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CN108938568A - 基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用 Download PDF

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CN108938568A
CN108938568A CN201810893172.4A CN201810893172A CN108938568A CN 108938568 A CN108938568 A CN 108938568A CN 201810893172 A CN201810893172 A CN 201810893172A CN 108938568 A CN108938568 A CN 108938568A
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Abstract

本发明涉及一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用，本发明以可共同负载模型抗原OVA及两种TLR激动剂(TLR7/8和TLR4)的磷脂杂化聚合物囊泡对DCs进行体外刺激，实现被DCs细胞的有效吞噬，通过内外共载OVA抗原的作用实现对DCs快速及长期免疫刺激作用，通过两种TLR激动剂的协同作用显著增强抗原刺激后的免疫应答；该共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡能有效促进DCs活化与成熟，提高交叉提呈水平，促进DC疫苗向次级淋巴器官的迁移，产生强有力的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤效应，从而有效杀伤肿瘤细胞实现DCs疫苗对肿瘤的免疫治疗。

Description

基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的 DCs疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells，DCs)存在于人外周血、皮肤、胸腺和淋巴器官，是人体功能最强大的专职性抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)。作为机体免疫反应的初始者，DCs在其表面表达MHC I和MHC II类抗原肽，通过激活CD4+Th和CD8+CTL细胞，控制免疫应答水平，而成为抗肿瘤免疫治疗的关键环节。
树突状细胞疫苗(DCs疫苗)是一类携带抗原信息的功能性树突状细胞，已经成为当今肿瘤生物治疗领域的研究热点，其优势在于能特异性诱导DCs成熟，将抗原信息提供给T细胞，使T细胞杀伤肿瘤细胞。DCs可以在体外培养后用于体内免疫治疗。体内实验表明，用肿瘤特异性蛋白或肿瘤细胞DNA或RNA等冲击致敏DCs并回输到动物体内可诱导产生较强的抗肿瘤免疫应答。在国外，DCs疫苗已经作为新的肿瘤治疗方式进入I/II期临床试验阶段，未观察到明显不良反应。然而，目前临床上用DCs疫苗治疗的患者只有约10-15％产生有效的免疫应答，因此近年来，研究者们正致力于激活DCs活性，提高其摄取抗原、被TLR激活并迁移到次级淋巴器官的能力。
DCs对T淋巴细胞的激活能力是DCs用于临床治疗的重要环节。Toll样受体(Tolllike receptors，TLR)是一类激活DCs的重要受体，通过识别病原微生物的特异性分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)来上调共刺激分子(CD86和CD80)，并产生促炎性细胞因子(IL-12、TNF-α和IFN-γ)。多种不同结构的细菌产物可以作为TLR配体或激动剂，如脂磷壁酸(TLR-2)与Poly I:C(TLR-3)、脂多糖(TLR4)、鞭毛蛋白(TLR-5)或细菌CpG DNA的配体(TLR-9)。配体与TLR结合引起细胞内信号级联反应，产生炎症因子。内体受体TLR7/8、TLR9与配体结合后被激活，与衔接蛋白MyD88(myeloiddifferentiationprimary response gene 88)相互作用后与信号复合物联合，导致IRF7，NF-κB和MAPK的激活。其中IRF的激活提高I型干扰素(IFN)的表达。MPLA与TLR4结合后，募集几种衔接蛋白(TRIF、TRIAP、TRAM和MyD88)到TIR胞内结构域(Toll/Interleukin-l receptor domain)，这些衔接蛋白随后参与MyD88和TRIF信号通路的激活。这些信号通路的激活会进一步促进DCs细胞的成熟与细胞因子的分泌。
近年来随着体外大量扩增DCs和制备DCs疫苗技术的日趋成熟，采用DCs疫苗进行抗肿瘤治疗已经成为当今肿瘤生物治疗领域的热点之一。但目前DCs疫苗有效免疫应答较低，主要原因在于：(1)目前的方法不能使DCs有效携带抗原及激活物，导致DCs缺乏交叉提呈，不能完全成熟；(2)由于对淋巴相关趋化因子的低迁移反应，DCs疫苗在体内的定位能力受到限制，只有5％或更少迁移到淋巴结。随着纳米技术的发展，采用纳米技术通过程序化设计可以将抗原与免疫激活剂共同递送到DCs细胞内，提高DCs对抗原及免疫激活剂的有效吞噬，同时通过免疫激活剂的协同作用而促进DCs成熟，并且具有淋巴结定向迁移作用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种，基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗及其制备方法与应用，用可共同负载模型抗原(Ovalbumin,OVA)及两种TLR激动剂(TLR7/8和TLR4)的磷脂杂化聚合物囊泡实现被DCs细胞的有效吞噬，通过内外共载OVA抗原的作用实现其对DCs快速及长期免疫刺激作用，通过两种TLR激动剂显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递，通过抗原与TLR激动剂的共同作用有效促进DCs活化与成熟，提高交叉提呈水平，促进DCs疫苗向次级淋巴器官的迁移，产生强有力的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤效应，从而有效杀伤肿瘤细胞实现DCs疫苗对肿瘤的免疫治疗。
本发明提供了一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，包括步骤：在培养贴壁后的BMDCs加入含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基，继续培养预设时间后，得到基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。
优选地，贴壁后的BMDCs的培养方包括步骤：收集培养至第6天的BMDCs，用新鲜的DC培养基稀释为4×106cells/mL，铺板于12孔培养板中，每孔含培养基和细胞共1mL，然后置于细胞培养箱中培养2h，得到贴壁后的BMDCs。
加入的含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基的体积为1mL；含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基中共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的浓度为4mg/mL；含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡采用的培养基为DC培养基；继续培养的温度为37℃，CO2的浓度为5％，继续培养的时间为16h。
共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法包括步骤：S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；S2：将初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；S3：去除二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜；将沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至薄膜中进行水化；S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。
S1中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂的质量比为20mg:2mg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量和有机溶剂的体积的比值为20mg:1mL；抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
S2中，聚乙烯醇溶液优选为溶胀好的聚乙烯醇溶液，聚乙烯醇溶液的质量分数为2％，聚乙烯醇溶液的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；滴入的过程伴随搅拌，搅拌的转速为200rpm。
S3中，去除二级乳化液中的有机溶剂具体包括步骤：将二级乳化液持续搅拌1h使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；离心的次数为多次，优选为3次，离心的功率为23000rpm，离心的时间为30min。
S4中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂的质量比为1mg:10μg；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；阳离子磷脂DOTAP的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；阳离子磷脂DOTAP的质量和水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL；水化的时间为1h。
S5中，抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，也可以是蛋白质和多肽抗原等，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)、肿瘤相关抗原等中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；孵育的温度为4℃，孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，搅拌的速率为500rpm。
本发明还保护根据上述方法制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。其具有亲水性内腔-疏水性膜层-磷脂外壳的结构，可将抗原同时高效包载在聚合物囊泡的亲水内腔中并通过静电作用吸附在聚合物囊泡的磷脂层外壳，将TLR7/8激动剂IMQ包载在疏水膜层中，TLR4激动剂MPLA嵌合在聚合物囊泡表面的磷脂层中，可高效活化树突状细胞，激活足够的免疫反应实现肿瘤的免疫治疗。
本发明还保护基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗在制备预防肿瘤和肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明所采用的可有效刺激DCs而制备出DCs疫苗的是一种同时高效包载模式抗原和免疫激动剂的新型疫苗递送载体，其具有磷脂外壳-疏水性膜层-亲水性内核结构，可将抗原同时包载在聚合物囊泡的亲水内腔中并通过静电作用吸附在聚合物囊泡的磷脂层外壳，聚合物囊泡内外包载抗原可以实现外层抗原快速释放而有效快速引起免疫反应，内核包载的抗原缓慢释放可引起长期持续的免疫刺激。同时，将TLR7/8激动剂IMQ包载在疏水膜层中，TLR4激动剂MPLA嵌合在聚合物囊泡表面的磷脂层中。所制备的新型疫苗递送载体粒径较小(<300nm)，可以被DCs有效吞噬，在细胞内有效积累，引起免疫反应。通过共递送溶酶体膜Toll样受体7/8激动剂和细胞膜Toll样受体4激动剂，可以同时靶向溶酶体膜和细胞膜，实现DCs靶向效果最大化，使免疫效果最优化，实现肿瘤的免疫治疗。
本发明采用该内外双载抗原和不同TLR免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡对未成熟DCs进行体外刺激，实现被DCs有效吞噬，在细胞内有效积累，通过外层抗原快速释放而有效快速引起免疫反应，内核包载的抗原缓慢释放可引起长期持续的免疫刺激。同时，通过两种TLR激动剂显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递，通过抗原与TLR激动剂的共同作用有效促进DCs活化与成熟，提高交叉提呈水平，促进DC疫苗向次级淋巴器官的迁移，产生强有力的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤效应，从而有效杀伤肿瘤细胞实现DCs疫苗对肿瘤的免疫治疗。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明采用共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡体外冲击DCs细胞，不仅可以保证抗原被有效摄取，还可以提供所需的共刺激信号，并且实现溶酶体逃逸，提高交叉提呈水平，有效诱导DCs活化和成熟。皮下注射该DCs疫苗后，可有效向次级淋巴结迁移，具有强大的激活CD8+T细胞和CD4+T细胞能力，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，对肿瘤有良好的预防和免疫治疗效果。
(2)本发明所设计的磷脂杂化聚合物囊泡具有亲水性内腔-疏水性膜层-磷脂外壳，可有效包载模型抗原OVA和两种免疫激动剂，具有较高的载药量和包封率，可保护游离抗原和免疫激动剂，克服其在体内不稳定和易被清除的缺点。
(3)本发明所设计的磷脂杂化聚合物囊泡可在亲水性内腔包载抗原，并在磷脂外壳通过静电吸附负载抗原，通过同时内外负载模式抗原OVA，既可以达到初始抗原快速释放引发快速免疫反应又可以达到内部抗原缓慢释放引起长期免疫刺激的效果。
(4)本发明所设计的磷脂杂化聚合物囊泡可在疏水性膜层包载TLR7/8激动剂IMQ，并同时在磷脂层嵌入TLR4激动剂MPLA，通过不同的途径发挥协同作用，增强模式抗原的免疫原性，有效激发抗肿瘤免疫应答。
(5)本发明所设计的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗可通过皮下注射、静脉注射、淋巴结周围注射等方式进行体内免疫治疗，其可引发特异性细胞免疫反应及体液免疫反应，具有良好的免疫治疗效果。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的表征图；
图2为DCs与本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)共孵育后的细胞活性和抗原的摄取结果图；
图3为DCs用本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)体外刺激后的活化与成熟结果图；
图4为DCs用本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)体外刺激后荷载抗原的DCs疫苗在体内的迁移结果图；
图5为小鼠注射本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗后的特异性抗原反应结果图；
图6为本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗体内诱导抗原特异性CTL反应结果图；
图7为本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗在预防性肿瘤模型中的应用图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗，制备方法包括步骤：
S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下，用3mm探头、功率调为25％(16W)的超声波细胞破碎仪超声5min，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；
其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂的质量比为20mg:2mg；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量和有机溶剂的体积的比值为20mg:1mL；抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
S2：在200rpm的磁力搅拌条件下，将初级乳化液滴入溶胀好的质量分数为2％的聚乙烯醇溶液中，滴入时间为2min，然后用去离子水清洗，将清洗后的混合物在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声10min，得到二级乳化液；
其中，聚乙烯醇溶液的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；去离子水的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1mL:20mg。
S3：将二级乳化液在通风橱中持续磁力搅拌1h，使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；再23000rpm离心30min，重复离心3次，收集沉淀。
S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后在茄形瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，抽真空过夜去除残留的有机溶剂；将沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至薄膜中，室温水化1h；
其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂的质量比为1mg：10μg；免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；阳离子磷脂DOTAP的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；阳离子磷脂DOTAP的质量和水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL。
S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声4min，将超声后的混合物和抗原溶液混合，在500rpm磁力搅拌、4℃条件下孵育1h，使抗原通过静电络合于聚合物囊泡表面，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡；
其中，抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；孵育的温度为4℃，孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，搅拌的速率为500rpm。
S6：收集培养至第6天的BMDCs，用新鲜的DC培养基稀释为4×106cells/mL，铺板于12孔培养板中，每孔含培养基和细胞共1mL，然后置于细胞培养箱中培养2h，得到贴壁后的BMDCs；
在培养贴壁后的BMDCs中加入1mL含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DC培养基，含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DC培养基中共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的浓度为4mg/mL，然后在CO2浓度为5％、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养16h，得到基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗，制备方法包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL4000-PEG8000-PCL4000和2mg TLR7/8激动剂IMQ溶于1mL二氯甲烷中；充分溶解后在冰浴条件下，用3mm探头、功率调为25％(16W)的超声波细胞破碎仪超声5min，在超声过程中滴入200μL 10mg/mL的OVA抗原溶液，得到初级乳化液。
S2：在200rpm的磁力搅拌条件下，将初级乳化液滴入10mL溶胀好的质量分数为2％的聚乙烯醇(PVA)溶液中，滴入时间为2min，然后用1mL去离子水清洗，将清洗后的混合物立即在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声10min，得到二级乳化液。
S3：将二级乳化液在通风橱中持续磁力搅拌1h，使有机溶剂挥发，然后抽真空1h除去残留有机溶剂；再23000rpm高速离心30min，重复离心3次，收集沉淀。
S4：将1mg阳离子磷脂DOTAP和10μg TLR4激动剂MPLA溶于4mL二氯甲烷中，然后在茄形瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，抽真空过夜去除残留的有机溶剂；将沉淀用4mL去离子水重悬，然后加至薄膜中，室温水化1h。
S5：将水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下，用5mm探头、功率调为30％(22W)的超声波细胞破碎仪超声4min，将超声后的混合物和1.5mL 1mg/mL的OVA溶液混合，在500rpm磁力搅拌、4℃条件下孵育1h，使OVA通过静电络合于聚合物囊泡表面，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)。
S6：收集培养至第6天的BMDCs，用新鲜的DC培养基稀释为4×106cells/mL，铺板于12孔培养板中，每孔含培养基和细胞共1mL，然后置于细胞培养箱中培养2h，得到贴壁后的BMDCs；
在培养贴壁后的BMDCs中加入1mL含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DC培养基，含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DC培养基中共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的浓度为4mg/mL，然后在CO2浓度为5％、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养16h，得到基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。
为了更好的表征基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的效果，本发明采用实施例1同样的方法，不加入IMQ和MPLA制备了无免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡(O-PS)，包载IMQ的磷脂杂化聚合物囊泡(IO-PS)和包载MPLA的磷脂杂化聚合物囊泡(MO-PS)。下面的实施例2-实施例11采用O-PS、IO-PS和MO-PS作为对照。
实施例2
1、本发明实施例1中制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)、O-PS、IO-PS和MO-PS的粒径、粒径分布、电位测定。
粒径、粒径分布、电位测定具体结果见表1。结果表明所制备的载抗原与TLR激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的平均粒径都在300nm以下，具有良好的负载模型抗原OVA的能力。
2、本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)中模型抗原OVA的包载量。
收集实施例1中的S3离心(30min/次，23000rpm，去离子水重悬)3次后的上清，用Micro BCA蛋白浓度检测试剂盒检测未包载的模式抗原OVA的含量。将BSA标准品(2mg/mL)加入96孔板中，每个浓度设置3个平行孔，用PBS进行倍比稀释，每孔最后留50μL标准品。只加入PBS的孔作为空白对照，将各组样品分别加入孔板种。将BCA检测A、B两种溶液按1:50混合后，在加入待检样品中加入200μL混合液。将96孔板置于37℃孵箱中孵育30min后用酶标仪读取570 562nm处的OD值。根据标准品计算出聚合物囊泡中OVA载药量。
OVA包载量(％)＝(加入模式抗原的总量-上清中游离模式抗原OVA的含量)/(磷脂杂化聚合物囊泡的质量)×100％。
结果证明，对于O-PS，OVA的包载量是116.07μg/mg，IO-PS中OVA包载量是116.95μg/mg，MO-PS中OVA包载量是123.09μg/mg，IMO-PS中OVA包载量是118.36μg/mg，表明聚合物囊泡较高的OVA包载能力，结果见表1。
表1不同磷脂杂化聚合物囊泡的表征
3、本发明实施例1制备得到的共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的形貌结构观察。
将制得的IMO-PS用去离子水稀释到浓度为2mg/mL(材料浓度)。取稀释后的样品溶液滴于铜网超薄碳支持膜上。用滤纸轻轻吸去多余液体，室温下自然晾干，过夜。用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察磷脂杂化聚合物囊泡的形貌并拍照。图1为本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的表征图；图1A为透射电镜图，结果表明制备的磷脂杂化聚合物囊泡球形规整且在其磷脂外壳表面能明显可见颗粒，表明外层OVA的成功吸附。
4、本发明实施例1制备得到的共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的体外OVA释放考察。
将实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)IMO-PS置于分子量为300kDa的透析袋中并置于装有20mL的PBS的50mL离心管中，该离心管放于37℃恒温箱中，并保持混合搅拌(120rpm)，在规定时间内取样并补充相同体积的新鲜PBS，取出的样品置于-40℃，然后用BCA蛋白试剂盒测定。在562nm处测得样品的吸光度值，测定并绘制抗原的释放曲线。
图1为本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的表征图；图1A为透射电镜图，表明具有明显的磷脂膜层；图1B为抗原OVA的体外释放，表明具有初始抗原快速释放及后续缓慢释放；图1C为近红外荧光图，表明抗原能有效包载在磷脂杂化聚合物囊泡中。样品1为PBS对照，样品2为Cy7荧光标记OVA(Cy7-OVA)，样品3为负载Cy7-OVA的磷脂杂化聚合物囊泡(O-PS)，样品4为共负载Cy7-OVA和TLR7/8激动剂IMQ的磷脂杂化聚合物囊泡(IO-PS)，样品5为共负载Cy7-OVA和TLR4激动剂MPLA的磷脂杂化聚合物囊泡(MO-PS)，样品5为共负载Cy7-OVA和2种TLR激动剂(IMQ与MPLA)的磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)。图1D为用样品1-6体外刺激DCs细胞后的近红外荧光图，表明抗原包载进磷脂杂化聚合物囊泡后能有效促进DCs对抗原的摄取，荧光强度随时间增强。
释放结果如图1B，表明OVA从囊泡中的体外释放存在两相，在初始释放阶段，24h内OVA的释放约为20％，之后28天内释放缓慢，最后约70％的抗原从囊泡中释放。初始释放较快的原因可能是吸附在聚合物囊泡表面的OVA解吸附后扩散进入介质。随后释放变缓可能由于包载在聚合物囊泡亲水内腔中的OVA缓慢扩散出膜层。最初的抗原释放可以较快引起抗原特异性免疫反应，而后续的缓慢持续释放则产生长期免疫记忆反应。
5、本发明实施例1制备得到的共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)及基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的体外荧光表征。
用近红外成像系统对制备的聚合物囊泡进行近红外荧光表征和体外浓度依赖的荧光成像，设定其激发光源为745nm，发射波长为774nm。将DCs以5×103cells/well的密度接种于96孔板中。随后用不同OVA浓度(25-200μg/mL)的各组载OVA囊泡与DCs在37℃下共孵育16h，用小动物活体成像系统获取NIR荧光图片。
共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的近红外荧光成像结果如图1C所示，O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS显示相同的荧光，而在PBS组中未检测到任何荧光信号。不同OVA浓度的聚合物囊泡与DCs孵育后的DCs疫苗的近红外荧光如图1D所示，结果显示抗原包载进磷脂杂化聚合物囊泡后能有效促进DCs对抗原的摄取，载OVA磷脂杂化聚合物囊泡的荧光强度随时间增强，其中500μg/mL组显示强烈的近红外荧光。
实施例3
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)对BMDCs的细胞毒性检测。
将培养至第6天的BMDCs轻轻吹打，用DC培养基稀释至4×105cells/mL，接种于96孔板(100μL/孔)，每孔含培养基和细胞共100μL，每个样品设置6个复孔，置与细胞培养箱中培养2h至贴壁后，向培养板中加入100μL含不同浓度(25μg/mL、50μg/mL)的装载OVA的囊泡的培养基，阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基。在细胞培养箱(37℃，5％CO2)分别培养24h和48h后，向每孔中加入20μL的MTS试剂和80μL新鲜培养基继续培养2-4h后用酶标仪测定490nm处的吸光度值。细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性组OD值－空白组OD值)。
图2为DCs与本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)共孵育后的细胞活性和抗原的摄取结果图；图2A和2B为MTS法分别在OVA浓度为25μg/mL和50μg/mL时测定的细胞存活率，表明所制备的磷脂杂化聚合物囊泡对DCs无细胞毒性；图2C为激光共聚焦观察的DCs对样品的吞噬图，表明磷脂杂化聚合物囊泡可有效促进DCs对抗原的摄取，并实现溶酶体逃逸；图2D为用流式细胞术测定的DCs对各样品的定量摄取，表明杂化聚合物囊泡促进了DCs对抗原的摄取。
细胞毒性结果见图2A和2B，表明当加入细胞的囊泡浓度为25μg/mL或50μg/mL时，细胞的增值率保持在100％，表明囊泡没有细胞毒性。该结果验证囊泡具有良好的生物相容性，这是体外体内研究的重要依据。
实施例4
BMDCs对本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)的摄取及细胞定位。
提前用聚赖氨酸(分子量150-300kD)包被激光共聚焦皿，有助于半悬浮的DCs贴壁便于后续实验与观察。具体步骤：在超净台中，在共聚焦皿中滴加0.01％聚赖氨酸覆盖其底部，包被3-5h后弃掉聚赖氨酸，等风干后用培养DC的培养基洗3次后待用。将培养至第6天的DCs以1×106cells/well的浓度接种至上述处理的共聚焦皿中，培养2h贴壁后，加入1mLfree OVA、O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS(其中抗原OVA浓度为25μg/mL)，在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养16h。用含有75nM Lyso Tracker-Red DND-99的RPMI 1640培养基代替原来的培养基继续培养2h，用1mL冰PBS洗2次，加入500μL DAPI染核20min，PBS洗涤2次，后重悬于600μL PBS。采用激光共聚焦扫描显微镜分别在激发波长为488nm和561nm下拍摄荧光图像。
进一步通过流式细胞术定量BMDCs对磷脂杂化聚合物囊泡的摄取。将培养至第6天的DCs以1×106细胞/mL接种于12孔板中，置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养2h使其贴壁。分别向细胞中加入OVA浓度为25μg/mL的FreeOVA、O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS，置于细胞培养箱中孵育16h。轻轻吹打细胞，收集并离心(450g，5min)，用冰PBS清洗细胞2次，用PerCP-anti-CD11c在4℃下染色30min后，再用上述PBS清洗2次后用0.6mLPBS重悬细胞，经细胞筛过滤后置于流式管中，用流式细胞分析仪测定DCs对囊泡包埋抗原的吞噬行为。
激光共聚焦结果(图2C)表明，经过16小时的孵育，用游离FITC-OVA孵育的DC细胞中，FITC-OVA与溶酶体共定位，表明游离OVA通过内含体/溶酶体途径进行抗原的降解和处理。而O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS组中的FITC-OVA部分与溶酶体共定位，部分FITC-OVA出现在细胞质中。抗原释放入胞有利于交叉提呈并且进一步激活CD4+T和CD8+T细胞。磷脂杂化聚合物囊泡中的阳离子DOTAP具有质子海绵效应，可以引起渗透性肿胀和溶酶体破裂，从而引起抗原的胞质释放，说明抗原用磷脂杂化聚合物囊泡包载后在DC细胞内可以通过MHC I或MHC II两种途径加工处理抗原，从而实现抗原的交叉提呈。
流式细胞术结果(图2D)表明，游离OVA显示低的抗原摄取效率。与游离OVA和O-PS相比，IO-PS，MO-PS和IMO-PS显示更高的递送效率。阳离子脂质杂化聚合物囊泡能显著增强抗原的摄取，这与文献中报道的阳离子脂质显著提高DC对抗原的摄取一致。IMO-PS与IO-PS和MO-PS相比显示出更高的细胞摄取效率，表明当囊泡中共递送双佐剂时能更有效促进抗原的内吞。
实施例5
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)对DC的活化和成熟作用。
向培养至第6天的BMDCs中加Free OVA、IO-PS、MO-PS和IMO-PS(模式抗原OVA浓度为20μg/mL)，以及不加任何刺激的对照组，继续在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后收集上层半贴壁的细胞进行表型分析。将各刺激培养组的DC收集至1.5mL离心管中，加入PBS洗涤两次，用100μL RPMI1640培养基重悬，分别向离心管中加入PerCP-anti-CD11c(1.25μL)，PE-anti-CD80(0.3μL)以及FITC-anti-CD86(0.25μL)。在4℃下孵育30min后，用PBS清洗2次，用0.6mL上述PBS重悬于流式管中过200目细胞筛，上流式细胞分析仪测定BMDCs表面共刺激因子CD86和CD80的表达水平。
图3为DCs用本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)体外刺激后的活化与成熟结果图；图中，CD86和CD80从左往右对应的依次是PBS、Free OVA、O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS。图3A与3B表明与游离OVA相比，载OVA磷脂杂化聚合物囊泡能有效提高CD80和CD86的表达，共负载TLR激动剂后进一步提高了DCs的活化；图3C表明载OVA磷脂杂化聚合物囊泡能有效促进抗原交叉提呈水平；图3D和图3E表明载OVA和TLR激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡能有效促进细胞因子TNF-α和INF-γ的分泌。
基于TLR的免疫佐剂能诱导DC表面共刺激分子如(CD80和CD86)的上调。CD80和CD86是评价基于DC的免疫反应的重要指标。图3A与3B显示与对照组(PBS和Free OVA)相比，O-PS显示微弱的上调。共负载抗原和TLR激动剂后，IO-PS，MO-PS和IMO-PS进一步提高了CD86的表达。MPLA与DC表面TLR4受体结合、IMQ与DC细胞内TLR7/8受体结合都能促进共刺激分子的表达，IMO-PS显著增强了DCs的活化，具有最高的CD80与CD86表达，说明两种TLR激动剂具有协同促进DC成熟的作用。
实施例6
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)促进DCs交叉提呈实验。
采用CD8+T细胞杂交瘤细胞系B3Z与DCs共孵育检测聚合物囊泡诱导BMDCs交叉提呈抗原OVA的肽段OVA257-264(SIINFEKL)。将第6天的BMDCs以5×104cells/well的密度接种至96孔圆底板中，培养2h待其贴壁后加入各组囊泡(抗原浓度均为25μg/mL)，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。未刺激的BMDCs作为阴性对照。培养时间结束后离心(1000rpm，5min)，用DPBS润洗。将B3Z细胞以1×105cells/well的浓度接种至润洗完的BMDCs中再孵育24h。再经过离心(1500rpm，5min)，DPBS小心润洗后用150μL CPRG底物缓冲液(含有0.1％Triton-X 100，9mmol/L MgCl2，100μM巯基乙醇，0.15％mmol/L氯酚红-β-D-半乳糖苷的0.01mol/L PBS缓冲液)，在37℃中避光孵育至充分的颜色反应。100μL样品转移至96孔平板中，在波长570nm和620nm处分别用酶标检测。
外来抗原经交叉提呈可以激活CD8+T细胞然后产生抗肿瘤免疫反应。许多研究表明同时递送抗原和TLR配体能提高Toll样受体依赖的抗原交叉提呈。CD8+T细胞杂交瘤细胞系B3Z与DCs共孵育可被用来检测DCs和OVA特异性的T细胞之间的交叉提呈。图3C表明与游离OVA相比，载OVA磷脂杂化聚合物囊泡增加了MHC I抗原交叉提呈，说明载OVA磷脂杂化聚合物囊泡优于游离OVA，这可能归因于载OVA聚合物囊泡被DCs的吞噬效率更高。数据表明，IMO-PS显著提高了OVA的抗原，IMO-PS的交叉提呈水平比游离OVA，O-PS，IO-PS和MO-PS分别提高了460％，148％，106％和106％。与IO-PS和MO-PS相比，IMO-PS的抗原交叉提呈效率更高，可能归因于免疫激动剂IMQ和MPLA的联合作用。
实施例7
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)对DC成熟细胞因子诱导的检测。
向培养至第6天的BMDCs中加Free OVA、O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS(模式抗原OVA浓度为20μg/mL)，不加任何刺激的作为对照组，继续在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后收集细胞离心(450g，5min)去除细胞或大颗粒，并收集上清。上清置-80℃储存，随后用ELISA试剂盒通过绘制标准曲线可以计算BMDCs上清中细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的浓度。
图3D和3E结果表明，IO-PS可以引起DC的活化并促进炎症因子TNF-α和IFN-γ，这归因于MyD88途径和NF-κB信号分子。当单载TLR7/8或TLR4只能引起较低的IFN-γ。用IMO-PS处理的DC可以引起最高的TNF-α。与O-PS相比，IO-PS、MO-PS和IMO-PS分别提高5.5倍、8倍和9倍。在IFN-γ方面，IO-PS、MO-PS和IMO-PS分别提高2倍、2.4倍和10倍。说明载OVA和TLR激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡能有效促进细胞因子TNF-α和INF-γ的分泌。
实施例8
本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)体外刺激DCs后荷载抗原的DCs疫苗在体内的迁移情况检测。
本发明采用体内DC活体追踪法检测DC疫苗的迁移能力。2×106个DC用Free OVA，O-PS和IMO-PS(OVA浓度为100μg/mL)孵育过夜后足底皮下注射到提前24h用30ng TNF-α处理的C57BL/6小鼠中。注射9h和24h后，小鼠用水合氯醛麻醉后用小动物活体成像系统进行观察。注射36h后解剖小鼠获得腿窝淋巴结，用Ex＝745nm，Em＝774nm的波长进行成像。
DC疫苗通过淋巴血管从免疫部位迁移到淋巴结对基于DC的免疫治疗至关重要。当抗原刺激的DC迁移到回流淋巴结中并与抗原特异性T细胞相互作用将会引起抗原特异性免疫反应。
图4为DCs用本发明实施例1制备得到的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡(IMO-PS)体外刺激后荷载抗原的DCs疫苗在体内的迁移结果图；图4A为小鼠足垫皮下注射DCs疫苗后的近红外荧光图，表明用共负载抗原与TLR激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡体外刺激制备的DCs疫苗被能有效迁移到次级淋巴结；图4B为次级淋巴结的近红外荧光图，表明IMO-PS能有效促进DCs向次级淋巴结迁移。
DC疫苗的活体体内迁移结果如图4A所示，Free OVA和O-PS处理的DC疫苗组在注射3h显示弱的荧光强度，并在24h显示快速的荧光清除；而IMO-PS处理的DC组注射3h后出现在腿窝淋巴结并在24h内维持较强的荧光强度，表明IMO-PS处理的DC通过淋巴血管逐渐从注射部位迁移到回流淋巴结，从而可有效诱导免疫反应。为了进一步分析，解剖腿窝淋巴结并用活体成像系统分析，发现IMO-PS处理的DC能够诱导最有效的淋巴结迁移从而产生最强的NIR信号，然而用Free OVA和O-PS处理的未成熟的DC只显示较弱的荧光信号(图4B)。
实施例9
本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的体内抗原特异性免疫反应。
DC(2×106cells/50μL)与Free OVA、O-PS、IO-PS、MO-PS和IMO-PS(模式抗原OVA浓度为20μg/mL)共孵育16h后通过皮下注射到C57BL/6小鼠体内。7天后分离脾脏，研磨获得脾细胞，用1μg/ml SIINFEKL多肽体外刺激96h后，用蛋白转运抑制剂再刺激5h后收集细胞采用流式细胞术分析产生IFN-γ的CD8+T和CD4+T细胞。
共递送抗原和佐剂到同一DC被报道能引起强烈的CD8+T细胞免疫。树突状细胞的TLR激活被认为能激活初始抗原特异性CD4+Th细胞，从而诱导抗体反应。
图5为小鼠注射本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗后的特异性抗原反应结果图；图5A和5B分别为流式细胞术测定的产生INF-γ的抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞图谱；图5C和5D为定量分析结果，表明共负载抗原和TLR激动剂后刺激制备的DCs疫苗具有强大的细胞免疫效果，IMO-PS刺激制备的DCs疫苗具有最强的免疫效果。
如图5A与5C所示，对于产生INF-γ的抗原特异性CD4+T细胞(IFN-γ+CD4+T细胞)，IMO-PS处理的DC组细胞比例为1.68±0.12％。IO-PS和MO-PS处理的DC细胞组为1.22±0.14％和1.33±0.10％，而PBS、Free OVA和O-PS处理的DC细胞组分别为0.523±0.120％，0.530±0.140％和0.548±0.110％。对于产生INF-γ的抗原特异性CD8+T细胞(IFN-γ+CD8+T细胞)，IMO-PS处理的DC免疫后的小鼠脾细胞中IFN-γ+CD8+T细胞比例为2.440±0.110％，IO-PS和MO-PS处理的DC免疫小鼠脾细胞中IFN-γ+CD8+T细胞分别是1.25±0.130％和1.290±0.110％。由PBS、Free OVA和O-PS处理的DC免疫的小鼠脾细胞中IFN-γ+CD8+T细胞数显著降低，分别为0.677±0.120％，0.693±0.140％和0.736±0.110％。表明共负载抗原和TLR激动剂后刺激制备的DCs疫苗显著提高DC诱导抗原特异性的CD8+T和CD4+T细胞反应，IMO-PS刺激制备的DCs疫苗具有最强的免疫效果。
实施例10
本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗体内诱导抗原特异性CTL反应检测。
EG7-OVA细胞系可以稳定转染OVA的cDNA并产生H-2Kb限制的CTL表位的OVA，可用于评价小鼠细胞毒T淋巴细胞的MHC I反应。将50μL 2×106cells DC疫苗皮下注射到C57BL/6小鼠中，7天后脾细胞分离并用含10μg/mLOVA多肽和10U/mL的IL-2刺激72h来获得CTL效应细胞。用Calcein-AM荧光染料标记EG7-OVA靶细胞，并通过Calcein释放实验检测细胞毒性T淋巴细胞活性。具体如下：靶细胞(1×106)用5μM calcein-AM在37℃下染色20min，这些效应细胞和靶细胞用PBS洗两次后以适当的效应细胞：靶细胞比例铺在圆形96孔板中。在37℃中孵育4h后，收集100μL细胞上清转移到新板中。用酶标仪测定Ex＝485nm，Em＝530nm处的吸光度。肿瘤特异性的裂解百分比(％)＝[(实验释放组-自发释放组)/(最大释放组-自发释放组)]×100％。最大裂解组由3％Triton X-100获得。
细胞毒T淋巴细胞作为一种T淋巴细胞，当结合到抗原特异性MHC I分子上后可以被激活通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤感染的细胞或肿瘤细胞。基于负载抗原的DC疫苗被认为能直接引起特异性CTL反应。为了确定共负载抗原与TLR激动剂聚合物囊泡诱导的OVA特异性CTL反应，我们用不同杂化磷脂聚合物囊泡处理的DC疫苗免疫小鼠。7天后，分离出脾细胞并用含有OVA多肽和IL-2的1640培养基刺激72h。用Calcein-AM标记EG7-OVA肿瘤细胞来检测细胞毒性。
图6为本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗体内诱导抗原特异性CTL反应结果图；图6A为不同效应细胞与靶细胞比例下EG7-OVA肿瘤细胞的特异性裂解百分比。图6B为通过将各DCs疫苗刺激后小鼠脾细胞又重新用OVA体外刺激后与EG7-OVA肿瘤细胞孵育后测定的CTL介导的免疫反应。
如图6A所示，当效应细胞与靶细胞的比例增加时，肿瘤细胞的裂解百分比逐渐增加。用IMO-PS处理的DCs疫苗免疫小鼠的脾细胞能有效引起CD8+T细胞介导的肿瘤细胞裂解。IMO-PS处理的DCs疫苗组引起的CTL增强反应归因于增强的MHC I提呈和提高的炎症因子IFN-γ的分泌。另一方面，用FreeOVA和O-PS处理的DC疫苗免疫组不能诱导有效的肿瘤特异性CTL反应。如6B表明，当E:T比值为40:1时，在荷IMO-PS的DCs疫苗组中观察到由CTLs诱导的对EG7-OVA肿瘤细胞具有最强的细胞毒性。
实施例11
本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗在预防性肿瘤模型中的免疫效果检测。
图7为本发明实施例1制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗在预防性肿瘤模型中的应用图；小鼠用DC疫苗皮下免疫一周后，进行肿瘤攻击。图7A为免疫方案；图7B为无瘤百分比曲线；图7C为生存率曲线；图7D为肿瘤第二次攻击后的无瘤百分比曲线。表明与游离抗原刺激制备的DCs疫苗相比，用共负载抗原和TLR激动剂后刺激制备的DCs疫苗具有良好的免疫预防效果，其中IMO-PS刺激制备的DCs疫苗具有最强的免疫预防效果。
为了评价各种荷抗原DC疫苗的预防效应，按照图7A的免疫流程用FreeOVA，O-PS，IO-PS，MO-PS，IMO-PS或PBS(对照组)分别免疫小鼠。免疫7天后将EG7-OVA肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6雌性小鼠中。每隔2天测量小鼠的肿瘤大小根据(长×宽2)/2来计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到3000mm3，小鼠被处死。
小鼠无瘤百分比曲线如图7B所示，只注射DC组在第4天全部出现肿瘤，而Free OVA和O-PS组在12天内全部长出肿瘤。相反地，IMO-PS处理的DCs疫苗免疫组在免疫54天仍然维持有37.5％的小鼠无瘤百分比，而IO-PS和MO-PS的无瘤百分比保持在25％。小鼠生存曲线如图7C所示，肿瘤接种54天后IMO-PS处理的DCs疫苗免疫组的生存率为37.5％，IO-PS和MO-PS处理的DC免疫组只有25％。结果表明IMO-PS能引起强烈的预防性抗肿瘤免疫。在接种后155天对未长肿瘤的IO-PS，MO-PS和IMO-PS进行再一次攻击，发现小鼠生存率为100％(图7D)，显示预防肿瘤复发的长期免疫记忆效果。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：
在培养贴壁后的BMDCs中加入含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基，继续培养预设时间后，得到所述基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。
2.根据权利要求1所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
所述贴壁后的BMDCs的培养方包括步骤：收集培养至第6天的BMDCs，用新鲜的DC培养基稀释为4×106cells/mL，铺板于12孔培养板中，每孔含培养基和细胞共1mL，然后置于细胞培养箱中培养2h，得到贴壁后的BMDCs；
加入的含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基的体积为1mL；所述含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的培养基中共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的浓度为4mg/mL；所述含共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡采用的培养基为DC培养基；
所述继续培养的温度为37℃，CO2的浓度为5％，所述继续培养的时间为16h。
3.根据权利要求1所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于，
所述共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法包括步骤：
S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；
S2：将所述初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；
S3：去除所述二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；
S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成均匀薄膜；将所述沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至所述薄膜中进行水化；
S5：将所述水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。
4.根据权利要求3所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
S1中，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和所述免疫激动剂的质量比为20mg:2mg；
所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；
所述免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；
所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量和所述有机溶剂的体积的比值为20mg:1mL；
所述抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，所述抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；
所述抗原溶液中抗原的浓度为10mg/mL，所述抗原和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为2mg:20mg。
5.根据权利要求3所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
S2中，所述聚乙烯醇溶液优选为溶胀好的聚乙烯醇溶液，所述聚乙烯醇溶液的质量分数为2％，所述聚乙烯醇溶液的体积和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为10mL:20mg；
所述滴入的过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为200rpm。
6.根据权利要求3所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
S3中，去除所述二级乳化液中的有机溶剂具体包括步骤：将所述二级乳化液持续搅拌1h使有机溶剂挥发，然后抽真空0.5-1h除去残留有机溶剂；
所述离心的次数为多次，优选为3次，所述离心的功率为23000rpm，所述离心的时间为30min。
7.根据权利要求3所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
S4中，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg:1mg；
所述阳离子磷脂DOTAP和所述免疫激动剂的质量比为1mg:10μg；
所述免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；
所述阳离子磷脂DOTAP的质量和所述有机溶剂的体积的比值为1mg:4mL；
所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；
所述阳离子磷脂DOTAP的质量和所述水和/或PBS溶液的体积的比值为1mg:4mL；
所述水化的时间为1h。
8.根据权利要求3所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗的制备方法，其特征在于：
S5中，所述抗原溶液中的抗原为多肽或糖肽抗原，所述抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；
所述抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，所述抗原和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为1.5mg:20mg；
所述孵育的温度为4℃，所述孵育的时间为1h，孵育过程伴随搅拌，所述搅拌的速率为500rpm。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗。
10.权利要求9所述的基于共包载抗原和双免疫激动剂的磷脂杂化聚合物囊泡的DCs疫苗在制备预防肿瘤和肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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