CN115948609B - 检测SARS-CoV-2的组合物及其试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测SARS‑CoV‑2的组合物及其试剂盒和应用。本申请的第一方面提供一种检测SARS‑CoV‑2的组合物，该组合物包括：二维纳米片；核酸外切酶Ⅲ；第一探针，用于靶向SARS‑CoV‑2Omicron变体的N基因靶序列，第二探针，用于靶向SARS‑CoV‑2Omicron变体的S基因靶序列。选取的第一探针和第二探针分别靶向SARS‑CoV‑2Omicron变体在N基因和S基因的特异性缺失位点，双靶标的检测方式满足实际的检测需求，同时，选择的两段靶序列在同步检测时不会发生相互干扰而影响检测结果的问题，使得最终检测结果具有良好的特异性和灵敏度，检测限在5pM左右。

Description

检测SARS-CoV-2的组合物及其试剂盒和应用

技术领域

本申请涉及核酸检测技术领域，尤其是涉及检测SARS-CoV-2的组合物及其试剂盒和应用。

背景技术

SARS-CoV-2适应性突变的不断出现改变了病毒的致病性和传播性，并使其对当前的疫苗和抗病毒药物产生了耐药性。最近发现的名为Omicron(B.1.1.529)的新型变异株具有高传染性和对当前疫苗和治疗性抗体的抵抗力，成为了世界卫生组织关注的变体(VOC，variant of concern)。当前医疗保健系统的主要策略是通过及时发现潜在的COVID-19感染和无症状携带者来控制。由于Omicron的高传染性，医务人员经常面临大量样本的检测。快速准确的检测工具有助于遏制疫情。

研究者已开发了基于电化学和场效应晶体管(FET)技术的SARS-CoV-2抗原和抗体检测的不同方法。然而，蛋白靶标不易扩增，所以抗原/抗体检测高度依赖于受试者样本中靶标的表达量。因此，这类方法更适合抗原尚未被自身免疫清除的初始症状受试者。相比之下，核酸检测，如聚合酶链反应(PCR)被认为是早期诊断COVID-19感染的金标准。但目前的PCR检测需要耗费大量的人力和较长的操作时间。为此，研究者探索了基于电化学、局部表面等离子共振(LSPR)传感和环介导等温放大(LAMP)技术的生物传感器来进行核酸检测。然而，这些方法有一些仅适用于单一目标表征，或开发方法比较复杂，不利于大规模展开检测。因此，有必要针对Omicron变体设计兼具高灵敏度、低成本和操作简单等优点的检测试剂。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种检测SARS-CoV-2的组合物及其试剂盒和应用，利于该组合物在针对SARS-CoV-2进行检测时，具有灵敏度高、制造成本低和操作简单等优势。

本申请的第一方面，提供一种检测SARS-CoV-2的组合物，该组合物包括：

二维纳米片；

核酸外切酶Ⅲ；

第一探针，第一探针用于靶向SARS-CoV-2 Omicron变体的N基因靶序列，N基因靶序列包括以下核苷酸序列：GATCGCGCCGCACCATTCTGG(SEQ ID No.1)；

第二探针，第二探针用于靶向SARS-CoV-2 Omicron变体的S基因靶序列，S基因靶序列包括以下核苷酸序列：GGAGATCTTCTGGCTCACGCACTATAAT(SEQ ID No.2)；

其中，第一探针和第二探针分别修饰有不同的荧光标记。

根据本申请实施例的组合物，至少具有如下有益效果：

该组合物基于荧光共振能量转移的原理设计，利用宽淬灭光谱和优异表面能量转移的二维纳米片作为淬灭剂，作为单链捕获探针的第一探针和第二探针在没有靶标的情况下，会被纳米片吸附，由于二维纳米片的光学吸收作用，使探针上的荧光标记通过荧光共振能量转移而淬灭。而在出现靶标后，第一探针和第二探针与靶序列杂交生成双链DNA，该双链DNA无法被二维纳米片吸附和淬灭。在这种情况下，利用核酸外切酶Ⅲ特异性催化双链DNA，使其沿3'到5'方向逐步去除单核苷酸，将探针的荧光标记从中释放，产生对应荧光；同时将靶标从双链中释放，然后反复结合更多的探针以放大信号。

此外，选取的第一探针和第二探针分别靶向SARS-CoV-2 Omicron变体在N基因和S基因的特异性缺失位点，双靶标的检测方式满足实际的检测需求，同时，选择的两段靶序列在同步检测时不会发生相互干扰而影响检测结果的问题，使得最终检测结果具有良好的特异性和灵敏度，检测限在5pM左右。

上述实施方式中，荧光标记是指激发后能够发出荧光的化合物或其部分官能团，例如可以是荧光团。可以理解的是，在本申请实施例中，修饰有荧光标记的单链探针在二维纳米片作用下其荧光能够被淬灭。具体的，荧光标记可选FAM、HEX、TAMRA、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Texax、ROX、JOE、R6G、EDANS以及其它一些本领域所指的荧光标记。不同的荧光标记是指激发波长(段)不同的荧光标记，以此可以分别单独检测第一探针和第二探针所靶向的N基因和S基因并进行综合。通常，核酸外切酶Ⅲ为来源于E.coli的核酸外切酶Ⅲ。

在本申请的一些实施方式中，SARS-CoV-2是指SARS-COV-2病毒的Omicron变异株，例如BA.1、BA.2、BA.4、BA.5、BA.2.12.1等。进一步，SARS-CoV-2是指Omicron B.1.1.529变体。

在本申请的一些实施方式中，N基因靶序列如下所示：GATCGCGCCGCACCATTCTGG(SEQ ID No.1)；S基因靶序列如下所示：GGAGATCTTCTGGCTCACGCACTATAAT(SEQ ID No.2)。

在本申请的一些实施方式中，第一探针和第二探针分别靶向包含如SEQ ID No.1和2所示的靶序列，并在探针和靶序列结合后使双链暴露出3'钝性末端。

在本申请的一些实施方式中，第一探针包括以下核苷酸序列：ATGGTGCGGCGCGATC(SEQ ID No.3)，第二探针包括以下核苷酸序列：GTGCGTGAGCCAGAAGATCTCC(SEQ ID No.4)。

在本申请的一些实施方式中，第一探针的序列如下所示：ATGGTGCGGCGCGATC(SEQID No.3)，第二探针的序列如下所示：GTGCGTGAGCCAGAAGATCTCC(SEQ ID No.4)。

在本申请的一些实施方式中，荧光标记修饰于所述第一探针和所述第二探针的内部。实验过程中发现，在内部而非在3′端修饰荧光标记可以使得探针在检测时具有更高的荧光强度，检测的灵敏度和特异性也就更好。其中，内部是指荧光标记所修饰的核苷酸并非其3′端或5′端的第1个核苷酸。例如，假设探针包含N个核苷酸，修饰荧光标记的核苷酸为3′端的第a个和5′端的第N+1-a个核苷酸，同时满足a≥2且N+1-a≥2。进一步可以是a≥2、3、4、5、6、7、8、9、10等且N+1-a≥2、3、4、5、6、7、8、9、10等。具体的核苷酸修饰位点根据探针的长度可以自由选择。

在本申请的一些实施方式中，荧光标记分别独立修饰于第一探针和第二探针的5′端第4～8个核苷酸中的任一个。可以理解的是，荧光标记分别独立修饰于第一探针和第二探针的5′端第4～8个核苷酸中的任一个同样满足其不为3′端的第1个核苷酸。

在本申请的一些实施方式中，二维纳米片为Ti₃C₂(Ti₃C₂T_x)纳米片。Ti₃C₂纳米片具有良好的生物相容性、高荧光猝灭效率和宽吸收光谱，并且表面具有丰富的-F、-O和-OH官能团，可以有效地与许多生物分子相互作用。作为淬灭剂使用可以获得更好的检测效果，同时可以选择更广泛来源和波段的荧光标记。

在本申请的一些实施方式中，Ti₃C₂纳米片由酸蚀(如氢氟酸)剥离MAX前体制得。MAX前体中，M为过渡金属(如Ti)，A由Al等Ⅰ3和Ⅰ4族元素，X为C。

在本申请的一些实施方式中，Ti₃C₂纳米片由LiF和HCl剥离Ti₃AlC₂制得。

在本申请的一些实施方式中，Ti₃C₂纳米片的流体动力学尺寸分布约为460～615nm。

在本申请的一些实施方式中，Ti₃C₂纳米片的厚度约为2～4nm。

在本申请的一些实施方式中，第一探针和二维纳米片的终浓度比例为20nM：(8～16)μg/ml，第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nM：(8～16)μg/ml。例如，第一探针/第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nM：8μg/ml、20nM：9μg/ml、20nM：10μg/ml、20nM：11μg/ml、20nM：12μg/ml、20nM：13μg/ml、20nM：14μg/ml、20nM：15μg/ml、20nM：16μg/ml。进一步的，第一探针/第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nM：(9～15)μg/ml、20nM：(10～14)μg/ml、20nM：(11～13)μg/ml。

在本申请的一些实施方式中，第一探针和核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：(0.005～0.025)U/μl，第二探针和核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：(0.005～0.025)U/μl。例如，第一探针/第二探针和核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：0.005U/μl、20nM：0.01U/μl、20nM：0.015U/μl、20nM：0.02U/μl、20nM：0.025U/μl。进一步的，第一探针/第二探针和核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：(0.01～0.025)U/μl、20nM：(0.01～0.020)U/μl、20nM：(0.015～0.025)U/μl、20nM：(0.015～0.02)U/μl。

在本申请的一些实施方式中，还包括Tris-HCl缓冲液、NE缓冲液、含有1～20mMNaCl的NE缓冲液。

在本申请的一些实施方式中，还包括Tris-HCl缓冲液。不同缓冲体系中不同的探针与靶向片段反应的荧光信号强度有明显区别，在Tris-HCl缓冲液中上述两种探针都显示出较强且稳定的荧光信号。因而采用Tris-HCl缓冲体系提高反应中的荧光强度，从而提高检测灵敏度。

本申请的第二方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述的组合物。利用该试剂盒可以对SARS-COV-2 1.1.529Omicron变体实现高灵敏度的检测。

在本申请的一些实施方式中，试剂盒中还包括阳性对照品(例如包含靶标的假病毒、重组质粒等其中至少一种)、阴性对照品(例如生理盐水等)中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，试剂盒中还包括RT-PCR试剂，包括RT-PCR反应液(包含组分如Tris、dNTPs、Mg²⁺、K⁺等其中至少一种)、RT-PCR酶(包含反转录酶、DNA聚合酶等其中至少一种)。

本申请的第三方面，提供一种非诊断目的的检测样本中SARS-CoV-2 Omicron变体的方法，该方法包括以下步骤：

提取样本中的核酸；

采用前述的组合物或试剂盒对所述核酸进行检测，根据检测结果分析SARS-CoV-2Omicron变体的浓度。

在本申请的一些实施方式中，在检测前还包括将提取的核酸进行RT-PCR反应。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例中的原理图。其中，A为Ti₃C₂纳米片的制备原理，B为SARS-CoV-2B.1.1.529(Omicron变体)的S和N基因区域示意图，C是FRET纳米探针检测的原理示意图。

图2是本申请的实施例中Ti₃C₂纳米片的表征结果。其中，A为TEM图像，B为形貌的AFM分析结果，C为厚度的AFM分析结果，D为STEM-HAADF图像(左上)和Ti₃C₂纳米片中Ti、C、O、F的元素映射结果，E为XRD图谱，F为全XPS光谱，G为H.C 1s区域扫描的高分辨率XPS光谱，H为Ti 2p区域扫描的高分辨率XPS光谱，I为Ti₃C₂纳米片的光吸收光谱以及FAM和Cy5的发射光谱。

图3是本申请的实施例中Ti₃C₂纳米片的流体动力学尺寸。

图4是本申请的实施例中荧光淬灭和放大的验证结果。其中，A为不同样品的FAM荧光检测结果，从上到下分别是P1、P1+T1、P1+T1+Ti₃C₂+ExoⅢ、P1+T1+Ti₃C₂、P1+Ti₃C₂样品的曲线。B为不同样品的Cy5荧光的检测结果，从上到下分别是P2、P2+T2、P2+T2+Ti₃C₂+ExoⅢ、P1+T1+Ti₃C₂、P1+Ti₃C₂样品的曲线。C为ExoⅢ催化效果的电泳结果，泳道2～5分别是T1、T1、P1+T1、P1+T1+ExoⅢ的电泳结果。

图5是本申请的实施例中条件优化实验的P1的结果。其中，A为P1(20nM)和P1+T1(20nM：10nM)与0.015U/μL ExoⅢ和不同浓度Ti₃C₂纳米片孵育后的荧光强度和P1+T1/P1的荧光强度比率。B为不同浓度Exo III与P1+T1(20nM：10nM)和12μg/mL Ti₃C₂纳米片混合孵育后相对于不添加Exo III的荧光增量(F-F0)。C为0.015U/μL Exo III和12μg/mL Ti₃C₂处理的P1/T1的双链DNA在37℃下孵育0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟后与第0分钟的荧光强度的比值(F/F0)，其中F和F0分别代表P1及P1+T1与上述浓度Exo III和Ti₃C₂孵育所得荧光强度。D为Ti₃C₂纳米片在0.5min、2.5min、5min、7.5min、10min、12.5min、15min和40min等不同淬灭时间下对P1和P1+T1的荧光强度的变化。E为P1在DI水、NE缓冲液、NE缓冲液+10mM NaCl和20mM Tris-HCl的不同缓冲体系中孵育的荧光光谱，其中从上到下的曲线分别表示Tris-HCl、NE缓冲液+10mM NaCl、NE缓冲液和DI水。F为P2在DI水、NE缓冲液、NE缓冲液+10mM NaCl和20mM Tris-HCl的不同缓冲体系中孵育的荧光光谱，波长675nm从上到下曲线分别表示DI水、Tris-HCl、NE缓冲液+10mM NaCl和NE缓冲液。

图6是本申请的实施例中条件优化实验的P2的结果。其中，A为P2(20nM)和P2+T2(20nM：10nM)与0.015U/μL ExoⅢ和不同浓度Ti₃C₂纳米片孵育后的荧光强度和P2+T2/P2的荧光强度比率。B为不同浓度Exo III与P2+T2(20nM：10nM)和12μg/mL Ti₃C₂纳米片混合孵育后相对于不添加Exo III的荧光增量(F-F0)。C为0.015U/μL Exo III和12μg/mL Ti₃C₂处理的P2/T2的双链DNA在37℃下孵育0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟后与第0分钟的荧光强度的比值(F/F0)。D为Ti₃C₂纳米片在0.5min、2.5min、5min、7.5min、10min、12.5min、15min和40min等不同淬灭时间下对P2和P2+T2的荧光强度的变化。

图7是本申请的实施例中灵敏度测试、干扰测试和特异性测试的实验结果。其中，A为浓度为0、0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、3.5、10nM的T1用P1+P2(20nM：20nM)与0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL Ti₃C₂纳米片进行检测的荧光光谱，从上到下的曲线中T1浓度依次下降。B是A中(Ft-F0)/F0与T1浓度和T1浓度对数的关系。C为浓度为0、0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、3.5、10nM的T2用P1+P2(20nM：20nM)与0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL Ti₃C₂纳米片进行检测的荧光光谱，从上到下的曲线中T2浓度依次下降。D是C中(Ft-F0)/F0与T2浓度和T2浓度对数的关系。E是P1检测T1或T2或T1+T2以及P2检测T1或T2或T1+T2的干扰测试的实验结果。F是P1或P2(20nM)与0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL Ti₃C₂纳米片对T1、T2、单碱基错配T1(1m-T1)、4碱基错配T1(4m-T1)、单碱基错配T2(1m-T2)、4碱基错配T2(4m-T2)、A型流感(TIA)M基因、B型流感(TIB)HA基因的特异性检测结果。

图8是本申请的实施例中荧光标记位点比较的实验结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。在以下描述中，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。

除非另有定义，本申请中所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

下面结合具体实例进行说明。

下面实施例中涉及的部分材料说明如下：

MAX前驱体Ti₃AlC₂购自吉林省一一科技有限公司。

ExonucleaseⅢ(E.coli)和NE Buffer^TM(10×)购自New England Biolabs Inc(美国)，-20℃保存。

盐酸(37％)购自VWR Chemicals(美国)。

UltraPureTM Tris-HCl(1M，pH＝7.5)购自InvitrogenTM(美国)并用去离子(DI)水稀释至20mM用于靶标检测。

SYBR^TM Gold核酸凝胶染料(以DMSO制备的10000×浓缩液)，O'RangeRuler 10bpDNA Ladder，Orange DNA Loading Dye(6×)，UltraPure^TM DNase/RNase-Free DistilledWater和TBE Buffer(Tris-borate-EDTA，10×)购自Thermo Fisher Scientific Inc(美国)。

普通琼脂糖G-10购自上海百基因生物技术有限公司，室温保存。

氯化钠(≥99.5％)购自上海阿拉丁生化科技有限公司，室温保存。

捕获探针、靶标和错配靶标的所有基因序列均由生工生物技术有限公司(中国上海)合成和纯化(HPLC)。这些探针和靶寡核苷酸的序列列于表S1。所有这些寡核苷酸均储存在-4℃的超纯DNase/RNase-Free DI水中，并用10mM Tris-HCl缓冲液(pH≈7.5)稀释以备进一步使用。

实施例1：Ti₃C₂纳米片的制备和表征

Ti₃C₂纳米片的制备方法参考图1的A，具体过程如下：

(1)室温下将0.67g的LiF缓慢溶解到10ml HCl(6M)中，磁力搅拌30min，得到混合溶液。

(2)然后将1.0g Ti₃AlC₂粉末在10min内缓慢加入到步骤(1)的混合溶液中以避免反应过热，得到混合物。

(3)将步骤(2)的混合物在35℃下连续搅拌24小时。

(4)将步骤(3)的产物用去离子水洗涤，4000rpm离心10min；重复若干次，直到上清的pH为5.0-6.0。

(5)取步骤(4)的上清摇动约50分钟并在氮气气氛下超声处理60min，5000rpm离心60min，收集含有Ti₃C₂纳米片的上清液，充氮气后在-4℃下储存。

对Ti₃C₂纳米片的表征方法如下：

通过JEOL 2100F透射电子显微镜(TEM)记录Ti₃C₂纳米片的形态，通过ZetasizerNano Z系统(Malvern Instruments Ltd)表征Ti₃C₂纳米片的流体动力学尺寸和ζ电位。通过X射线衍射仪(Rigaku SmartLab)获得XRD图案。通过紫外可见分光光度计(Ultrospec2100pro)测量光吸收光谱。通过使用多功能扫描探针显微镜(Digital InstrumentsNanoscope IV)获得AFM形态。

结果如图2和3所示，图2中A为Ti₃C₂纳米片的TEM图像，图3为Ti₃C₂纳米片的流体动力学尺寸，从中可以看出，合成的Ti₃C₂纳米片呈薄层状形态，其流体动力学尺寸分布约为460～615nm。从图2的C可以看出，Ti₃C₂纳米片的厚度约为2.6nm，与图2的B所反映的包含层间间隙的晶体厚度相匹配。从图2的D可以看出，Ti₃C₂纳米片中钛(Ti)和碳(C)元素均匀分布。从图2中E的X射线衍射(XRD)图谱可以看出，8.9°的衍射峰对应晶面(002)指征了层状结构的形成，与Ti₃AlC₂ XRD的PDF卡线对比(JCPDS card No.52-0875)相比，39°(2θ)消失，表明Al原子层的去除与二维结构的形成。如图2的F～H所示，在Ti₃C₂纳米片全XPS光谱中观察到C 1s、Ti 2p、O 1s、Ti 2s的特征峰；在C1s的XPS光谱中有两个峰281.9eV和284.7eV，对应C-Ti和C-C；在Ti 2p的XPS光谱有四个峰455.34eV、458.48eV、461.24eV和463.99eV，分别对应于Ti-C(2 p3/2)、Ti-O(2 p3/2)、Ti-C(2p1/2)和Ti-O(2p1/2)。由于其表面的-OH、-F官能团，Ti₃C₂纳米片ζ电位为-24.10mV。这些特征性证据证实Ti₃C₂纳米片中Ti离子、氢键和碳键的存在，它们可以与单核苷酸的磷酸基团相互作用。

在图2的I中分析了Ti₃C₂纳米片的光吸收广谱，从200nm一直到800nm，吸收广谱极宽，并且包含了FAM和Cy5的发射光谱，因而可以通过Ti₃C₂纳米片和FAM和Cy5进行FRET传感。

实施例2：检测SARS-CoV-2的组合物

1.探针设计

全球系统发育分析结果表明，SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron变体在N基因中第28362-28371和S基因中第22194-22196位点出现缺失，这两个具有独特突变的基因片段可能在鉴定疑似Omicron样本时具有很高的准确性。因此，在本实施例中针对上述位点设计N基因和S基因的探针靶向片段和对应的探针以及对应的若干个碱基错误的错配靶向片段如下表所示，其中，T1和T2中划线部分为其与对应的P1和P2杂交后会暴露出的3′端的钝性末端，错配靶向片段中划线部分为与T1、T2相比的错误碱基：

表1.寡核苷酸序列表

上述的探针、靶向片段、错配靶向片段的所有基因序列均由生工生物技术有限公司合成和纯化(HPLC)，并储存在-4℃的超纯DNase/RNase-Free DI水中，用10mM Tris-HCl缓冲液(pH≈7.5)稀释以备进一步使用。

其中，Omicron变体中缺失的N基因和S基因的靶向片段分别命名为T1和T2。相对应的第一探针和第二探针分别由FAM和CY5标记在其内部的核苷酸上，分别命名为P1和P2。基于这一组合，在ExoⅢ酶对靶向片段和探针结合的双链DNA进行水解时可以单独催化探针的水解，使其中的荧光标记释放而发出荧光，同时保留靶向片段以结合更多的探针；通过这种设计同时能够避免探针和靶向片段结合后，由于两条链的钝性3’末端都暴露出而造成的靶向片段同样被水解、无法结合更多探针进而有效放大信号的情况的出现。

2.Ti₃C₂纳米片荧光淬灭效果验证

将实施例1制备得到的Ti₃C₂纳米片的分散液在冰浴中超声处理5分钟，以剥离出纳米片，然后2000rpm离心5min以除去聚集颗粒。

将20nM P1、20nM P1+10nM T1、20nM P1+10nM T1+0.015U/μL ExoⅢ+12μg/mLTi₃C₂、20nM P1+10nM T1+12μg/mL Ti₃C₂、20nM P1+12μg/mL Ti₃C₂共五组样品分别在室温下孵育5分钟。同理将P1和T1替换为P2和T2，设置相同的组别孵育5分钟。然后通过光致发光(PL)光谱表征每组样品的荧光强度：492nm激发光下在505～660nm内进行FAM荧光的采集，645nm激发下在660～800nm内进行Cy5荧光的采集。

结果如图4的A和B所示，在图4的A中，P1(曲线a)和P1+T1(曲线b)都表现出强烈的荧光；但P1+Ti₃C₂(曲线c)在加入Ti₃C₂纳米片后，荧光明显猝灭；而P1+T1+Ti₃C₂(曲线d)中由于T1与P1形成双链DNA部分荧光恢复。比较曲线d和曲线e，在加入ExoⅢ酶后，荧光信号强度变为原来的2.22倍，有了明显提升，表明ExoⅢ能够起到信号放大作用。图4的B所示的P2和T2的结果与之类似。

使用5％琼脂糖凝胶进一步验证验证ExoⅢ对单链和双链DNA的催化作用，具体步骤如下：

将2.5g琼脂糖加入到50ml 0.5×TBE缓冲液中，在微波炉中密封加热1分钟使琼脂糖完全熔化，得到琼脂糖胶液，将其间歇性摇动并冷却至70℃，然后加入5μL SYBR^TM Gold核酸凝胶染料，倒入胶槽中凝固形成厚度为0.5cm的凝胶。将10nM T1、20nM P1+10nM T1、20nMP1+10nM T1+0.015U/μL ExoⅢ样品孵育5min后依次加入凝胶中。然后在0.5×TBE缓冲液中以110V恒压下电泳45min，然后在Alexa 488光下成像。

结果如图4的C所示，泳道4可以看出分别代表P1和T1的两条条带，但经过ExoⅢ催化后，泳道5中的P1条带几乎不可见，表明ExoⅢ已经将P1消化。

综合上述实验结果，采用Ti₃C₂纳米片进行有效的荧光猝灭和ExoⅢ酶对双链DNA进行选择性切割是可行的，能够以此来放大FRET检测效果。

为此，本实施例提供一种检测SARS-CoV-2的组合物，该组合物包括作为淬灭剂的Ti₃C₂纳米片、起信号放大作用的核酸外切酶Ⅲ以及探针P1和P2。

其中，P1用绿色荧光染料亚胺荧光素(FAM)标记，P2用红色荧光染料花青5(Cy5)标记。P1和P2可以与SARS-CoV-2Omicron变体核酸中的特异性靶向片段杂交，形成具有强荧光的双链DNA。利用ExoⅢ催化水解双链DNA，从3′端开始逐步去除单核苷酸。由于荧光团FAM/Cy5被修饰在探针内部，因而可以更好地暴露钝性末端，促进ExoⅢ酶的消化。

如图1的C所示，在没有正确靶向片段的情况下，Ti₃C₂纳米片表面上的钛离子与单链探针上的磷酸基团之间形成氢键和螯合相互作用而将其吸附，捕获探针上标记的FAM和Cy5的荧光通过荧光共振能量转移(FRET)被淬灭。但在存在靶向片段T1/T2(或称靶标)的情况下，P1/P2与其特定的靶标杂交形成双链DNA。杂交双链DNA中捕获探针(P1/P2)这一链由3'端开始被ExoⅢ消化，释放出P1/P2上的荧光。然后双链DNA中的靶标被释放，进入到下一个循环中，反复结合更多荧光染料标记的探针，从而放大荧光信号。

通过这种方式监测荧光信号的变化可以灵敏地检测SARS-CoV-2B.1.1.529的核酸。

实施例3：条件优化实验

淬火稳定性是将12μg/ml TI₃C₂纳米片与20nM p1的样品和P1+T1(20nm：10nm)的双链DNA，孵育0.5，2.5，5，10分钟，12.5分钟，15分钟，40分钟，然后分析每个样品的荧光信号。

1.荧光标记和淬灭剂的比例

参考实施例2的方法，P1 20nM和P1+T1(20nM：10nM)的样品用0.015U/μL ExoⅢ和0、4、8、12、16、20μg/mL不同浓度的Ti₃C₂纳米片孵育5min，检测两者的荧光强度(FI)。

结果如图5的A所示，从图中可以看出，随着Ti₃C₂浓度的增加，P1和P1+T1的荧光强度(FI)逐渐降低。而在Ti₃C₂>12μg/mL时，多余的Ti₃C₂会导致背景过暗并隐藏T1恢复的荧光信号。其中，如图5的A中右上小图所示，在12μg/mL Ti₃C₂的条件下下，FI_P1+T1/FI_P1的比率达到最大值2.03。相同条件下，P2+T2的结果与之类似，如图6的A所示，12μg/mL的Ti₃C₂用于T2检测时，FI_P2+T2/FI_P2值也达到最大，为3.46。

2.ExoⅢ的用量和催化时间

参考实施例2的方法，P1+T1(20nM：10nM)用0.005、0.01、0.015、0.02和0.025U/μLExoⅢ在37℃下处理40分钟，其中，每组加入12μg/mL Ti₃C₂进行荧光猝灭，反应体系100μL。

结果如图5的B所示，从图中可以看出，随着ExoⅢ量的增加，P1所有组的FI逐渐增强，并在ExoⅢ为0.015～0.02U/μL处达到饱和。而过多的ExoⅢ则可能会导致背景噪声增加。相同条件下将P1和T1替换为P2和T2，结果如图6的B所示，P2所有组的FI也随着ExoⅢ量的增加而逐渐增强，并在ExoⅢ为0.015U/μL处达到饱和。

参考实施例2的方法，将P1+T1(20nM：10nM)与0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL Ti₃C₂孵育0、20、40、60、100分钟，确定不同催化时间的效果。

结果如图5的C所示，从图中可以看出，P1各组的FI随着时间的增加逐渐升高，并在40min时达到饱和。相同条件下将P1和T1替换为P2和T2，结果如图6的C所示，P2各组的FI随着时间的增加逐渐升高，同样在40min时达到饱和。

3.荧光淬灭稳定性

参考实施例2的方法，分别将P1 20nM和P1+T1(20nM：10nM)用0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL的Ti₃C₂孵育0-40分钟来评估荧光猝灭稳定性。

根据以下公式计算淬灭效率Q_e：Q_e＝(F_p-F_q)/F_p；

其中，F_q代表Ti₃C₂淬灭后的荧光强度，F_p代表Ti₃C₂淬灭前的荧光强度。

结果如图5的D所示，P1和P1+T1的FI在前2.5分钟内迅速下降，10分钟后逐渐平衡。而Ti₃C₂处理的P1和P1+T1的淬灭效率分别达到51.74％和36.73％，稳定淬火可以完全覆盖整个检测时间(40min)。

同理，将P1和T1替换为P2和T2，结果如图6的D所示，P2和P2+T2的FI在前2.5分钟内迅速下降，15分钟后逐渐平衡。而Ti₃C₂处理的P2和P2+T2的淬灭效率分别达到59.66％和63.23％，稳定淬火可以完全覆盖整个检测时间(40min)。

4.缓冲体系比较

参考实施例2中的方法，分别以DI水(去离子水)、NE缓冲液、含有10mM NaCl的NE缓冲液和20mM Tris-HCl缓冲液作为反应的缓冲体系，检测P1和P2的荧光。

结果如图5的E和F所示，从图中可以看出，对于P1，Tris-HCl缓冲液中显示出更强且稳定的荧光信号，很少受到自猝灭的影响；而对于P2，Tris-HCl缓冲液和DI水体系的荧光信号都比较强且相差不大。综合来看，选择Tris-HCl缓冲液具有更好的荧光效果。

实施例4：灵敏度实验

采用实施例3中实验出的最优检测条件，应用Ti₃C₂-ExoⅢ的组合物识别Omicron变体。P1+P2(20nM：20nM)与0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL的Ti₃C₂纳米片在Tris-HCl缓冲液体系下孵育40min，分别检测浓度依次为0、0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、3、5、10nM的T1和T2。定量分析(Ft-F0)/F0与T1或T2对数浓度的关系，其中Ft代表有靶标样品的荧光强度，F0代表无靶标样品的荧光强度。同时，由空白信号到校准曲线斜率(3σ/S)的3倍标准除法计算检测限LOD。

结果图7的A～D所示，从中可以看出，FI随着T1或T2浓度的增加而逐渐升高，T1检测的线性范围从0.01nM到2.5nM，检测限LOD为2.36pM；T2检测的线性范围从0.01nM到2.5nM，检测限LOD为4.72pM。

实施例5：干扰测试

在20mM Tris-HCl缓冲体系中加入20nM P1与2.5nM T1或2.5nM T2或T1+T2(2.5nM：2.5nM)以及0.015U/μL ExoⅢ和12μg/mL Ti₃C₂纳米片。37℃下孵育40分钟后，测量每个样品的荧光强度。同理，将20nM P1替换为2.5nM P2，对T2进行了类似的干扰测试。

结果如图7的E所示，从图中可以看出，P1仅在T1或T1+T2中有强烈荧光信号，而P2仅在T2或T1+T2中有强烈荧光信号。所以，P1或P2的可区分荧光信号只能在其特定靶标存在下收集得到并且不受其他靶标的干扰。

实施例6：特异性测试

参考实施例2的方法，将20nM P1、0.015U/μL的ExoⅢ和12μg/mL TI₃C₂纳米片与2.5nM T1或单碱基错配T1(1m-T1)、4碱基错配T1(4m-T1)、A型流感病毒M基因(TIA)、B型流感病毒HA基因(TIB)在20mM Tris-HCl缓冲液中于37℃下孵育40分钟。

同理，将20nM P1、0.015U/μL的ExoⅢ和12μg/mL TI₃C₂纳米片与2.5nM T2或单碱基错配T2(1m-T2)、4碱基错配T2(4m-T2)、A型流感病毒M基因(TIA)、B型流感病毒HA基因(TIB)在20mM Tris-HCl缓冲液中于37℃下孵育40分钟。

检测各样本荧光信号，结果如图7的F所示，P1和P2仅对特异性的T1或T2产生强烈荧光信号，至少为非靶标1m-T1/T2的6.38和11.12倍，因此，该检测组合物对于SARS-COV-21.1.529的N和S基因具有良好的特异性。

实施例7：荧光标记位点实验

参考实施例1，设计FAM和Cy5分别标记于3′端的第一探针P1′和P2′。将20nM P1′和20nM P1分别与0.25nM T1在37℃下与0.015U/μL的Exo III共孵育40min，再加入12μg/mLTi₃C₂纳米片淬灭，检测其荧光强度。参考实施例4计算(Ft-F0)/F0。同理，将P1′和P1以及T1替换为P2′和P2以及T2重新进行实验。

结果如图8所示，P1和P2的荧光强度(Ft-F0)/F0都明显大于P1′和P2′，表明内部修饰FAM/Cy5均较端基修饰FAM/Cy5能够产生更高的相对荧光强度值。因此，荧光基团FAM/Cy5修饰于探针的内部能够更好地暴露钝性末端从而被Exo III的消化，获得信号强度的提升，提高检测效果。

综合上述实施例可以看出，本申请实施例所设计的基于ExoⅢ辅助Ti₃C₂的纳米探针组合物对于SARS-COV-2 1.1.529Omicron变体的核酸进行检测时具有良好的的敏感性，同时检测速度较快，成本较低。该组合物利用Ti₃C₂纳米片与ssDNA和双链DNA的可区别的亲和力以及ExoⅢ的催化能力，实现了一种简单、易于操作的扩增检测方法。利用Ti₃C₂纳米片优异的光学吸光度和高表面积，能够有效地检测SARS-COV-2 1.1.529缺失的N和S基因。因而，利用这种组合物实施低成本、高效的传感检测方法具有良好的临床和社区医学潜力。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (6)

1.检测SARS-CoV-2的组合物，其特征在于，包括：

二维纳米片，所述二维纳米片为Ti₃C₂纳米片；

核酸外切酶Ⅲ；

第一探针，所述第一探针用于靶向SARS-CoV-2Omicron变体的N基因靶序列，所述N基因靶序列包括以下核苷酸序列：GATCGCGCCGCACCATTCTGG，所述第一探针的核苷酸序列如下：ATGGTGCGGCGCGATC；

第二探针，所述第二探针用于靶向SARS-CoV-2Omicron变体的S基因靶序列，所述S基因靶序列包括以下核苷酸序列：GGAGATCTTCTGGCTCACGCACTATAAT，所述第二探针的核苷酸序列如下：GTGCGTGAGCCAGAAGATCTCC；

其中，所述第一探针和所述第二探针分别修饰有不同的荧光标记；所述第一探针和所述Ti₃C₂纳米片的终浓度比例为20nM：(8～16)μg/ml，所述第二探针和所述Ti₃C₂纳米片的终浓度比例为20nM：(8～16)μg/ml；所述第一探针和所述核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：(0.015～0.02)U/μl，所述第二探针和所述核酸外切酶Ⅲ的终浓度比例为20nM：(0.015～0.02)U/μl。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述荧光标记修饰于所述第一探针和所述第二探针的内部。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述荧光标记分别独立修饰于所述第一探针和所述第二探针的5′端第4～8个核苷酸中的任一个。

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，还包括Tris-HCl缓冲液。

5.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的组合物。

6.非诊断目的的检测样本中SARS-CoV-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取所述样本中的核酸；

采用权利要求1至4任一项所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒对所述核酸进行检测，根据检测结果分析所述SARS-CoV-2的浓度。