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CN108969771A - 甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents

甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用 Download PDF

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CN108969771A CN201810892534.8A CN201810892534A CN108969771A CN 108969771 A CN108969771 A CN 108969771A CN 201810892534 A CN201810892534 A CN 201810892534A CN 108969771 A CN108969771 A CN 108969771A
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Abstract

本发明涉及一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用，该疫苗载体以两亲性三嵌段共聚物为材料，亲水内腔中载入OVA，IMQ载入疏水的膜层，DOTAP阳离子层嵌合MPLA，阳离子脂质外层吸附外层OVA；并引入具有活性基团的磷脂，将具有靶向作用的甘露糖配体通过共价键连接载聚合物囊泡表面PEG活性远端，集主动靶向肿瘤、共递送抗原和佐剂等功能于一体；具有粒径小、分散性好、抗原载药量高和良好生物相容性等特点，可促进抗原的摄取、DC的活化与成熟、抗原的交叉提呈、抗原的淋巴结迁移、淋巴细胞的活化、效应性T细胞的免疫反应、CD8+T和CD4+T细胞应答及记忆性T细胞免疫反应。

Description

甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡 及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤目前严重威胁人类健康，总体治愈率低于20％。目前临床上针对肿瘤的治疗方法主要包括手术切除、化疗和放疗。这些治疗手段往往聚焦于肿瘤局部病灶，都存在局限性，手术切除对发生转移的肿瘤治疗无效；化疗和放疗毒副作用大，严重损伤病人的免疫系统。肿瘤的治疗经历了传统治疗到靶向治疗，再到最新的细胞免疫治疗。肿瘤的免疫治疗已经成为“第四大”被证明能显著提高临床治疗效果的肿瘤治疗方法，是未来3-5年疾病治疗领域的热点，也是目前全球研究的热点，肿瘤的免疫治疗将会颠覆肿瘤治疗格局。通过增强机体的免疫系统(体液免疫和细胞免疫)，改变肿瘤生长的微环境抑制肿瘤生长，从而控制和杀灭肿瘤。给转移性晚期肿瘤患者带来福音，并被认为是目前唯一可能彻底治愈癌症的治疗手段。目前肿瘤免疫治疗主要3个方面着手：①作用于DC细胞抗原提呈阶段的DC治疗性肿瘤疫苗；②作用于T细胞活化效应阶段的T细胞过继疗法；③作用于免疫检查点信号传导的免疫检查点抑制剂。其中，DC治疗性肿瘤疫苗发展火热，制备DC疫苗主要分为两种方法，一种方法是体内抗原靶向DC，将抗原和佐剂与细胞表面受体配基如甘露糖或趋化因子等制成疫苗直接靶向体内DC，从而增强DC摄取抗原的能力；另一种方法是让 DC在体外荷载抗原和佐剂后回输到患者体内，产生保护性免疫反应，两种方法的最终目的都是活化抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞，最大程度发挥抗肿瘤效应。后者已经在肿瘤免疫治疗的临床研究中取得突破性进展，成为肿瘤免疫治疗的研究热点。DC疫苗安全性高，能够有效激发抗肿瘤免疫反应而无严重的毒副作用。
研究表明，甘露糖受体(MR)属于DC细胞和巨噬细胞膜表面受体，是 C2型动物凝集素超家族之一，可以识别末端为甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺的糖链，介导有效的抗原识别与摄取。未成熟的DC细胞表面高表达MR，因此甘露糖修饰对DC细胞具有特异的靶向性，从而提高对DC细胞的摄取和提呈效率。
靶向肿瘤的多肽及蛋白疫苗被认为能活化CD4+ T及CD8+ T细胞，但是此类疫苗不能产生足够的免疫应答强度从而限制了其抗肿瘤效率。目前，用TLR 配体对多肽疫苗产生佐剂效应成为该领域的研究热点。已有研究表明，TLR配体如TLR3配体、TLR4配体、TLR7/8配体和TLR9配体可以作为佐剂与多肽疫苗联用能够提高APC及NK细胞的活性，促进肿瘤的死亡。多种TLR配体可作用于DC，直接或间接促进DC的成熟和迁移，提高DC诱导的免疫应答。TLRs是宿主对抗病原体的第一道屏障。TLR7主要表达于抗原提呈细胞如浆细胞样DC，TLR8大部分表达于髓系细胞如髓系DC，可以诱导有效的Th1极化反应。TLRs家族信号机制的特征之一是利用胞质区的街头蛋白分子和激酶传导信号。胞内的TLR7/8与其对应的配体结合后，募集包含髓样分化蛋白88 (MyD88)的TIR结构域。MyD88与TLR7/8协同作用负责IL-1受体相关激酶家族成员的招募，活化了下游有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)和IκB激酶(IKK)复合体。MAPKs通过磷酸化激活了转录因子激活蛋白(AP)-1。IKK 复合体负责核转录因子(NF-κB)的核转录。AP-1和NF-κB协同控制促炎性细胞因子基因的表达。Toll样受体8激动剂合成的非核苷类异环咪唑喹琳胺类如咪喹莫特(R-837)、瑞喹莫德(R-848)、S-27609和鸟苷类似物(洛索立宾) 等，通过TLR咪喹莫特和瑞喹莫德激活NF-κB。目前，咪喹莫特被认为无直接杀伤病毒和肿瘤的能力，主要通过免疫调节机制，与树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞等的TLR 7结合，诱导IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等多种Th1型细胞因子的分泌，激活机体的天然免疫反应和获得性免疫反应。已有研究发现，如果将TLR7/8激动剂和TLR4激动剂联合使用，DCs会表现出更强的Th1极化作用。
囊泡(vesicle)是一种由两亲性分子自组装形成的具有类细胞膜双层结构的球形、椭球形或扁球形有序超分子聚集体。一般由合成表面活性剂自组装形成囊泡，由天然磷脂则成为脂质体。1999年，Discher等报道了经两亲性嵌段共聚物(PEG40-PEE37)通过自组装形成囊泡，被称为聚合物囊泡 (Polymersomes)。这种巨大囊泡被证明其硬度比磷脂大，在裂解前能维持很大张力，对水的渗透性比普通的磷脂双层膜小。后来人们用聚乙二醇-聚乳酸 (PEG-PLA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)制备了多种可控释的聚合物囊泡。由天然改性或合成的两亲性聚合物自组装成的聚合物囊泡相对于表面活性剂和脂质体等小分子囊泡，具有强度高、渗透性强、稳定性好和分子可设计性好等优点。聚合物囊泡有其独特的优势，主要包括：①具有亲水内腔和疏水双分子膜层，可以增溶水溶性成分(如蛋白质、多肽、DNA和RNA片段)、脂溶性药物(如紫杉醇)或同时递送水溶性和脂溶性药物。②聚合物囊泡具有与生物膜类似的双层膜结构，可以与生物屏障很好地兼容，是药物递送的优良载体。囊泡的双层膜结构可以延缓所载活性分子的释放，同时囊泡的亲水外壳延长了体内循环时间，提高了药物的体内生物利用度。③聚合物囊泡粒径一般在几百纳米左右，并且其表面亲水外壳具有空间稳定性，在体内具有长循环特性，可以利用利用肿瘤组织的EPR效应，避免了RES的吞噬，在病变部位积累，获得被动靶向效果。EPR的被动靶向使聚合物囊泡选择性富集在肿瘤组织，不仅提高了疗效，而且降低了毒副租用。④聚合物囊泡表面可以通过亲水链段稳定连接特异性配体，如叶酸、抗体和甘露糖等，从而增强其血液长循环特性并赋予囊泡主动靶向功能。⑤聚合物有优良的分子可设计性，选择不同的分子量、嵌段比例或共聚物结构的两亲性聚合物分子可以构建不同粒径、膜厚、渗透性和载药量的聚合物囊泡系统。近年来，作为一种软纳米材料的聚合物囊泡随着大分子自组装技术的发展，已经成为一种新型药物载体，吸引了研究者的广泛关注。聚合物囊泡重要的应用之一就是作为药物(包括小分子抗肿瘤药物、蛋白质和基因)的载体。与其他载体相比，聚合物囊泡更适合用来包载蛋白质。与脂质体比，聚合物囊泡壁膜的稳定性更高，可以更好保护蛋白质不被降解，并且具有较高的载药量。Li等用功能化的PEG-PTMC制备出新型可降解的具有离子化膜的聚合物囊泡，高效包载蛋白并实现胞内快速释放，在胞内蛋白递送载体方面具有潜力。聚合物囊泡在DC疫苗中发挥重要作用，近红外荧光发射聚合物囊泡可以用来标记体外细胞和追踪体内细胞，利用活体成像技术示踪体内DC来了解对肿瘤治疗的意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用，该疫苗载体将模式抗原有效包载在聚合物囊泡的亲水内腔中，将TLR7/8激动剂IMQ包载在疏水膜层，TLR4激动剂MPLA嵌聚合物囊泡表面的阳离子脂质中，通过静电作用将OVA吸附在聚合物囊泡外层，靶向基团通过DSPE-PEG-NH2连接在囊泡的外壳，粒径较小(<300nm)，可以被DC细胞有效吞噬，在细胞内有效积累，引起免疫反应。
本发明提供了一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，包括步骤：S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；S2：将初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；S3：去除二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜；将沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至薄膜中进行水化；S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。
S4中，还包括将功能磷脂溶于有机溶剂的步骤；并且S5中，将超声后的混合物和抗原溶液混合前还包括步骤：在超声后的混合物中加入糖类结构，然后加入三乙胺，搅拌反应预设时间。
优选地，功能磷脂为DSPE-PEG-NH2和/或DSPE-PEG-Mal；DSPE-PEG-N H2的PEG分子量为2000；糖类结构选自异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷、半乳糖、岩藻糖、葡聚糖和N-乙酰葡萄糖胺中的一种或多种的混合物；功能磷脂和糖类结构的摩尔比为1:1，三乙胺的体积和糖类结构的质量的比值为1μL:0.05m g；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和糖类结构的质量比为20mg:0. 05mg；搅拌反应的时间为2-4h。
S1中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂的质量比为 20mg:2mg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；免疫激动剂为TLR4、 TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL的质量和有机溶剂的体积的比值为20mg:1mL；抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
S2中，聚乙烯醇溶液优选为溶胀好的聚乙烯醇溶液，聚乙烯醇溶液的质量分数为2％，聚乙烯醇溶液的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；滴入的过程伴随搅拌，搅拌的转速为200rpm。
S3中，去除二级乳化液中的有机溶剂具体包括步骤：将二级乳化液持续搅拌1h使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；离心的次数为多次，优选为3次，离心的功率为23000rpm，离心的时间为30min。
S4中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂的质量比为1mg：10μg；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9 中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为 MPLA；阳离子磷脂DOTAP的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；阳离子磷脂DOTAP的质量和水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL；水化的时间为1h。
S5中，抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，也可以是蛋白质和多肽抗原等，包括乙肝表面抗原 (HBsAg)、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)、肿瘤相关抗原等中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；孵育的温度为4℃，孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，搅拌的速率为500rpm。
本发明还保护根据上述方法制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。本发明通过将免疫激动剂和模式抗原共载、靶向递送到树突状细胞，实现靶向免疫治疗的效果最大化。一方面，聚合物囊泡内外包载抗原可以实现外层抗原快速释放和包载的抗原缓慢释放，引起长期持续的免疫刺激。另一方面，通过共递送溶酶体膜Toll样受体7/8激动剂和细胞膜Toll样受体4受体激动剂，可以同时靶向溶酶体膜和细胞膜，实现DC靶向效果最大化，使免疫效果最优化，实现肿瘤的靶向免疫治疗。
本发明还保护共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明提供的甘露糖靶向共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡，是以两亲性三嵌段共聚物PCL-PEG-PCL聚合物为原料通过双乳化-溶剂挥发和薄膜超声分散法法制备出的聚合物囊泡为载体，模式抗原包载于亲水内腔，IMQ 载于疏水膜层，MPLA嵌入阳离子脂质，甘露糖靶向基团通过功能磷脂 DSPE-PEG-NH2共价修饰于囊泡表面；其中两亲性三嵌段共聚物PCL-PEG-PCL 的结构如下：
聚合物的分子量为10000-24000，优选为16000，其中，PEG亲水链段质量百分比>45％，DSPE-PEG-NH2的PEG分子量为2000。其中，m为160-180，n 为30-40，m、n均为整数，m，n分别代表PEG，PCL的结构单元数。本发明提供的甘露糖靶向共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的OVA载药量为118μg/mL，粒径在300nm以下。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明所用的两亲性载体材料具有良好的生物相容性和生物可降解性；制备的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡粒径小、分散度好，适合肌肉注射给药。
(2)本发明所设计的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡将抗原和免疫激动剂有效包载，具有较高的载药量和包封率。保护游离抗原和免疫激动剂的体内不稳定和易被清除的缺点。
(3)本发明制备中采用功能化磷脂DSPE-PEG-NH2，其DSPE疏水性较强能插入到囊泡疏水膜层，甘露糖与囊泡表面PEG远端氨基结合，能提高载药纳米囊泡的主动靶向性。
(4)本发明通过内外包载模式抗原OVA，既可以达到初始抗原快速释放又可以达到内部抗原缓慢释放引起长期免疫刺激的效果。
(5)本发明IMQ和MPLA共包载于聚合物囊泡内，通过不同的途径发挥协同作用，增强模式抗原的免疫原性，增强免疫效果。
(6)本发明提供的甘露糖靶向共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡能特异性靶向树突状细胞高表达的甘露糖受体，提高抗原的摄取和交叉提呈。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS的透射电镜图；
图2为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS中OVA结构稳定性的测定结果图；
图3为本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS在pH 7.4条件下的OVA 释放结果图；
图4为不同浓度本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS对树突状细胞的细胞毒性结果图；
图5为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS在DC内的定位结果图；
图6为DC对本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS的摄取结果图；
图7为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS对共刺激因子CD86和CD80的表达影响结果图；
图8为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS对DC成熟细胞因子诱导的检测结果图；
图9为采用本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS作为疫苗治疗后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，包括步骤：
S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下，用3mm探头、功率调为25％(16W)的超声波细胞破碎仪超声5min，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；
其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂的质量比为 20mg:2mg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；免疫激动剂为TLR4、 TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL的质量和有机溶剂的体积的比值为20mg：1mL；抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
S2：在200rpm的磁力搅拌条件下，将初级乳化液滴入溶胀好的质量分数为2％的聚乙烯醇溶液中，滴入时间为2min，然后用去离子水清洗，将清洗后的混合物在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声10min，得到二级乳化液；
其中，聚乙烯醇溶液的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；去离子水的体积和两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1mL:20mg。
S3：将二级乳化液在通风橱中持续磁力搅拌1h，使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；再23000rpm离心30min，重复离心3次，收集沉淀。
S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后在茄形瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，抽真空过夜去除残留的有机溶剂；将沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至薄膜中，室温水化1h；
其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂的质量比为1mg:10 μg；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9 中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为 MPLA；阳离子磷脂DOTAP的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；阳离子磷脂DOTAP的质量和水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL。
优选地，还包括将功能磷脂溶于有机溶剂的步骤；其中，功能磷脂为 DSPE-PEG-NH2和/或DSPE-PEG-Mal；DSPE-PEG-NH2的PEG分子量为2000。
S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声4min，将超声后的混合物和抗原溶液混合，在500rpm磁力搅拌、4℃条件下孵育1h，使抗原通过静电络合于聚合物囊泡表面，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡；
其中，抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；孵育的温度为4℃，孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，搅拌的速率为500rpm。
优选地，将超声后的混合物和抗原溶液混合前还包括步骤：在超声后的混合物中加入糖类结构，然后加入三乙胺，搅拌反应2-4h；其中，糖类结构选自异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷、半乳糖、岩藻糖、葡聚糖和N-乙酰葡萄糖胺中的一种或多种的混合物；功能磷脂和糖类结构的摩尔比为1:1，三乙胺的体积和糖类结构的质量的比值为1μL:0.05mg；两亲性三嵌段共聚物 PCL-b-PEG-b-PCL和糖类结构的质量比为20mg:0.05mg。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL4000-PEG8000-PCL4000和2mg TLR7/8 激动剂IMQ溶于1mL二氯甲烷中；充分溶解后在冰浴条件下，用3mm探头、功率调为25％(16W)的超声波细胞破碎仪超声5min，在超声过程中滴入200 μL 10mg/mL的OVA抗原溶液，得到初级乳化液。
S2：在200rpm的磁力搅拌条件下，将初级乳化液滴入10mL溶胀好的质量分数为2％的聚乙烯醇(PVA)溶液中，滴入时间为2min，然后用1mL去离子水清洗，将清洗后的混合物立即在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为 30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声10min，得到二级乳化液。
S3：将二级乳化液在通风橱中持续磁力搅拌1h，使有机溶剂挥发，然后抽真空1h除去残留有机溶剂；再23000rpm高速离心30min，重复离心3次，收集沉淀。
S4：将1mg阳离子磷脂DOTAP和10μg TLR4激动剂MPLA溶于4mL 二氯甲烷中，然后在茄形瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，抽真空过夜去除残留的有机溶剂；将沉淀用4mL水重悬，然后加至薄膜中，室温水化1h。
S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声4min，将超声后的混合物和1.5 mL 1mg/mL的OVA溶液混合，在500rpm磁力搅拌、4℃条件下孵育1h，使 OVA通过静电络合于聚合物囊泡表面，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)。
实施例2
本实施例提供一种甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL4000-PEG8000-PCL4000和2mg TLR7/8 激动剂IMQ溶于1mL二氯甲烷中；充分溶解后，在冰浴条件下，用3mm探头、功率调为25％(16W)的超声波细胞破碎仪超声5min，在超声过程中滴入200μL 10mg/mL的OVA抗原溶液，得到初级乳化液。
S2：在200rpm的磁力搅拌条件下，将初级乳化液滴入10mL溶胀好的质量分数为2％的聚乙烯醇(PVA)溶液中，滴入时间为2min，然后用1mL去离子水清洗，将清洗后的混合物立即在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为 30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声10min，得到二级乳化液。
S3：将二级乳化液在通风橱中持续磁力搅拌1h，使有机溶剂挥发，然后抽真空1h除去残留有机溶剂；再23000rpm高速离心30min，重复离心3次，收集沉淀。
S4：将1mg阳离子磷脂DOTAP和10μg TLR4激动剂MPLA、PEG分子量为2000的DSPE-PEG-NH2(DSPE-PEG-NH2与异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷的反应摩尔比为1:1)溶于4mL二氯甲烷中，然后在茄形瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，抽真空过夜去除残留的有机溶剂；将沉淀用4mL水重悬，然后加至薄膜中，室温水化1h。
S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声4min，将超声后的混合物加入 0.05mg异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷，然后加入1μL三乙胺，搅拌反应2-4h；
将反应后的混合物和1.5mL 1mg/mL的OVA溶液混合，在500rpm磁力搅拌、4℃条件下孵育1h，使OVA通过静电络合于聚合物囊泡表面，得到甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)。
实施例3
1、本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)的粒径、粒径分布、电位测定。
粒径、粒径分布、电位测定具体结果见表1。
2、本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)中OVA的载药量。
收集实施例1和实施例2中的S3离心(30min/次，23000rpm，去离子水重悬)3次后的上清，用Micro BCA蛋白浓度检测试剂盒检测未包载的模式抗原OVA的含量。将BSA标准品(2mg/mL)加入96孔板中，每个浓度设置3 个平行孔，用PBS进行倍比稀释，每孔最后留50μL标准品。只加入PBS的孔作为空白对照，将各组样品分别加入孔板种。将BCA检测A、B两种溶液按 1:50混合后，再加入待检样品中加入200μL混合液。将96孔板置于37℃孵箱中孵育30min后用酶标仪读取570nm处的OD值。根据标准品计算出聚合物囊泡中OVA载药量，结果见表1。
载药量(％)＝(加入模式抗原的总量-上清中游离模式抗原OVA的含量) /(聚合物囊泡的质量)×100％。
实验证明，对于IMO-PS，OVA的载药量是118.11μg/mg，对于靶向囊泡MAN-IMO-PS，OVA的载药量是118.86μg/mg，表明聚合物囊泡较高的OVA 包载能力，结果见表1。用本方法也可以制备出载其他蛋白(如单克隆抗体或热休克蛋白)的聚合物囊泡。
表1共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的表征
3、本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)的形貌结构观察。
将制得的MAN-IMO-PS用去离子水稀释到浓度为2mg/mL(材料浓度)。取稀释后的样品溶液滴于铜网超薄碳支持膜上。用滤纸轻轻吸去多余液体，室温下自然晾干，过夜。用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)观察聚合物囊泡并拍照。
图1为本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS的透射电镜图，图1结果表明制备的囊泡球形规整，表面光滑，表明所制备的囊泡粒径均匀。
4、本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)中OVA的稳定性考察。
用圆二色谱仪测定所制备的囊泡包埋OVA的二级结构，扫描范围为 190-250nm。
图2为实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS中OVA结构稳定性的测定结果图；图2A结果表明，游离OVA 和MAN-IMO-PS的圆二色光谱图曲线近乎一致，且最小吸光度值在208nm和 222nm处，与文献中报道一致，说明OVA中典型的二级结构(α-螺旋结构) 没有发生变化。
采用荧光光谱仪测定所制备的囊泡包埋的抗原的三级结构，激发波长为 280nm，发射波长定为300-450nm。
图2B结果表明，游离OVA和MAN-IMO-PS的蛋白质最大光吸收范围在 331-342nm处，此处为OVA肽段中色氨酸残基的强发射区。游离OVA和 MAN-IMO-PS在338nm处产生单一的发射峰，说明抗原经囊泡包埋后，其三级结构没有发生任何变化。
实施例4
将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)进行体外OVA释放考察。
将实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡 (IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)分成三组，每组2mL，置于分子量为300kDa的透析袋中并置于装有20mLPBS的50mL离心管中，该离心管放于37℃恒温箱中，并保持混合搅拌(120rpm)，防止囊泡的聚集与沉淀，在规定时间内取样并补充相同体积的新鲜PBS，取出的样品置于-40℃，然后用BCA蛋白试剂盒测定。在562nm处测得样品的吸光度值，测定并绘制抗原的释放曲线。
图3为本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS在pH 7.4条件下的OVA 释放图；图3表明OVA从囊泡中的体外释放存在两相，在初始释放阶段，24h 内OVA的释放约为20％，之后24天内释放缓慢，最后约80％的抗原从囊泡中释放。初始释放较快的原因可能是吸附在聚合物囊泡表面的OVA解吸附后扩散进入介质。随后释放变缓可能由于包载在聚合物囊泡亲水内腔中的OVA缓慢扩散出膜层。最初的抗原释放可以较快引起抗原特异性免疫反应，而后续的缓慢持续释放则产生长期免疫记忆反应。
实施例5
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)对BMDCs的细胞毒性检测。
将培养至第6天的BMDCs轻轻吹打，用DC培养基稀释至4×105cells/mL，接种于96孔板(100μL/孔)，每孔含培养基和细胞共100μL，每个样品设置6 个复孔，置于细胞培养箱中培养2h至贴壁后，向培养板中加入100μL含不同浓度(25μg/mL、50μg/mL)的载OVA囊泡(IMO-PS、MAN-IMO-PS)的培养基，阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基。在细胞培养箱(37℃，5％ CO2)分别培养24h和48h后，向每孔中加入20μL的MTS试剂和80μL新鲜培养基继续培养2-4h后用酶标仪测定490nm处的吸光度值。细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性组OD值－空白组 OD值)。
图4为不同浓度本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS对树突状细胞的细胞毒性结果图。图4表明当加入细胞的囊泡浓度为25μg/mL或50μg/mL时，细胞的增值率保持在100％，表明囊泡没有细胞毒性。该结果验证囊泡具有良好的生物相容性，这是体外体内研究的重要依据。
实施例6
将本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)进行细胞定位实验。
提前用聚赖氨酸(分子量150-300kD)包被激光共聚焦皿，有助于半悬浮的DCs贴壁便于后续实验与观察。具体步骤：在超净台中，在共聚焦皿中滴加 0.01％聚赖氨酸覆盖其底部，包被3-5h后弃掉聚赖氨酸，等风干后用培养DC 的培养基洗3次后待用。将培养至第6天的DCs以1×106cells/well的浓度接种至上述处理的共聚焦皿中，培养2h贴壁后，加入1mL O+I+M sol，IMO-PS和MAN-IMO-PS(其中抗原OVA浓度为25μg/mL)，在细胞培养箱中(37℃，5％ CO2)培养16h。用含有75nM Lyso Tracker-Red DND-99的RPMI 1640培养基代替原来的培养基继续培养2h，用1mL冰PBS洗2次，加入500μL DAPI染核20min,PBS洗涤2次，后重悬于600μL PBS。采用激光共聚焦扫描显微镜在63倍油镜下分别在激发波长为488nm和561nm下，采集500-550nm和 570-600nm波长区间内的用FITC和Lyso Tracker-Red DND-99分别标记的抗原和溶酶体。
图5为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS在DC内的定位结果图。图5结果表明，经过16小时的孵育，经游离FITC-OVA孵育的细胞中，FITC-OVA与溶酶体共定位，而IMO-PS和 MAN-IMO-PS组中的FITC-OVA存在于溶酶体和细胞质。其中一个很好的解释就是阳离子聚合物在酸性溶酶体中的质子海绵效应。这一逃逸现象会显著激活 CD4+和CD8+ T细胞。逃逸后的外源抗原可以被主要组织相容复合物(MHC I)激活CD8+ T细胞从而诱导细胞毒T淋巴细胞反应。并且MAN-IMO-PS比 IMO-PS组的FITC-OVA更多地出现在胞质中，说明MAN-IMO-PS组可以更好地从溶酶体中逃逸出来，具有提高CTL细胞免疫的潜能。与O+I+M sol相比，经过甘露糖修饰的聚合物囊泡更容易被DCs摄取，荧光强度及荧光亮度更具显著性。
实施例7
将本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)进行细胞摄取实验。
收集DC细胞，用移液枪缓慢吹打培养至第6天的DCs，离心(450g/min) 后用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×106细胞/mL。将上述细胞接种于12孔板中置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养2h使其贴壁。分别向细胞中加入浓度为25μg/mL的O+I+M sol，IMO-PS和MAN-IMO-PS，其中各组得到FITC荧光强度一致，置于细胞培养箱中孵育16h。轻轻吹打细胞，收集并离心(450g，5min)，用冰PBS清洗细胞2次，用 PerCP-anti-CD11c在4℃下染色30min后，再用上述PBS清洗2次后用0.6mL PBS重悬细胞，经细胞筛过滤后置于流式管中，用流式细胞分析仪测定DCs对囊泡包埋抗原的吞噬行为。
图6为DC对本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的MAN-IMO-PS的摄取结果图。图6结果表明与游离OVA相比， MAN-IMO-PS和IMO-PS显示更高的细胞摄取能力，推测其原因可能由于 MPLA是细胞表面受体，影响表面受体介导的内吞动力学，从而能够能有效促进抗原的内吞。DCs对MAN-IMO-PS和IMO-PS的吞噬效率分为为30.60％和18.16％，DCs对O+I+M sol的吞噬率为1.6％。MAN-IMO-PS组比O+I+M sol的吞噬效率高达15倍。MAN-IMO-PS与IMO-PS组相比，吞噬效率提高了1.68 倍。以上结果表明甘露糖修饰的聚合物囊泡与DC表面的甘露糖受体结合后发生吞噬，靶向性增加，摄取较多。表明MAN-IMO-PS对DCs具有较好的靶向性。
实施例8
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡 (IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)对DCs的活化和成熟的影响。
向培养至第6天的BMDCs中加O+I+M sol、IMO-PS和MAN-IMO-PS(模式抗原OVA浓度为25μg/mL，以及不加任何刺激的对照组)，继续在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后收集上层半贴壁的细胞进行表型分析。将各刺激培养组的DC收集至1.5mL离心管中，加入PBS(450g，5min)洗涤两次，用100μL RPMI1640培养基重悬，分别向离心管中加入PerCP-anti-CD11c (1.25μL)，PE-anti-CD40(2.5μL)以及FITC-anti-CD86(0.25μL)。在4℃下孵育30min后，用PBS清洗2次，用0.6mL上述PBS重悬于流式管中过200 目细胞筛，上流式细胞分析仪测定BMDCs表面共刺激因子CD86和CD80的表达水平。
图7为本发明实施例1制备得到的IMO-PS、本发明实施例2制备得到的 MAN-IMO-PS对共刺激因子CD86和CD80的表达影响结果图；图中，CD86 和CD80从左往右对应的依次是PBS、O+I+M sol、IMO-PS和MAN-IMO-PS。图7表明O+I+M sol组(26.96％)比培养基对照组(14.21％)在CD40的表达方面有适度提高。IMO-PS和MAN-IMO-PS组均显示较高CD40的表达，分别为37.06％和39.89％。CD86被认为是抗体反应需要的重要分子。上调CD86可以增强初始和第二T细胞反应。数据显示IMO-PS和MAN-IMO-PS组均增加了 CD86的表达。并且O+I+Msol组比对照组(25.05％)有略微提高。总之，IMO-PS 和MAN-IMO-PS组上调了CD40和CD86的表达约1.3-1.5倍，表明他们促进 DC成熟的能力，我们推测这可能因为他们高的抗原摄取能力和细胞内OVA的缓释。另一种解释可能因为MAN-IMO-PS与DC细胞表面或内部的TLR相互作用增加其免疫刺激能力。我们的结果表明，MAN-IMO-PS可以诱导DCs的成熟，并且有望促进T细胞的增殖和后续细胞免疫反应。
实施例9
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡 (IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)对DC成熟细胞因子诱导的检测。
向培养至第6天的BMDCs中加O+I+M sol、IMO-PS和MAN-IMO-PS(模式抗原OVA浓度为20μg/mL，以及不加任何刺激的对照组)，继续在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后收集细胞离心(450g，5min)去除细胞或大颗粒，并收集上清。上清置-80℃储存，随后用ELISA试剂盒通过绘制标准曲线可以计算BMDCs上清中细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的浓度。
图8结果表明，与MAN-IMO-PS孵育24h后比相同浓度的IMO-PS和 O+I+M sol产生更高的TNF-α。在IFN-γ的分泌水平方面，IMO-PS和MAN-IMO-PS比O+I+M sol要高。IMO-PS和MAN-IMO-PS显示与LPS相似的细胞因子表达增强模式。与O+I+M sol相比增加4-7倍。DCs分泌的这些Th1 型细胞因子表明聚合物囊泡可以促进DCs的成熟并且为有效激活CD8+ T细胞做准备。这些数据表明MAN-IMO-PS比IMO-PS和O+I+M sol组有更强的细胞因子诱导能力。
实施例10
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡 (IMO-PS)和本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(MAN-IMO-PS)诱导预防性肿瘤模型的预防效果。
C57BL/6小鼠被随机分为4组，每组8只，分别用PBS，O+I+M sol，IMO-PS 和MAN-IMO-PS以每周一次的间隔免疫三次。最后一次免疫后第7天，1×105个E.G7-OVA细胞通过皮下注射到免疫小鼠的右侧背部。肿瘤大小每隔一天量一次，肿瘤大小根据长×宽2/2计算得出。通过观察肿瘤出现的时间和测量肿瘤的体积来判断疫苗的保护性肿瘤免疫效果。
实验结果如图9A表明，PBS对照组在第6天开始出现可测量的肿瘤块，到第9天组内所有的小鼠均长出肿瘤，成瘤率为100％。O+I+M sol组肿瘤出现的时间为第7天。而在IMO-PS和MAN-IMO-PS组中肿瘤出现的时间分别为第9天和第21天。与预期相符的是，IMO-PS免疫组的小鼠全部长出肿瘤的时间为第17天。值得注意的是，MAN-IMO-PS免疫30天后tumor-free的百分比为25％并且维持到第92天。生存曲线分析(图9B)表明与PBS和O+I+M sol 免疫组相比，IMO-PS组延长了生存期。与PBS(d20)，O+I+M sol(d22)，IMO-PS (d26)组相比，MAN-IMO-PS免疫组延长中位生存期至d38。并且，在免疫后 92天对MAN-IMO-PS组的两只未长瘤小鼠皮下注射1×106个E.G7-OVA细胞观察至152天仍未出现肿瘤，表明MAN-IMO-PS具有预防肿瘤复发的长期免疫效应。
以上数据表明，MAN-IMO-PS不仅有效抑制了肿瘤的生长，而且延长了免疫小鼠的存活率。因此，MAN-IMO-PS具有较好的肿瘤保护作用，能够在体内诱导抗肿瘤免疫反应，可以显著抑制肿瘤的生长。证明本专利构建的甘露糖介导的靶向树突状细胞的MAN-IMO-PS作为肿瘤疫苗载体具有明确的肿瘤预防作用。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；
S2：将所述初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；
S3：去除所述二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；
S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成均匀薄膜；将所述沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至所述薄膜中进行水化；
S5：将所述水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S4中，还包括将功能磷脂溶于有机溶剂的步骤；
并且S5中，将超声后的混合物和抗原溶液混合前还包括步骤：在超声后的混合物中加入糖类结构，然后加入三乙胺，搅拌反应预设时间。
3.根据权利要求2所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
所述功能磷脂为DSPE-PEG-NH2和/或DSPE-PEG-Mal；所述DSPE-PEG-NH2的PEG分子量为2000；
所述糖类结构选自异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷、半乳糖、岩藻糖、葡聚糖和N-乙酰葡萄糖胺中的一种或多种的混合物；
所述功能磷脂和所述糖类结构的摩尔比为1:1，所述三乙胺的体积和所述糖类结构的质量的比值为1μL:0.05mg；
所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和所述糖类结构的质量比为20mg:0.05mg；
所述搅拌反应的时间为2-4h。
4.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S1中，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和所述免疫激动剂的质量比为20mg:2mg；
所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；
所述免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；
所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量和所述有机溶剂的体积的比值为20mg:1mL；
所述抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，所述抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；
所述抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，所述抗原和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
5.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S2中，所述聚乙烯醇溶液优选为溶胀好的聚乙烯醇溶液，所述聚乙烯醇溶液的质量分数为2％，所述聚乙烯醇溶液的体积和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；
所述滴入的过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为200rpm。
6.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S3中，去除所述二级乳化液中的有机溶剂具体包括步骤：将所述二级乳化液持续搅拌1h使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；
所述离心的次数为多次，优选为3次，所述离心的功率为23000rpm，所述离心的时间为30min。
7.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S4中，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；
所述阳离子磷脂DOTAP和所述免疫激动剂的质量比为1mg:10μg；
所述免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；
所述阳离子磷脂DOTAP的质量和所述有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；
所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；
所述阳离子磷脂DOTAP的质量和所述水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL；
所述水化的时间为1h。
8.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
S5中，所述抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，所述抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；
所述抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，所述抗原和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；
所述孵育的温度为4℃，所述孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，所述搅拌的速率为500rpm。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。
10.权利要求9所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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