CN109468375B - 分子标志物在骨质疏松症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了绝经后骨质疏松的诊疗标志物，该标志物是miR‑6511a‑3p。本发明通过QPCR证明了miR‑6511a‑3p与绝经后骨质疏松的发生发展相关，同时本发明通过细胞实验证明了miR‑6511a‑3p影响成骨细胞的分化，提示miR‑6511a‑3p可作为分子靶标应用于绝经后骨质疏松的早期诊断和治疗。

Description

分子标志物在骨质疏松症中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及分子标志物在骨质疏松症中的应用，具体涉及的标志物为miR-6511a-3p。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由于多种原因导致的骨密度下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而易于发生骨折的全身性骨病。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类，原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松症(包括青少年型)3种。绝经后骨质疏松症一般发生在女性绝经后5～10年内；老年性骨质疏松症一般是70岁后发生的骨质疏松；而特发性骨质疏松主要发生在青少年，病因尚不明确。

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指女性绝经后卵巢内分泌功能失调衰退，导致雌激素水平下降，从而导致破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成的一种代谢性疾病，其特征为进行性全身性骨密度(bone mineral density，BMD)降低和骨组织微结构发生改变。骨质疏松症是老年人脊柱、髋部、桡骨远端骨折的最常见的原因。通常，骨质疏松症没有特异性的临床表现，直到轻微的应激诱发骨折时才会引起重视。在发达国家的女性中绝经后骨质疏松症的发生率为38％，根据临床诊断标准，目前全世界有800万50岁以上的女性被诊断为骨质疏松症，3400万女性有明显的骨质减少症状。绝经后骨质疏松性骨折对绝经后女性的生活质量产生了很大的影响。绝经后骨质疏松症的病因是多因素的，现有的研究认为雌激素水平降低导致的骨吸收、骨形成平衡破坏是主要因素，除此之外，钙和其他环境因素对骨质流失也有影响。目前研究骨质疏松发生机制及其相关信号通路是科研工作的重中之重。

microRNA(miRNA)是一类18～25nt的非编码单链小分子RNA，是在Drosha和Dicer酶的共同作用下加工形成的。miRNA的编码基因在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录成初级转录本pri-miRNA，再通过一系列连续的加工处理后得到成熟的miRNA。成熟miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中发挥效应。根据miRNA与靶基因3’UTR的互补配对程度，miRNA可通过抑制翻译和介导靶基因mRNA的降解两条途径介导基因活性下降。

根据生物信息学预测，一个miRNA可作用于多个靶基因，而一个靶基因mRNA的编码区或3’UTR可能存在多种miRNAs的结合位点，由此构成了一个复杂的网络，此外ceRNA作用模式的提出，进一步拓展了microRNA作用网络。microRNA通过信号网络调控细胞的增殖、调亡、免疫、肿瘤、炎症等病理生理过程，研究miRNA的作用机制，关键在于探索miRNA与其靶基因的相互作用。miRNA与靶基因的作用有内在规律性，可以用软件对其进行预测。近年来，从最开始的一个miRanda靶基因预测软件到现在开发出了10余种预测软件，目前常用的包括miRanda、TargetScan、PicTar、RNA22等。

微小RNA(miRNA)是一种由高等真核生物基因组编码，在进化上十分保守的非编码小分子RNA，具有调控基因表达的能力。miRNA主要通过和靶基因mRNA碱基配对，引导沉默复合体降解mRNA或抑制其翻译。基于miRNA的作用机制，通过人工合成miRNA拟似物和miRNA抑制剂调节miRNA相关通路，或人工构建miRNA介导RNA干扰途径，进行基因和分子治疗，从而在分子水平上为研究新一代基因药物和生物治疗手段提供新的切入点。关于骨质疏松，目前研究发现miRNA主要通过影响Runx2和Osterix信号通路发挥调控成骨信号作用，因此，干预miRNA可通过影响干细胞骨再生延缓骨质疏松进程，促进骨折修复。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种miRNA诊疗标志物，该诊疗标志物为miR-6511a-3p。

本发明的目的之二，提供一种诊断产品，实现绝经后骨质疏松的早期诊断。

本发明的目的之三，提供一种治疗手段和治疗药物，实现绝经后骨质疏松的精准医疗和病人的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA在制备诊断绝经后骨质疏松的产品中的应用，所述miRNA为miR-6511a-3p。

进一步，所述产品通过测定miR-6511a-3p或其同源物的表达水平来诊断绝经后骨质疏松。

进一步，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-6511a-3p或其同源物的水平以诊断绝经后骨质疏松的产品。miR-6511a-3p或其同源物在绝经后骨质疏松组织中呈高表达，当患者的miR-6511a-3p显著升高时，可以判断患者患绝经后骨质疏松。

本发明提供了一种诊断绝经后骨质疏松的产品，所述产品能够通过检测miR-6511a-3p或其同源物的水平来诊断绝经后骨质疏松。

进一步，所述产品包括芯片、阵列或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miR-6511a-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测miR-6511a-3p的表达水平的试剂。

进一步，所述检测miR-6511a-3p表达水平的试剂包括针对miR-6511a-3p的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断绝经后骨质疏松miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断绝经后骨质疏松的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，针对miR-6511a-3p的引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明提供了miR-6511a-3p在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用。

进一步，所述药物包含miR-6511a-3p或其同源物的抑制剂。

进一步，所述miR-6511a-3p的抑制剂是miR-6511a-3p或其同源物的反义寡核苷酸或拮抗剂。根据miR-6511a-3p序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miR-6511a-3p的表达。反义miRNA可包括总计5-100或10-60个核苷酸。反义miRNA还可包括总计为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。优选的，反义miRNA的序列可包括(a)至少5个与miRNA 5′端完全相同的核苷酸以及至少5-12个与所述miRNA 5′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸，或(b)至少5-12个与所述miRNA3′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸。

根据miR-6511a-3p序列设计出它的拮抗剂，拮抗剂是经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA，将拮抗剂转移到生物体后，能够高效阻断miR-6511a-3p的表达，下调miR-6511a-3p表达水平。

本发明提供了一种治疗绝经后骨质疏松的药物，所述药物包括包含miR-6511a-3p或其同源物的抑制剂。所述的miR-6511a-3p抑制剂能够抑制miR-6511a-3p的表达或者能够抑制miR-6511a-3p的功能。所述miR-6511a-3p抑制剂的抑制靶标不限于miR-6511a-3p本身，还包括miR-6511a-3p的上下游，例如：编码miR-6511a-3p的基因组序列，miR-6511a-3p靶基因、调控miR-6511a-3p的蛋白或者基因。

进一步，miR-6511a-3p抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。优选的，所述抑制剂是miR-6511a-3p或其同源物的反义寡核苷酸或拮抗剂。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。对于固体药物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服给药的固体药物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miR-6511a-3p基因产物的抑制剂。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01％-20％、优选按重量计算1％-10％的至少一种miR-6511a-3p基因产物的抑制剂和喷射剂。当需要时也可包含载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。

应当知道，本发明的miR-6511a-3p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与绝经后骨质疏松发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。其显示完整miR-6511a-3p核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-6511a-3p功能的条件下，对miR-6511a-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

在本发明中，一种代表性的miR-6511a-3p核酸序列如SEQ ID NO.1所示，CCUCACCAUCCCUUCUGCCUGC(SEQ ID NO.1)。

根据miR-6511a-3p的核酸序列，可以生成用于给定miRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素3H、32P、33P、14C或35S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。

通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miRNA基因转录产物水平的精确测量。

本发明所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断绝经后骨质疏松的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断绝经后骨质疏松的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断绝经后骨质疏松miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断绝经后骨质疏松的情况也包含在本发明的保护范围之内。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。

本发明的miR-6511a-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-6511a-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。本发明的可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

可以表达miR-6511a-3p的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miR-6511a-3p在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miR-6511a-3p初始miRNA的位置，在miR-6511a-3p初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miR-6511a-3p的DNA片段。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。

用于真核细胞的转染方法在本领域内熟知，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、粒子加速，磷酸钙沉淀和通过病毒载体介导的转染。

本发明所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制绝经后骨质疏松的药物进行组合施用。施用有效量的miR-6511a-3p基因产物或其分离的变体或生物活性片段，以便受试者能够从中获益。

miRNA基因产物的“生物活性片段”是指，具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，绝经后骨质疏松的细胞增殖过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。还可对用于脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有500至约40000道尔顿和优选约20000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺；聚丙烯酸；多元醇如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂。此外调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸如半乳糖醛酸、葡萄醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖；羧化多糖或低聚糖如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选的，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。

本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miR-6511a-3p基因产物的抑制剂。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miRNA基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。

在本发明中，术语“miRNA基因产物”可以是任何从miRNA基因转录得到的产物，包括初级转录产物、初级miRNA、pre-miRNA、miRNA*或成熟miRNA。

在本发明中，术语“治疗”是指改善与疾病或病症例如骨质疏松相关的症状，包括抑制作用，在一定程度上抑制疾病进展，其包括减缓以及完全抑制；减少疾病发作和/或症状的数量；在一定程度上缓解与疾病相关联的一种或多种症状；治疗后增加无病表现的时间长度；在治疗后的给定时间点减少死亡率；和/或治疗后无副作用。

术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。优选的，动物为人。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了一种绝经后骨质疏松的诊疗标记物miR-6511a-3p，通过检测标记物或其同源物的水平，可以判断受试者是否患有绝经后骨质疏松。

本发明提供了一种诊断绝经后骨质疏松的产品，为绝经后骨质疏松早期诊断的实现提供了可能性。

本发明提供了miR-6511a-3p可以作为绝经后骨质疏松的诊治靶标，指导相关药物的研发和筛选。

附图说明

图1是利用QPCR检测miR-6511a-3p在绝经后骨质疏松患者中的表达情况图；

图2是检测miR-6511a-3p对hMSCs成骨能力的影响图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与绝经后骨质疏松相关的miRNA的筛选

1、样本收集

各收集30例正常人和绝经后骨质疏松患者的血液样本。EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。取5例样本进行miRNA表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在全部30例样本中进行大样本验证实验。

排除标准：过早绝经者；如内分泌病、血液病、结缔组织病、药物和营养性疾病等引起的继发性骨质疏松症患者；代谢性骨病、慢性肝肾疾病等干扰骨代谢疾病者；近期服用雌激素、钙剂、二磷酸盐和维生素D等药物的患者；糖尿病患者；高血压患者；合并严重的心脑血管疾病者。

2、样本总RNA的提取

使用Invitrogen公司的血液RNA提取试剂盒提取总RNA。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA文库的构建

1)富集Small RNA

使用5μg-10μg RNA样品，然后用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA，选择18-30nt(14-30ssRNALadder Marker，TAKARA)条带回收。

2)加接头

5’连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA；选择40-60nt条带回收。

3’连接接头反应体系：反应条件：20℃，6h；用聚丙烯酰胺凝胶分离不同片段大小的RNA；选择60-80nt nt条带回收。

3)反转录

反应条件：65℃，10min；48℃，3min；42℃，1h；70℃，15min。

4)PCR扩增

反应条件：98℃,30s；12-15循环(98℃，10s，72℃，15s)；72℃，10min；4℃保存。

5)纯化PCR产物

用聚丙烯酰胺凝胶进行纯化，分离110bp左右的条带EB溶解，胶回收产物即为最终文库。

6)文库质检

使用Agilent 2100Bioanalyzer和QPCR对文库质量进行检测。

5、上机测序

使用HiSeq4000测序仪进行上机检测，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)用bowtie把reads map到基因组上。成熟miRNA和miRNA前体序列下载自miRBase，参考基因组为GRCh38；

3)用miRDeep2定量已知miRNA的表达；

4)在R环境下用DESeq2包比较两组的表达差异，当p值<0.05，|log2FC|>1时，认为基因显著差异表达。

7、结果：

测序结果显示，与正常人相比，绝经后骨质疏松患者中miR-6511a-3p的表达量显著升高。

实施例2 QPCR验证差异表达的miR-6511a-3p

1、对差异表达的miR-6511a-3p进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。

3、逆转录：

1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miR-6511a-3p的引物

正向引物：CCTCACCATCCCTTCTGCCTGC(SEQ ID NO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)

扩增U6 snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)

2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

	体积
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
正向引物	1μl
		反向引物	1μl
cDNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.5μl
总体积	25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6 snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与正常人的样本相比，绝经后骨质疏松血液中miR-6511a-3p的表达水平显著升高(P<0.05)，与高通量测序结果一致。

实施例3 miR-6511a-3p表达对成骨分化的影响

培养人的骨髓间充质干细胞(hMSCs)，将miR-6511a-3p的抑制物has-miR-6511a-3p mirVana^TM miRNA inhibit(美国life technologies)、模拟物has-miR-6511a-3pmirVana^TM miRNA mimic(美国life technologies)，借助载体lipofectamine RNAiMAXReagent转染hMSCs，观察miR-6511a-3p对hMSCs诱导分化为成骨样细胞的影响。

1、细胞的培养

人的骨髓间充质干细胞(hMSCs)以含以含10％胎牛血清和1％P/S的专用培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2、细胞转染

将细胞浓度按3×10⁵/孔接种到6孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，待细胞密度在70％时更换培养基，按照转染说明书进行转染培养，3天换液一次，成骨诱导14天后进行ARS(茜素红)染色。

将实验分成三组，每组设三个平行实验孔，具体分组情况如下：

A.对照组：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂；

B.模拟物组：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+miRNA mimic；

C.抑制物组：含10％胎牛血清的专用培养基+成骨诱导剂+miR-6511a-3p的抑制物。

3、ARS染色

细胞弃掉培养液，4％多聚甲醛固定15～20min，PBS液冲洗3遍。加入茜素红染液，于染色时加入培养板中，培养箱内放置15分钟，弃染色液，PBS液冲洗3遍，沥干，置于差像显微镜下拍照。在染色后的6孔板加入氯化十六烷基毗淀溶液(100mmol/L)，每孔500μL，等其充分溶解后按照一定比例取等量的溶解液，使用分光光度计测量各吸光度数值用于定量。

4、结果

结果如图2所示，加入miR-6511a-3p的抑制物组能够促进ARS阳性标记，加入miR-6511a-3p模拟物组则减少ARS阳性标记，说明miR-6511a-3p可以影响成骨能力，提示miR-6511a-3p的抑制物可以应用于骨质疏松疾病的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 固安博健生物技术有限公司

<120> 分子标志物在骨质疏松症中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccucaccauc ccuucugccu gc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcaccatc ccttctgcct gc 22

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (7)

1.检测miR-6511a-3p表达水平的试剂在制备诊断绝经后骨质疏松的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miR-6511a-3p的水平以诊断绝经后骨质疏松的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、阵列或试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括针对miR-6511a-3p的引物和/或探针。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，针对miR-6511a-3p的引物的序列如SEQID NO.2~3所示。

6.抑制miR-6511a-3p的试剂在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包含miR-6511a-3p的抑制剂。

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