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CN108949919B - 一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法 - Google Patents

一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。通过杂交链式反应对目标核酸序列进行信号放大，得到HCR反应产物；将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的HCR反应产物进行混合，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式。本发明的检测方法结合了聚集诱导发光效应和表面等离子体色度分析法，具有简便、实时、免纯化处理等优势。

Description

一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测 方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。
背景技术
随着近代分子诊断方法的发展，核酸分子检测/分析在肿瘤诊断，病原微生物鉴定及遗传性疾病筛查领域获得了越来越多的关注。最近发展起来的非侵入式的液体活检方法表明，血液中的核酸片段可以提供胎儿的基因、肿瘤的复发情况及感染疾病的种类信息。然而，传统的核酸检测方法，如聚合酶链式反应(PCR)方法，电化学分析及Southern/Northern印迹杂交方法具有成本高、操作复杂、响应速度慢等问题。发展新颖的、易操作、响应灵敏的核酸检测分析方法具有重要的意义。
即时检测方法(Point-of-care testing，POCT)是一种便携、原位实时分析的检测方法。目前为止，许多精巧的POCT方法被设计出来，通常，构建POCT是基于以下的材料，包括：金属纳米离子、碳纳米管、磁性纳米粒子、氧化石墨烯、量子点及有机发光团等。比如：基于金纳米粒子的色度分析法具有很高的检测灵敏度，同时产生的信号可以直接通过肉眼进行观测。但是，这种基于溶液色度改变的检测方法并不支持定量的分析。相比之下，有机发光团由于其可调控的发光及化学性质，被广泛应用于定量化荧光分析中。将两种检测方法结合起来就可以实现通过一次测试便获得两套互补的信号。然而，对于传统的荧光分子而言，往往需要对生物分子进行化学修饰及纯化分离。这大大增加了操作难度及成本。因此，发展一种无标记、免洗的荧光分子具有重要的意义。
聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)是一类反常的光物理现象。具体表现为具有螺旋状的荧光分子在分子状态下发出微弱的荧光。而当分发生聚集或运动受到限制时可以发出强烈的荧光。基于AIE分子的在游离状态下的低背景信号，一系列点亮型的生物探针被开发出来。基于此，AIE分子在荧光分析检测中具有重要的应用前景。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。
本发明的另一目的在于提供上述核酸检测方法在离体血液中循环肿瘤核酸或病原微生物基因片段的即时检测中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，包括如下步骤：
(1)通过杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)对目标核酸序列进行信号放大，超滤除去未反应的短片段核酸，得到HCR反应产物；
(2)将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的步骤(1)的HCR反应产物进行混合，得到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；
(3)将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到步骤(2)中吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；
所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式：
Figure BDA0001733197020000021
其中，R1～R4为独立的C1-18的烷基或烷氧基；R5～R16为独立的氢或C1-18的烷基；X为卤素基团。优选地，所述的烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基或叔丁基。(式(I)结构通式化合物参考文献制备，Chem.Eur.J.2010,16,1232–1245)。
进一步地，所述的目标核酸序列为DNA或RNA序列。
优选地，所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(II)所示的结构式：
Figure BDA0001733197020000031
优选地，步骤(1)中所述超滤是指用尺寸为3～100kDa的超滤管进行超滤，超滤次数为1～5次，每次超滤结束后，通过超声处理20s～10min，使粘附在管壁上的核酸充分脱落。
优选地，步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子的尺寸为5～100nm，表面修饰的DNA数目为10～10000条，每条DNA的碱基个数为5～100个。
优选地，步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子加入的浓度以金纳米粒子计算为1～50nM。
上述核酸检测方法在离体血液中循环肿瘤核酸或病原微生物基因片段的即时检测中的应用。
相对于现有技术，本发明的检测方法具有如下优点及有益效果：
本发明的检测方法结合了聚集诱导发光效应和表面等离子体色度分析法，具有简便、实时、免化学标记、免纯化处理、背景信号低、成本低，可以产生双模式信号的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤(2)得到的不同浓度HCR产物的凝胶电泳结果图(a)和HCR产物的原子力显微镜表征图(b)。
图2为本发明实施例1步骤(3)中将HCR产物与TA-TPE相互作用后的研究结果图：a、TA-TPE与HCR产物作用前后的荧光强度变化的比较图；b、TA-TPE与不同DNA结构作用之后荧光强度的变化图；c、不同浓度的TA-TPE与HCR产物作用的荧光强度分析结果图。
图3为本发明实施例1中将TA-TPE与不同浓度目标DNA(目标DNA浓度分别为0、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱图(a)及根据荧光强度与核酸浓度所绘制的标准曲线(b)。
图4为本发明实施例1中将TA-TPE与步骤(4)中各个不同DNA链序列相互作用后的荧光检测结果图。
图5为本发明实施例2中不同摩尔比的巯基DNA修饰的金纳米粒子溶液与不同浓度的TA-TPE混合后的溶液颜色变化图。
图6为本发明实施例2中两组颜色差距较大的纳米金溶液(TA-TPE浓度分别为5μmol和1μmol，金纳米粒子与DNA的摩尔浓度比为1:100(适中)的透射电镜表征结果图。
图7为本发明实施例2中选择适中浓度的巯基DNA修饰的金纳米粒子与不同浓度TA-TPE作用后，加入到不同浓度的目标DNA的HCR产物中所得溶液颜色的变化和溶液的吸收光谱图。
图8为本发明实施例3中将TA-TPE与不同浓度目标RNA(目标RNA浓度分别为0、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱图(a)和根据荧光强度与microRNA浓度得到的标准曲线(b)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)H1和H2DNA首先溶解于1×PBS缓冲液中，然后分别加热至95℃，恒温5min，然后降低至室温并保持1h。接着将H1和H2混合备用。H1和H2DNA的序列分别为：
DNA-H1：ttaacccacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtg(SEQ ID No.1)；
DNA-H2：agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaatcctagactactttg(SEQ ID No.2)。
(2)不同浓度的目标DNA(0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM和1μM)与H1和H2进行混合，室温反应2h，得到HCR反应产物。通过超滤处理HCR产物以降低背景信号。具体步骤为：HCR产物首先通过1×PBS进行稀释，稀释倍数为4，然后将稀释液加入到100kDa(购买自Millipore)的超滤管中。样品经过离心处理(10000r/min，2min)，然后超声处理30s。重复这一步骤2遍。然后通过凝胶电泳及原子力显微镜进行产物的分析表征。目标DNA的序列为：agtctaggattcggcgtgggttaa(SEQ ID No.3)。
(3)将水溶性聚集诱导发光分子(TA-TPE)(Chem.Eur.J.2010,16,1232–1245)加入到步骤(2)的HCR产物中，测试其荧光光谱曲线。TA-TPE的分子结构如下：
Figure BDA0001733197020000051
(4)针对碱基错配的检测。目标DNA链上不同位置进行单碱基的删减、增添及突变，相同条件下比较不同DNA系列引发HCR反应的效率：各个DNA链序列如下：
删除：agtctaggattcg_cgtgggttaa(SEQ ID No.4)；(下划线表示删除的位置)；
插入：agtctaggattcaggcgtgggttaa(SEQ ID No.5)；
随机：tccatgacgttcctgacgttgcat(SEQ ID No.6)；
错配1：agtctaggattaggcgtgggttaa(SEQ ID No.7)；
错配2：agtctaagattcggcgtgggttaa(SEQ ID No.8)；
错配3：agtctaggattcggcgtgagttaa(SEQ ID No.9)；
对照：不加入任何DNA。
本实施例步骤(2)中不同浓度目标DNA的HCR产物凝胶电泳及原子力显微镜数据如图1所示。a、不同浓度目标DNA的HCR产物的凝胶电泳结果图，从左至右，目标DNA序列浓度分别为0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM和1μM，最右边为DNA marker；b、HCR产物的原子力显微镜表征图，图中标尺长度为100纳米。从图1中可以看出，不同浓度的DNA目标链均可以有效的引发HCR反应的进行。原子力显微镜照片显示HCR反应后的确生成了长达200nm左右的DNA双链，结果证实HCR的高效进行。
本实施例步骤(3)中将HCR产物与TA-TPE相互作用后荧光信号如图2所示。a、TA-TPE与HCR产物作用前后的荧光强度变化的比较图；b、TA-TPE与不同DNA结构作用之后荧光强度的变化图；c、不同浓度的TA-TPE与HCR产物作用的荧光强度分析结果图。从图2可以看出，TA-TPE与HCR产物相互作用后荧光强度提高了60倍左右，且荧光强度随着TA-TPE的浓度增加而增加。证实了TA-TPE可以有效的验证HCR产物的存在。
本实施例中将TA-TPE与不同浓度目标DNA(目标DNA浓度分别为0、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱如图3中a所示；根据a中荧光强度与核酸浓度的标准曲线如图3中b所示。从图3可以看出，该体系可以高效的检测出目标DNA，在100fM至10nM区间具有很好的检测线性，检测线达到100fM。
本实施例中将TA-TPE与步骤(4)中各个不同DNA链序列相互作用后的荧光检测结果如图4所示。从图4可以看出，本发明的检测方法可以实现对于单碱基错配的识别。
实施例2
(1)金纳米粒子首先同巯基修饰的DNA孵育过夜，金纳米粒子与DNA的摩尔浓度比分别为1:50(低)，1:100(适中)和1:300(高)。然后向溶液中加入10μL 1×PBS溶液，每隔半小时加一次，共三次。室温反应7小时。然后离心样品，用去离子水洗涤三遍。最后沉淀用去离子水重悬至浓度为10nM，得到巯基DNA修饰的金纳米粒子溶液(金纳米粒子上修饰的DNA是为了提高金纳米粒子的稳定性，其序列可以为任意序列)。
(2)取3种不同摩尔比的巯基DNA修饰的金纳米粒子溶液，各取100μL加入96孔板中(共6个孔)，向其中分别加入TA-TPE至终浓度分别为0.5μmol、1μmol、2μmol、3μmol、4μmol、5μmol。拍照观察纳米金溶液颜色的改变，结果如图5所示。从左至右，随着TA-TPE浓度的增加，溶液逐渐由酒红色变为蓝紫色。挑选两组颜色差距较大的纳米金溶液(TA-TPE浓度分别为5μmol和1μmol、金纳米粒子与DNA的摩尔浓度比为1:100(适中))进行透射电镜表征，结果如图6所示。由图5和图6结果可以看出，高浓度DNA修饰的纳米金在不同浓度的TA-TPE中均不会聚集，而低浓度DNA修饰的纳米金在很低浓度的TA-TPE中即发生聚集，适中浓度DNA修饰的纳米金可以在一定浓度范围的TA-TPE溶液中稳定存在。
(3)选择适中浓度的巯基DNA修饰的金纳米粒子与不同浓度TA-TPE作用后的溶液50μL，加入到不同浓度的目标DNA的HCR产物中，金纳米粒子的终浓度为6nM。观察溶液颜色的变化并测试溶液的吸收光谱。结果如图7所示。从图7中可以看出不同浓度目标DNA引发的HCR产物可以吸附不同含量的TA-TPE，从而导致纳米金溶液显示出不同的颜色。
实施例3
本实施例对microRNA的检测，检测方法与实施例1中DNA的检测方法类似。不同于DNA的是，RNA及检测中用到的H1及H2的序列如下：
RNA序列：uggagugugacaaugguguuuga(SEQ ID No.10)；
RNA-H1：tggagtgtgacaatggtgtttgaaccattgtcacactccaaattgc(SEQ ID No.11)；
RNA-H2：tcaaacaccattgtcacactccagcaatttggagtgtgacaatggt(SEQ ID No.12)。
本实施例中将TA-TPE与不同浓度目标RNA(目标RNA浓度分别为0、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱如图8中a所示；根据a中荧光强度与microRNA浓度的标准曲线如图8中b所示。从图8中可以看出随着目标RNA浓度的增加，荧光强度也随之增加，并呈现很好的线性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttg 48
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtctaggat tcggcgtggg ttaa 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtctaggat tcgcgtgggt taa 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtctaggat tcaggcgtgg gttaa 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccatgacgt tcctgacgtt gcat 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtctaggat taggcgtggg ttaa 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtctaagat tcggcgtggg ttaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtctaggat tcggcgtgag ttaa 24
<210> 10
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uggaguguga caaugguguu uga 23
<210> 11
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggagtgtga caatggtgtt tgaaccattg tcacactcca aattgc 46
<210> 12
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaaacacca ttgtcacact ccagcaattt ggagtgtgac aatggt 46

Claims (3)

1.一种非诊断目的聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)通过杂交链式反应对目标核酸序列进行信号放大，超滤除去未反应的短片段核酸，得到杂交链式反应产物；
(2)将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的步骤(1)的杂交链式反应产物进行混合，得到吸附有聚集诱导发光分子的杂交链式反应产物，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；
(3)将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到步骤(2)中吸附有聚集诱导发光分子的杂交链式反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；
步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子的尺寸为5～100nm，表面修饰的DNA数目为10～10000条，每条DNA的碱基个数为5～100个；金纳米粒子与DNA的摩尔浓度比为1:100；
所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(II)所示的结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（II）。
2.根据权利要求1所述的一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述超滤是指用尺寸为3～100kDa的超滤管进行超滤，超滤次数为1～5次，每次超滤结束后，通过超声处理20s～10min，使粘附在管壁上的核酸充分脱落。
3.根据权利要求1所述的一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子加入的浓度以金纳米粒子计算为1～50nM。
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