表明了对抗体p2B10G5的sMIC特异性的表征。图 17A示出了来自于流式细胞术分析的代表性频率分布图，显示纯化的 p2B10G5mAb是MIC(A和B)特异性的。在与2μg/ml p2B10G5或对照小鼠IgG(cIgG)和PE缀合的山羊抗小鼠IgG孵育之前，使小鼠前列腺肿瘤细胞系TRAMP-C2(TC2)及其衍生物TC2-MICA和TRAMP-MICB 与CD16/32孵育以阻断FcRγ。图17B示出了未经编辑的免疫印迹，显示 p2B10G5是sMIC特异性的。将TC2-sMICB或TC2细胞的2ml培养上清液与p2B10G5和蛋白A珠孵育。用PNGaseF对一半免疫复合物进行处理以去糖基化。将免疫复合物溶解在SDS样品缓冲液中，加载至7.5％ SDS-PAGE凝胶上，转移至硝酸纤维素膜中，并以山羊抗MICB多克隆抗体AF1599(R&D Systems)进行印迹。泳道1，去糖基化sMICB。泳道2，天然sMICB。
图18示出了随着肿瘤转移，组织中的NK细胞损失。柱状图显示由一个肺切片计数的NK细胞的汇总数据。对来自于每只动物的五个肺切片进行计数，以获得个体的平均数据。数据显示了随着肿瘤微转移(H&E 染色中的箭头)，肺实质中的NK细胞损失。
图19A-图19B示出了在移植的TRAMP-C2(TC2)和TC2-sMICB 转移模型的脾和淋巴结中过继转移的V450标记的同类系CD45.1+NK1.1 群(图19A)和增殖(图19B)的流式细胞术分析的代表性散点图。数据显示，与植入TC2细胞的小鼠相比，植入TC2-sMICB细胞的小鼠中所保持的同类系CD45.1+NK1.1细胞明显较少。数据还显示，sMIC中和抗体处理通过增加NK细胞增殖来提高植入TC2-sMICB细胞的小鼠中的同类系CD45.1+NK1.1细胞的可持续性。图19C示出了代表性散点图和合并统计数据，显示sMICB不影响NK细胞归巢受体CD62L的表达。
图20示出了P2B10G5抗体(IgG1K)轻链(蛋白序列公开为SEQ ID NO：7，DNA序列公开为SEQ ID NO：19)和重链(蛋白序列公开为SEQ ID NO：8，DNA序列公开为SEQ ID NO：20)的序列。
图21A-图21G表明以sMIC特异性单克隆抗体B10G5进行治疗使得原发性前列腺癌和转移显著抑制/消退。图21A是处理方案的示意图。图 21B和图21C示出了来自于接受B10G5治疗或同种型对照IgG(cIgG)的小鼠的代表性的前列腺大体尺寸以及前列腺重量的汇总。图21D示出了转移发生率的汇总。图21E表明B10G5治疗降低了sMIC的血清水平。图21F示出了治疗结束时的血清细胞因子谱的图。图21G示出了治疗过程中小鼠体重变化的图。注意到对照组的体重增加是由于原发肿瘤负荷大。
图22A-图22G表明B10G5治疗不仅增强NK细胞稳态和功能，还加强适应性T细胞功能。图22A-图22B表明B10G5治疗显著增加了外周NK细胞数量以及NK细胞更新的能力。图22C表明，B10G5治疗显著促进响应于PMA和离子霉素再刺激的NK细胞IFNγ产生。图22D表明B10G5治疗显著增加CD8T细胞上共刺激性NKG2D的表达。图22E 表明，治疗加强了响应于再刺激的CD8T细胞IFNγ产生。图22F表明， B10G5治疗致敏(primed)dLN中的CD4T细胞极化为肿瘤反应性Th1 和Th17。图22G表明B10G5治疗显著增加了CD44hi记忆CD4和CD8T 细胞。数据表示三次独立研究。对于每组中的动物，n>5。*表示p<0.05。
图23A-图23C表明NK耗竭减轻了B10G5的治疗效果。图23A示出了一经NK耗竭即严重增大的前列腺肿瘤。图23B示出了对接受B10G5 治疗的NK耗竭小鼠和非耗竭小鼠的前列腺重量进行比较的图，表明随着NK细胞耗竭，肿瘤不能对B10G5治疗产生应答。图23C示出了B10G5 治疗期间IFN-γ+CD4T细胞百分比随NK细胞耗竭而发生降低的图。
图24示出了流式细胞术分析的频率分布图，表明在与由C1R-MICA 细胞表达的MICA结合这方面，嵌合的chB10G5抗体与天然mAb B10G5 具有类似的亲和力。嵌合的chB10G5是通过将mAb B10G5(IgG1)的可变区VL和VH分别与人IgG1恒定区CL和CH进行融合而产生的。
具体实施方式
本文所示的具体事项仅是出于对本发明的优选实施方式进行说明性讨论的目的并采用了示例的方式，并且是为了提供被认为是在本发明各种实施方式的原理和概念方面的最有用且容易理解的说明而提出。在这方面，除了对于基本理解本发明而言必要的内容，并未更详细地显示本发明的结构细节；这些说明连同附图和/或实施例使得本发明的若干形式可如何在实践中实施对于本领域技术人员而言是显而易见的。
除非在以下实例中作出明确且无疑义的修改、或应用该含义导致任何阐释(construction)无意义或本质上无意义，否则以下定义和解释在任何未来的阐释中均意在且旨在为控制性的(controlling)。在术语的阐释将使其无意义或本质上无意义的情况下，应从Webster's Dictionary(第三版)或本领域技术人员已知的词典(例如OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Anthony Smith编，牛津大学出版社，牛津，2006)中采用定义。
除非另有说明，本文所使用的术语“一个(a/an)”是指“一个/种”、“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。除非上下文另有要求，本文所使用的单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
除非上下文另有明确要求，在整个说明书和权利要求书中，单词“包含/包括/含有(comprise/comprising)”等以开放性(inclusive)含义进行阐释，与封闭性(exclusive)或穷举性(exhaustive)含义相反；也就是说，其含义为“包括但不限于”。使用单数或复数的单词也分别包含复数和单数。此外，在本申请中使用时，单词“本文”、“以上”、“以下”和类似含义的单词应当是指作为整体的本申请，而非本申请的任何特定部分。
为方便起见，将本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语汇集于此。除非另有说明或隐含于上下文中，下列术语和短语包含以下所提供的含义。除非另有明确声明或基于上下文是显而易见的，以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属的技术领域中已获得的含义。提供此类定义以帮助描述具体实施方式，并非旨在限制所要求保护的发明，这是由于本发明的范围仅受到权利要求书的限制。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。
术语“降低/下降”、“减小/减少”和“抑制”在本文中通常均是用于指相对于参照而言减少统计上显著的量。然而，为了避免疑义，“减小/ 减少”或“降低/下降”或“抑制”通常是指与参照水平相比减少至少10％，并且可以包括例如与参照水平相比减少至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％，直至并包括例如与参照水平相比给定实体或参数完全缺失，或与缺少给定处理相比减少10-99％之间的任意值。
术语“增加/增高”或“增强/提高”或“活化/激活”在本文中通常均是用于指增加统计上显著的量；为了避免任何疑义，术语“增加/增高”或“增强/提高”或“活化/激活”是指与参照水平相比增加至少10％，例如与参照水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约 90％、或直至并包括增加100％，或与参照水平相比增加10-100％之间的任意值，或与参照水平相比增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4 倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或与参照水平相比增加2倍-10倍以上之间的任意值。
在核酸或多肽的情况下，本文所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”是指与至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽，所述其它组分在发现所述核酸或多肽的天然来源中与所述核酸或多肽共同存在；和/或所述其它组分在由细胞表达时、或者在分泌的多肽的情况下被分泌时，将与所述核酸或多肽共同存在。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。术语“纯化的”或“基本纯化的”是指分离的核酸或多肽，其至少95wt％为目标核酸或多肽，包括例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。这些本领域公知的术语是指如Kabat等(1971)Ann.NY Acad， Sci.190:382-391和/或Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242中所描述的用于对抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的与其它氨基酸残基相比而言更为可变 (即，高可变(hypervariable))的氨基酸残基进行编号的系统。
本文所使用的“表位”可由连续氨基酸在多肽上形成或可由通过蛋白质的三级折叠而毗邻的不连续氨基酸在多肽上形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露至变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在以变性溶剂进行处理时通常丢失。表位典型地包含处于独特空间构象中的至少3个氨基酸，更通常为至少5个、约9个、或约8-10个氨基酸。“表位”包含由免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位限定了抗体的最小结合位点，因此代表了抗体的特异性靶标。在单域抗体的情况下，表位代表由孤立的可变域结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可以互换使用。在某些实施方式中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基；并且，在某些实施方式中，表位决定簇可能具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
“亲合力(avidity)”是抗原结合分子(如本文所述的抗体或其抗体片段)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与如下两方面均有关：抗原决定簇与抗原结合分子上其抗原结合位点之间的亲和力；以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数量。通常来说，抗原结合蛋白(如本文所述的抗体或抗体的部分)将以一定的解离常数结合至它们的同源抗原(cognate antigen)或特异性抗原(KD为10-5～10-12摩尔/升以下，如 10-7～10-12摩尔/升以下、或10-8～10-12摩尔/升(即，结合常数(KA)为 105～1012升/摩尔以上，如107～1012升/摩尔或108～1012升/摩尔))。通常认为高于10-4摩尔/升的任何KD值(或低于104Μ-1的任何KA值)表明非特异性结合。被认为是有意义的(例如特异性的)生物相互作用的KD 通常在10-10M(0.1nM)～10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。例如，本文所述的抗体或其部分上的结合位点将以低于500 nM(例如低于200nM)或低于10nM(例如低于500pM)的亲和力与期望的抗原结合。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过以下方式确定：任何本身已知的合适方式(包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法 (EIA)和夹心竞争测定法)；以及本领域中本身已知的上述方式的不同变型；以及本文提到的其它技术。
因此，本文所用的“选择性结合”或“特异性结合”是指本文所述的抗MIC结合肽(例如抗体或其部分)以10-5M(10000nM)以下(例如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M或更低) 的KD结合至靶标(例如存在于细胞表面上的MIC分子)的能力。特异性结合可以受到例如多肽试剂的亲和力与亲合力以及多肽试剂的浓度等因素的影响。本领域普通技术人员可以采用任何合适的方法(例如，在合适的细胞结合测定法中对多肽试剂进行滴定)确定适当的条件，在该条件下，本文所述的多肽试剂选择性地与靶标相结合。特异性地结合至靶标的多肽不被不相似的竞争物所置换。在某些实施方式中，当抗体或其抗原结合部分在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，认为该抗体或其抗原结合部分特异性地与抗原相结合。
在一些实施方式中，与非MIC多肽相比，特异性结合至sMIC的试剂特异性地结合至sMIC。在一些实施方式中，与非可溶性MIC相比(例如，与未切断的、成熟MIC的胞外域相比)，特异性结合至sMIC的试剂特异性地结合至sMIC。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分以10-5M (10000nM)以下(例如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11 M、10-12M或更低)的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-5M～10-6M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-6M～10-7M的解离常数(KD)与sMIC 多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-7M～10-8M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-8M～10-9M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-9M～10-10M的解离常数(KD)与 sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-10M～10-11M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以约10-11 M～10-12M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。在一些实施方式中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合部分以低于10-12M的解离常数(KD)与sMIC多肽结合。
本文所使用的术语“包含/包括/含有”是指对于所述方法或组合物来说必需的组分、方法和它们各自的组成部分，然而无论是否必需，对于包含未指定的要素来讲仍是开放的。
本文所使用的术语“实质上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在不实质性地影响该实施方式的基础和新颖性或功能性特性的要素。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法和它们各自的组成部分，排除未在该实施方式的描述中列举的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文明确地另有规定，单数形式“一”、“一个/一种”以及“该/所述”包含复数指代。因此，举例来说，在提及“该方法/所述方法”时，涵盖本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤；和/或本领域技术人员在阅读本公开后将变得显而易见的一种或多种方法和/或步骤等。类似地，除非上下文明确地另有规定，单词“或/或者”旨在包含“和/及/以及”。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实施或测试中，下文仍描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源于拉丁语“exempli gratia”，在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如/举例来说(for example)”意义相同。
除了在操作实施例中或另有提及的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”在与百分比连接使用时可以表示±1％。
术语“统计上显著”或“显著地”是指统计显著性，一般是指高于或低于参照值两个标准差(2SD)的差异。在下面各个部分的文本中给出了额外定义。
细胞生物学和分子生物学中的常用术语的定义可以在下述文献中找到：TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(编)， The Encyclopedia of MolecularBiology，Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Current Protocols in ProteinSciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等编。
除非另有说明，本发明采用例如以下文献中所述的标准程序进行： Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，美国(2012)； Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York，美国(1995)；或Methods inEnzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques 152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编，Academic Press Inc.，San Diego，美国(1987)；Current Protocols in ProteinScience(CPPS) (John E.Coligan等编，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocolsin Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编，John Wiley and Sons，Inc.)；以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney 著，Wiley-Liss出版，第5版(2005)；Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编，Academic Press，第1版，1998)，以引用的方式将上述全部文献整体并入本文。
本文在对本发明各个方面进行的描述中对其它术语进行定义。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及结合MIC多肽的抗体和/ 或包含抗体的抗原结合部分的多肽。在一些实施方式中，MIC多肽是可溶性MIC多肽(sMIC)。本文所使用的“可溶性MIC”或“sMIC”是指缺乏跨膜结构域的MIC多肽的部分，例如，已经从跨膜结构域切割下来的MIC的胞外部分。在一些实施方式中，可溶性MIC可以包含约为例如 SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的氨基酸24-260。在一些实施方式中，可溶性MIC可以包含约为例如SEQ IDNO：15或SEQ ID NO：16的残基24-260的20个以上的氨基酸，例如，SEQ ID NO：15或SEQ IDNO： 16的残基24-260的20个、50个、100个、150个以上的氨基酸。
主要组织相容性复合物I类链相关(MIC)多肽是表面跨膜蛋白。细胞表面上MIC多肽的存在可以向免疫受体NKG2D发出信号以进行肿瘤免疫摧毁，典型地通过自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞(CTL) 来完成。然而，在许多肿瘤中，MIC从肿瘤表面脱落(shed)，导致宿主针对肿瘤细胞的免疫力降低，并促进肿瘤逃逸和肿瘤进展。MIC多肽包括但不限于人MICA(例如，NCBI Ref Seqs NP_000238(SEQ ID NO： 15)和001170990)以及人MICB(例如，NCBI Ref Seq:NP_005922(SEQ ID NO：16))。在一些实施方式中，MIC多肽可以包含MICA。在一些实施方式中，MIC多肽可以包含MICB。
在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及sMIC的抑制，例如，降低可与细胞受体相互作用的sMIC的水平和/或活性。在一些实施方式中，sMIC的抑制可以是未结合sMIC(例如，未结合至受体的sMIC 和/或可被本文所述的抗体试剂结合的sMIC)的减少。在一些实施方式中， sMIC的抑制可以是sMIC水平(例如循环中的sMIC水平)的降低。
在一些实施方式中，本文描述了特异性地与sMIC多肽相结合的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含选自于由下述重链和轻链互补决定区(CDR)所组成的组中的一个或多个重链和轻链CDR：(a)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；(b) 具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；(c)具有SEQ ID NO： 11的氨基酸序列的轻链CDR3；(d)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。在一些实施方式中，本文描述了特异性地与sMIC多肽相结合的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述轻链互补决定区(CDR)： (a)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；和(c)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方式中，本文描述了特异性地与sMIC 多肽相结合的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述重链互补决定区(CDR)：(d)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链 CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。在一些实施方式中，本文描述了特异性地与sMIC多肽相结合的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述重链和轻链互补决定区(CDR)：(a)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；(d)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；(e)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链 CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或包含抗体的抗原结合片段的多肽包含选自于由下述CDR所组成的组中的一个或多个CDR(例如1 个CDR、2个CDR、3个CDR、4个CDR、5个CDR或6个CDR)：(a) 具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；(b)具有SEQ ID NO： 10的氨基酸序列的轻链CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；(d)具有SEQ IDNO：12的氨基酸序列的重链CDR1；(e) 具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；和(f)具有SEQ ID NO： 14的氨基酸序列的重链CDR3。在一些实施方式中，本文所述的抗体或包含抗体的抗原结合片段的多肽包含重链或其部分，所述重链或其部分包含选自于由下述CDR所组成的组中的一个或多个CDR(例如1个 CDR、2个CDR或3个CDR)：具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有 SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。在一些实施方式中，本文所述的抗体或包含抗体的抗原结合片段的多肽包含轻链或其部分，所述轻链或其部分包含选自于由下述CDR所组成的组中的一个或多个CDR (例如1个CDR、2个CDR或3个CDR)：具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分可以包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分可以包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在本文所述的抗体包含与SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：14的序列不同的至少一个CDR的实施方式中，该至少一个CDR的氨基酸序列可以通过本领域技术人员公知的方法选择。例如，Fujii，2004，Antibody affinity maturation by random mutagenesis，Methods inMolecular Biology:Antibody Engineering 248：345-349(以引用的方式将其内容整体并入本文)，特别是在图2和3.3节，描述了生成任何感兴趣的CDR的文库的方法。这允许本领域普通技术人员识别出可替代的CDR(包括本文所述的特定CDR 序列的保守置换变体)，当本文所述的抗体或其抗原结合片段中存在所述可替代的CDR时，将产生会与MIC多肽相结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可以抑制sMIC。Fujii 等中所述的方法也允许本领域普通技术人员能够对在与已知重链片段混合时会给出期望的结合行为的轻链序列进行筛选，反之亦然。
本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性地与抗原相结合的抗原结合位点的分子。该术语也指包含2个免疫球蛋白重链和2个免疫球蛋白轻链的抗体以及包括全长抗体及其抗原结合部分在内的各种形式；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双价抗体(diabody)、多特异性抗体(multispecific antibody)、双重特异性抗体(dualspecific antibody)、抗独特型抗体 (anti-idiotypic antibody)、双特异性抗体(bispecific antiboty)、上述抗体的功能活性表位结合片段、双功能混合抗体(例如Lanzavecchia等，Eur. J.Immunol.17，105(1987))和单链(例如Huston等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等，Science 242，423-426(1988)，以引用的方式将它们并入本文)。(一般地，请参见Hood等，Immunology， Benjamin，N.Y.，第2版(1984)；Harlow和Lane，Antibodies.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)；以及Hunkapiller和Hood， Nature，323，15-16(1986)，以引用的方式将它们并入本文)。
每条重链由所述重链的可变区(此处简称为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由所述轻链的可变区(此处简称为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL结构域构成。VH和VL区可进一步分为称为互补决定区(CDR)的高变区以及穿插其中的称为框架区(FR)的保守区。因此，每个VH和VL区由三个CDR和四个FR构成，从N端到C端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这一结构是本领域技术人员所公知的。
本文所使用的术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每一可变区中有三个CDR，对于每一可变区将它们指定为 CDR1、CDR2和CDR3。不同系统对这些CDR的确切边界给出了不同定义。由Kabat描述的系统(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(美国国立卫生研究院，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了适用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称作Kabat CDR。定义出与Kabat CDR相重叠的CDR的其它边界已由以下文献描述：Padlan (FASEB J.9：133-139(1995))、MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45 (1996))及Chothia(J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和Nature 342:877-883(1989))。在此之外的CDR边界定义可能未严格遵循上述系统之一，尽管它们基于“特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合”的预测或实验结果可能会缩短或加长，但仍然会与Kabat CDR相重叠。尽管优选的实施方式使用了Kabat定义的CDR，但是本文所使用的方法可以利用根据上述任何系统定义的CDR。
如本文所使用的，术语“蛋白/蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，用来指定各自通过相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键连接至另一氨基酸残基的一系列氨基酸残基。在本文中可互换使用的术语“蛋白/蛋白质”和“多肽”是指蛋白质氨基酸(包括修饰的氨基酸(例如磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物)的聚合物，而不考虑其大小或功能。“蛋白/蛋白质”和“多肽”通常用来指相对较大的多肽，而术语“肽”通常用于指代小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是重叠的。当提及编码的基因产物及其片段时，术语“蛋白/蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物(homologs)、直系同源物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)、片段，以及上述的其它等同物、变体、片段和类似物。
在本文中可互换使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指本文所述的抗体的一个或多个片段，所述片段仍具有上文所定义的结合亲和力。已经表明完整抗体的片段能够发挥抗体的抗原结合功能。按照术语抗体的“抗原结合部分”，结合片段的实例包括：(i)Fab 片段，即，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab')2 片段，即，包含两个Fab片段的双价片段，所述两个Fab片段通过二硫桥在铰链区互相连接；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv) 由抗体单臂的FL和VH结构域组成的Fv片段；以及(v)由VH结构域或由VH、CH1、CH2、DH3或VH、CH2、CH3组成的dAb片段(Ward 等，(1989)Nature341:544-546)(已经表明dAb或仅包含VL结构域的单域抗体也特异性地结合至靶表位)。虽然Fv片段的称为VL和VH的两个结构域由分离的基因编码，还可以使用合成的接头(例如poly-G4S 氨基酸序列(“G4S”，公开为SEQ ID NO：17))和重组方法将它们进一步互相连接，使得有可能将它们制备为单蛋白质链，其中VL和VH区结合以形成一价分子(称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在包含此类单链抗体。单链抗体的其它形式(例如“双价抗体”)也包含在此处。双价抗体是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，然而所使用的接头过短，两个结构域不能结合在同一链上，从而强制所述结构域与不同链的互补结构域进行配对，并形成两个抗原结合位点(参见例如Holliger，R.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恒定域是指重链或轻链恒定域。人IgG重链和轻链恒定域氨基酸序列在本领域是已知的。
此外，本文所述的抗体或其抗原结合部分可以是所述抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白质或肽通过共价或非共价缔合形成的更大的免疫粘附分子的一部分。与此类免疫粘附分子相关的是使用链霉亲和素核心区以制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C端聚组氨酸(例如六聚组氨酸标签(“六聚组氨酸标签”公开为SEQ ID NO：18))以生产双价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994) Mol.Immunol.31：1047-1058)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体和/或其抗原结合部分可以是免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、 Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体，以及上述抗体的功能活性表位结合片段。
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，当所造成的改变导致将氨基酸置换为化学上类似的氨基酸、并保留了特异性结合至靶抗原(例如MIC多肽的sMIC上存在的表位)的能力时，使得编码序列中单个氨基酸或少量百分比的氨基酸发生改变的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个置换、删除或添加是“保守修饰变体”。这种保守修饰变体是在与本发明相一致的多态性变体、种间同源物与等位基因的基础之上另外涵盖的，并且不排除与本发明相一致的多态性变体、种间同源物与等位基因。
在一些实施方式中，抗体试剂的保守修饰变体可以包含位于CDR之外的改变，例如，抗体试剂的保守修饰变体可以包含具有SEQ ID NO： 9-SEQ ID NO：14中的一个或多个的序列的CDR。
给定氨基酸可以由具有相似生理化学特性的残基替换，例如，用一个脂肪族残基置换另一个(例如，Ile、Val、Leu或Ala互相置换)，或用一个极性残基置换另一个(例如，Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn 之间)。其它此类保守置换(例如，具有类似疏水特性的整个区域的置换) 是众所周知的。可以在任一种本文所述的分析中对包含保守氨基酸置换的多肽进行检测，以确认所期望的活性(例如天然多肽或参照多肽的抗原结合活性和特异性)得以保留。
可以根据氨基酸侧链性质的相似性对氨基酸进行分组(参见A.L. Lehninger，Biochemistry，第2版，73-75页，Worth Publishers，New York (1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、 Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷、极性：Gly(G)、Ser(S)、 Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、 Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，可以基于一般的侧链性质对天然存在的残基进行分组：(1) 疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、 Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5) 影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守置换将需要使得把这些类别之一的成员变换为另一类别。
具体的保守置换包括例如：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys； Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn； Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile 变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln 或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu 或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。
在一些实施方式中，本文所述的抗体和/或其抗原结合部分可以是本文所述序列的变体，例如，抗体多肽的保守置换变体。在一些实施方式中，该变体是保守修饰变体。例如，通过天然核苷酸序列的突变可以得到保守置换变体。本文所称的“变体”是与天然或参照多肽实质上同源的多肽，但是由于一个或多个删除、插入或置换，其具有与天然或参照多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的DNA序列涵盖了与天然或参照 DNA序列相比而言包含核苷酸的一个或多个添加、删除或置换，但编码了保留活性(例如，针对相关靶多肽(如sMIC多肽)的抗原特异性结合活性)的变体蛋白或其片段的序列。各种各样的基于PCR的位点特异性突变方法也是本领域已知的，可以由本领域普通技术人员加以应用。
置换变体的实例包括不改变CDR序列的氨基酸的保守置换，例如 VH或VL结构域中的保守置换。不包含于CDR中的序列中的保守置换可以是相对于野生型序列或天然存在的序列(例如，人或鼠类抗体序列的框架区和/或恒定区)的置换。
变体氨基酸序列或DNA序列优选与天然序列或参照序列具有至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的一致性。天然序列和突变序列之间的同源程度(一致性百分比)可以通过例如使用可在万维网上免费获取的通常用于这一目的的计算机程序(例如BLASTp或BLASTn，使用默认设置)对两个序列进行比较而确定。
天然氨基酸序列的改变可以使用本领域技术人员公知的诸多技术中的任何技术来实现。例如，可通过合成包含突变序列的寡核苷酸(其两翼为限制性位点，从而能够与天然序列片段连接)来在特定位点引入突变。连接后，所得到的重建序列编码具有所期望的氨基酸插入、置换或删除的类似物。或者，可采用寡核苷酸引导的位点特异性突变程序来提供具有取决于所需置换、删除或插入的特定密码子的改变的核苷酸序列。已经充分建立了制造此类改变的技术，包括例如以下文献中描述的技术： Walder等(Gene 42：133，1986)；Bauer等(Gene 37:73，1985)；Craik (BioTechniques，1985年1月，12-19)；Smith等(Genetic Engineering: Principles and Methods，Plenum Press，1981)；以及美国专利No.4,518,584 和No.4,737,462，以引用的方式将上述文献整体并入本文。
任何不涉及维持多肽适当构象的半胱氨酸残基也可以被置换(一般以丝氨酸进行置换)，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以向多肽添加半胱氨酸键以提高其稳定性或促进寡聚化。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分是完全的人抗体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分是重组多肽。
术语“人抗体”是指其可变区和恒定区对应于或源于人生殖系的免疫球蛋白序列的抗体，例如Kabat等所描述的免疫球蛋白序列(参见Kabat 等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版No.91-3242)。然而，人抗体可含有并非由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机突变或位点特异性突变、或由体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。本文所述的重组人抗体具有可变区，并还可含有源于人生殖系免疫球蛋白序列的恒定区(参见Kabat，E.A.等 (1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH出版No.91-3242)。然而，根据具体实施方式，使此类重组人抗体经受体外突变(或体细胞体内突变，如果使用经人Ig序列转基因的动物的话)，使得重组抗体的VH和 VL区的氨基酸序列尽管是涉及或源自人生殖系的VH和VL序列的序列，但并不天然地体内存在于人抗体生殖系系统中。根据具体实施方式，这种重组抗体是选择性突变或回复突变或两者共同导致的结果。优选地，突变导致与亲本抗体相比对靶标的亲和性更高和/或对非靶标结构的亲和性更低。
术语“嵌合抗体”是指含有来自于一个物种的重链和轻链的可变区序列以及来自于另一物种的恒定区序列的抗体，例如，具有连接至人恒定区的鼠重链和轻链可变区的抗体。人源化抗体具有实质上来自于人抗体(称为受体抗体)的可变区框架残基和实质上来自于非人抗体(例如小鼠抗体)(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区。参见Queen等，ProcNatl Acad Sci USA 86：10029-10033(1989)和WO 90/07861、美国专利 No.5,693,762、美国专利No.5,693,761、美国专利No.5,585,089、美国专利No.5,530,101和Winter，美国专利No.5,225,539，以引用的方式将上述文献整体并入本文。恒定区(如果存在的话)也实质上或完全来自于人免疫球蛋白。人可变域通常选自于其框架序列与CDR所源自的(鼠) 可变区结构域呈现出高度的序列一致性的人抗体。重链和轻链可变区框架残基可以实质上类似于相同或不同人抗体序列的区域。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列，或者可以是若干人抗体的共有序列。参见Carter等，WO 92/22653，以引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的抗体试剂(例如抗体)不是天然存在的生物分子。例如，在不存在人为干预和操纵(例如，由人实施的制造步骤)的情况下，针对人源性抗原的鼠抗体不会自然产生。嵌合抗体也不是天然存在的生物分子，例如，这在于所述嵌合抗体包含从多个物种获得并组装为重组分子的序列。在某些具体实施方式中，本文所述的人抗体试剂不是天然存在的生物分子，例如，针对人抗原的完全的人抗体在自然中将会经受负选择，并不会天然存在于人体中。
传统上，单克隆抗体已在鼠杂交瘤细胞系中作为天然分子制造。除了这一技术以外，本文所述的方法和组合物还提供了单克隆抗体的重组 DNA表达。这允许在所选择的宿主物种中制造人源化抗体以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。在细菌、酵母、转基因动物和鸡蛋中制造抗体也是基于杂交瘤的制造系统的替代选择。转基因动物的主要优点在于来自于可再生资源的潜在高收率。
通过本领域公知的各种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于通过事先制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变和盒式突变来制备。编码本文所述的至少一个抗体、部分或多肽的核酸序列可依据传统技术(包括用于连接的平末端或粘性末端、限制性酶消化以提供合适末端、适当填充粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不合意的连接、以及使用适当的连接酶来连接)来与载体DNA重组。用于此类操作的技术公开于例如 Maniatis等，Molecular Cloning，Lab.Manual(Cold Spring Harbor Lab. 出版，纽约，1982和1989)；以及Ausubel，1987，1993中，此类技术可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
如果核酸分子(如DNA)包含含有转录和翻译调控信息的核苷酸序列、而且这样的序列“可操作地连接”至编码多肽的核苷酸序列，则该核酸分子(如DNA)被称为“能够表达”所述多肽。可操作的连接是调控DNA序列与旨在被表达的DNA序列通过“允许基因以可回收的量表达为肽或抗体部分”的方式相连接的连接。基因表达所需的调控区的精确性质可能因生物体不同而不同，这在类似领域中是公知的。参见例如 Sambrook等，1989；Ausubel等，1987-1993。
因此，本文所述的抗体或其抗原结合部分的表达既可以发生在原核细胞中也可以发生在真核细胞中。合适的宿主包括细菌或真核生物宿主，包括酵母、昆虫、真菌、鸟和哺乳动物细胞(在体内或在原位)，或者哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以来源于人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫，但也可使用任何其它哺乳动物细胞。此外，通过使用例如酵母泛素水解酶系统，可实现泛素-跨膜多肽融合蛋白的体内合成。这样产生的融合蛋白可以在体内加工或在体外纯化并加工，使得能够合成具有特定的氨基末端序列的本文所述的抗体或其部分。此外，可以避免在直接的酵母(或细菌)表达中与源自起始密码子的蛋氨酸残基的保留相关的问题。Sabin等，7Bio/Technol.705(1989)；Miller等，7Bio/Technol.698 (1989)。可利用引入了来自于对当酵母在富葡萄糖培养基中生长时大量生产的糖酵解酶进行编码的主动表达基因的启动子元件和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任何一者来获得本文所述的重组抗体或其抗原结合部分。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止子信号。
可以实现在昆虫中生产本文所述的抗体或其抗原结合部分。例如，通过本领域普通技术人员已知的方法，使用工程化的杆状病毒感染昆虫宿主来表达跨膜多肽。参见Ausubel等，1987，1993。
在一些实施方式中，将所引入的核苷酸序列纳入能在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。各种各样的载体中的任何一种都可以用于这一目的，这些载体对于本领域普通技术人员是已知并且可获取的。参见例如Ausubel等，1987，1993。对特定质粒或病毒载体进行选择的重要因素包括：可从不包含载体的受体细胞识别和选择出包含载体的受体细胞的容易程度；在特定宿主中所期望的载体的拷贝数；以及是否期望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭(shuttle)”该载体。
本领域已知的示例性原核载体包括例如质粒，如能够在大肠杆菌中复制的质粒。其它对于表达编码抗体或其抗原结合部分的cDNA有用的基因表达元件包括但不限于：(a)病毒转录启动子及其增强子元件，如 SV40早期启动子(Okayama等，3Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳氏肉瘤病毒LTR(Gorman等，79PNAS 6777(1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等，41Cell 885(1985))；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，如来自于SV40晚期区的聚腺苷酸化位点(Okayarea等，1983)；以及(c)聚腺苷酸化位点，如SV40中的聚腺苷酸化位点(Okayama等， 1983)。如Liu等，infra和Weidle等，51Gene 21(1987)所述的，可使用下述元件作为表达元件来表达免疫球蛋白cDNA基因：SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区mRNA 剪接、兔S-珠蛋白间隔序列(interveningsequence)、免疫球蛋白和兔S- 珠蛋白聚腺苷酸化位点以及SV40聚腺苷酸化元件。
对于包含部分cDNA、部分基因组DNA的免疫球蛋白基因(Whittle 等，1ProteinEngin.499(1987))，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白，且mRNA剪接和聚腺苷酸化区可以是天然染色体免疫球蛋白序列。
在一些实施方式中，为了在啮齿动物细胞中表达cDNA基因，转录启动子是病毒LTR序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子中的任意一者或两者，剪接区含有大于31bp的内含子，聚腺苷酸化和转录终止区来自于对应于被合成的免疫球蛋白链的天然染色体序列。在其它实施方式中，将编码其它蛋白质的cDNA序列与上述表达元件相组合，以实现在哺乳动物细胞中表达蛋白质。
将各融合基因组装于或插入表达载体中。接着用抗体、其抗原结合部分、或嵌合H链编码基因或嵌合L链编码基因单独转染，或用嵌合H 链基因和嵌合L链基因共转染能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞。在允许所纳入的基因表达的条件下培养经转染的受体细胞，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整的抗体或片段。
在一些实施方式中，将编码抗体、其抗原结合片段、或嵌合H链和 L链、或它们的部分的融合基因组装在分离的表达载体中，然后将这些表达载体用于共转染受体细胞。每个载体可含有2个可选择基因，设计用于在细菌系统中进行选择的第一可选择基因和设计用于在真核系统中进行选择的第二可选择基因，其中，每个载体具有不同的基因对。这一策略形成在细菌系统中首先引导产生融合基因、并允许融合基因进行扩增的载体。这样在细菌宿主中产生和扩增的基因随后被用于对真核细胞进行共转染，并允许对携有所期望的转染基因的共转染细胞进行选择。用于细菌系统中的可选择基因的非限制性实例是赋予氨苄青霉素抗性的基因和赋予氯霉素抗性的基因。用于真核转染子中的可选择基因包括黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(命名为gpt)和来自于Tn5的磷酸转移酶基因(命名为neo)。或者，对嵌合H链和L链进行编码的融合基因可被组装在同一表达载体上。
对于表达载体的转染以及本文所述的嵌合的、人源化的或复合的人抗体的产生，受体细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具备用于免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施方式中，受体细胞是产生重组 Ig的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC#CRL 8287)。SP2/0细胞只产生由转染的基因编码的免疫球蛋白。可以在培养物中或在小鼠腹腔内培养骨髓瘤细胞，在小鼠腹腔中，可以由腹水液体获得分泌的免疫球蛋白。其它合适的受体细胞包括淋巴样细胞(例如人源或非人源的B淋巴细胞)、人源或非人源的杂交瘤细胞、或种间异源杂交瘤细胞。
可以通过各种适当方法中的任意方法将本文所述的携有嵌合的、人源化的或复合的人抗体构建体的表达载体、抗体或其抗原结合部分引入适当的宿主细胞内，所述方法包括如转化、转染、缀合、原生质体融合、磷酸钙沉淀和使用聚阳离子(例如二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖)的应用等生化方法；以及如电穿孔、直接显微注射和微弹轰击等机械方法。Johnston等，240Science 1538(1988)，这是本领域普通技术人员已知的。
对于产生免疫球蛋白H链和L链，酵母相比细菌而言具有一定优势。酵母进行包含糖基化在内的翻译后肽修饰。存在一些利用强启动子序列和高拷贝数质粒(可用于在酵母中产生所需蛋白质)的重组DNA策略。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列，并分泌具有前导序列的肽(即，前肽)。Hitzman等，11th Intl.Conf.Yeast，Genetics&Molec.Biol. (Montpelier，法国，1982)。
可对酵母基因表达系统的生产水平、分泌、以及抗体和组装的嵌合的、人源化的或复合的人抗体及它们的部分和区域的稳定性进行常规评价。可利用引入了来自于对当酵母在富葡萄糖培养基中生长时大量生产的糖酵解酶进行编码的主动表达基因的启动子元件和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任何一者。已知的糖酵解基因也可提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可采用许多方法来对用于在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最优表达质粒进行评价。参见II DNA Cloning 45(Glover 编，IRL Press，1985)和例如美国专利公布No.US 2006/0270045 A1。
也可将细菌菌株用作用于产生本文所述的抗体分子或肽的宿主，可以使用如下细菌：大肠杆菌K12菌株，如大肠杆菌W3110(ATCC 27325)；芽孢杆菌(Bacillus species)；肠细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；以及各种假单胞菌(Pseudomonas species)。将含有来自于与宿主细胞相容的物种的复制子和调控序列的质粒载体与这些细菌宿主共同使用。所述载体携有复制位点以及在转化细胞中可以用于表型选择的特定基因。可采用许多方法来对用于在细菌中生产由克隆的免疫球蛋白cDNA或CDR编码的嵌合的、人源化的或复合的人源化抗体及它们的片段的表达质粒进行评价(参见Glover，1985；Ausubel 1987，1993；Sambrook，1989；Colligan， 1992-1996)。
可在体外或体内培养宿主哺乳动物细胞。哺乳动物细胞向免疫球蛋白蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽去除、H链和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化、以及功能性抗体蛋白的分泌。
除了上述淋巴样源性的细胞以外，可作为用于产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞还包括成纤维细胞源性的细胞，如Vero细胞(ATCC CRL 81)或CHO-K1细胞(ATCC CRL61)。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于：COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E 细胞；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；PER.C6TM细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方式中，基于真核宿主细胞向重链和/或轻链作出期望的翻译后修饰的能力对特定的真核宿主细胞进行选择。例如，在一些实施方式中，CHO细胞产生与293细胞中产生的相同多肽相比具有较高的唾液酸化作用水平的多肽。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合部分可以在动物中体内生产，所述动物已根据任何合适的方法用编码多肽的一种或多种核酸分子进行了工程化或转染。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合部分在无细胞系统中生产。非限制性的示例性无细胞系统在例如以下文献中描述：Sitaraman 等，MethodsMol.Biol.498：229-44(2009)；Spirin，Trends Biotechnol.22： 538-45(2004)；Endo等，Biotechnol.Adv.21：695-713(2003)。
许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆的H链基因和L链基因(参见Glover，1985)。可以遵循不同的方法来获得完整的H2L2抗体。如上文所讨论的，有可能在相同细胞内共表达H链和L链，以实现 H链和L链细胞内缔合并连接为完整的四聚体H2L2抗体或其抗原结合部分。可通过在同一宿主中使用相同的或不同的质粒来产生共表达。可将用于H链和L链二者或它们的部分的基因置于同一质粒中，然后将其转染入细胞，从而直接对表达两条链的细胞进行选择。或者，可先用对一条链(例如L链)进行编码的质粒转染细胞，然后以含有第二可选择标记物的H链质粒对生成的细胞系进行转染。可以使用编码额外拷贝的肽、 H链、L链、或H链加L链连同额外的可选择标记的质粒对通过两种途径中的任一途径产生抗体、其抗原结合部分和/或H2L2分子的细胞系进行转染，以生成具有增强的性能的细胞系，所述增强的性能例如是组装的 H2L2抗体分子的产量更高或转染的细胞系的稳定性增强。
此外，植物已经成为基于大规模微生物或动物细胞培养的用于重组抗体生产的方便、安全和经济的替代的主流表达系统。抗体可以在植物细胞培养物或传统种植的植物中表达。植物中的表达可以是系统性表达、限于亚细胞质体、或限于种子(胚乳)。参见例如美国专利公开号No.2003/ 0167531；美国专利No.6,080,560；No.6,512,162；WO 0129242。数种植物源性抗体已达到开发的高级阶段，包括临床试验(参见例如Biolex，NC)。
在一些方面，本文提供了用于产生人源化抗体的方法和系统，所述人源化抗体通过包含如下步骤的过程而制备：将使用对所述人源化抗体的轻链进行编码的第一表达载体和对所述人源化抗体的重链进行编码的第二表达载体转化的宿主维持在每条链都表达的条件下；并对由这样表达的链组装形成的人源化抗体进行分离。第一和第二表达载体可以是相同的载体。本文还提供了对人源化抗体的轻链或重链进行编码的DNA序列；纳入所述DNA序列的表达载体；以及使用所述表达载体转化的宿主。
从本文所提供的序列和信息产生人源化抗体可以由本领域普通技术人员在不付出过多实验的情况下实施。在一种方法中，采用四个常规步骤来将单克隆抗体人源化，参见例如美国专利No.5,585,089；No. 6,835,823；No.6,824,989。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链可变域和重链可变域的核苷酸序列和预测氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中采用哪一个抗体框架区；(3)实际的人源化方法学/ 技术；以及(4)人源化抗体的转染和表达。
通常，人源化抗体和人抗体变体中的CDR区是实质上相同的；更通常地，所述CDR区与其所源自的小鼠抗体或人抗体中的相应CDR区一致。虽然并不是通常所期望的，然而有时可能制造CDR残基的一个或多个保守氨基酸置换，而不明显影响生成的人源化免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力。偶尔地，CDR区的置换可以增强结合亲和力。
此外，可以使用通过剪接具有适当抗原特异性的来自于小鼠或其它物种的抗体分子基因以及来自于具有适当生物活性的人抗体分子的基因的开发用于生产“嵌合抗体”的技术(参见Morrison等，Proc.Natl.Acad. Sci.81：851-855(1984)；Neuberger等，Nature312:604-608(1984)；Takeda 等，Nature 314:452-454(1985)；以引用的方式将它们整体并入本文)。嵌合抗体是其不同的部分来自于不同动物物种的分子，例如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。
嵌合抗体的可变区段通常连接至免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白。可依照公知的程序从各种人细胞中分离人恒定区DNA序列，所述人细胞例如永生化B细胞(WO 87/02671；以引用的方式将其内容整体并入本文)。抗体可同时含有轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区可包含CH1、铰链、CH2、CH3，并且有时也包含CH4区。为了治疗的目的，可删除或省略CH2域。
或者，描述用于产生单链抗体的技术(参见例如美国专利No. 4,946,778；Bird，Science 242:423-42(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85:5879-5883(1988)；以及Ward等，Nature 334:544-54(1989)；以引用的方式将它们整体并入本文)可以适用于产生单链抗体。单链抗体通过经由氨基酸架桥连接Fv区的重链片段和轻链片段、生成单链多肽而形成。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(参见例如 Skerra等，Science 242:1038-1041(1988)；通过引用将其内容整体并入本文)。
通常通过重组表达产生嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。重组多核苷酸构建体通常包含可操作地连接至抗体链编码序列的表达调控序列，包含天然相关的或异源的启动子区。优选地，表达调控序列是载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统。一旦载体已被纳入适当的宿主中，将宿主保持在适合高水平表达核苷酸序列、采集和纯化交叉反应抗体的条件下。在宿主生物体中，这些表达载体作为游离体或作为宿主染色体DNA的组成部分通常是可复制的。通常，表达载体含有选择标记物(例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性)，从而允许对转化有期望的 DNA序列的细胞进行检测。大肠杆菌是一种特别适用于克隆DNA序列的原核宿主。微生物(例如酵母)也可用于表达。采用具有所期望的表达调控序列、复制起点、终止序列等的合适载体，酵母属(Saccharomyces) 是优选的酵母宿主。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。可诱导的酵母启动子在其它启动子之外还包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸片段的优选宿主。参见 Winnacker，FromGenes to Clones(VCH Publishers，NY，1987)，以引用的方式将其内容整体并入本文。一些能分泌完整异源蛋白的合适宿主细胞系在本领域中已有开发，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa 细胞、L细胞和多发性骨髓瘤细胞系。针对这些细胞的表达载体可以包含表达调控序列(例如复制起点、启动子、增强子)(Queen等，Cell-type Specific Regulation of aKappa Immunoglobulin Gene by Promoter and Enhancer Elements，Immunol Rev 89:49(1986)，以引用的方式将其内容整体并入本文)以及必要的加工信息位点(如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列)。优选的表达调控序列是实质上类似于内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒之类的区域的启动子。参见Co等，Chimeric and Humanized Antibodies with Specificity for the CD33 Antigen，JImmunol 148：1149(1992)，以引用的方式将其内容整体并入本文。或者，抗体编码序列可以纳入转基因中，用于引入转基因动物的基因组中，随后表达于转基因动物的乳汁中(例如，根据美国专利No.5,741,957、美国专利No.5,304,489、美国专利No.5,849,992所描述的方法，以引用的方式将上述全部文献的内容整体并入本文)。合适的转基因包含轻链和/或重链的编码序列，所述轻链和/或重链的编码序列可操作地连接有来自于乳腺特异性基因(例如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子。取决于细胞宿主的类型，可以通过公知的方法将含有感兴趣的DNA片段的载体转移至宿主细胞中。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞；而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪法或基于病毒的转染可用于其它细胞宿主。其它用于转化哺乳动物细胞的方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见Sambrook等，supra，以引用的方式将其内容整体并入本文)。为了产生转基因动物，可将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或可以导入胚胎干细胞的基因组中并将这种细胞的细胞核转移至去核卵母细胞中。抗体一经表达，即可以按照本领域的标准程序进行纯化，包括 HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳等(一般地，参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，纽约，1982)，以引用的方式将其内容整体并入本文)。
一经表达，整个抗体、其二聚体、各个轻链和重链或本发明的其它免疫球蛋白形式即可通过已知技术进行回收和纯化，例如免疫吸附或免疫亲和层析、色谱法如HPLC(高效液相色谱法)、硫酸铵沉淀、凝胶电泳，或以上方法的任意组合。一般地，参见Scopes，PROTEINPURIF. (Springer-Verlag，纽约，1982)。具有至少约90％至95％的均质性的实质上纯的免疫球蛋白(例如具有98％至99％或更高的均质性的免疫球蛋白)是有利的，特别是对于药物用途而言。一旦根据需要纯化(部分纯化或纯化至均质化)后，人源化的或复合的人抗体即可随后被用于治疗性应用或开发和执行分析程序、免疫荧光染色等。一般地，参见卷I&IIImmunol.Meth.(Lefkovits和Pernis编，Acad.Pres，NY，1979和1981)。
额外地以及如本文所述的，对于人类的治疗，可进一步对重组人源化抗体进行优化，以降低潜在的免疫原性并同时保持功能活性。在这一方面，功能活性是指多肽能够显示与本文所述的重组抗体或其抗原结合部分相关的一种或多种已知功能活性。此类功能活性包括sMIC的抑制和/或抗癌活性。此外，具有功能活性的多肽意味着如在特定分析法(例如生物分析法)中所测定的，该多肽展示出与本文所述的参照抗体或其抗原结合部分(包括成熟形式)的活性相似、但未必相同的活性，并具有或不具有剂量依赖性。在存在剂量依赖性的情况下，其无需与参照抗体或其抗原结合部分相同，而是相比本文所述的参照抗体或其抗原结合部分而言实质上类似于给定活性中的剂量依赖性(即，相对于本文所述的抗体和抗原结合片段，候选多肽将呈现出更高活性，或不高于约25分之一、约10分之一或约3分之一的活性)。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸。本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”是指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的聚合物分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条核酸链。在一些实施方式中，核酸可以是cDNA，例如缺少内含子的核酸。
在一些实施方式中，对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸被包含在载体中。在本文所述的一些方面，对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸序列或其任何模块可操作地连接至载体。本文所使用的术语“载体”是指设计用于向宿主细胞递送或在不同宿主细胞之间传递的核酸构建体。本文所使用的载体可以是病毒载体或非病毒载体。术语“载体”涵盖当与适当调控元件结合时能够复制以及能够将基因序列转移至细胞的任何基因元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。
本文所使用的术语“表达载体”是指引导RNA或多肽由载体上的连接至转录调控序列的序列表达的载体。对细胞来说，所表达的序列通常是但不必须是异源的。表达载体可以包含额外的元件，例如，表达载体可以有两个复制系统，从而允许其在两种生物体中维持，例如，在人细胞中用于表达，在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当地分泌蛋白的细胞过程，在可适用的情况下包含但不限于例如转录、转录加工、翻译及蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括由基因转录来的RNA和由基因转录来的mRNA翻译获得的多肽。术语“基因”是指在可操作地连接至适当的调节序列时在体外或在体内(由DNA)转录为RNA的核酸序列。基因可包含或不包含编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译区(5'UTR)或“前导”序列以及3’UTR 或“尾随”序列、以及各个编码段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
本文所使用的术语“病毒载体”是指包含至少一个病毒源性元件并具有被包装进入病毒载体颗粒中的能力的核酸载体构建体。病毒载体可含有对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸，以代替非必需病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。
“重组载体”是指包含能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应该理解的是，在一些实施方式中，本文所述的载体可以与其它合适的组合物和疗法相组合。在一些实施方式中，载体是游离体。合适的游离体载体的使用提供了在受试者中于染色体DNA外以高拷贝数维持感兴趣的核苷酸的方法，从而消除了染色体整合的潜在影响。
本文所述技术的多个方面涉及包含本文所述的抗体或其抗原结合部分或者对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸的组合物。在一些实施方式中，该组合物是药物组合物。本文所使用的术语“药物组合物”是指与经认可用于制药行业中的药学上可接受的载体联用的活性试剂。本文所使用的短语“药学上可接受的”是指在健全的医疗判断范围内适用于接触人类和动物的组织而不具有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制剂在本领域是公知的，并无需基于配制而受到限制。通常将此类组合物制备成可注射的液体溶液剂或混悬剂，但是也可以制备成适用于溶液剂或混悬剂的固体形式，使用前配制在液体中。所述制剂还可以被乳化或作为脂质体组合物存在。可以以适合用于本文所述治疗方法的量将活性成分与药学上可接受的且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及上述赋形剂的组合。此外，如果需要的话，组合物可以包含少量的辅助物质，例如增强或保持活性成分有效性的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如本文所述的治疗组合物可以包含其中成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如醋酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的自由氨基基团形成)。与自由羧基基团形成的盐也可以来自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。生理上可耐受的载体是本领域公知的。示例性的液体载体是无菌水溶液，其除了活性成分和水之外不含任何物质；或包含缓冲剂，例如处于生理pH值的磷酸钠、生理盐水或这两者，例如磷酸盐缓冲的盐水。更进一步地，水性载体可以包含多于一种缓冲盐、以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇及其它溶质。在水的基础之上以及将水排除在外，液体组合物还可含有液相。此类额外的液相的实例是甘油、植物油(如棉籽油)以及水- 油乳液。将在特定疾病或病症的治疗中有效的本发明所使用的活性试剂的量取决于该疾病或病症的性质，并可通过标准临床技术来确定。
在一些实施方式中，包含本文所述的抗体或其抗原结合部分或对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸的组合物可以是冻干品。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及包含治疗有效量的本文所述的组合物的注射器。
本文所使用的短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指在肿瘤或恶性肿瘤(malginancy)的治疗、预防或管理中提供治疗益处或美学益处(aesthetic benefit)的量，例如，在肿瘤或恶性肿瘤的至少一种症状、迹象或标记物中提供统计上显著减少的量。对治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内。一般来说，治疗有效量可根据受试者的病史、年龄、状况、性别及受试者中医药状况的严重程度和类型以及其它药物活性剂的给药而有所不同。
一方面，本文所述的技术涉及包括向受试者给予本文所述的抗体或其抗原结合部分或者对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸的方法。在一些实施方式中，受试者需要针对癌症和/或恶性肿瘤的治疗。在一些实施方式中，受试者需要针对上皮细胞肿瘤或造血系统恶性肿瘤的治疗。在一些实施方式中，所述方法是对受试者进行治疗的方法。在一些实施方式中，所述方法是对受试者中的上皮细胞肿瘤或造血系统恶性肿瘤进行治疗的方法。
本文所使用的“肿瘤”是指干扰身体器官和系统发挥正常功能的不受控制的细胞生长。术语“癌症”和“恶性肿瘤”是指转移性的肿瘤，即，已成为侵袭性的、在远离原发肿瘤位点的组织中引发肿瘤生长的肿瘤。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者的体内存在客观上可测量的癌细胞的受试者。这一定义包括良性肿瘤和恶性癌症以及潜在的休眠肿瘤或微转移。从它们的原发位置迁移并植入(seed)其它关键器官的癌症可通过使受影响器官的功能劣化而最终导致受试者死亡。造血系统癌症 (如白血病)能够竞争胜过受试者的正常造血区室，从而(以贫血、血小板减少和中性粒细胞减少的形式)导致造血功能衰竭，最终导致死亡。
癌症的实例包括但不限于：癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更具体的实例包括但不限于：基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌症；消化系统癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈部癌；胃部癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤(GBM)；肝脏癌(hepaticcarcinoma)；肝细胞瘤(hepatoma)；上皮内瘤变(neoplasm)；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌(liver cancer)；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤(neuroblastoma)；口腔癌 (例如，唇、舌、口和咽部癌症)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其它癌和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括轻度/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL、中度弥散型NHL、重度免疫母细胞NHL、重度淋巴母细胞NHL、重度小无裂细胞NHL、大肿瘤NHL(bulkydisease NHL)、套细胞淋巴瘤、 AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性髓性白血病；以及移植后淋巴组织增生性紊乱(PTLD)；以及瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征。
在一些实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤为MIC阳性。本文所使用的术语“MIC阳性肿瘤”用于描述产生MIC蛋白的肿瘤细胞、肿瘤细胞群或肿瘤块。该术语旨在涵盖脱落全部或部分MIC蛋白、从而这些细胞可能只在短时间内在其表面展示MIC蛋白的所有肿瘤细胞和/或肿瘤块，即，该术语涵盖脱落MIC蛋白的肿瘤，无论其细胞表面是否仍然存在可检测的MIC蛋白。然而，任何可以通过脱落MIC而逃脱先天免疫排斥的肿瘤都被认为是本文中使用的术语“MIC阳性肿瘤”。MIC阳性肿瘤的一些非限制性实例包括上皮细胞肿瘤和造血系统恶性肿瘤。在一些实施方式中， MIC阳性肿瘤或恶性肿瘤可以是MIC阳性前列腺癌和/或它的转移。
本文所使用的“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴(cynomologous monkey)、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括：奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括上述的任何子集，例如，除一个或多个群体或物种(例如人、灵长类动物或啮齿类动物)以外的全部上述物种。在某些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可以互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。可以有利地将人以外的哺乳动物例如用作代表例如各种癌症的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法可以用于对家养动物和/或宠物进行治疗。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已被诊断为或确认为患有或具有需要治疗的病症 (例如癌症)或与这样的病症相关的一种或多种并发症的受试者，并且可选但不必需地已经接受对病症或与所述病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是先前没有被诊断为具有需要治疗的病症或与这样的病症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是显示出病症或与病症相关的一种或多种并发症的一个或多个风险因素的受试者、或未显示出风险因素的受试者。对特定病症的治疗“有需要的受试者”可以是具有该病症、诊断为具有该病症、或处于发展为该病症的风险中的受试者。
在涉及疾病、失调或医学病症而使用时，本文所使用的术语“治疗”或“改善(amelioration)”是指对病症的治疗性处置，其目的在于逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓解病症的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗一般是“有效的”。或者，如果病症的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括改善症状或标志物，也包括使预期在没有治疗时将发生的症状进展或恶化得以停止或至少减缓。有益的或期望的临床结果包括但不限于：与在没有治疗的情况下所预期的相比，缓解一种或多种症状、缩减缺损(deficit) 的程度、稳定(即，不恶化)肿瘤或恶性肿瘤的状态、延迟或减缓肿瘤生长和/或转移、以及延长寿命。本文所使用的术语“给予/给药”是指通过将导致试剂至少部分定位于所需位点的方法或途径，向受试者中置入本文所述的抗体或其抗原结合部分、或对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸。本文所公开的包含本文所述的抗体或其抗原结合部分、或对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸的药物组合物可通过在受试者中产生有效治疗的任何适当途径给药。
试剂的剂量范围取决于效力，并涵盖大到足以产生预期效果(例如减缓肿瘤生长或减少肿瘤大小)的量。剂量不应大到造成不可接受的不利副作用。一般情况下，剂量将随患者的年龄、病症和性别而变化，并可由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可由个别医生进行调整。在一些实施方式中，剂量范围为0.001mg/kg体重～0.5mg/kg体重。在一些实施方式中，剂量范围为5μg/kg体重～100μg/kg体重。或者，可对剂量范围进行滴定，以维持血清水平在1μg/ml和1000μg/ml之间。对于全身给药，可以向受试者给予治疗量，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、 1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、 25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更高。
上述剂量的给药可以重复进行。事实上，在抑制MIC脱落可以促进对肿瘤的免疫攻击的范围内，考虑进行长期给药，从而例如首先治疗肿瘤本身，然后对获得脱落MIC能力的肿瘤细胞的进展提供持续监测。在一些实施方式中，每天一次或每天多次(例如但不限于每天三次)给予所述剂量。在优选的实施方式中，在数周或数月内每天给予上述剂量。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展和对疗法的响应性。
在一些实施方式中，剂量可为约2mg/kg～约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约2mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约4mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约5mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约 6mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约8mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约10mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约100mg/m2～约700mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约250mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约375mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约400mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约500mg/m2。
在一些实施方式中，可以静脉内给予所述剂量。在一些实施方式中，静脉内给药可以为在约10分钟～约3小时的时间内输液。在一些实施方式中，静脉内给药可以为在约30分钟～约90分钟的时间内输液。
在一些实施方式中，所述剂量可约每周给药。在一些实施方式中，所述剂量可每周给药。在一些实施方式中，所述剂量可每周给药，持续约 12周～约18周。在一些实施方式中，所述剂量可约每2周给药。在一些实施方式中，所述剂量可约每3周给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约2mg/kg～约15mg/kg，约每2周给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约2mg/kg～约15mg/kg，约每3周给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约2mg/kg～约15mg/kg，约每2周静脉内给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约2mg/kg～约15mg/kg，约每3周静脉内给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约200mg/m2～约400mg/m2，约每周静脉内给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约200mg/m2～约400mg/m2，约每 2周静脉内给药。在一些实施方式中，所述剂量可为约200mg/m2～约 400mg/m2，约每3周静脉内给药。在一些实施方式中，共给药约2～10 剂。在一些实施方式中，共给药4剂。在一些实施方式中，共给药5剂。在一些实施方式中，共给药6剂。在一些实施方式中，共给药7剂。在一些实施方式中，共给药8剂。在一些实施方式中，总共给药约4周～约12周。在一些实施方式中，总共给药约6周。在一些实施方式中，总共给药约8周。在一些实施方式中，总共给药约12周。在一些实施方式中，初始剂量可为后续剂量的约1.5倍至约2.5倍。
在一些实施方式中，所述剂量可为约1mg～约2000mg。在一些实施方式中，所述剂量可为约3mg。在一些实施方式中，所述剂量可为约 10mg。在一些实施方式中，所述剂量可为约30mg。在一些实施方式中，所述剂量可为约1000mg。在一些实施方式中，所述剂量可为约2000mg。在一些实施方式中，所述剂量可为每日通过静脉内输注给予约3mg。在一些实施方式中，所述剂量可为每日通过静脉内输注给予约10mg。在一些实施方式中，所述剂量可为每周三次通过静脉内输注给予约30mg。
治疗有效量是足以在肿瘤大小、肿瘤生长等方面产生统计上显著的、可测量的变化的试剂的量(效力测量如下文所述)。可以在临床试验和动物研究中对此类有效量进行估量。
可以通过注射或通过经时平缓输注来静脉内给予试剂。对于用于给定途径的适当制剂，例如，在本文所述的方法和组合物中有用的试剂可以静脉内给药、鼻内给药、吸入给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下给药、腔内(intracavity)给药，并且，如果需要的话，可以通过蠕动方式递送，或通过本领域技术人员已知的其它方式递送。优选地，将本文所述的化合物口服给药、静脉内给药或肌内给药至癌症患者。也特别考虑直接向肿瘤块进行局部给药。
例如，包含至少一种试剂的治疗组合物可以以单位剂量常规给药。在涉及治疗组合物而使用时，术语“单位剂量(unit dose)”是指适合作为用于受试者的单一剂量(unitary dosage)的物理上离散的单位，每单位包含计算出的产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及所需的生理上可接受的稀释剂，即，载体或媒介物。
以与剂型相容的方式并以治疗有效量给予所述组合物。待给予的量和时间安排取决于待治疗的受试者、受试者的系统利用活性成分的能力、以及所期望的治疗效果的程度。
需要给予的活性成分的精确量取决于执业医生的判断，并且对每一个体而言都是特定的。然而，用于全身应用的合适的剂量范围在本文中公开，并依赖于给药途径。给药的适当方案(regimes)也各不相同，但典型地是通过初始给药并继以经由随后的注射或其它给药方式以一个或多个小时的间隔给予重复剂量。或者，也考虑足以将血液中的浓度维持在针对体内疗法所规定的范围内的持续静脉内输注。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括将本文所述的药物组合物与作为组合疗法一部分的一种或多种额外的化学治疗剂、生物制剂、药物、或治疗共同给予。在一些此类实施方式中，所述化学治疗剂、生物制剂、药物或治疗选自于以下所组成的组：放射疗法、外科手术、吉西他滨、cisplastin、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737和PI-103。
在本文所述方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括向给予了本文所述的药物组合物的受试者给予一种或多种化学治疗剂。化学治疗剂的非限制性实例可包括：烷化剂，例如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和嗪消安(piposulfan)；氮丙啶(aziridines)，例如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa 和uredopa；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (trietylenephosphoramide)、硫代三乙烯磷酰胺 (triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin) 合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189 和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；软海绵素 (spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇 (phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和 ranimnustine；抗生素，例如烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ΩI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐(bisphosphonates)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素 (esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)，aclacinomysins，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素， cactinomycin，carabicin，caminomycin，嗜癌菌素(carzinophilin)， chromomycinis，更生霉素，柔红霉素，detorubicin，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代阿霉素、菁基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)，表阿霉素，依索比星(esorubicin)，伊达比星，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(例如丝裂霉素C)，麦考酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycins)，培洛霉素 (peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、thiamiprine、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；乙葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；地美可辛(demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁 (etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；podophyllinic acid； 2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS Natural Products， Eugene，Oreg.)；丙亚胺(razoxane)；根瘤菌素；sizofuran；螺旋锗 (spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌 (triaziquone)；2,2',2”-trichlorotriethylamine；单端孢菌烯类(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、漆斑菌素A(roridin A) 和蛇行菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free，紫杉醇白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners， Schaumberg，I11.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer， Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6- 硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如厄洛替尼)和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本文所使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，At211、I131、 I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂；以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物源性的小分子毒素或酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体。
本文所使用的术语“化疗/化学治疗”或“化学治疗剂”是指在对特征为异常细胞生长的疾病的治疗中具有治疗有效性的任何化学试剂。此类疾病包括肿瘤、瘤变(neoplasms)和癌症以及特征为增生性生长的疾病。本文所使用的化学治疗剂包括化学试剂和生物试剂。这些试剂的功能在于抑制癌细胞持续生存所依赖的细胞活性。化学治疗剂的类别包括烷化剂/生物碱剂、抗代谢药物、激素或激素类似物和各种抗肿瘤药物。这些试剂的大多数(如果不是全部的话)都对癌细胞具有直接毒性，且无需免疫刺激。在一个实施方式中，化学治疗剂是用于治疗瘤变(例如实体瘤)的试剂。在一个实施方式中，化学治疗剂是放射性分子。本领域技术人员可容易地确定可用的化学治疗剂(例如参见Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison's Principles of Internal Medicine中的第86章，第14版；Perry等，Chemotherapy，Abeloff，Clinical Oncology 中的第17章，第2版，2000Churchill Livingstone，Inc；Baltzer L，Berkery R(编)：Oncology Pocket Guideto Chemotherapy，第2版，St.Louis，Mosby- Year Book，1995；Fischer D S，Knobf M F，Durivage H J(编)：The Cancer Chemotherapy Handbook，第4版，St.Louis，Mosby-YearBook，1993)。本文所述的双特异性和多特异性多肽试剂可与其它化学治疗剂联合使用。
“放射疗法”是指使用定向γ射线或β射线来诱发对细胞足够的伤害，从而限制其正常行使功能的能力或将细胞完全破坏。应理解的是本领域将有许多已知方法来确定治疗的剂量和持续时间。所给出的典型治疗是一次给药，并且典型的剂量范围为每天10～200单位(Gray)。
在一些实施方式中，本文所述的方法可以进一步包括向受试者给予额外的免疫疗法。本文所使用的“免疫疗法”是指设计用于诱导患者自身的免疫系统来对抗肿瘤的不同治疗策略组，并包括但不限于：用于浅表膀胱癌的膀胱内BCG免疫疗法；用于产生特异性免疫应答的疫苗，例如用于恶性黑色素瘤和肾细胞癌；将Sipuleucel-T用于前列腺癌，其中，使来自患者的树突状细胞负载有前列腺酸性磷酸酶肽，以诱导针对前列腺来源的细胞的特异性免疫应答；给予刺激一种或多种免疫细胞类型的细胞因子、生长因子和/或信号转导分子(例如白细胞介素)；离体扩增和/或刺激对肿瘤抗原具有特异性的淋巴细胞和/或树突状细胞，然后将其再引入至患者；咪喹莫特；过继细胞转移；和/或例如国际专利公布WO 2003/063792和美国专利No.8,329,660中所描述的方法。在一些实施方式中，所述免疫疗法刺激NK应答。在一些实施方式中，所述免疫疗法是过继细胞转移方法。
给定癌症治疗的效力可由熟练的临床医生决定。然而，在利用本文所述的试剂进行治疗后，如果例如肿瘤的任何一种迹象或症状或者所有迹象或症状以有益的方式得以改变，或其它临床上认可的症状得以改善或甚至减轻(例如至少10％)，则所述治疗被认为是“有效治疗”(如该术语在本文所使用的)。效力也可以由住院治疗或对医疗干预的需求所评估出的个体不再恶化(即，疾病的进展停止)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中有所描述。
用于疾病治疗的有效量是指当给予对其有需要的哺乳动物时，该量足以产生对于该疾病的有效治疗(如该术语在本文中所定义的)。试剂的效力可以通过对例如癌症的物理指标(例如肿瘤大小、肿瘤块、肿瘤密度、血管生成、肿瘤生长速度等)进行评估而决定。此外，试剂的效力可以通过利用包含本文所述的抗体或其抗原结合部分或者对本文所述的抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸的试剂进行治疗的受试者中循环 MIC肽或其片段的减少来衡量。
对本公开的实施方式所进行的描述并不旨在进行穷举或将本公开限制为所公开的确切形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是正如相关领域的技术人员将了解的，可在本公开的范围内进行各种等同修改。本文所提供的公开内容的教导可以适当地用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。如果需要的话，可对本公开的方面进行修改，以采用上述参考文献和应用的组合物、功能和概念，从而提供本公开进一步的实施方式。根据详细的说明，可以对本公开作出这些改变和其它改变。
可将任何上述实施方式中的特定要素与其它实施方式中的要素组合或置换为其它实施方式中的要素。此外，虽然在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的某些实施方式相关的优点，然而其它实施方式也可以表现出此类优点，并且，并非所有的实施方式都必须表现出这样的优点才能落入本公开的范围之内。
出于描述和公开的目的，以引用的方式将标明的所有专利和其它出版物明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的可用于与本发明关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本发明进一步通过以下实例进行说明，所述实例不应被解释为限制性的。
1.一种特异性结合至sMIC多肽的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含选自于由下述重链和轻链互补决定区 (CDR)所组成的组中的一个或多个重链和轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；
c.具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；
e.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
f.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
2.如段落1所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
c.具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3。
3.如段落1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述重链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
c.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
4.如段落1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；
c.具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；
e.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
f.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
5.如段落1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：7的序列的轻链。
6.如段落1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：8的序列的重链。
7.一种特异性结合至sMIC多肽的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述重链和轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；
c.具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；
e.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
f.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
8.如段落1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分进一步包含不包含于CDR中的序列中的保守置换。
9.如段落1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或多肽选自于由下述抗体或多肽所组成的组：
免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体和双特异性抗体。
10.如段落1-9中任一项所述的抗体或其抗体结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合至sMIC。
11.包含如段落1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
12.编码如段落1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核酸。
13.如段落12所述的核酸，其中，编码所述抗体或其抗原结合部分的CDR的一个或多个核酸序列选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6 所组成的组。
14.如段落12所述的核酸，其中，编码所述抗体或其抗原结合部分的CDR的核酸序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
15.如段落12-14中任一项所述的核酸，其中，所述核酸是cDNA。
16.一种抑制sMIC的方法，所述方法包含使细胞与如段落1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分相接触或向受试者给予如段落1-10 中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
17.一种在有需要的受试者中对MIC阳性癌症进行治疗的方法，所述方法包含向所述受试者给予有效量的如段落1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如段落11所述的药物组合物。
18.如段落17所述的方法，其中，所述MIC阳性癌症是肿瘤。
19.如段落17所述的方法，其中，所述MIC阳性癌症是上皮细胞肿瘤。
20.如段落17所述的方法，其中，所述MIC阳性癌症是造血系统恶性肿瘤。
21.如段落17-20中任一项所述的方法，所述方法进一步包含给予额外的免疫疗法。
实施例
实施例1
NKG2D介导的抗肿瘤免疫在实验动物模型中很明显。然而，NKG2D 配体是否在临床上有助于肿瘤阻遏或进展仍存在争议。本文描述了“人源化”双转基因(bi-Tg)小鼠的两个新品系，其中，天然人NKG2D配体MICB或工程化的膜限制性MICB(MICB.A2)在自发性癌变TRAMP 小鼠模型的前列腺中表达。bi-Tg TRAMP/MICB小鼠表现出进展了的癌和转移的发生率明显增加，而TRAMP/MICB.A2小鼠得以享受由持续的 NKG2D介导的抗肿瘤免疫赋予的长期无瘤生存率。从机制上来说，发现 TRAMP/MICB小鼠中的癌症进展与源自肿瘤的可溶性MICB(sMICB) 的高血清水平所带来的外周NK细胞池的损失有关。这些发现在前列腺癌患者中也很明显。总的来说，这项研究不仅首次在“人源化”小鼠模型中提供了表明可溶性和膜限制性NKG2D配体对癌进展具有明显相反的影响的直接的决定性证据，而且还揭示了sMIC诱导的NK细胞抗肿瘤免疫削弱的新机制。目前的发现表明，可溶性NKG2D配体使得基于NK细胞的癌症免疫疗法成为可能。在这一上下文中，本文所述的独特的小鼠模型在免疫疗法的优化中是有价值的。
引言
如在实验动物模型中所证实的，NKG2D及其配体在抗肿瘤免疫中具有重要意义。NKG2D是一种由所有自然杀伤(NK)细胞、大部分NKT 细胞、γδT细胞亚群、所有人CD8T细胞和活化的小鼠CD8T细胞(1、 2)表达的活化受体。NKG2D的接合(engagement)可以在体外激活NK 细胞以及共刺激CD8T细胞和γδT细胞(3-5)。NKG2D配体的强制表达(enforcedexpression)导致肿瘤细胞在同基因型小鼠(syngeneic mice) 中以依赖于NK细胞以及在一些情况下依赖于致敏CD8T细胞的方式被排斥(6、7)。使用特异性抗体在体内中和NKG2D增强了针对致癌物诱导的自发性肿瘤启动的宿主敏感性(8)。与NKG2Dwt TRAMP对应小鼠(counterparts)相比，NKG2D缺陷TRAMP小鼠(小鼠前列腺的转基因腺癌)发展为侵袭性低分化(PD)前列腺癌的可能性高出三倍(9)。此外，在NKG2Dwt TRAMP小鼠中，进展为PD前列腺癌大多与肿瘤细胞的NKG2D配体表达下调有关(9)。
奇怪的是，大多数的人肿瘤(特别是上皮源性人肿瘤)表达丰富的 NKG2D配体，但仍进展成为晚期疾病(10、11)，暗示癌症患者中NKG2D 功能受损。已提出各种机制来解释肿瘤细胞如何逃逸NKG2D免疫。一种主流观点在于，由长期暴露于其配体导致的NKG2D功能耗尽显著有助于肿瘤免疫逃逸和进展(12-19)。然而，癌症患者中NKG2D配体表达的预后值在最佳情况下是不一致的(20-24)。据报道，NKG2D配体表达的水平与结肠直肠癌和早期乳腺癌中较好的临床预后相关(22-24)，但与卵巢癌和浸润性乳腺癌中的低生存率相关(20、21)。另外，对于癌症患者中NKG2D耗尽的根本机制也存在争论。一种假说认为，作为肿瘤相关脱落的结果，可溶性NKG2D配体是NKG2D功能的负调节因子，并赋予免疫逃逸机制。事实上，临床数据表明，可溶性NKG2D配体的血清水平升高与晚期上皮恶性肿瘤相关(13、14、25-29)。另一种假说认为，基于NKG2D配体在正常小鼠中的组成型表达和异位表达使NKG2D 功能下调这一观测结果，长期暴露于肿瘤细胞表面上的膜结合NKG2D 配体也影响NKG2D免疫(12、15、19)。
由于人和小鼠之间NKG2D配体存在的差异，目前没有合适的小鼠模型来研究人NKG2D配体在肿瘤进展和宿主免疫中的影响。虽然在人和啮齿类动物之间NKG2D功能是保守的，然而其配体的性质及表达模式在两个物种之间高度不相似(10、31)。在人中，已知的NKG2D配体包括主要组织相容性复合物(MHC)I类链相关分子(MIC)家族成员 MICA和MICB以及UL-16结合蛋白(ULBP)1-5家族(10、31)。在鼠类系统中，已知的NKG2D配体包括蛋白RAE-1的维甲酸早期可诱导家族(retinoic acid early inducible family)、次要组织相容性抗原H60及其变体、以及鼠ULBP样转录因子1(MULT1)(10、31)。尚没有在小鼠中的人MIC同源物的描述。总的来说，除了小鼠NKG2D能识别人MICB 以及人MICA的选择性等位基因以外，人或小鼠NKG2D不能识别它们的对应物的配体(32-34)。最重要的是，已经描述了NKG2D配体的肿瘤脱落使NKG2D功能下调，并且提出其是人癌症中的免疫逃逸机制之一，但在小鼠中还没有描述。在小鼠中，NKG2D介导的对肿瘤细胞上配体表达的阻遏被认定为是肿瘤免疫逃逸的主要机制(9)。这些差异构成了研究人NKG2D配体在肿瘤进展中的影响的障碍。
为了阐明人NKG2D配体对于癌症的影响，我们利用了人NKG2D配体MICB可以刺激小鼠NKG2D免疫的知识(33、34)，并生成了“人源化”双转基因(bi-Tg)小鼠模型TRAMP/MICB和TRAMP/MICB.A2两个独特的品系。前者表达可被肿瘤细胞脱落的天然人MICB，后者在内源TRAMP小鼠前列腺中表达工程化的膜限制性MICB(指定为MICB.A2) (33、35、36)。利用这些模型，本文中首次决定性地表明了膜结合NKG2D 配体和源自肿瘤的可溶性NKG2D配体对肿瘤进展的不同作用。此外，还发现在人和小鼠中，前列腺癌的转移进展都与外周NK细胞的显著丧失和循环可溶性NKG2D配体的水平升高有关。
结果
bi-Tg TRAMP/MIC小鼠表现出加速进展成为低分化(PD)前列腺癌和转移。
为了对NKG2D配体在肿瘤进展中的作用进行定义，使用最小大鼠 probasin(rPb)启动子(35)来引导编码天然人NKG2D配体MICB和工程化的膜限制性MICB.A2的转基因在C57BL/6小鼠的独立品系中(分别定义为MICB/B6和MICB.A2/B6，图14A-图14C)表达至前列腺上皮。单拷贝整合和转基因的前列腺特异性表达分别通过针对有限模板稀释标准的基因组PCR(数据未示出)及RT-PCR(图14A-图14C)得以证实。这些转基因小鼠表现出如野生型B6动物一般的正常的前列腺生理学和免疫构成(图14A-图14C和图15A-图15D)。
为了探讨天然人NKG2D配体在肿瘤免疫中的作用，使雄性MICB/B6 小鼠与B6背景的TRAMP雌性小鼠杂交，以生成bi-Tg TRAMP/MICB 小鼠。通常，B6背景的雄性TRAMP小鼠在18周龄前发展出增生和腺癌，并在30周龄前发展出转移性疾病(35、37)，低分化(PD)癌极少发生。值得注意的是，与TRAMP同窝仔畜(littermate)相比，TRAMP/MICB 小鼠引起更具有侵袭性的肿瘤生长和进展，总生存率显著降低(图1A和表1)。当在24周龄进行特别检查时，与年龄匹配的TRAMP(n＝13)相比，33％(4/12)的TRAMP/MICB小鼠有可触及的(palpable)前列腺肿瘤，并在处死时具有显著升高的前列腺重量(图1B)。该可触及的肿瘤体积巨大，并在组织学上均一表现为PD癌(图1C)。在来自TRAMP/MICB 小鼠的不可触及的肿瘤中，75％(6/8)表现为由完整腺体结构表征的高分化(WD)癌(表1)。其余的肿瘤(2/8)为中度分化(MD)癌，由具有腺体结构残余的接近间变性(anaplastic)的细胞片表征的进展中的过渡病变(数据未示出)(37)。在年龄匹配的TRAMP雄性同窝仔畜(n＝13) 中，只有8％(1/13)有可触及的前列腺肿瘤，然而，其并没有表现出PD 病变的病理特征，而是表现出特征为鹿角腔模式的分叶状(PHY)病变 (表1)，类似于预后不明确的人前列腺癌中的罕见病变(37、38)。此外，如SV40T癌蛋白的免疫染色所证实的，发展出可触及的PD癌的全部四只TRAMP/MICB小鼠在盆腔引流淋巴结、肺和/或肝中具有转移性沉积 (数据未示出)。相反，13只年龄匹配的TRAMP同窝仔畜在淋巴结、肺、肝或骨中都没有转移性病变的证据(表1)。这些结果表明，天然NKG2D 配体MICB的表达加速了TRAMP小鼠中的癌进展。
TRAMP/MICB小鼠中前列腺癌的迅速进展与可溶性MICB(sMICB) 的血清水平升高有关
为了了解NKG2D配体MICB的表达加速TRAMP小鼠中前列腺癌的进展的根本机制，通过以特异性针对MICA和MICB的α1α2胞外域的单克隆抗体(mAb)6D4.6进行的免疫组织化学法，在TRAMP/MICB小鼠的前列腺中检测MICB的表达(11)。有趣的是，恶变前(pre-malignant) PIN(前列腺上皮内瘤)样病变和WD癌显示强烈的MIC免疫染色，主要位于前列腺的上皮细胞表面，而极少在或未在PD肿瘤细胞表面上检测到MICB表达(图2A)。相反，PD病变的间质间隙中可见强烈的MIC 免疫染色(数据未示出)。WD癌和PD癌中这种MICB免疫反应性模式类似于在癌症患者中的重度和轻度前列腺癌中关于MIC表达的先前观察 (28)。此外，定量RT-PCR显示，在mRNA水平上，WD病变和PD病变中MICB同等表达(图2B)，暗示在PD病变中肿瘤细胞表面MICB 表达的损失是归因于在转录后水平的修饰。在前列腺癌患者中，显示肿瘤细胞表面MIC的损失是脱落的结果(28)。在癌发展过程中追踪这些小鼠中的sMICB的血清水平。在所有年龄段的所有TRAMP/MICB小鼠中检测出具有不同水平的sMICB(图2C)。然而，与只发展为WD癌的小鼠(n＝6)相比，24周龄的发展为PD癌的小鼠(n＝4)具有显著升高的血清sMICB水平(图2C，p<0.01)。此外，如在24周龄时所检测的，血清sMIC和最终肿瘤体积之间存在显著相关性(图2D，R2＝0.88，p<0.88)。总的来说，这些数据表明，TRAMP/MICB小鼠中进展为PD癌与肿瘤细胞表面膜结合MICB的损失和sMICB的血清水平升高有关。
已经在许多类型的人癌症中表明NKG2D配体的肿瘤脱落影响其受体功能，并提出其是免疫逃逸的机制之一。然而，在TRAMP小鼠中，已经表明肿瘤通过另外的机制逃逸NKG2D免疫监视。Guerra等表明，在肿瘤进展过程中，内源性NKG2D配体(例如RAE-1)的表达被受体NKG2D 下调(9)。为了得知该另外的机制是否至少部分地在TRAMP/MICB小鼠中对PD肿瘤发展起作用，对RAE-1(TRAMP肿瘤中最丰富表达的内源性小鼠NKG2D配体(9))的表达进行了检测。在来自于TRAMP/MICB 小鼠的PD肿瘤和WD肿瘤中发现RAE-1表达的mRNA水平和蛋白水平是类似的(图2E-图2F)。这些数据表明，TRAMP/MICB小鼠中PD癌的发展并不归因于内源性NKG2D配体表达的免疫编辑。因此，源自肿瘤的sMICB是肿瘤进展的主要原因。
sMICB扰乱NK细胞的外周维持并促进肿瘤转移
为了了解sMICB促进肿瘤进展的机制，检测了TRAMP/MICB小鼠相对于它们的TRAMP同窝仔畜的脾CD8T细胞群和NK细胞群以及它们的NKG2D表达。所有TRAMP/MICB小鼠和TRAMP小鼠都具有类似的脾CD8T细胞频率和绝对数量(图3A和图16A)。只有一小部分CD8 T细胞表达NKG2D，并且在TRAMP/MICB小鼠和TRAMP小鼠之间表达水平并没有显著不同。鉴于NKG2D仅由活化的小鼠CD8T细胞表达，并且在TRAMP小鼠中存在抗原特异性CD8T细胞耐受的充分证据(39、 40)，这一观察符合预期。有趣的是，在发展为PD癌和转移的TRAMP/MICB 小鼠中，脾中NK细胞的频率和绝对数量明显减少(图3B和图16B)。在TRAMP/MICB小鼠同期组群(cohort)中，sMICB的血清水平与残余脾 NK细胞的数量之间呈显著负相关(图3C，p＝0.02，R2＝-0.94)。在TRAMP 同窝仔畜中没有观察到脾NK细胞群存在主要区别。
进一步要解决的是TRAMP/MICB小鼠中sMICB相关的脾NK细胞耗竭是否是归因于受损运输(trafficking)的系统性效应或脾特异性效应。尽管脾NK细胞明显减少并且伴有sMICB的血清高水平，然而在淋巴结或骨髓中未见CD3-NK1.1+细胞群积聚。相反，还观察到在淋巴结中NK 细胞频率显著减少(图3D)。在骨髓中只观察到NK细胞频率适度但不显著的减少(图3D)。与外周淋巴器官中的发现一致，PD癌的肿瘤实质中NK细胞浸润也明显减少(图3E)，而CD8T细胞浸润未受到影响(图 16C)。然而，在浸润于PD癌中的CD8T细胞中，NKG2D+CD8T细胞明显减少(图16C)。这些观察表明，次级淋巴器官中NK细胞的损失并不归因于NK细胞的发育阻滞或进入肿瘤实质的NK细胞增加。
为了确认肿瘤进展和转移是由sMICB通过影响NK细胞稳态而促进的，测定了静脉内接种后有和没有sMICB表达的源自TRAMP癌的同基因型转移性细胞系TRAMP-C2(TC2)(41、42)的生长特性(图4A)。植入三周后，用sMIC中和抗体P2B10G5或对照IgG对动物进行处理，持续两周(图17A-图17B)。正如所预期的，与植入TC2细胞的小鼠相比，植入表达sMICB的TC2细胞(TC2-sMICB)的小鼠肺中的微转移沉积明显更高(图4B)(显微镜图像数据未示出)。与之相伴的是，与植入TC2 细胞的小鼠相比，发现在植入TC2-sMICB细胞的小鼠的脾、LN和肺中NK 细胞显著减少(图4C和图18)(显微镜图像数据未示出)。此外，TC2-sMICB 的肺微转移沉积因sMIC中和抗体而显著减少(图4B)(显微镜图像数据未示出)，NK细胞外周池同时重建(图4C)。通过BrdU脉冲，发现高度增殖的NK细胞无法在携有TC2-sMICB的小鼠的脾中积聚，但随着 sMICB中和抗体处理而重建(图4D)。总之，这些数据清楚地表明，sMICB 促进肿瘤细胞转移，且这样的活性与NK细胞外周维持的破坏密切相关。
为了进一步确定所建立的NK细胞群的维持是否受到sMICB的负向影响以及确认潜在的根本机制，将细胞示踪染料V450标记的同类系 (congenic)CD45.1+脾细胞过继转移至如上所述的植入TC2或TC2-sMICB 细胞四周后的小鼠中。在移植之前一周，将这些小鼠用sMIC中和抗体 P2B10G5或对照IgG进行预处理(每周2次)。转移后五天，检测在脾和淋巴结中同类系NK细胞的频率。与植入TC2细胞的小鼠相比，植入 TC2-sMICB细胞的小鼠在脾和淋巴结中都具有显著降低的CD45.1+NK 细胞频率(图5A、图5B和图19A)。然而，在接种TC2-sMICB细胞的小鼠中，用sMIC中和抗体进行的处理导致同类系CD45.1+NK细胞显著增加(图5A、图5B和图19A)。在植入TC2细胞的小鼠中，sMIC中和抗体不显著影响CD45.1+NK细胞的频率(图5A、图5B和图19A)。转移的同类系CD45.1+细胞的V450稀释分析表明，在植入TC2-sMICB细胞的小鼠中，使用sMIC中和抗体进行处理使得脾和淋巴结中的CD45.1+ NK细胞的增殖都显著增加(图5C、图5D和图19B)。在所有的动物组中，脾或淋巴结中的NK细胞归巢受体CD62L的表达未检测出显著差异 (图19C)，表明与sMIC相关的外周NK细胞损失似乎不归因于受损的 NK运输。这一过继转移实验已经明确且确凿地表明sMICB部分地通过影响NK细胞增殖来扰乱NK细胞外周维持。
肿瘤细胞稳定表达不脱落的膜结合NKG2D配体阻止肿瘤发生进展
为了进一步确定TRAMP/MICB小鼠中肿瘤进展是由sMICB驱动而不是由肿瘤表面MICB驱动，并且为了确定膜结合NKG2D配体在肿瘤免疫中的作用，通过将雄性MICB.A2/B6小鼠与雌性TRAMP(B6背景) 小鼠杂交，生成了bi-Tg MICB.A2/TRAMP小鼠。值得注意的是，工程化的MICB.A2是通过将MICB的脱落调控区替换为HLA-A2的相应序列而生成。MICB.A2不能从肿瘤细胞表面脱落，具有膜限制性(36)。总的来说，超过90％的TRAMP/MICB.A2小鼠保持长期无瘤生存(图6A)。当在24周龄时检测TRAMP/MICB.A2小鼠的同期组群时，前列腺重量(0.20±0.01g)只比野生型B6同窝仔畜(0.17±0.01g；p＝0.16)稍高，但是显著低于TRAMP同窝仔畜(0.30±0.04g；p<0.01，图6B)。值得注意的是，没有一只TRAMP/MICB.A2小鼠发展为前列腺癌。通过p63免疫染色表明，前列腺的正常结构大部分保存(数据未示出)。在21只TRAMP/MICB.A2小鼠中，来自于8只动物的前列腺腺体表现出具有完整基底细胞层的正常组织学。来自于其余13只动物的前列腺表现出不同等级的PIN样病变，表现为多层病变的内部中p63阳性降低以及腔细胞与p63阳性基底细胞的比率增加(数据未示出)(37)。此外，TRAMP小鼠中驱动癌发展的SV40T致癌蛋白仍然存在于所有TRAMP/MICB.A2小鼠的前列腺的上皮细胞中(35)。重要的是，这些动物的血清中没有检测到sMICB的可溶形式(图6C)。这些数据清楚地表明，MICB的膜结合形式阻遏前列腺癌的癌症发生和进展。
为了确定TRAMP/MICB.A2小鼠中的肿瘤阻遏是作为MICB.A2的前列腺特异性表达的结果由NKG2D免疫介导，用NKG2D阻断抗体C7或对照大鼠IgG处理16至18周龄的TRAMP/MICB.A2小鼠同期组群(n＝6/ 同期组群)，每周2次，为期8周。无一例外地，所有经C7处理的小鼠都具有升高的前列腺重量并发展为前列腺癌(图6D以及未示出的数据)。
值得注意的是，不同于脾中NK细胞明显减少的TRAMP/MICB小鼠 (图3A-图3E)，NK细胞群和CD8T细胞群的频率都类似于TRAMP或野生型B6同窝仔畜(图7A-图7D)。TRAMP/MICB.A2小鼠中NK细胞上的NKG2D表达水平也未受干扰(图7A)。此外，当使用表达NKG2D 配体RAE-1的细胞系离体(ex vivo)刺激时，来自于TRAMP/MICB.A2 小鼠和野生型小鼠的脾NK细胞显示出类似水平的IFNγ产生和NKG2D 依赖性细胞毒作用(图7B和图7C)。此外，与TRAMP同窝仔畜相比，虽然总CD8T细胞频率保持相似，但TRAMP/MICB.A2小鼠中脾NKG2D+CD8T细胞频率有所增加(图7D)。这些数据支持如下观点：肿瘤细胞上膜结合NKG2D配体的表达促进CD8T细胞应答，这是因为NKG2D 表达与小鼠CD8T细胞的活化状态相关(6)。总的来说，这些数据提供了关于“NKG2D配体的膜结合形式的持续表达并非削弱、而是刺激宿主免疫，从而阻遏肿瘤发生进展”的直接体内证据。
男性中的转移性前列腺癌与外周NK细胞减少和血清sMIC升高有关
为了了解这些发现的临床意义，对具有不同Gleason评分的36名新诊断的初治前列腺癌患者的外周血中的CD3-CD56+NK细胞群进行了分析，其中11人患有远处转移疾病，25名只患有局部疾病。与年龄匹配的健康男性(n＝10)相比，发现前列腺癌患者(n＝36)中循环NK细胞的频率显著降低。引人注目的是，与只诊断为局部疾病的男性相比，发展为转移性疾病的男性的循环NK细胞频率显著较低(图8A)。在所有分析的受试者中，未观察到循环T细胞(CD3+CD56-)的显著差异(图8B)。此外，与患局部疾病的男性相比，患有转移性疾病的男性中sMIC的血清水平显著更高(图8C)。此外，sMIC的血清水平与循环中的NK细胞频率之间呈显著负相关(图8D)。没有发现T细胞频率与sMIC相关(数据未示出)。这些数据揭示了前列腺癌转移与患者中外周淋巴细胞池中 NK细胞的损失以及sMIC的高血清水平的明确关联，并确认了 TRAMP/MIC小鼠模型与前列腺癌患者的高度免疫相似性和病理相似性。
sMIC中和单克隆抗体P2B10G5的生成和表征。使用纯化的重组可溶性MIC(rsMIC)对两只balb/c小鼠进行三次免疫，间隔两周。将完全弗氏佐剂中的100μg重的缀合KLH肽用于第一次免疫。在随后的免疫中，给予不完全弗氏佐剂中的50μg KLH肽。在最后一次免疫前一周采血，并使用rsMIC包被的板通过ELISA测定抗体滴度。通过使用聚乙二醇将来自于免疫小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合而生成杂交瘤。融合混合物利用HAT培养基进行选择，所分泌的抗体的反应性通过针对 C1R和C1R-MIC细胞的流式细胞术分析和ELISA来测定。由其中一个杂交瘤p2B10G5产生的抗体使用BioXcell(Labnon，NH)进行纯化。
讨论
来自于实验动物模型的充分证据支持NKG2D功能在肿瘤免疫中的重要性。然而，迄今为止的研究一直无法阐明，是肿瘤细胞上NKG2D 配体的持续表达、还是NKG2D长期暴露于肿瘤细胞上表达的它的配体对肿瘤免疫最为有益(12、15、19)。为此，建立了新的“人源化”bi-Tg TRAMP/MIC和TRAMP/MIC.A2小鼠模型，其中，人NKG2D配体在自发性肿瘤上特异性表达，伴有致癌蛋白SV40T的同时表达，高度模仿了人癌症。此外，我们区别表达了两种形式的NKG2D配体，以区分它们在肿瘤进展中的影响：天然NKG2D配体MIC，与在癌症患者中自然发生的一样，可从肿瘤脱落生成可溶性形式；以及突变的膜限制性NKG2D 配体MIC.A2，不能从肿瘤脱落。使用小鼠模型的这两个品系，首次清楚地表明膜限制性NKG2D配体和可溶性NKG2D配体在肿瘤进展和转移中造成相反影响。这确凿地表明了，膜限制性NKG2D配体MIC.A2可以维持NKG2D保护性免疫，并防止自发性肿瘤发生；而天然NKG2D配体 MIC通过可溶性配体介导的NK细胞外周维持的削弱来促进肿瘤进展。
诸如由源自肿瘤的可溶性NKG2D配体(13、14、25、28、43)和 TGFβ(44)引起NKG2D表达下调以及由核心2O-聚糖阻碍MIC-NKG2D 相互作用(45)的机制已被描述为NKG2D介导的免疫的肿瘤免疫逃逸。关于在小鼠和人中源自肿瘤的可溶性NKG2D配体严重削弱NK细胞稳态，在当前研究中作出了新观察。发现在bi-Tg TRAMP/MIC小鼠中，高水平的循环sMIC造成外周NK细胞明显耗竭。在实验性肺 TRAMP-C2-sMIC模型中进一步证实了这一肿瘤逃逸机制，并表明该机制在前列腺癌患者中具有重要意义。如动物模型中所示的，NK细胞的耗竭在外周淋巴器官中最明显，而在骨髓中较少，暗示外周NK细胞池的稳态维持受到影响。这一点由过继转移实验进一步确认，在过继转移实验中观察到由可溶性MIC造成的增殖NK细胞的耗竭可以通过中和抗体处理逆转。这些发现是有趣的，并至少部分地为许多临床观察提供了解释。
例如，已经发现降低的肿瘤内NK细胞数在某些类型的癌症患者中预测出欠佳的临床结局(clinical outcome)(46、47)。并且，回顾性研究暗示血清sMIC对于上皮癌进展至转移具有预测价值(13、14、29)。过继NK细胞转移用于治疗人恶性肿瘤的临床试验的失败(48、49)也可以部分地通过可溶性NKG2D配体介导的NK细胞耗竭来解释。改善治疗结局的挑战之一是在癌症患者中维持所输注的NK细胞(48、49)。目前的研究表明，可溶性NKG2D配体的消除是待探索的对基于NK细胞的癌症免疫疗法加以改良的可行途径。需要进一步的研究来揭示sMIC 削弱NK细胞外周稳态的细胞机制和分子机制。
膜结合NKG2D配体保护抗肿瘤免疫这一发现与由其它报道得出的结论(长期暴露于膜结合配体削弱NKG2D功能，从而增加肿瘤发生的易感性)(15、19)相矛盾。本文预期，矛盾之处在于各种实验模型之间的不同。在两项研究中，NKG2D配体在非肿瘤易发的野生型小鼠中组成型地广泛表达(15、19)，这相对于在自发性肿瘤的情况下以组织特异性方式表达而言是高度非生理性的。例如，与野生型对应小鼠相比，通过基于C57BL/6背景在组成型的普遍存在的小鼠MHC I类H-2Kb启动子下表达人MIC而生成的一种转基因小鼠模型显示出NK细胞排斥MICA转染的RMA肿瘤的能力受损(19)。在其它模型(15)中，NKG2D配体 RAE-1ε在正常小鼠中在组成型外皮蛋白(involucrin)启动子(诱导鳞状上皮表达)或普遍存在的鸡β-肌动蛋白启动子下表达；注意到与野生型对应小鼠相比，这些小鼠中的局部NKG2D和系统NKG2D下调。值得注意的是，在这些转基因小鼠模型中，NKG2D配体表达是“异位的(ectopic)”，并且是在体细胞中在组成型或普遍存在的启动子的引导下进行。考虑到配体诱导的NKG2D信号对于活化NK细胞的重要性，与另外的野生型对应小鼠相比，预期在这些转基因小鼠中存在NKG2D功能下调，作为自我调节机制以允许正常胚胎发育。因此，尽管从这些小鼠模型得到的发现令人感兴趣，但它们并不代表癌症患者的实际情况。相反，本文描述了独特的转基因小鼠，其在前列腺表达NKG2D配体，因SV40T抗原的同时表达而易于自发性发展为癌症。在癌症进展中，NKG2D配体的器官特异性的暂时表达非常类似于人癌症中的情况。本文所述的结果更能准确反映在人患者中发生的情况，这一点通过一致的临床观察得到验证：前列腺癌进展与循环中可溶性MIC增加和并发的NK池耗竭密切相关。
大多数研究没有明确说明存在于肿瘤组织上的NKG2D配体是膜结合的还是可溶的。甚至是对于处于不同疾病阶段的相同类型的癌症，上述不确定性也可导致患者中NKG2D配体的预后值的矛盾。例如，报道了肿瘤中NKG2D配体MIC的高表达预测出早期乳腺癌的良好预后，而对于浸润性乳腺癌则是预后不良(21、24)。sMIC的肿瘤脱落由基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员介导(50、51)。显示出介导MIC脱落(50) 的其中一个成员MT1-MMP在浸润性乳腺癌中上调，并且它的表达在具有浸润性乳腺癌的患者中导致不良的临床预后(52)。因此，在早期乳腺癌组织和浸润性乳腺癌组织中，可能检测到了NKG2D配体的不同形式。因为可溶性NKG2D配体在肿瘤组织中系统地负调节多种抗肿瘤效应细胞的功能，本文预期将肿瘤组织中NKG2D配体表达的警戒评分(vigilant scoring)与sMIC的血清水平相结合可以提供恶性肿瘤的准确预后。
综上所述，本文描述了自发性癌的独特小鼠模型，其概括了肿瘤进展中NKG2D及其同源配体之间的特异性相互作用。进一步表明了在小鼠和人中，前列腺癌的转移进展都与循环中NK细胞的减少和可溶性MIC 的高水平有关。本研究不仅清楚地确定了NKG2D配体表达对肿瘤进展的影响，还提出了可以用于开发和优化基于NKG2D及其配体的生物学的癌症免疫疗法的有价值的临床前自身性(autochthonous)小鼠模型。
方法
人血样本采集。对人外周血样本及相关临床资料的采集和使用均得到了华盛顿大学机构伦理审查委员会和南卡罗来纳医科大学的批准。所有受试者均为本研究给出了书面知情同意书。新治和新诊断的前列腺癌患者(n＝36，年龄52-79)的血液样本从西雅图癌症治疗联盟、Hollings 癌症中心以及退伍军人事务部普吉特海湾医疗保健系统的门诊泌尿科诊所获得。本研究中登记的所有受试者具有正常的白细胞计数(4,000-11,000 细胞/微升)。其中25名男性仅被诊断为局部疾病。其中11名男性被诊断具有远处转移(骨或淋巴结)。来自于年龄匹配的健康对照男性(n＝10，年龄50-68)的血液样本从在华盛顿大学征募的人受试者获得。健康受试者被定义为没有癌症病史并且没有免疫学失调。将全血采集在肝素化管中。采集血清并通过Ficoll-Hypaque密度分离PBMC。
转基因小鼠。利用经批准的IACUC方案，按照机构指南，在华盛顿大学和南卡罗来纳医科大学的动物设施中在无特定病原体的条件下繁殖并豢养小鼠。本研究中使用的所有小鼠都具有C57BL6(B6)背景。rPB-MICB 和rPB-MICB.A2表达盒通过分别使用编码MICB或MICB.A2的cDNA 片段替换来自于rPB-SV40T表达盒(35)的SV40T片段构建。MICB.A2 的cDNA编码已有类似描述(33)。简而言之，将跨越调节MICB脱落的基序的MICBα3结构域的小区域(aa 238-252)(36)用来自于HLA.A2 的相应序列替换。在识别NKG2D方面，分子MICB.A2具有与MICB相同的功能(33、36)。对整个rPB-MICB或rPB-MICB.A2表达盒进行凝胶纯化，然后用HindIII消化，并分别显微注射至受精的B6胚胎中(在华盛顿大学比较医学转基因核心设施完成)。使用rPB特异性的正向引物 (5’-acaagtgcatttagcctctccagta-3’)和MICB特异性的反向引物 (5’-tgtgtcttggtcttcatggc-3’)或MICB.A2特异性的反向引物 (5’-cagagacagcgtggtgagtcatatg-3’)，通过对由尾部活检提取的DNA进行PCR分析来对转基因后代进行确认。
使雄性rPB MICB和rPB-MICB.A2动物与雌性TRAMP小鼠繁殖以产生实验性雄性TRAMP-MICB和TRAMP-MICB.A2动物。使用SV40Tag 特异性引物(正向5’-gatatggctgatcatgaacagact-3’以及反向 5’-tttgaggatgtaaagggcactg-3’)以及如上所述的MICB特异性引物或MICB.A2 特异性引物，通过对由尾部活检提取的DNA进行PCR分析来对双转基因的存在进行确认。所有实验小鼠随机分配至同期组群，并在一定的年龄处死以进行评估。在一些同期组群中，动物分别i.p.给予抗NKG2D阻断抗体C7(100μg/小鼠，eBiosciences)或对照IgG，每周2次，为期8 周。采集前列腺、淋巴结、肝、肺和股骨用于组织学评价。在一些实验中，LN和骨髓也随着脾一起采集，用于单细胞悬液和免疫评价。采集血液以用于通过ELISA测定sMICB的血清水平。
实验性肺转移模型。将表达可溶性MICB的TRAMP-C2(TC2)或TC2 细胞(TC2-sMICB)i.v.移植到两组8-10周龄的同基因型MICB/B6转基因小鼠(n＝6)(0.5×106个细胞/小鼠)中。由于小鼠不自然表达人MIC 的同源物，在本实验中我们选择使用转基因MICB/B6小鼠而不是B6小鼠，以避免针对人分子sMICB的自身抗体在实验中的影响。移植六周后，将每组中的小鼠进一步随机分为两个亚组：使用抗MICB mAb p2B10G5 (或称为B10G5)处理或使用对照小鼠IgG处理。在处死前，处理组中的每只小鼠i.p.接受100μg剂量的mAb p2B10G5或小鼠IgG，每周2次，为期两周。对于BrdU饲喂，在每天更新的饮用水中供给小鼠0.8mg/ml 的BrdU(Sigma)。对于同类系实验，在i.v.转移至每只小鼠中之前，使用细胞示踪染料V450对1x107个同类系CD45.1+脾细胞进行标记。安乐死之后，收获脾、骨髓和LN用于单细胞悬液分析。收获肺，在10％中性固定缓冲液中固定、石蜡包埋并切片以用于组织学评价。
组织学及免疫组织化学检查。将小鼠前列腺和其它软组织固定于 10％甲醛中，并包埋在石蜡内。在包埋前，将骨组织脱钙24小时。切割为五微米切片并用H&E染色以用于病理评价。还使用下述物质对切片进行染色：1)抗MICB(和MICB.A2)mAb 6D4.6(小鼠IgG；1:500；Biolegend)； 2)抗panRAE-1抗体(大鼠mAb IgG2a；1:500；R&D)；3)抗SV40T 抗原(兔多克隆IgG；1:200；Santa Cruz)；4)抗小鼠p63抗体(小鼠mAb IgG2a；1:200；ThermoScientific)。将切片脱蜡，在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中在95℃孵育10分钟，修复抗原。使用3％过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性。在消除内源性过氧化物酶活性并阻断非特异性结合后，将玻片与特异性一抗在4℃孵育过夜，接着与适当的生物素化二抗(1:1000稀释)在37℃孵育20分钟：山羊抗兔IgG(Vector，Burlingame， CA)；兔抗大鼠IgG(Vector)；山羊抗小鼠IgG(Vector)。采用Vectastain Elite ABC免疫过氧化物酶试剂盒和DAB检测免疫反应性抗原。所有玻片用苏木精(Vector)复染，并用Permount(Fisher Scientific)封片。
IHC评价。IHC染色的评分在先前有类似描述(53)。简而言之，特异性染色的强度按照双盲分级分为等级1至3(1＝弱染色，2＝中度染色， 3＝强染色)。将范围为0％～100％的基于10％增量规模的半定量评分用于评估某一强度的染色细胞的百分比。每一种情况都对约500个细胞进行了分析。免疫染色的最终综合染色评分基于染色强度(1、2或3)乘以免疫阳性细胞的百分比(0-100)。最大综合得分为300。
病理评价。由两名科学家对来自于每一个同期组群的个体小鼠的前列腺的H&E染色切片的十个随机选择的区域进行独立评分，得到对应于每个病理阶段的区域的发生率和百分数。根据已发表的研究的推荐(35、 38)进行前列腺的病理分级。
流式细胞术分析。为了分析人PBMC中的NK细胞频率，将单细胞悬液用FITC缀合的抗人CD3和PE缀合的抗人CD56抗体(eBiosciences) 染色。用BD FACScanTM分析样品。NK细胞被限定为CD3-CD56+。为了分析小鼠样品，将脾细胞、LN和骨髓的单细胞悬液与FITC缀合的mNK 特异性mAb NK1.1或DX5或mCD8特异性抗体(eBiosciences)以及PE 缀合的抗小鼠NKG2D mAb CX5(eBiosciences)和PerCP缀合的抗小鼠 CD3抗体(eBiosciences)一起在冰上孵育30分钟。用BD FACscanTM或 FortessaTM分析细胞。采用BD FlowJoTM软件(Tree Star)分析数据。
细胞毒性测定。将从来自相同实验组中的具有相似前列腺疾病进展的两到三只代表性小鼠的合并脾细胞中分离(如先前所述的)的小鼠NK 细胞用作效应物(33)。将51Cr标记的TRAMP-MICB.A2细胞用作靶细胞。细胞毒性测定使用如前所述的标准4小时51Cr释放测定法进行(33)。将30μg/ml抗NKG2D抗体C7(ebioscience)用于阻断NKG2D功能。
用于sMIC的ELISA。将血清用PBS稀释为1：2。采用MICA DuoSetTM夹心ELISA试剂盒(R&D Systems)按照制造商的方案测定人血清中可溶性MIC的量。如前所述的，使用人MICBDuoSetTM夹心ELISA试剂盒 (R&D Systems)测定小鼠血清中可溶性MICB的量(33)。
统计分析。所有统计数据均以平均值±SEM表示。对于未配对的单尾样本，群体的平均值之间的差异通过标准学生t检验进行比较。通过 Kaplan-Meier分析确定生存率，采用Mantel-Haenszel log-rank检验对曲线进行比较。p值为0.05以下被认为是显著的。将GraphPad PrismTM软件用于全部分析。
实施例2
中和可溶性NKG2D配体的抗体恢复宿主抗肿瘤免疫并缓解晚期前列腺癌
C型凝集素样刺激受体NKG2D的活化对于维持抗肿瘤免疫是重要的。在肿瘤细胞表面保留NKG2D配体是维持NKG2D介导的肿瘤阻遏的关键。在癌症患者中，癌细胞导致的NKG2D配体的脱落使CD8T细胞和NK细胞中NKG2D受体表达下调，并因此削弱了NKG2D介导的免疫监视。更严重的是，长期暴露至可溶性NKG2D配体可以诱导外周NK 细胞的耗竭，而这在进展为转移性疾病的患者中尤其意义深远。血清可溶性NKG2D配体的水平已被提议作为人恶性肿瘤转移的潜在的预后生物标志物。从未对中和循环可溶性NKG2D配体是否可以成为用于转移性恶性肿瘤的有效治疗进行测试。
在实体瘤的人恶性肿瘤中，表达最丰富的NKG2D配体是MHC I链相关分子A和B(MICA/B)。已经表明MIC的脱落与各种类型的人癌症的疾病阶段相关。鉴于在啮齿类动物中并未鉴定出人MIC同源物以及在荷瘤宿主中NKG2D功能的调节隐含了另外的机制的事实，本文描述的是“NKG2D配体人源化的”小鼠前列腺肿瘤TRAMP/MIC模型，并证明了这个模型在病理学和免疫学方面模拟了患有前列腺癌的男性。在这项研究中，证明了使用单克隆抗体中和血清可溶性MIC显著诱导晚期前列腺癌的消退并阻遏转移。该治疗效果是通过重建NK细胞稳态以及引发 CD4T细胞和CD8T细胞抗肿瘤免疫实现的。
结果
中和sMIC的抗体导致晚期前列腺癌消退并阻遏转移
如本文所述，sMIC的肿瘤脱落导致多于40％的“NKG2D配体人源化的”TRAMP/MIC小鼠在24周龄前发展为低分化前列腺癌和转移。使用单克隆抗体“P2B10G5”(对人MICA和MICB的胞外结构域具有特异性)或对照小鼠IgG(安慰剂)处理27～28周龄的TRAMP/MIC小鼠同期组群，每周2次以30mg/kg体重的量进行腹膜内注射(图9A)。处理 6周后，抗体处理组中的所有小鼠普遍健康，而对照组中的所有小鼠出现严重患病症状。检查时，与对照组的大肿瘤相比，抗体处理组中的所有动物具有显著更小的前列腺尺寸(图9B)。与对照组相比，处理组小鼠的前列腺重量显著降低(图9C)。在抗体处理的小鼠的淋巴结或肺中未观察到转移。相反，在对照组中100％的小鼠有肺或淋巴结转移(图9D)。
Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色表明抗体处理导致肿瘤细胞显著凋亡(数据未示出)。
未观察到与处理有关的显著系统性细胞毒性。与处理组相比，对照安慰剂组中的动物具有显著更高的体重(图10A)，这归因于大的肿瘤负荷。使用抗体处理的动物仅有重量减少的趋势，但不显著(图10A)。重量的变化可以归因于系统性细胞因子风暴的处理应答(图10B)。抗体处理显著降低了sMIC的血清水平(图10C)。
抗体处理重建NK细胞稳态并增强NK细胞功能
源自肿瘤的sMIC扰乱NK外周稳态从而使外周NK细胞耗竭(JCI revision)。如通过脾和引流淋巴结中的NK细胞频率所衡量的(图11A)，利用中和循环sMIC的抗体，明显重建了外周NK细胞稳态。此外，连续 BrdU脉冲(以5mg/ml在饮用水中进行5天)显示，NK细胞更新率通过抗体处理而显著提高(图11B)。此外，抗体处理明显增加了对再刺激进行应答的NK细胞IFNγ产生(图11C)。当将同类系脾细胞转移至这些动物时，观察到对同类系的转移的脾NK细胞的类似效果。
抗体处理破坏CD8T细胞耐受
CD8T细胞耐受化已被描述为癌症患者中的免疫功能障碍的一般机制，在前列腺癌小鼠模型TRAMP中也有详细记载。利用中和TRAMP/MIC 小鼠中的血清sMIC的抗体处理，如通过NKG2D表达所检查的，在脾和 LN中观察到CD8T细胞显著活化(图12A)。如所描述的，在小鼠中，NKG2D 仅由活化的CD8T细胞表达。此外，如通过IFNγ产生所测定的，在来自于接受抗体处理的动物的CD8T细胞中观察到对于再刺激产生显著更强的应答(图12B)。此外，抗体处理显著增加了LN和脾中的中枢记忆性CD8T细胞池(数据未示出)。
抗体处理将CD4辅助性T细胞极化为Th1和Th17型
中和sMIC的抗体对脾或LN中的总CD4T细胞池没有显著影响(数据未示出)。然而，随着sMIC的中和，如通过使用转录因子T-bet和RORγt 染色所测定的，CD4T细胞被致敏而极化成为Th1和Th17辅助性细胞(图 13A和图13B)。对于过继转移的同类系脾细胞，在CD4T细胞上观察到了类似的效果。此外，LN中的中枢记忆性CD4T细胞池随着抗体处理而显著增加(图13C)。
讨论
利用临床相关动物模型，本文证明了使用单克隆抗体(例如P2B10G5) 中和血清sMIC可以有效诱导晚期前列腺癌的消退并抑制转移。进一步证明了，肿瘤阻遏和清除是通过重建NK细胞稳态、将CD4辅助性T细胞极化为Th1和Th17、以及CD8T细胞的再活化而实现的。此外，本文还证明了，过继性转移的NK细胞不能在肿瘤宿主中保持，除非sMIC耗竭。重要的是，本文报道了一类新的单克隆抗体，所述单克隆抗体可以治疗许多晚期实体瘤，包含但不限于晚期前列腺癌。
方法
动物和抗体给药。TRAMP/MICB的繁殖在先前已经有所描述(JCI revision)。当小鼠达到26-28周龄时，向动物的同期组群i.p.注射mAb P2B10G5或同种型对照IgG，剂量为30mg/kg体重，每周2次。所有动物都在处理6周后处以安乐死，将其定义为研究终点。在研究终点之前5 天，在饮用水中向小鼠喂食0.8mg/mL BrdU(Sigma)。所有动物都被安置在无特定病原体的设施中。所有实验程序均得到实验动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。
同类系细胞转移。对于同类系脾细胞的过继转移，从Charles RiverLaboratories(Frederick Cancer Research Center，Frederick，Maryland)购买C57BL/6(CD45.1/Ly5.2)小鼠。一经安乐死，在使用红细胞裂解缓冲液(Sigma)去除红细胞后得到全有核脾细胞(whole nucleated splenocytes)，并根据制造商的说明书使用V450细胞增殖染料(eBioscience)对其进行标记。将V450标记的脾细胞悬浮于1×PBS中，并以2×107/小鼠的剂量 i.v.注射至接受者中。在终点和组织采集前5天进行过继转移。
组织采集。在终点日的前一天使用尾部放血程序采集外周血单核细胞。使用基于1×PBS的1％葡聚糖T500和红细胞裂解缓冲液处理PBMC 的单细胞悬液用于FACS染色。采集血清用于测定细胞因子和sMIC。采集脾、淋巴结、前列腺、肺、股骨和胫骨。如在其它地方描述的，制备淋巴结、脾和骨髓的单细胞悬液用于表型分型和功能分析。采集前列腺、肺、肾和胰腺，固定于10％NBF(中性固定缓冲液)中，石蜡包埋并切片，用于组织学分析。
流式细胞术。对于表面表型分型，使用了以下抗体：荧光染料 (fluorochrome)缀合的或生物素化的小鼠特异性单克隆抗体CD3e(克隆145-2c11)、CD8a(克隆53-6.7)、CD4(克隆GK1.5)、NK1.1(克隆 PK136)、NKG2D(克隆CX5)、CD27(克隆LG.7F9)、CD11b(克隆 M1/70)、CD45.1(克隆A20)、CD44(克隆IM7)、FoxP3(克隆FJK-16s)、抗BrdU(克隆Bu20a)、Ki67(克隆SolA15)、T-bet(克隆eBio4B10)、 RORγt(克隆B2D)、CD62L(MEL-14)、PD-1(克隆J43)、(KLRG1)(克隆2F1)和相应的同种型对照抗体是eBioscience的产品。CD69(H1.2F3)、INF-γ(XMG1.2)、CD25(克隆PC61)来自于BD。对于离体再刺激，将新分离的脾细胞和来自于LN的单细胞悬液在含有50ng/mL PMA和 500ng/mL离子霉素的完全RPMI 1640培养基(Hyclone)(具有10％FBS (Atlanta Biologicals，GA)、青霉素/链霉素(Hyclone)和50μM 2ME(Millipore))中维持培养4-6小时，然后通过使用对IFNg、IL-4、IL-17 和IL-10具有特异性的抗体进行细胞内染色来进行分析。BrdU染色使用所描述的甲醇固定和酸处理程序进行。多参数流式细胞术分析在LSR IITM(BD)上进行，并使用FlowJoTM软件来进行分析(Tree Star)。
IHC染色和数据采集。IHC染色方案先前已有描述。使用以下抗原特异性抗体：抗SV40T(Santa Cluz，克隆v300)、抗精氨酸酶I(Santa Cluz，克隆H52)、F4/80(Biolegend，克隆BM8)、抗Ki67(Neomarker，克隆 SP6)、MAC-2(ATCC杂交瘤)、抗Cleaved Caspase-3(CellSignaling，克隆5A1E)。用Hemotoxyline(Thermo Scientific)对全部组织进行复染。
细胞因子组(cytokines panel)读取。使用小鼠32-plex discovery assay，由EveTechnologies Corporation(加拿大)测定血清细胞因子浓度。
ELISA测定。使用来自R&D的MICB ELISA试剂盒根据制造商的手册对血清可溶性MICB浓度进行测试。对每个样本进行三个平行检测。读取OD450相对于OD570的值，并在处理组和对照组之间进行比较。
统计分析。所有结果均以平均值±SEM表示。除非另有指明，小鼠和样本组大小为n>5。采用未配对检验分析数据，P<0.05确定差异显著。
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表1.24周时TRAMP和TRAMP/MICB小鼠的病理学比较
a，MD病变在向PD病变转变。
b，分叶状，鹿角型病变。在两者中，一个是MD病变，另一个是WD。
c，在4只具有PD肿瘤的动物中，三只在肺和淋巴结中有转移，一只仅有肺转移。
d，表示为平均值±SEM(g)。
实施例3：可溶性NKG2D配体是晚期癌症的有效免疫治疗靶标
可溶性NKG2D配体MHC I类链相关分子(sMIC)的肿瘤脱落增高与许多类型的实体瘤中的晚期癌症阶段和转移有关。sMIC的高血清水平不仅在自然杀伤(NK)细胞和效应T细胞中下调NKG2D表达，还扰乱 NK细胞外周维持。尚不清楚sMIC是否是MIC+癌症患者中的有效治疗靶标。使用“人源化的”临床相关自发性前列腺癌TRAMP/MIC双转基因小鼠模型，本文证明了，使用sMIC特异性单克隆抗体的疗法通过诱发原发肿瘤和转移的快速消退和抑制而显著改善了动物的生存率。该疗法通过下述机制起作用：降低血清sMIC、重建NK细胞稳态更新和功能、致敏和极化CD4T细胞成为Th1型、以及增强CD8T细胞功能。不存在系统性细胞毒性。值得注意的是，治疗过程中NK细胞的耗竭减轻了治疗效果，而且不能增强CD4T细胞和CD8T细胞的效应物功能。这一数据表明，sMIC是用于MIC+晚期癌症的有效治疗靶标，并且共同靶向sMIC 显著强化了基于自适应性的(adaptive-based)癌症免疫疗法。
MIC是在人癌症中表达的诱导分子，极少出现在正常组织中。在具有转移性癌症的患者中，sMIC的血清水平一致地升高。啮齿类动物不表达MIC同源物，因而sMIC的肿瘤脱落是人特有的现象。为了了解在癌症进展中sMIC的肿瘤脱落的影响，开发了在TRAMP小鼠的前列腺上皮细胞中由前列腺特异性启动子引导表达人MIC的双转基因TRAMP/MIC(B) 小鼠。TRAMP/MIC小鼠高度概括了人癌症患者的许多免疫学及病理学特点。具有高血清水平sMIC的TRAMP/MIC小鼠高度模拟了具有前列腺癌的男性，表现出受损的NK细胞外周稳态以及低分化(PD)前列腺癌和转移的高发生率。通常在24周龄前，超过40％的TRAMP/MIC小鼠发展为PD癌和转移。为了对sMIC是否是有效的治疗靶标进行评估，使用 sMIC特异性单克隆抗体B10G5或对照小鼠IgG(cIgG，安慰剂)对27～28 周龄的TRAMP/MIC小鼠同期组群进行处理，每周2次经i.p.进行，剂量为3.4mg/kg体重(图21A)。处理8周后，抗体处理组中的所有小鼠普遍健康，而对照组中的所有小鼠出现严重患病症状。与安慰剂组的小鼠相比，接受B10G5治疗的小鼠具有显著更小的前列腺(图21B-图21C)。在 B10G5处理的小鼠的远处器官中未出现转移。相反，安慰剂组中超过60％的小鼠在远处器官中发展出转移(图21D)。确定了对B10G5处理的系统应答。响应于B10G5处理，sMIC的血清水平显著降低(图21E)。可能是随着B10G5处理的宿主抗肿瘤应答再活化的结果，出现了血清细胞因子“风暴”，主要的抗肿瘤细胞因子(例如IFNγ、IL-12)明显升高(图 21F)。然而，由于未检测到动物体重、器官炎症或总血清IgG水平的明显变化，未观察到响应于B10G5治疗的明显的系统性细胞毒性(图21G)。
检测了B10G5治疗对原发性肿瘤的影响。组织学上，接受B10G5 治疗的动物表现出器官界定的高分化前列腺癌，而接受安慰剂的动物表现出高频率的进行性PD前列腺癌(数据未示出)。如分别通过Ki-67和 Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色所显示的，B10G5治疗显著抑制前列腺上皮细胞的增殖并诱导凋亡(数据未示出)。在前列腺癌中，虽然在早期前列腺肿瘤中极少发现神经内分泌癌细胞，然而40-100％的去势抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer，CRPC)表明了神经内分泌转分化的证据(15)，该过程中腺癌细胞获得神经内分泌细胞标志物(例如突触素和嗜铬粒蛋白A)。由于这些细胞丧失了激素受体表达，神经内分泌表型本质上抵抗激素消融(hormone-ablation)疗法，因此被认为给出不良预后(15-17)。在接受安慰剂治疗或不治疗的大多数TRAMP/MIC 小鼠的前列腺中，弥散性突触素阳性神经内分泌细胞的独特群浸润在基质中。B10G5治疗显著消除了前列腺中的突触素阳性细胞(数据未示出)。
系统sMIC靶向显著将前列腺肿瘤微环境引发为具有高度免疫反应性，表现为在前列腺中肿瘤细胞毒性NK细胞和CD8T细胞浸润明显增加以及免疫阻遏调节性T细胞(Treg)和肿瘤相关2型巨噬细胞(M2) 得以消除。在大多数晚期恶性肿瘤中，在肿瘤浸润物中很少发现NK细胞。在大多数原发实体瘤的早期阶段，NK细胞浸润物与更好的临床结局相关(Desbois M和Chaput N，2012)，暗示在控制癌症进展中NK细胞具有重要作用。我们最近发现在TRAMP/MIC小鼠中，由于sMIC的肿瘤脱落，在进行性前列腺癌中极少发现NK浸润。响应于B10G5治疗，原发性前列腺肿瘤被NK细胞大量浸润(数据未示出)。CD8T细胞在肿瘤微环境中的无反应性或耐受化在TRAMP小鼠中已经有充分描述，大多数肿瘤类型也是一样。有趣的是，响应于B10G5治疗，细胞毒性CD8T 细胞使前列腺发炎(数据未示出)，暗示归巢恢复或肿瘤反应性细胞毒性 T细胞增殖。普遍被接受的是，在肿瘤微环境中，免疫阻遏性Tregs或产生精氨酸酶I的M2巨噬细胞的存在使得癌症预后不良。通过B10G5治疗，两个群都显著减少(数据未示出)。
显示出升高的血清sMIC通过下调NKG2D表达，大大损害癌症患者中的外周NK功能。利用TRAMP/MIC小鼠，表明了高水平的sMIC扰乱 NK细胞稳态维持并与癌症患者中NK细胞的耗竭相关。认为sMIC主要通过这一机制赋予免疫阻遏并促进癌症进展为转移。B10G5治疗在外周显著重建外周NK细胞池(图22A)以及脾和骨髓中NK细胞更新的能力(如通过连续BrdU脉冲后(在饮用水中以0.8mg/ml进行5天)的BrdU 摄取所显示的)(图22B)。此外，B10G5治疗明显提高NK细胞功能，表现为响应于PMA和离子霉素刺激的IFNγ产生(图22C)。当同类系脾细胞转移至这些动物时，证明了类似效果(数据未示出)。这些数据共同表明，消除血清sMIC提高了MIC+癌症宿主中的NK细胞稳态维持和功能。
使用B10G5中和血清sMIC极大地增强了CD8和CD4抗肿瘤应答，这在很大程度上取决于功能性NK细胞的可持续性。在癌症患者和荷瘤小鼠模型中，T细胞通常是耐受的或无反应性的。在TRAMP小鼠中，CD8 和CD4T细胞的无反应性已经证据确凿。在TRAMP/MIC小鼠中，B10G5 治疗显著破坏CD8T细胞耐受性，显示为脾、LN和肿瘤浸润物中NKG2D+ CD8T细胞群增加以及响应于PMA和离子霉素刺激的IFNγ大幅产生(图 22D-图22E)。B10G5治疗并未显著影响在脾或LN中的外周CD4T细胞池(数据未示出)；然而，如通过CD4T细胞中的T-bet+和RORγt+群以及细胞因子IFNγ和IL-17响应于离体刺激而显著增加所评估的，CD4T 细胞被致敏而极化成为Th1和Th17辅助性细胞(图22F)。
此外，响应于B10G5治疗，CD44hi记忆性CD8T细胞群和CD4T 细胞群都显著增长(图22G)。有趣的是，当在治疗过程中NK细胞耗竭时，B10G5的抗肿瘤作用以及CD4T细胞和CD8T细胞的增强作用出现减轻(图23A-图23C)。
讨论
本文首次利用临床相关的动物模型表明，靶向sMIC的抗体有效地诱导原发性肿瘤的消退并抑制MIC+恶性肿瘤中的转移。进一步表明，肿瘤阻遏和转移清除的机制是通过重建NK细胞稳态维持和功能、增强细胞毒性CD8T细胞以及致敏CD4辅助性T细胞极化为Th1和Th17而实现的。此外，本文还指出，靶向sMIC或其它可溶性NKG2D配体可以强化用于MIC+恶性肿瘤(或广义上来讲，NKG2D配体+恶性肿瘤)的过继 NK细胞疗法。此外，本文表明，在增强针对MIC+肿瘤的自适应性免疫应答中，功能性NK细胞具有关键作用。总体来说，本文提供了证实sMIC 是用于癌症治疗的有效靶标的体内证据，并证明了如下新概念：对于 MIC+肿瘤而言，无论是基于NK还是基于自适应性的癌症免疫治疗，共同靶向sMIC可以提高癌症免疫治疗目前的临床实践。
方法汇总
动物和抗体治疗。TRAMP/MICB的繁殖在先前已经有所描述。当小鼠达到27-28周龄时，向动物的同期组群i.p.注射B10G5或同种型对照 IgG，剂量为4mg/kg体重，每周2次。B10G5抗体的生成和特征先前已有描述。所有动物都在处理8周后处以安乐死，将其指定为研究终点。在研究终点前连续五天，小鼠接受每天更新的含有0.8mg/mL BrdU的饮用水。所有动物都被安置在无特定病原体的设施中。所有实验程序均得到实验动物管理和使用委员会的批准。重复三次这一研究。
同类系细胞转移。脾细胞分离自同类系CD45.1+C57BL/6小鼠(Charles RiverLaboratories，Frederick Cancer Research Center，Frederick，Maryland)，并根据制造商的方案使用V450细胞示踪染料进行标记(eBioscience)。在终点前五天，将V450标记的脾细胞重悬于PBS中，并以2×107/小鼠的剂量通过尾静脉注射至接受者TRAMP/MICB小鼠(CD45.2+)中。
NK耗竭。在B10G5抗体治疗之前一天，向小鼠注射NK1.1特异性抗体PK136(BioXcell，Labnon，NH)，剂量为200μg/小鼠；此后直到研究终点，每2周注射，剂量为100μg/小鼠。三只野生型C57BL/6小鼠也接受相同剂量的PK136抗体，以监测NK耗竭的效力。使用NK受体的抗体NKp46，在实验小鼠和对照野生型C57BL/6小鼠的外周血中通过对 NK细胞群的流式细胞术分析确认了NK耗竭的效率。在PK136给药后1 周，达到大于99％的NK耗竭(数据未示出)。
组织采集。在治疗过程中通过尾部放血或在安乐死后通过心脏穿刺采集血液。采集脾和引流淋巴结(dLN)进行免疫分析。采集前列腺、肺、肝、肾、胰腺和肠，固定于10％中性固定缓冲液中，然后进行石蜡包埋或直接包埋于OCT中，用于病理和组织学分析。在一些实验中，将一部分前列腺肿瘤用胶原酶消化，用于肿瘤浸润淋巴细胞分析。
流式细胞术。按照所描述的，准备来自于脾细胞、dLN或肿瘤浸润物的单细胞悬液。使用下列抗体的组合进行细胞表面或胞内染色，用于确定NK细胞群、CD8细胞群和CD4T细胞亚群：CD3e(克隆145-2c11)、 CD8a(克隆53-6.7)、CD4(克隆GK1.5)、NK1.1(克隆PK136)、NKp46、 NKG2D(克隆CX5)、CD45.1(克隆A20)、CD44(克隆IM7)、CD62L (MEL-14)、FoxP3(克隆FJK-16s)、T-bet(克隆eBio4B10)和RORγt (克隆B2D)。对于离体再刺激，将新鲜分离的脾细胞或LN的单细胞悬液在包含50ng/mL PMA和500ng/mL离子霉素的完全RPMI 1640培养基中培养4-6小时，并通过使用IFNγ(XMG1.2)、IL-4、IL-17和IL-10特异性抗体进行细胞内染色来进行分析。对于NK细胞更新，使用抗BrdU 抗体(克隆Bu20a)进行细胞内BrdU染色。所有抗体及相应的同种型对照均是荧光染料缀合的，并购买自eBioscience或BD Biosciences。多色流式细胞术分析在LSR IITM(BD)上进行。使用FlowJoTM软件(Tree Star) 对数据进行分析。
组织学和免疫组织化学染色(IHC)。将前列腺、肺和其它器官进行切片，使用H&E进行染色，用于组织学评价。对于检测特异性抗原的免疫组织化学染色，使用下列抗体：抗SV40T(Santa Cluz，克隆v300)、抗精氨酸酶I(Santa Cluz，克隆H52)、抗Ki67(Neomarker，克隆SP6)，抗Cleaved Caspase-3(cell signaling，克隆5A1E)、抗FoxP3、抗CD8、抗NK1.1(PK136)和抗突触素。IHC染色方案在先前已有描述。所有的组织都使用Hemotoxyline进行复染，用于核的可视化。
血清sMIC和细胞因子检测。使用MICB夹心ELISA试剂盒(R&D Systems)对sMICB的血清水平进行评估。由Eve Technologies Corporation 使用Luminex技术(Alberta，加拿大)对细胞因子的血清水平进行分析。
统计分析。所有结果均以平均值±SEM表示。除非另有指明，小鼠和样本组大小为n>5。采用未配对检验分析数据，P<0.05确定差异显著。
对本公开的实施方式所进行的描述并非旨在进行穷举或将本公开限制为所公开的确切形式。虽然本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是正如相关领域的技术人员将了解的，可在本公开的范围内进行各种等同修改。
将本文引用的所有参考文献以引用的方式并入本文。如果需要的话，可对本公开的方面进行修改，以采用上述参考文献和应用的系统、功能和概念，从而提供本公开进一步的实施方式。根据详细的说明，可以对本公开作出这些改变和其它改变。
可将任何上述实施方式中的特定要素与其它实施方式中的要素组合或置换为其它实施方式中的要素。此外，虽然在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的某些实施方式相关的优点，然而其它实施方式也可以表现出此类优点，并且，并非所有的实施方式都必须表现出这样的优点才能落入本公开的范围之内。
表2
SEQ ID NO:
1 轻链CDR1 GCC CAC ATT AAT AAT TGG
2 轻链CDR2 GAT GCA ACC
3 轻链CDR3 CAA CAT TAT TGG AGT ACT CCG TGG ACG
4 重链CDR1 GGC TAC TCA ATC ACC AGT GAT TAT GCC
5 重链CDR2 ATA AGC TAC AGT GGT AGC ACT
6 重链CDR3 GCA AGG GGG GGG ACT TAC TTT GAC TAC
9 轻链CDR1 AHINNW
10 轻链CDR2 DAT
11 轻链CDR3 QHYWSTPWT
12 重链CDR1 GYSITSDYA
13 重链CDR2 ISYSGST
14 重链CDR3 ARGGTYFDY
实施例4：嵌合chB10G5抗体的生成
通过PCR对B10G5轻链可变区(VL)的cDNA进行扩增。经过序列确认后，通过克隆至表达载体pFUSE2-CLIg-hk(InvivoGen)，将VL 的cDNA片段框内(in-frame)融合至人IgG1轻链的恒定区。通过PCR 对B10G5重链可变区(VH)的cDNA进行扩增。通过克隆至表达载体pFUSE-CHIg-hG1(Invivogen)，将具有VH的正确序列的cDNA片段框内融合至人IgG1重链的恒定区。将这两个载有杂交VL和VH的表达质粒共转染到293T细胞中。采用流式细胞术，使用表达MIC的细胞对转染的293T培养上清液中的混合抗体的表达及特异性进行检测(图24)。

Claims (21)

1.一种特异性结合至sMIC多肽的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含下述重链和轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链CDR2；
c.具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链CDR3；
d.具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR1；
e.具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
f.具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：7的序列的轻链。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：8的序列的重链。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：8的序列的重链。
5.如权利要求2-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分进一步包含不包含于CDR中的序列中的保守置换。
6.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分选自于由下述抗体或其抗原结合部分所组成的组：
免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体和双特异性抗体。
7.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分选自于由下述抗体或其抗原结合部分所组成的组：
免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体和双特异性抗体。
8.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合至sMIC。
9.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合至sMIC。
10.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合至sMIC。
11.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述抗体或其抗原结合部分特异性地结合至sMIC。
12.包含如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
13.编码如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核酸。
14.如权利要求13所述的核酸，其中，编码所述抗体或其抗原结合部分的CDR的一个或多个核酸序列选自于由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所组成的组。
15.如权利要求13所述的核酸，其中，编码所述抗体或其抗原结合部分的CDR的核酸序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
16.如权利要求13-15中任一项所述的核酸，其中，所述核酸是cDNA。
17.如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备用于在细胞或受试者中抑制sMIC的药物中的用途。
18.如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分或如权利要求12所述的药物组合物在制备用于在有需要的受试者中对MIC阳性肿瘤进行治疗的药物中的用途，其中，所述MIC阳性肿瘤是可以通过脱落MIC而逃脱先天免疫排斥的肿瘤。
19.如权利要求18所述的用途，其中，所述MIC阳性肿瘤是上皮细胞肿瘤。
20.如权利要求18所述的用途，其中，所述MIC阳性肿瘤是造血系统恶性肿瘤。
21.如权利要求18-20中任一项所述的用途，其中，所述药物进一步包含用于给予额外的免疫疗法的试剂。
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