CN108904481B - 邻羟基查尔酮类似物在制备抗氧化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及特定的查尔酮类似物在制备抗氧化药物及由氧化应激损伤造成的各种疾病中的应用。这些类似物同时具有直接清除自由基和通过激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性。对双氧水、高糖或6‑羟基多巴胺诱导的各种细胞(PC12细胞、心肌细胞、人肝细胞、鼠肾细胞、内皮细胞)的氧化应激损伤具有良好的抗氧化保护作用。可以抑制氧化应激中MDA、ROS的产生，也能明显激活激活Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路。对大鼠和小鼠的脑缺血再灌注损伤具有很好的预保护和治疗作用。

Description

邻羟基查尔酮类似物在制备抗氧化药物中的应用

技术领域：

本发明属药物化学领域，具体而言，本发明涉及特定的邻羟基查尔酮类似物在制备抗氧化药物及由氧化应激损伤造成的各种疾病中的应用，这些查尔酮类似物同时具有直接清除自由基和激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性，起到显著的体外和体内抗氧化保护作用。

背景技术：

自由基引起的氧化应激损伤与多种疾病的发生、发展、密切相关。如急性氧化应激会导致的脑、心脏、肾脏、肝脏的器官缺血及缺血再灌注损伤，慢性氧化应激导致的帕金森、老年痴呆、糖尿病及其并发症、动脉粥样硬化等。抗氧化剂通过清除自由基能够对相关疾病治疗起到预保护或治疗作用。

基于清除自由基的机制，目前有两类抗氧化剂：(1)直接清除自由基的抗氧化剂：与自由基直接反应的化合物，它能够破坏自由基链反应过程，如依达拉奉、白藜芦醇、槲皮素等。(2)间接清除自由基的抗氧化剂：与自由基没有直接反应的化合物，但通过激活细胞内源性抗氧化信号通路，促进细胞保护基因转录，从而清除自由基，如TBHQ、姜黄素、莱菔硫烷等。其中Keap1/Nrf2/ARE是重要的抗氧化信号通路之一。目前，尽管这两类抗氧化剂均有较多的研究报道，但除直接抗氧化剂依达拉奉应用于临床脑中风治疗外，其它大多数抗氧化剂均以失败而告终。

查尔酮或(E)1,2-二苯基-2-丙烯-1-酮是类黄酮家族的天然产物，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗血管增生和抗炎等多种生物特性。目前，已有以查尔酮为先导设计合成多种查尔酮类似物，并研究其药理学活性，以期寻找到高效低毒的抗氧化药物的报道。例如，中国专利申请CN201710580105.2号公开了查尔酮类衍生物作为Keap1/Nrf2/ARE 信号通路激动剂来预防或治疗炎症、癌症药物的用途。但是未见本发明中同时具有直接清除自由基和激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性的查尔酮类衍生物的专利和研究报道。

本发明人经过长期和艰苦的研究实践，在没有结构-功能定向启示的情况下，合成了一系列查尔酮类似物，发现了多个兼有直接清除自由基和激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性的类似物，这些化合物有望成为抗氧化保护药物。

发明内容：

本发明目的在于提供多个查尔酮类似物在制备抗氧化药物及由氧化应激损伤导致的各种疾病的预保护和治疗中的应用。

本发明的另一目的是提供一种用于治疗氧化应激损伤疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的所述的查尔酮类似物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。

具体而言，本发明的有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、 37、39、41)、对照化合物(1、3、5、9、15、17、21、1b、槲皮素(Quercetin)、依达拉奉(ED))、无效化合物(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38和40)结构如下：

1的分子式为C₁₅H₁₂O₄，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(3-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。2的分子式为 C₁₇H₁₅O₄，化学名称为：(E)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(3-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。3的分子式为 C₁₅H₁₃NO₃，化学名称为： (E)-1-(4-Aminophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。4的分子式为 C₁₇H₁₇NO₃，化学名称为：(E)-1-(4-Aminophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。5的分子式为C₁₆H₁₄O₄，化学名称为：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。6的分子式为C₁₈H₁₈O₄，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。7的分子式为 C₁₆H₁₆O₄，化学名称为：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(4-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。 8的分子式为C₁₉H₂₀O₄，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(4-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。9的分子式为 C₁₅H₁₁ClO₃，化学名称为： (E)-1-(4-Chlorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。10的分子式为 C₁₇H₁₅ClO₃，化学名称为： (E)-1-(4-Chlorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。11的分子式为 C₁₅H₁₁FO₃，化学名称为：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(2-fluorophenyl)prop-2-en-1-one。 12的分子式为C₁₇H₁₅FO₃，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(2-fluorophenyl)prop-2-en-1-one。13的分子式为 C₁₅H₁₁ClO₃，化学名称为： (E)-1-(2-Chlorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。14的分子式为 C₁₇H₁₅ClO₃，化学名称为： (E)-1-(2-Chlorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。15的分子式为 C₁₅H₁₁FO₃，化学名称为：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one。 16的分子式为C₁₇H₁₅FO₃,化学名称为： (E)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one。17的分子式为 C₁₅H₁₀F₂O₃，化学名称为 (E)-1-(3,4-Difluorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。18的分子式为 C₁₇H₁₄F₂O₃，化学名称为： (E)-1-(3,4-Difluorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。19的分子式为C₁₇H₁₆O₅，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。20的分子式为 C₁₉H₂₀O₅，化学名称为：(E)-1,3-bis(3,4-Dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。21的分子式为C₁₅H₈F₂O₃，化学名称为： (E)-1-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。22的分子式为C₁₇H₁₄F₂O₃，化学名称为：(E)-1-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。23的分子式为 C₁₆H₁₄O₄，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。24的分子式为 C₁₈H₁₈O₄，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。25的分子式为 C₁₆H₁₄O₅，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。26的分子式为C₁₈H₁₈O₅，化学名称为：(E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。27的分子式为C₁₇H₁₆O₅，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。28的分子式为 C₁₉H₂₀O₅，化学名称为： (E)-3-(2,4-Dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。29的分子式为 C₁₆H₁₄O₄，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。30的分子式为 C₁₈H₁₈O₄，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one。31的分子式为 C₁₇H₁₆O₅，化学名称为：(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,3-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。32的分子式为 C₁₉H₂₀O₅，化学名称为： (E)-3-(2,3-Dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。33的分子式为C₁₇H₁₆O₅，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。34的分子式为 C₁₉H₂₀O₅，化学名称为： (E)-3-(2,5-Dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。35的分子式为C₁₅H₁₁ClO₃，化学名称为： (E)-3-(4-Chlorophenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。36的分子式为 C₁₇H₁₅ClO₃，化学名称为： (E)-3-(4-Chlorophenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。37的分子式为 C₁₅H₁₀Cl₂O₃，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dichlorophenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one。38的分子式为C₁₇H₁₄Cl₂O₃，化学名称为： (E)-3-(3,4-Dichlorophenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。39的分子式为 C₁₈H₁₈O₆，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。40的分子式为 C₂₀H₂₂O₆，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。41的分子式为C₁₇H₁₆O₅，化学名称为： (E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one。1b的分子式为C₂₀H₂₀O₅，化学名称为： (E)-2-methoxy-4-(3-(4-methoxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenylpropionate。DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼或1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)为一种稳定的自由基。具有直接中和自由基活性的抗氧化剂具有清除DPPH的活性，因此，DPPH清除实验是研究药物体外直接清除自由基抗氧化活性的最常用方法之一。因此，本发明首先用 DPPH清除实验研究了化合物直接清除自由基的抗氧化活性(详情见实施例2)。本发明的有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)都具有很好的对自由基DPPH的清除活性，其清除率均达到80％以上，本发明的对照化合物(1、3、5、9、15、17、21)也具有很好的清除DPPH的活性，它们的活性均与阳性对照药物槲皮素(Quercetin)、依达拉奉(ED)相当；而其它无效化合物则均无活性。

双氧水(H₂O₂)能在短时间内诱导细胞产生自由基，造成对细胞的氧化损伤。而抗氧化剂能够清除自由基，对细胞起到抗氧化保护作用。因此，双氧水诱导细胞氧化损伤模型是研究抗氧化药物药效的经典细胞模型。药物在短时间(如1小时)孵育细胞后，来不及激活细胞内源的抗氧化信号通路。因此，药物孵育1小时后，加入双氧水损伤细胞，药物是通过直接中和清除自由基起到抗氧化保护作用。药物在较长时间(大于8小时)孵育细胞后，可以通过激活抗氧化信号通路，上调抗氧化相关基因的表达，起到抗氧化保护作用，即药物通过间接清除自由基起到抗氧化作用。就已经报道的通过双氧水诱导细胞氧化损伤的文献而然，其抗氧化筛选模型一般都是药物孵育8小时及以上，再加入双氧水损伤。未发现药物孵育1小时后，加入双氧水损伤的筛选模型报道；也未发现同时选用药物孵育1小时和24小时两种筛选模型的报道。因此，我们设置化合物预孵育1h和24h后给予双氧水损伤两个模型，分别来进行化合物直接清除自由基和间接清除自由基的抗氧化活性研究。

首先，我们选择了脑中风、帕金森、阿尔茨海默病等脑部疾病研究中常用的模型细胞PC12细胞为研究对象(详情见实施例2)。该细胞用H₂O₂损伤后，细胞生存率降低为60％左右。在药物孵育1h的筛选模型中(详情见实施例2)，本发明的有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)及对照化合物(1、 3、5、9、15、17、21)孵育细胞后，细胞生存率均提升到了80％左右，即均表现出非常好的抗氧化保护效果；它们的活性均与阳性对照药物槲皮素(Quercetin)、依达拉奉 (ED)相当。而其它对照化合物则无活性。在药物孵育1h的筛选模型中，化合物活性结果与DPPH的实验结果完全吻合，进一步说明了本发明有效化合物具有直接清除自由基的抗氧化效果。

与双氧水组的细胞生存率60％相比，在药物孵育24h的模型中(详情见实施例2)，本发明所有有效化合物孵育细胞后，细胞生存率均提高到了80％左右，即均表现出非常好的抗氧化保护效果，其抗氧化活性均强于阳性对照TBHQ(该化合物具有通过激活抗氧化信号Nrf2通路的抗氧化活性)；而具有直接清除自由基活性的对照化合物(1、 3、5、9、15、17、21)未表现或仅表现出弱的抗氧化保护效果；具有直接清除自由基的对照化合物槲皮素(Quercetin)、依达拉奉(ED)也未表现活性；其它对照化合物均未表现出活性。

Keap1/Nrf2/ARE是重要的抗氧化信号通路，间接清除自由基的抗氧化剂可以激活该通路，激活其下游抗氧化蛋白HO-1等的表达。因此，进一步测定了化合物对HO-1 的mRNA表达的影响。本发明所有有效化合物均能够明显上调HO-1的mRNA表达(详情见实施例3)。综上所述，本发明所有有效化合物均同时具有直接清除自由基和通过激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性。

用MTT法测定了本发明有效化合物对PC12细胞的细胞毒性。结果显示，所有有效化合物均没有表现出细胞毒性(详情见实施例3)。

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、心肌细胞(H9C2)、人肝细胞(HepG2)、鼠肾细胞(NRK)是分别用来研究脑、心、肝、肾器官相关疾病的模型细胞。内皮细胞(EC) 被广泛用于动脉粥样硬化、糖尿病血管病变等疾病研究的细胞模型。双氧水诱导的以上细胞损伤模型，是经典的氧化应激损伤模型，可以用于基于抗氧剂机制治疗以上疾病的细胞研究模型。进一步证实，本发明的有效化合物均对双氧水诱导的以上细胞的氧化损伤具有很好的抗氧化保护作用(详情见实施例4)。

高糖可诱导细胞损伤，氧化应激损伤是重要的机制之一。因此，该模型可以用于基于抗氧化治疗糖尿病、糖尿病血管病等糖尿病并发症研究的细胞模型。因此，本发明进一步用高糖诱导的内皮细胞、人神经母细胞瘤细胞、心肌细胞、人肝细胞、鼠肾细胞损伤模型，发现本发明的有效化合物均对高糖诱导的以上细胞的氧化损伤具有很好的抗氧化保护作用(详情见实施例4)。

6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导人神经母细胞瘤细胞损伤模型为帕金森治疗研究的常用细胞模型。本发明的有效化合物均对6-OHDA诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤具有很好的保护作用(详情见实施例4)。

由于本发明有效化合物均具有新型的双重抗氧化活性，进一步优选有效化合物33，进行了体外和体内抗氧化活性研究，发现双抗氧化机制化合物具有比单抗氧化机制化合物具有更好的成药前景。对照用的单抗氧化机制的化合物为21和1b，两者均具有和化合物33相同的结构骨架。在DPPH清除率实验中，化合物33、21均具有良好活性，而化合物1b则无活性(详情见实施例6)。在化合物孵育PC12、H9C2和NRK2 细胞1h或24h后H2O2损伤模型中，33在两个时间都表现较好的细胞保护作用， 21仅在1h模型中有保护作用，1b仅在24h模型中有保护作用(详情见实施例6)。在化合物分别孵育PC12细胞2h、6h、12h、18h、24h后，通过West Blotting检测Nrf2 下游调控的HO-1蛋白的表达，化合物33在12-24h明显增强HO-1蛋白的表达，而 21在所有时间点对HO-1的表达均无影响，1b则在12-18h增强HO-1的表达(详情见实施例7)。综上所述，化合物21可以视为只具有直接清除自由基活性的单机制抗氧化剂；化合物1b可视为只具有通过激活抗氧化信号通路间接清除自由基的单机制抗氧化剂；化合物33可视为具有以上两种机制的双抗氧化机制抗氧化剂。

首先细胞毒性试验结果表明：化合物21、33和1b在预孵育24h细胞毒性实验中， 3个化合物均不表现明显细胞毒性(详情见实施例7)。21、33和1b分别孵育PC12 细胞1h、2h、4h、6h、9h、12h、15h、18h、21h和24h，再加入H₂O₂诱导24h 的实验中发现，33在所有时间点都表现较好的保护作用，而21和1b仅分别在1-10h、 9-18h之间有保护作用(详情见实施例7)。氧化应激损伤为脑中风中脑缺血再灌注损伤的核心机制，因此，进一步选择大鼠中动脉栓塞模型(MCAO)为脑缺血再灌注损伤模型，测定了化合物的体内抗氧化保护效果。结果发现在预保护实验中，相对21 和1b，33能更有效降低大鼠的梗死面积以及改善神经得分(详情见实施例9)。综合以上结果，与单抗氧化机制化合物相比，双抗氧化机制化合物33具有更好的体内外抗氧化保护作用，因此具有更好的成药前景。

优选化合物33，孵育PC12细胞1h或24h后，两个时间点均能浓度依赖性地增加细胞生存率，有效抑制H2O2诱导的PC12细胞中自由基ROS的聚集，抑制自由基诱导的丙二醛(MDA)的生成，且呈良好的量效关系(详情见实施例7)。免疫荧光实验表明33能够有效的促进Nrf2的核转移(详情见实施例8)。PCR实验表明33能够增加Nrf2信号通路调控的GCLC和HO-1的mRNA的表达；West Blotting实验表明33 能够增加GCLC和HO-1蛋白的表达(详情见实施例8)。同时，GCLC和HO-1蛋白的抑制剂实验也表明，相对于单独使用33和2个蛋白的抑制剂(BSO和Znpp)，当33 分别和抑制剂BSO或Znpp联合使用，细胞的生存率降低，这说明了33至少是部分通过增加GCLC和HO-1蛋白的表达来起到保护作用(详情见实施例8)。因此，综合体外实验结果表现出化合物33能直接清除ROS，同时诱导GCLC和HO-1蛋白的表达，间接清除ROS。大鼠MCAO实验和小鼠两侧颈总动脉夹闭(BCAO)实验检测化合物33 对脑缺血再灌注损伤的治疗的保护作用。结果发现相对于临床使用药物依达拉奉，33 在造模后3h或6h对脑缺血再灌注损伤表现出更优的治疗效果(详情见实施例10)。综合体内外实验，33具有开发为脑中风中脑缺血再灌注损伤治疗药物的前景，也具有开发为各种氧化应激损伤相关疾病的预防或治疗药物的前景。

本发明所述抗氧化化合物可以应用于制备抗氧化药物及与氧化应激相关疾病的预保护和治疗药物中，所述疾病的病因至少部分地是由氧化应激引起，所述疾病包括但不限于以下疾病：急性氧化应激导致的脑、心脏、肾脏、肝脏的器官缺血及缺血再灌注损伤，慢性氧化应激导致的帕金森、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、糖尿病并发症。其中所述糖尿病并发症包括但不限于以下疾病：糖尿病高糖氧化应激导致的糖尿病性心肌病、糖尿病性肾病、糖尿病性脑血管病、糖尿病性视网膜病。

一种用于治疗炎性疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的以上所述23个查尔酮类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。“药物组合物”指本发明所述23个查尔酮类化合物中的任何一种或多种或其可药用盐与现已上市的抗炎药物联合使用，制备得到的防治炎症疾病类药物的组合物，已上市的抗炎药物包括各种甾体类抗炎药物和非甾体类抗炎药物。

一种用于治疗氧化应激相关疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的以上所述14个有效化合物或其可药用盐及其药用辅料。“药物组合物”指本发明所述14个有效化合物或其可药用盐与现已上市的治疗药物联合使用，制备得到的防治氧化应激疾病类药物的组合物。

本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等，填充剂如淀粉、蔗糖等；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇等。包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、滴剂、滴丸剂及纳米制剂等。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。

附图说明：

图1查尔酮类似物对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤模型(A，B)的保护作用以及对DPPH的清除能力(C)。对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用的检测方法：PC12细胞(5×10³个细胞/孔)接种在96孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。加入化合物1h或24h后，再加入H₂O₂(450μM)损伤24h。24h后细胞用MTT 溶液(5mg/mL)在37℃中处理4h。最后甲瓒晶体溶解于120μL DMSO中，在490nm 测量OD值。细胞存活率为DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3 次，计算平均值和误差值。检测DPPH的清除能力：用乙醇制备查尔酮类似物溶液(20 mg/mL)。也用乙醇制备DPPH·溶液(0.15mM)。80μL查尔酮类似物溶液加入120μL 的DPPH·溶液(0.15mM)(Ai)。对照组为80μL查尔酮类似物溶液加入到120μL乙醇溶液(Aj)。空白组为80μL乙醇溶液加入120μL DPPH·溶液(Ac)。这些混合物在25℃下孵育30min，然后在517nm测量吸光度。实验重复三次。DPPH的清除能力计算：％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。(^##P<0.01,^#P<0.05vs DMSO组,^**P<0.01,^*P<0.05vs H₂O₂组。数据表示为平均值±SD(n＝3))；

图2有效化合物(7、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41)对PC12 细胞的毒性及对PC12细胞中HO-1的mRNA表达的影响。细胞的毒性的检测方法：方法基本同前，PC12细胞用10μM的化合物孵育24h，用MTT法检测细胞生存率。HO-1的mRNA表达的影响的检测方法：PC12细胞分别用有效化合物和DMSO作用 24h，用q-PCR检测HO-1mRNA的水平。(^**P<0.01,^*P<0.05vs DMSO组。数据表示为平均值±SD(n＝3))；

图3有效化合物对H₂O₂(A、C、E、G、I)和高糖(B、D、F、H、J)诱导的各种细胞的抗氧化保护作用。检测方法：方法基本同前，人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)(A、 B)、心肌细胞(H9C2)(C、D)、人肝细胞(HepG2)(E、F)、鼠肾细胞(NRK)(G、 H)、内皮细胞接(I、J)种在96孔板中，用培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。加入化合物24h后，再加入H₂O₂(450μM左右)或HG(140mM左右)损伤24h。24h 后再次通过MTT法检测细胞生存率。(^###P<0.01,^##P<0.05vsDMSO组,^**P<0.01,^*P <0.05vs H₂O₂组。数据表示为平均值±SD(n＝3))；

图4有效化合物对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用。检测方法：SH-SY5Y细胞以5000个/孔接种在96孔板中，用DMEM/F12培养基培养于37℃培养箱，并使其过夜。培养24h后，再孵10μM浓度的育有效化合物。 24h后加入6-OHDA(100μM)刺激24h。最后弃去含药培养基，将CCK8原液与培养基1:10混合加入96孔板中，2h后在450nm波长检测吸光度。再计算细胞生存率。 (^###P<0.01vs DMSO组,^**P<0.01,^*P<0.05vs 6-OHDA组。数据表示为平均值±SD(n＝ 3))；

图5有效化合物33、对照化合物21、1b对DPPH清除活性(A)，及孵育PC12细胞1h(B)，或24h(C)后，对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用。33、21、1b对DPPH清除活性检测方法：方法基本同前。对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用检测方法：方法基本同前。(^###P<0.05vsDMSO组,^**P<0.01,^*P<0.05vs H₂O₂组。数据表示为平均值±SD(n＝3))；

图6活性化合物33对H₂O₂诱导的PC12细胞保护作用：

PC12细胞中33的细胞毒性筛选和细胞保护作用的时间关系(A，B)，化合物33以及其对照化合物21、1b对HO-1蛋白表达的影响(C)，活性化合物33对H₂O₂诱导的 PC12细胞损伤的量效关系(D)，对H₂O₂诱导的MDA的表达(E)以及对H₂O₂诱导的 ROS的生成(F)。33的细胞毒性筛选检测方法：方法基本同前，PC12细胞用33(10μM)、 21(10μM)、1b(10μM)预处理24h，用MTT法检测细胞生存率。33的细胞细胞保护作用的时间关系检测方法：PC12细胞分别用10μM的33、21、1b预处理1h、2h、4h、 6h、9h、12h、15h、18h、21h和24h，再用H₂O₂(450μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。HO-1的表达检测方法：PC12细胞用10μM的33、21、1b分别作用2h、6h、12h、18h和24h，用western blot检测HO-1的水平，β-actin为内参。柱状图代表westernblot中蛋白条带的光密度比值，每个柱条为三次实验的平均值和误差值。33对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的量效关系检测方法：方法基本同前，PC12 细胞用33(2.5、5、10μM)预处理1h和24h，再用H₂O₂(450μM)刺激24h，用MTT 法检测细胞生存率。33对H₂O₂诱导的MDA的表达检测方法：细胞用33(2.5、5、10 μM)作用1h或24h。然后用700μM H₂O₂作用16h。通过在4℃下，1600×g离心10min 收集上清液。根据MDA说明书检测上清液中MDA含量。33对H₂O₂诱导ROS的生成：细胞用33(10μM)、21(10μM)和1b(10μM)作用1h或24h。再用H₂O₂作用3h，然后，加入1μLDCFH-DA(10mM)在37℃孵育30min。接着细胞用酶消化并用PBS 冲洗，并重悬于500mL PBS中。通过流式仪检测ROS含量。所有实验均进行三次重复。(^###P<0.001，^##P<0.01，^#P<0.05vsDMSO组，^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05 vs H₂O₂组)；

图7活性化合物33促进Nrf2的入核，诱导GCLC和HO-1抗氧化mRNA和蛋白的表达(A，B)，GCLC的抑制剂(BSO)和HO-1的抑制剂(ZnPP)分别能够拮抗33对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用。Nrf2的入核的检查方法：PC12细胞分别用33、ED和 TBHQ作用24h，用4％多聚甲醛固定20min，0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich)孵育15min，1％BSA中封闭1h。一抗、二抗作用后，再用DAPI染色细胞核。最好用荧光显微镜拍摄。GCLC和HO-1mRNA的表达检测方法：PC12细胞分别用33(1、 3、10μM)和DMSO作用24h，用q-PCR检测GCLC和HO-1mRNA的水平。GCLC 和HO-1蛋白的表达检测方法：PC12细胞分别用33(2.5、5、10μM)和TBHQ(10μM) 作用24h，用western blot检测HO-1的水平，GAPDH为内参。柱状图代表western blot 中蛋白条带的光密度比值，每个柱条为三次实验的平均值和误差值。GCLC和HO-1 的抑制剂拮抗3a对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用检测方法：PC12细胞铺板96 孔板过夜，BSO(10μM)和ZnPP(15μM)作用1h后，加33(10μM)作用24h，再用 H₂O₂(450μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。三次重复实验得到相同结论。 (^###P<0.001,^##P<0.01,^#P<0.05vs DMSO组,^***P<0.001,^*P<0.05vsH₂O₂组)；

图8活性化合物33比单抗氧化机制化合物对脑缺血再灌注损伤有更好的预保护作用。检测方法(MCAO)：首先，雄性SD大鼠(250-280g)用10％水和氯醛麻醉(0.35mL/100kg；腹腔注射)。颈部用75％酒精消毒，在颈部正中位置做1.5mm切口，然后分离右颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。用动脉夹暂时夹闭右颈总动脉和颈内动脉。在颈外动脉切开一个小切口，插入拴线，直到我们感到阻力为止(约1.8cm)。固定拴线并缝合切口。栓塞2h后，退出拴线进行再灌注72h。神经得分和TTC染色方法如下：神经得分使用Longa方法：0：正常，无神经功能缺损；1：由侧前爪不能完全伸展，轻度神经缺损；2：行走时，大鼠向右侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3：行走时，大鼠身体向右侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损；4：不能自发行走，有意识丧失。TTC染色方法如下：大脑迅速从大鼠中取出，-20℃冻存20min，冠状切片切 5片，置TTC溶液中，37℃下30min。用数码相机拍摄TTC染色的脑切片。用Image-Pro plus计算大鼠梗死面积。所有老鼠在造模前2h侧脑室注射给药。(^###P<0.001vs sham 组,^***P<0.001,^*P<0.05vs溶剂组)；

图9活性化合物33对脑缺血再灌注损伤的治疗作用。检测方法(BCAO)：雄性C57BL/6 小鼠(8周龄)用4％水合氯醛麻醉(0.1mL/10g；腹腔注射)。在颈部进行中线切口，暴露左右颈动脉。用动脉夹闭塞左右颈动脉，然后再灌注24小时。在假手术动物中，动脉暴露但未闭塞。再灌注24h后，将动物置于特定的方形室(40cm³)中。然后，使用 Digbehv软件(DigBehav，Jiliang Co.，Ltd.，Shanghai，China)记录其行为5min。通过测量装置中行进的总距离来评估运动能力。老鼠在造模后3h或6h腹腔注射给药。检查方法(MCAO)：方法基本同上，所有老鼠在造模后3h或6h腹腔注射给药。(^###P< 0.001，^##P<0.001vs sham组,^***P<0.001,^**P<0.001，^*P<0.05vs溶剂组)。

具体实施方式：

实施例1化合物的合成

将苯乙酮(1mmol)和适当的醛(1mmol)用乙醇溶解后,室温下搅拌5min，并向溶液中通入NaOH或HCl(气体)作为催化剂。将反应混合物在室温下搅拌直至醛消耗(通常 6-12h)。反应完后，将粗混合物冷却并倒入冰水(50mL)中，析出沉淀，抽滤，真空干燥过夜后得粉末状产物，经硅胶柱色谱纯化后得纯度均大于98％的化合物。在合成的数百个化合物中，药理活性差别很大，有代表性的化合物及其理化性质如下所述：

对比化合物1：

(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(3-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one(1):Yellow power, 57.5％yield,mp 193.6-195.4℃[191-192℃Lit¹].¹H-NMR(Acetone-d₆)δ:8.640(brs,1H, OH-4),8.527(brs,1H,OH-3’),8.181(brs,1H,OH-3),7.660(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.607 (d,J＝7.8Hz,1H,H-6’),7.546(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.532(s,1H,H-2’),7.373(t, J＝7.8Hz,1H,H-5’),7.327(s,1H,H-2),7.202(d,J＝7.8Hz,1H,H-5),7.094(d,J＝7.8Hz,1H, H-4’),6.908(d,J＝7.8Hz,1H,H-6).LC-MS m/z:254.8(M-H)^-,calcdfor C₁₅H₁₂O₄: 256.07.；

对比化合物2：

(E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-1-(3-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one(2):Yellow power, 65.7％yield,mp 89.8-93.1℃[115-116℃Lit¹].¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.776(d,J＝15.6Hz, 1H,H-β),7.609(d,J＝1.8Hz,1H,H-2’),7.570(d,J＝7.8Hz,1H,H-6’),7.377(t,J＝7.8Hz, 1H,H-5’),7.369(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.229(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.151(d, J＝1.8Hz,1H,H-2),7.110(dd,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-4’),6.894(d,J＝8.4Hz,1H,H-5), 3.946(s,3H,OCH₃-3),3.932(s,3H,OCH₃-4).LC-MS m/z:285.2(M+H)⁺,calcd for

C₁₇H₁₅O₄:284.10.；

对比化合物3：(E)-1-(4-aminophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one(3): White powder,43.5％yield,mp 184.7-187.8℃[184-185℃Lit²].¹H-NMR(CDCl₃)δ: 9.464(s,2H,OH-3,OH-4),7.696(d,J＝9.0Hz,2H,H-2’,H-6’),7.314(d,J＝1.8Hz,2H,H-2, H-5),7.298(s,1H,H-β),7.234(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),6.867(d,J＝7.8Hz,1H,H-6),6.677 (d,J＝8.4Hz,2H,H-3’,H-5’).LC-MS m/z:256.3(M+H)⁺,calcd for C₁₅H₁₃NO₃:255.09.；

对比化合物4：(E)-1-(4-aminophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(4): Yellow powder,68.7％yield,mp 123.6-125.7℃[120-122℃Lit³].¹H-NMR(CDCl₃)δ: 7.927(d,J＝8.4Hz,2H,H-2’,H-6’),7.729(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.395(d,J＝15.6Hz,1H, H-α),7.213(dd,J＝1.2Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.148(d,J＝1.2Hz,1H,H-2),6.885(d, J＝8.4Hz,1H,H-5),6.736(d,J＝8.4Hz,2H,H-3’,H-5’),3.946(s,3H,OCH₃-3),3.922(s, 3H,OCH₃-4).LC-MS m/z:284.2(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₇NO₃:283.12.；

对比化合物5：

(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one(5):Red-brown power,45.5％yield,mp 171.5-173.4℃[170.4-172.9℃Lit¹].¹H-NMR(Acetone-d6)δ: 8.134(dd,J＝1.8Hz,J＝7.2Hz,2H,H-2’,H-6’),7.660(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.619(d, J＝15.6Hz,1H,H-α),7.322(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.173(dd,J＝1.8Hz,8.4Hz,1H,H-6), 7.070(dd,J＝1.8Hz,7.2Hz,2H,H-3’,H-5’),6.901(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.894(s,3H, OCH3-4’).LC-MS m/z:270.9(M+H)⁺,calcd for C₁₆H₁₄O₄:270.09.；

对比化合物6：

(E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-1-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one(6):Yellow power, 18.3％yield,mp 80.0-82.3℃[93-98℃Lit⁴].¹H-NMR(CDCl₃)δ:8.040(d,J＝8.4Hz,2H, H-2’,H-6’),7.758(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.407(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.235(dd, J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.229(d,J＝1.2Hz,1H,H-2),6.988(d,J＝9.0Hz,2H,H-3’, H-5’),6.917(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.958(s,3H,OCH₃-3),3.953(s,3H,OCH₃-4),3.894(s, 3H,OCH₃-4’).LC-MS m/z:299.2(M+H)⁺,calcd for C₁₈H₁₈O₄:298.12.；

有效化合物7：(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(4-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(7): Yellow power,66.5％yield,mp 168.7-170.3℃Lit⁵.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ:8.119(dd, J＝1.8Hz,J＝7.3Hz,2H,H-2’,H-6’),7.654(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.623(d,J＝15.6Hz,1H, H-α),7.320(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.190(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.041(dd, J＝1.8Hz,J＝7.2Hz,2H,H-3’,H-5’),4.173(t,J＝13.8Hz,3H,OCH₃-4’)1.481(t,J＝13.8Hz, 3H,CH₃).LC-MS m/z:285.16(M+H)⁺,calcd for C₁₆H₁₆O₄:284.10.；

对比化合物8：(E)-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)-1-(4-ethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(8): Yellow power,67.6％yield,m.p.88.9–93.4℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.165(d,J＝9.0Hz, 2H,H-2’,H-6’),7.839(d,J＝15.5Hz,1H,H-β),7.683(d,J＝15.5Hz,1H,H-α),7.683(d,J ＝15.5Hz,1H,H-5),7.069(d,J＝9.0Hz,2H,H-3’,H-5’),7.069(d,J＝9.0Hz,2H,H-3’, H-5’),7.022(d,J＝8.5Hz,1H,H-6),4.145(q,J＝7.0Hz,J＝6.5Hz,2H,OCH₂-4’),3.877 (s,3H,OCH₃-3),3.824(s,3H,OCH₃-4),1.369(t,J＝6.5Hz,3H,CH₃)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.25,162.35,151.13,149.53,143.53,130.76(2),130.56,127.67,123.64,119.62,114.27(2),111.60,110.82,63.52,55.74,55.58,14.45.LC-MS m/z:313.2[M+H]⁺,Calcd.for C₁₉H₂₀O₄:312.14.；

对比化合物9：(E)-1-(4-chlorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one(9): Yellow power,31.5％yield,mp 202.4-204.5℃[201-202℃Lit⁶].¹H-NMR(CDCl₃)δ: 8.621(s,1H,OH-3),8.173(s,1H,OH-4),8.133(d,J＝9.0Hz,2H,H-3’,H-5’),7.694(d, J＝15.6Hz,1H,H-β),7.608(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.577(d,J＝9.0Hz,2H,H-2’,H-6’), 7.338(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.212(t,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.905(d,J＝8.4Hz,1H,H-5). LC-MS m/z:275.0(M+H)⁺,calcd for C₁₅H₁₁ClO₃:274.04.；

对比化合物10：

(E)-1-(4-chlorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(10):Yellow power, 65.5％yield,mp 97.3-101.7℃[103-105℃Lit⁷].¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.955(dd,J＝1.8Hz, J＝7.8Hz,2H,H-2’,H-6’),7.764(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.468(dd,J＝1.8Hz,J＝7.8Hz,2H, H-3’,H-5’),7.335(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.236(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.152 (d,J＝1.8Hz,1H,H-2),6.904(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.954(s,3H,OCH₃-3),3.937(s,3H, OCH₃-4).LC-MS m/z:303.14(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₅ClO₃:302.07.；

有效化合物11：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(2-fluorophenyl)prop-2-en-1-one(11): Yellow green powder,72.6％yield,m.p.174.7–175.8℃.¹H NMR(Acetone-d₆)δ8.581(s, 1H,OH-3),8.255(s,1H,OH-4),7.760(dd,J＝1.8Hz,J＝7.2Hz,1H,H-6’),7.633–7.645 (m,1H,H-4’),7.572(dd,J＝1.2Hz,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.331–7.357(m,1H,H-5’), 7.281–7.299(m,1H,H-3’),7.266(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.213(dd,J＝2.4Hz,J＝15.6Hz, 1H,H-α),7.142(dd,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.904(d,J＝7.8Hz,1H,H-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ188.55,161.02,159.02,149.13,145.70,133.73,130.30,127.32,125.71, 124.75,122.54,122.09,116.58,115.87,114.97.LC-MS m/z:259.1[M+H]⁺,Calcd.for C₁₅H₁₁FO₃:258.07.；

对比化合物12：(E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(2-fluorophenyl)prop-2-en-1-one (12):Yellow powder,67.4％yield,m.p.90.5–92.4℃.¹H NMR(CDCl₃)δ7.591(d,J＝7.8Hz,1H,H-β),7.564–7.536(m,2H,H-4’,H-6’),7.489(t,J＝14.4Hz,1H,H-5’),7.403(d,J＝1.8Hz,1H,H-6),7.310–7.288(m,2H,H-3’,H-2),7.188(d,J＝16.2Hz,1H,H-α)7.002(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.809(s,6H,OCH₃-3,OCH₃-4)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.93, 151.45,149.04,145.01,137.81,136.51,130.29(2),128.77(2),127.40,124.07,119.28, 111.58,110.93,55.75,55.59.LC-MS m/z:287.2[M+H]⁺,Calcd.for C₁₇H₁₅FO₃:286.10.；

有效化合物13：

(E)-1-(2-chlorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one(13):Brown power, 81.6％yield,mp 144.3-145.7℃Lit⁵.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ:8.319(brs,2H,OH-3,OH-4), 7.500-7.538(m,3H,H-3’,H-4’,H-6’),7.451-7.486(m,1H,H-5’),7.315(d,J＝16.2Hz,1H, H-β),7.226(d,J＝2.4Hz,1H,H-2),7.090(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.955(d, J＝16.2Hz,1H,H-α),6.988(d,J＝8.4Hz,1H,H-5).LC-MS m/z:275.2(M+H)⁺,calcd for C₁₅H₁₁ClO₃:274.04.；

对比化合物14：

(E)-1-(2-chlorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(14):Light Yellow power,92.4％yield,mp 93.2-96.0℃Lit⁵.¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.452-7.468(m,2H,H-3’, H-6’),7.416(dt,J＝1.8Hz,J＝7.8Hz,1H,H-4’),7.382(d,J＝16.2Hz,1H,H-β),7.364(dt, J＝1.2Hz,J＝7.8Hz,1H,H-5’),7.142(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.088(d,J＝2.4Hz, 1H,H-2),6.991(d,J＝16.2Hz,1H,H-α),6.878(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.951(s,6H, OCH₃-3,OCH₃-4).LC-MS m/z:303.3(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₅ClO₃:302.07.；

对比化合物15：(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one(15): Yellow power,78.8％yield,m.p.224.4–226.0℃.¹H NMR(Acetone-d₆)δ8.594(s,1H, OH-3),8.212(t,J＝1.8Hz,2H,H-3’,H-5’),8.151(s,1H,OH-4),7.687(d,J＝15.6Hz,1H, H-β),7.624(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.336(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.298(t,J＝8.7Hz,1H, H-2’,H-6’),7.210(t,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.905(d,J＝8.4Hz,1H,H-5)；¹³CNMR (DMSO-d₆)δ191.01,152.10,148.76,145.85,145.58,145.11,131.24,131.16,128.86,126.21,124.40,122.23,118.19,115.50,114.40.LC-MS m/z:258.9[M+H]⁺,Calcd.forC₁₅H₁₁FO₃:258.24.；

对比化合物16：

(E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-1-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one(16):Yellow powder, 91.0％yield,mp 76.7-79.4℃[81-82℃Lit⁸].¹H-NMR(CDCl₃)δ:8.053(dd,J＝5.4Hz, J＝8.4Hz,2H,H-2’,H-6’),7.769(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.361(d,J＝15.6Hz,1H,H-α), 7.242(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.162-7.192(m,2H,H-3’,H-5’),7.160(d,J＝2.4Hz, 1H,H-2),6.909(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.958(s,3H,OCH₃-3),3.940(s,3H,OCH₃-4). LC-MS m/z:287.0(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₅FO₃:286.10.；

对比化合物17：(E)-1-(3,4-Difluorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (17):Yellow power,77.9％yield,m.p.234.9–236.4℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.803(s,1H, OH-3),9.123(s,1H,OH-4),8.178–8.214(m,1H,H-2’),8.019–8.037(m,1H,H-6’), 7.600–7.667(m,1H,H-5’),7.654(d,J＝16.2Hz,1H,H-β),7.628(d,J＝16.2Hz,1H,H-α), 7.302(d,J＝2.4Hz,1H,H-2),7.218(dd,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.819(d,J＝8.4Hz,1H,H-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ186.38,149.00,145.80,145.60,126.16,125.99,125.93,122.49,117.92,117.78,117.74,117.67,117.53,115.82,115.70.LC-MS m/z:277.1[M+H]⁺,Calcd.for C₁₅H₁₀F₂O₃:276.06.；

对比化合物18：(E)-1-(3,4-Difluorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one (18):Yellow power,75.0％yield,m.p.118.6–120.4℃.¹H NMR(CDCl₃)δ7.846–7.880(m, 1H,H-6’),7.801–7.809(m,1H,H-2’),7.788(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.309(d,J＝15.6Hz, 1H,H-α),7.262–7.311(m,1H,H-5’),7.248(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.156(d,J ＝1.8Hz,1H,H-2),6.913(d,J＝7.8Hz,1H,H-5),3.976(s,3H,OCH₃-3),3.945(s,3H, OCH₃-4)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ182.45,146.59,144.15,140.69,122.32,120.00,119.94, 118.18,113.59,112.58,112.44,112.26,112.12,106.00,105.04,50.78(2).LC-MS m/z: 305.3[M+H]⁺,Calcd.for C₁₇H₁₄F₂O₃:304.09.；

有效化合物19：

(E)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(19):Yellow power,72.59％yield,mp 93.8-95.4℃[132-137℃Lit⁹].¹H-NMR(Acetone-d₆)δ:7.841 (dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.673(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.663(d,J＝1.8Hz,1H, H-2’),7.629(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.318(d,J＝1.8Hz,1H,H-5’),7.177(dd,J＝1.8Hz, J＝8.4Hz,1H,H-2),7.091 (d,J＝8.4Hz,1H,H-5),6.901(d,J＝8.4Hz,1H,H-6),3.892(s,6H,OCH₃-3’,OCH₃-4’). ESI-MS m/z:301.2(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₆O₅:300.10.；

对比化合物20：(E)-1,3-bis(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(20):Light Yellow power,57.5％yield,mp 105.5-107.2℃[102-104℃Lit¹⁰].¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.766(d, J＝15.6Hz,1H,H-β),7.687(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.628(d,J＝1.8Hz,1H,H-2’), 7.419(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.249(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),7.167(d,J＝1.8Hz, 1H,H-2),6.937(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),6.908(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.978(s,3H, OCH₃-3’),3.972(s,3H,OCH₃-4’),3.960(s,3H,OCH₃-4),3.938(s,3H,OCH₃-3).LC-MS m/z:329.15(M+H)⁺,calcd for C₁₉H₂₀O₅:328.13.；

对比化合物21：(E)-1-(3,5-Difluorophenyl)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (21):Yellow powder,46.6％yield,m.p.180.9–183.2℃.¹H NMR(Acetone-d₆)δ 7.729–7.764(m,3H,H-β,H-2’,H-6’),7.672(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.379(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.305(dd,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-4’),7.251(dd,J＝1.8Hz,J＝7.8Hz,1H, H-6),6.912(d,J＝7.8Hz,1H,H-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ191.00,152.10,149.17,146.44,145.86,145.60,128.86,126.12,124.39,122.71,117.68,115.95,115.70,115.50,114.40.LC-MS m/z:277.09[M+H]⁺,Calcd.for C₁₅H₈F₂O₃:276.06.；

对比化合物22：

(E)-1-(3,5-difluorophenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(22):Yellow power, 54.7％yield,mp 107.4-109.2℃[122-123℃Lit¹¹].¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.799(d, J＝15.6Hz,1H,H-β),7.500-7.531(m,2H,H-2’,H-6’),7.267(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.251 (d,J＝7.8Hz,1H,H-6),7.158(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.028(dd,J＝1.2Hz,J＝8.4Hz,1H, H-4’),6.916(d,J＝7.8Hz,1H,H-5),3.966(s,3H,OCH₃-3),3.946(s,3H,OCH₃-4).LC-MS m/z:305.0(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₄F₂O₃:304.09.；

有效化合物23：(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (23):Yellow crystal,81.6％yield,m.p.129.3–132.3℃.¹H NMR(CDCl₃)δ7.800(d,J＝ 9.0Hz,2H,H-2,H-6),7.698(d,J＝15.0Hz,1H,H-β),7.614(d,J＝15.0Hz,1H,H-α),7.607(dd,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.499(d,J＝2.4Hz,1H,H-2’),7.002(d,J＝9.0Hz,2H,H-3,H-5),6.850(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),3.814(s,3H,OCH₃-4)；¹³C NMR (DMSO-d₆)δ187.14,161.04,150.66,145.41,142.32,130.46×2,129.84,127.54,121.87,119.74,115.40,115.17,114.36(2),55.32.LC-MS m/z:268.8[M-H]^-,Calcd.for C₁₆H₁₄O₄:270.09.；

对比化合物24：

(E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one(24):White power, 81.1％yield,mp 83.3-85.2℃Lit¹².1H-NMR(CDCl₃)δ:7.778(d,J＝15.6Hz,1H,H-β), 7.677(dd,J＝1.2Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.623(d,J＝1.8Hz,1H,H-2’),7.608(d,J＝8.4Hz, 2H,H-3,H-6),7.446(d,J＝15.0Hz,1H,H-α),6.940(d,J＝8.4Hz,2H,H-3,H-5),6.929(d, J＝7.8Hz,1H,H-5’),3.971(s,6H,OCH₃-3’,OCH₃-4’),3.858(s,3H,OCH₃-3).LC-MS m/z: 299.00(M+H)⁺,calcd for C₁₈H₁₈O₄:298.12.；

有效化合物25：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one(25): Yellow powder,43.5％yield,m.p.153.8–156.6℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.601(d,J＝ 3.6Hz,1H,H-β),7.583(t,J＝5.4Hz,1H,H-6’),7.530(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.491(d,J ＝2.4Hz,1H,H-2’),7.273(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.247(dd,J＝2.4Hz,J＝2.4Hz,1H, H-6),6.987(d,J＝6.4Hz,1H,H-5’),6.855(d,J＝7.8Hz,1H,H-5),3.835(s,3H,OCH₃-4)；¹³CNMR(DMSO-d₆)δ187.12,150.70,149.97,146.65,145.40,142.82,129.86,127.85, 121.79,121.56,119.55,115.31,115.08,114.62,111.98,55.66.LC-MS m/z:287.14[M+H]⁺,Calcd.for C₁₆H₁₄O₅:286.08.；

对比化合物26：

(E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one(26): Yellow powder,78.9％yield,mp 118.4-121.5℃Lit¹³.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ:9.154(s,1H, 3-OH),7.875(dd,J＝1.8Hz,J＝2.4Hz,1H,H-β),7.713(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.615-7.589 (m,2H,H-2’,H-6’),7.343(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.289(dd,J＝2.4Hz,J＝2.4Hz,1H,H-6), 7.098(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),6.999(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),3.874(s,3H,OCH₃-3’),3.864 (s,3H,OCH₃-4’),3.844(s,3H,OCH₃-4).LC-MS m/z:314.86(M+H)⁺,calcd for C₁₈H₁₈O₅: 314.12.；

有效化合物27：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(27):Yellow powder,43.9％yield,m.p.191.3–192.9℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.928(d,J＝15.6Hz, 1H,H-β),7.819(d,J＝15.6Hz,1H,H-6),7.626(dd,J＝3.0Hz,J＝2.4Hz,1H,H-6’),7.505 (d,J＝1.8Hz,1H,H-α),7.494(d,J＝2.4Hz,1H,H-2’),7.044–6.997(m,2H,H-5,H-5’), 6.859(d,J＝20.4Hz,1H,H-3),3.835(s,3H,OCH₃-2),3.790(s,3H,OCH₃-4)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.31,162.70,159.73,150.50,145.36,137.27,130.01,129.95,121.62,119.35,116.19,115.30,115.07,106.23,98.35,55.78,55.48.LC-MS m/z:298.8[M-H]^-,Calcd.for C₁₇H₁₆O₅:300.10.；

对比化合物28：

(E)-3-(2,4-dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(28):Yellow power,74.1％yield,mp 111.3-112.6℃Lit¹².¹H-NMR(CDCl₃)δ:8.040(d,J＝15.6Hz,1H, H-β),7.666(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.6235(d,J＝1.8Hz,1H,H-2’),7.575(d, J＝8.4Hz,1H,H-6),7.563(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),6.928(d,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.539(dd, J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,1H,H-5),6.482(d,J＝2.4Hz,1H,H-3),3.970(s,3H,OCH₃-4’),3.962(s, 3H,OCH₃-3’),3.905(s,3H,OCH₃-2),3.858(s,3H,OCH₃-4).LC-MS m/z:329.1(M+H)⁺, calcd for C₁₉H₂₀O₅:328.13.；

有效化合物29：(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (29):Red-brown power,50.8％yield,m.p.143.2–147.9℃.¹H NMR(CDCl₃)δ8.107(d,J ＝16.2Hz,1H,H-β),7.635(d,J＝16.2Hz,1H,H-α),7.773(s,1H,H-2’),7.591–7.635(m, 2H,H-5’,H-6’),7.381(t,J＝7.8Hz,1H,H-4),6.937–7.008(m,3H,H-3,H-5,H-6’),3.924 (s,3H,OCH₃-2)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.38,158.10,150.81,145.46,137.06,131.80, 129.72,128.40,123.22,122.09,121.91,120.67,115.33,115.12,111.74,55.67.LC-MS m/z: 268.8[M-H]^-,Calcd.for C₁₆H₁₄O₄:270.09.；

对比化合物30：(E)-1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one (30):Yellow powder,58.9％yield,m.p.53.9–55.0℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.035(d,J＝ 15.6Hz,1H,H-β),7.989(dd,J＝1.8Hz,J＝1.8Hz,1H,H-6’),7.913–7.866(m,2H,H-2’, H-6),7.599(d,J＝2.4Hz,1H,H-3),7.468-7.440(m,1H,H-4),7.118(t,J＝15.6Hz,2H,H-5,H-5’),7.044(t,J＝15Hz,1H,H-α),3.907(s,3H,OCH₃-3’),3.879(s,3H,OCH₃-4’),3.866(s,3H,OCH₃-2)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.52,158.16,153.14,148.85,137.63,131.84,130.74,128.32,123.24,123.08,121.75,120.56,111.55,110.75,55.48(3).LC-MSm/z:298.85[M+H]⁺,Calcd.for C₁₈H₁₈O₄:298.12.；

有效化合物31：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,3-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(31):Brown yellow powder,20.0％yield,m.p.160.2–163.2℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.960(s,1H, OH-3’),9.407(s,1H,OH-4’),7.905(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.813(d,J＝16.0Hz,1H, H-α),7.624(d,J＝8.0Hz,1H,H-6’),7.572(s,1H,H-6),7.521(s,1H,H-5),7.139(s,2H, H-2’,H-5’),6.878(d,J＝8.0Hz,1H,H-4),3.845(s,3H,OCH₃-2),3.798(s,3H,OCH₃-3)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.30,152.77,150.91,148.10,145.49,136.50,129.52,128.44,124.25,123.10,122.03,119.15,115.36,115.12,114.76,60.86,55.81.LC-MS m/z:298.7[M -H]^-,Calcd.for C₁₇H₁₆O₅:300.10.；

对比化合物32：

(E)-3-(2,3-dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(32):White power,69.1％yield,mp 82.5-84.2℃Lit¹².¹H-NMR(CDCl₃)δ:8.072(d,J＝15.6Hz,1H, H-β),7.782(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.628(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.629(d, J＝1.8Hz,1H,H-2’),7.275(dd,J＝1.2Hz,J＝7.8Hz,1H,H-6),7.098(t,J＝8.4Hz,1H,H-5), 6.967(dd,J＝1.2Hz,J＝7.8Hz,1H,H-4),6.932(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),3.973(s,3H, OCH₃-2),3.970(s,3H,OCH₃-3’),3.897(s,3H,OCH₃-3),3.890(s,3H,OCH₃-4’).LC-MS m/z:329.0(M+H)⁺,calcd for C₁₉H₂₀O₅:328.13.；

有效化合物33：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(2,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(33):Yellow powder,56.8％yield,m.p.95.4–97.9℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.869(s,1H,OH-3’), 9.320(s,1H,OH-4’),7.926(d,J＝19.2Hz,1H,H-β),7.803(d,J＝19.2Hz,1H,H-α),7.615 (d,J＝9.6Hz,1H,H-6’),7.495(d,J＝19.2Hz,2H,H-2’,H-5’),7.029(d,J＝8.4Hz,2H, H-3,H-6),6.872(d,J＝9.0Hz,1H,H-4),3.845(s,3H,OCH₃-2),3.799(s,3H,OCH₃-5)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.36,153.26,152.56,150.84,145.45,136.79,129.70,123.79,122.28,122.04,117.63,115.38,115.07,113.04,112.62,56.15,55.67.LC-MS m/z:301.16[M+H]⁺,Calcd.for C₁₇H₁₆O₅:300.10.；

对比化合物34：

(E)-3-(2,5-Dimethoxyphenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(34):Yellow powder,74.3％yield,m.p.72.5–73.4℃.¹H-NMR(CDCl₃)δ8.066(d,J＝15.5Hz,1H, H-β),7.680(d,J＝8.0Hz,1H,H-6’),7.607(d,J＝18.0Hz,2H,H-2’,H-α),7.178(s,1H, H-6),6.938(d,J＝7.5Hz,2H,H-3,H-4),6.884(d,J＝8.5Hz,1H,H-5’),3.974(s,6H, OCH₃-3’,OCH₃-4’),3.878(s,3H,OCH₃-2),3.826(s,3H,OCH₃-5)；¹³C NMR(CDCl₃)δ189.25,153.59,153.30,153.14,149.22,139.33,131.61,124.86,123.00(2),116.86,113.97, 112.53,111.03,110.06,56.16,56.07,56.05,55.87.LC-MS m/z:329.00[M+H]⁺,Calcd.for C₁₉H₂₀O₅:328.13.；

有效化合物35：(E)-3-(4-Chlorophenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (35):Light powder,34.8％yield,m.p.216.4–217.8℃.¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.980(s,1H, OH-3’),9.386(s,1H,OH-4’),7.906(s,1H,H-β),7.886(t,J＝15Hz,2H,H-6,H-2),7.666-7.623(m,2H,H-2’,H-6’),7.523(d,J＝2.4Hz,2H,H-3,H-5),7.507(s,1H,H-α),6.869(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ188.55,161.02,159.02,149.13,145.70,133.73,130.30,127.32,125.71,124.75,122.54,122.09,116.58,115.87,114.97.LC-MS m/z:275.17[M+H]⁺,Calcd.for C₁₅H₁₁ClO₃:274.04.；

对比化合物36：

(E)-3-(4-chlorophenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(36):Yellow powder, 82.3％yield,mp 112.8-113.9℃[110-113℃Lit¹⁴].¹H-NMR(DMSO-d₆)δ:7.991(d, J＝15.6Hz,1H,H-β),7.951(s,1H,H-2’),7.928(t,J＝7.2Hz,2H,H-6’,H-5’),7.706(d, J＝15.6Hz,1H,H-α),7.618(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.532(d,J＝8.4Hz,2H,H-3,H-5),7.116 (d,J＝8.4Hz,1H,H-6),3.884(s,3H,OCH₃-3’),3.868(s,3H,OCH₃-4’).LC-MSm/z: 303.08(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₅ClO₃:302.07.；

有效化合物37：(E)-3-(3,4-Dichlorophenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one (37):Dark purple syrupy,49.2％yield.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ9.808(s,1H,OH-3’),9.122 (s,1H,OH-4’),8.196(t,J＝9.0Hz,1H,H-β),8.025(s,1H,H-2’),7.643-7.591(m,3H,H-α, H-6’,H-6),7.305(s,1H,H-2),7.218(d,J＝9.5Hz,1H,H-5’),6.956(d,J＝8.0Hz,1H, H-5).¹³C NMR(DMSO-d₆)δ186.94,151.16,145.53,139.55,135.85,132.29,131.76, 130.88,129.91,129.39,128.82,124.36,122.43,115.46,115.04.LC-MS m/z:309.01[M+ H]⁺,Calcd.for C₁₅H₁₀Cl₂O₃:308.00.；

对比化合物38：

(E)-3-(3,4-dichlorophenyl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(38):Yellowish powder,48.9％yield,mp 96.4-101.5℃[122-123℃Lit¹⁵].¹H-NMR(CDCl₃)δ:7.731(d, J＝1.8Hz,1H,H-2),7.689(d,J＝16.2Hz,1H,H-β),7.680(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’), 7.619(d,J＝1.8Hz,1H,H-2’),7.529(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.497(d,J＝8.4Hz,1H,H-5), 7.452(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6),6.939(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),3.964(d,J＝18Hz, 3H,-OCH₃),3.932(d,J＝9Hz,3H,-OCH₃).LC-MS m/z:337.13(M+H)⁺,calcd for C₁₇H₁₄Cl₂O₃:336.03.；

有效化合物39：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(39):Yellow powder,56.4％yield,m.p.118.9–121.0℃.¹H NMR(CDCl₃)δ9.944(s,1H,OH-3’),9.370 (s,1H,OH-4’),7.814(d,J＝12Hz,1H,H-β),7.671(dd,J＝2.4Hz,J＝2.4Hz,1H,H-6’), 7.609(d,J＝15.0Hz,1H,H-α),7.533(d,J＝2.4Hz,1H,H-2’),7.195(s,2H,H-2,H-6), 6.882(d,J＝7.8Hz,1H,H-5’),3.865(s,6H,OCH₃-3,OCH₃-5),3.712(s,3H,OCH₃-4)；¹³CNMR(DMSO-d₆)δ187.21,153.09(2),150.82,145.45,142.85,139.51,130.48,129.72,122.13,121.43,115.43,115.00,106.30(2),60.10,56.11(2).LC-MS m/z:331.20[M+H]⁺,Calcd.for C₁₈H₁₈O₆:330.11.；

对比化合物40：

(E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(40):Light Yellow power,83.3％yield,mp 123.9-128.6℃[126-127℃Lit¹⁶].¹H-NMR(CDCl₃)δ: 7.725(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.687(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,1H,H-6’),7.627(d,J＝1.8Hz, 1H,H-2’),7.428(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),6.944(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),6.873(s,2H,H-2, H-6),3.977(s,6H,OCH₃-4,OCH₃-4’),3.932(s,6H,OCH₃-3,OCH₃-5),3.906(s,3H, OCH₃-3’).LC-MS m/z:359.23(M+H)⁺,calcd for C₂₀H₂₂O₆:358.14.；

有效化合物41：

(E)-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(41):Yellow power, 64.3％yield,m.p.109.5–111.0℃.¹H NMR(CDCl₃)δ7.737(d,J＝15.6Hz,1H,H-β), 7.648(dd,J＝1.8Hz,J＝1.8Hz,1H,H-6’),7.608(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),7.519(d,J＝ 1.8Hz,1H,H-2’),7.508(d,J＝1.8Hz,1H,H-2),7.337(dd,J＝1.8Hz,J＝1.8Hz,1H,H-6), 7.015(d,J＝8.4Hz,1H,H-5’),6.867(d,J＝8.4Hz,1H,H-5),3.863(s,3H,OCH₃-3),3.817 (s,3H,OCH₃-4)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ187.36,153.26,152.56,150.84,145.45,136.79, 129.70,123.79,122.28,122.04,117.63,115.38,115.07,113.04,112.62,56.15,55.67. LC-MS m/z:301.5[M+H]⁺,Calcd.for C₁₇H₁₆O₅:300.10.；

实施例2化合物对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用以及化合物对DPPH 的清除能力

测试化合物对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护方法：PC12细胞(5×10³个细胞/孔)接种在96孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。加入化合物1h 或24h后，再加入H₂O₂(450μM)损伤24h。24h后细胞用MTT溶液(5mg/mL)在37℃中处理4h。最后甲瓒晶体溶解于120μL DMSO中，在490nm测量OD值。细胞存活率为DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。实验结果见图1A-B。与DMSO组细胞生存率100％相比，用双氧水损伤后，细胞生存率仅为60％左右。而在药物孵育1h或24h后，再给予双氧水损伤，本发明的有效化合物在两个时间点时均具有很好的抗氧化保护效果，均能使细胞的生存率升高到 80％左右。具体如下：在药物孵育1h的筛选模型中，本发明有效化合物(7、11、13、 19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)及对照化合物(1、3、5、9、15、 17、21)孵育细胞后，细胞生存率均提到到了80％左右；而无效化合物(2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)孵育后细胞生存率与双氧水组相当，没有表现出活性。在药物孵育24h的筛选模型中，本发明有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)孵育细胞后，细胞生存率均提高到80％左右，均表现出明显的抗氧化保护作用；而对照化合物(1、 3、5、9、15、17、21)仅表现出极弱的活性或无明显活性；无效化合物(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)则无明显活性。

采用化合物对DPPH·自由基的清除能力初步测试化合物在试管内抗氧化活性，具体方法如下：用乙醇制备NDGA类似物溶液(20mg/mL)。也用乙醇制备DPPH·溶液 (0.15mM)。80μL查尔酮类似物溶液加入120μL的DPPH·溶液(0.15mM)(Ai)。对照组为80μL查尔酮类似物溶液加入到120μL乙醇溶液(Aj)。空白组为80μL乙醇溶液加入120μL DPPH·溶液(Ac)。这些混合物在25℃下孵育30min，然后在517nm测量吸光度。实验重复三次。DPPH的清除能力计算：％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。测试时用阳性药槲皮素(Quercetin)、依达拉奉(ED)和TBHQ做对照。化合物对DPPH的清除能力见图1。可以发现部分化合物能够通过化学方式有效清除DPPH自由基，并显示出类似于查尔酮类似物的自由基清除活性。实验结果见图1C。本发明的所有有效化合物均具有很好的清除自由基DPPH的活性。具体如下，有效化合物(7、11、13、19、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)及对照化合物(1、3、5、9、15、17、 21)对DPPH的清除率均达到80％以上；而无效化合物(2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40)对DPPH的清除率均小于 20％，对DPPH基本无清除活性。

实施例3有效化合物对PC12细胞的细胞毒性及对PC12细胞中HO-1的mRNA表达的影响。

测试化合物对PC12细胞毒性的方法：PC12细胞(5×10³个细胞/孔)接种在96孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。用10μM的有效化合物(7、 11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41)作用，24h后通过MTT 法检测细胞生存率。细胞存活率为DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。实验结果见图2A。与DMSO组细胞生存率100％相比，所有本发明有效化合物细胞生存率都大于或等于100％，表明本发明有效化合物细胞对PC12细胞不表现毒性。

用western blot检测抗氧化蛋白HO-1的表达水平。实验方法步骤：PC12细胞(3×10⁵个细胞/孔)接种在6孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。用 10μM的有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41) 作用24h，蛋白质通过10％SDS-PAGE分离，然后转移PVDF膜上，再用5％脱脂乳液封闭。HO-1(1：300)，β-actin(1：1000)的抗体孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1：1000)室温下孵育1h。最后通过Image J软件检测靶蛋白。结果如图2B，所有的有效化合物都都能够有效增强HO-1的表达。

实施例4有效化合物对H₂O₂和高糖诱导的各种细胞的抗氧化保护作用。

用MTT法检测有效化合物对H₂O₂和高糖诱导的各种细胞的抗氧化保护作用。实验方法步骤：人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、心肌细胞(H9C2)、人肝细胞(HepG2)、鼠肾细胞(NRK)、内皮细胞(EC)接种在96孔板中，用培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。用10μM的有效化合物(7、11、13、19、23、25、27、29、31、33、 35、37、39、41)和对照化合物21、1b作用，再加入H₂O₂(450μM)或HG(140mM) 损伤24h。24h后再次通过MTT法检测细胞生存率。细胞存活率为DMSO对照组的 OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。实验结果见图3。与DMSO组细胞生存率100％相比，用双氧水或高糖损伤后，细胞生存率仅为60％左右。而在药物孵育24h后，再给予双氧水或高糖损伤，本发明的有效化合物在所有细胞模型中都表现出较好的抗氧化保护效果，而对照化合物21在所有细胞模型中都不表现保护作用，化合物1b则在所有细胞模型中也都表现出一定的细胞保护作用。

实施例5有效化合物对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用。

检测方法：SH-SY5Y细胞以5000个/孔接种在96孔板中，用DMEM/F12培养基培养于37℃培养箱，并使其过夜。培养24h后，再孵10μM浓度的育有效化合物。24 h后加入6-OHDA(100μM)刺激24h。最后弃去含药培养基，将CCK8原液与培养基1:10混合加入96孔板中，2h后在450nm波长检测吸光度。细胞存活率为DMSO 对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。结果见图4。与DMSO组细胞生存率100％相比，用6-羟基多巴胺损伤后，细胞生存率仅为 60％左右。而在药物孵育24h后，再给予6-羟基多巴胺损伤，本发明的有效化合物都表现出较好细胞保护作用。

实施例6有效化合物33、对照化合物21、1b对DPPH清除活性，及孵育PC12细胞 1h或24h后，对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用。

DPPH清除活性的具体方法如下：用乙醇制备化合物33、21、1b溶液(20mg/mL)。也用乙醇制备DPPH·溶液(0.15mM)。80μL化合物33、21、1b溶液加入120μL的 DPPH·溶液(0.15mM)(Ai)。对照组为80μL化合物33、21、1b溶液加入到120μL乙醇溶液(Aj)。空白组为80μ乙醇溶液加入120μL DPPH·溶液(Ac)。这些混合物在25℃下孵育30min，然后在517nm测量吸光度。实验重复三次。DPPH的清除能力计算：％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。化合物33、21、1b对DPPH的清除能力见图5A。可以发现本发明的有效化合物33和对照化合物21能够通过化学方式有效清除DPPH自由基，而对照化合物1b则不能够有效清除DPPH自由基。

再次通过MTT法检测有效化合物33、对照化合物21、1b对H₂O₂诱导的PC12 细胞的保护作用。实验方法如下：PC12细胞接种在96孔板中，用培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。用10μM的有效化合物33、对照化合物21、1b分别作用1h 或24h，再加入H₂O₂(450μM)损伤。24h后再次通过MTT法检测细胞生存率。细胞存活率为DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。实验结果见图5B-5C。与DMSO组细胞生存率100％相比，用双氧水损伤后，细胞生存率仅为60％左右。在药物孵育1h模型中，本发明的有效化合物33和对照化合物21表现出较好的抗氧化保护效果，而对照化合物1b则不表现保护作用。而在药物孵育24h模型中，33和1b表现出一定的细胞保护作用，而21不表现出细胞保护作用。

实施例7活性化合物33对H₂O₂诱导的PC12细胞保护作用。

PC12细胞中33的细胞毒性筛选和细胞保护作用的时间关系检测方法：方法基本同前，细胞同样接种于96孔板，培养过夜，再加入化合物21、33、1b，作用24h后 MTT法检测细胞生存率。实验数据见图6A，化合物21、33、1b预孵育24h对PC12 细胞都不表现细胞毒性作用。细胞保护作用的时间关系检测方法：方法基本同前，在化合物21、33、1b预孵育1-24h不同时间点后再通过H₂O₂(450μM)损伤24h，结果如图6B,21只在1-12h表现较好的细胞保护作用，1b只在15-21h表现较好的细胞保护作用，33则在24h的各个时间点都呈现较好的细胞保护作用。

用western blot检测抗氧化蛋白HO-1的表达水平。实验方法步骤：PC12细胞(3×10⁵个细胞/孔)接种在6孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。用 10μM的33、21、1b分别作用2h,6h,12h,18h和24h，蛋白质通过10％SDS-PAGE 分离，然后转移PVDF膜上，再用5％脱脂乳液封闭。HO-1(1：300)，β-actin(1：1000) 的抗体孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1：1000)室温下孵育1h。最后通过Image J软件检测靶蛋白。结果如图6C，33在所有时间点都能够有效增强HO-1 的表达。

33对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的量效关系检测方法：方法基本同前，PC12细胞用33(2.5、5、10μM)预处理1h和24h，再用H₂O₂(450μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。丙二醛(MDA)是由ROS引起的多不饱和脂肪酸过氧化物的副产物，被认为是氧化应激的重要生物标志物。结果如图6D，PC12细胞用33预处理1h或24 h，以剂量依赖的方式显着降低MDA。具体方法：细胞分别用33(2.5、5、10μM)作用 1h或24h。然后用700μM H₂O₂刺激16h。根据MDA说明书检测上清液中MDA含量。三次重复实验得到相同结论。同时，H₂O₂刺激PC12细胞可以促进ROS产生，于是检查了33是否可以预防PC12细胞中ROS的积累。具体方法：细胞用33(10μM)、 21(10μM)和1b(10μM)作用1h或24h。再用H₂O₂作用3h，然后，加入1μL DCFH-DA(10mM)在37℃孵育30min。通过流式仪检测ROS含量。活性结果见图 6E-6F，用33预处理1h或24h的细胞显着降低了MDA的生成，ROS的积累。此外，通过化合物33预防PC12细胞中的ROS积累可能解释其对氧化损伤的细胞保护作用。总之，化合物33可以显著增强抗氧化蛋白的表达实现PC12细胞免受H₂O₂诱导的细胞损伤。

实施例8活性化合物33激活Nrf2信号通路，诱导GCLC和HO-1抗氧化mRNA和蛋白的表达，GCLC的抑制剂(BSO)和HO-1的抑制剂(ZnPP)分别能够拮抗33对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用。

通过免疫荧光实验检测Nrf2的入核，具体实验步骤如下：将处理好的PC12细胞用4％多聚甲醛在室温下固定20min并用PBS洗涤三次。将细胞在0.1％TritonX-100 (Sigma-Aldrich)中孵育15min，并在室温下在1％BSA中封闭1h。洗涤后，将细胞与1：200稀释的Nrf2抗体在4℃下孵育过夜，并通过适当的荧光二抗进行染色1h。细胞核用DAPI染色。通过荧光显微镜获取图像。结果见图7A，化合物33能够明显诱导Nrf2入核。

通过q-PCR检测GCLC和HO-1mRNA的水平，具体实验步骤如下：PC12细胞 (5×10³个细胞/孔)接种在6孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。细胞分别用33(1、3、10μM)和DMSO作用24h，收集细胞并提取总RNA。然后，用M-MLV逆转录酶进行逆转录以及进行进一步的PCR反应。通过以下引物分析 mRNA的相对水平。mHO–1:5′–GCCTGCTAGCCTGGTTCAAG–3′； 5′–AGCGGTGTCTGGGATGA ACTA-3′；mGCLC:5′–GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC–3′；5′–TGTTCTTCAGG GGCTCCAGTC-3′；mGAPDH: 5′–AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC–3′；5′–GAAGACGCCAG TAGACTCCACG–3′。通过2^-ΔΔCt法计算相对mRNA含量。结果见图7B-C，化合物33能够剂量依赖性地诱导GCLC和HO-1的mRNA表达。

再次通过western blot检测GCLC和HO-1蛋白的表达：方法基本如上，33(2.5、5、10μM)作用24h后，收样进行western blot实验。一抗分别为HO-1(1：300)，GCLC(1： 100)，GAPDH(1：3000)，最后通过Image J软件检测靶蛋白。结果见图7D，化合物 33能够剂量依赖性地诱导GCLC和HO-1的蛋白表达。

GCLC和HO-1的抑制剂拮抗33对H₂O₂诱导的PC12细胞的保护作用检测方法： PC12细胞铺板96孔板过夜，BSO(10μM)和ZnPP(15μM)作用1h后，加33(10μM) 作用24h，再用H₂O₂(450μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。三次重复实验得到相同结论。结果见图7E，BSO和ZnPP均能明显抑制化合物33对PC12细胞的抗氧化保护作用，说明33至少部分地通过激活GCLC和HO-1的表达起到抗氧化保护作用。

实施例9活性化合物33比单抗氧化机制化合物对脑缺血再灌注损伤有更好的预保护作用。

大脑中动脉栓塞模型(MCAO)是经典的脑缺血再灌注损伤模型。检测方法：雄性 SD大鼠麻醉后颈部做一个切口，然后分离右颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。然后有颈外动脉插入拴线至颈内动脉，直至大脑总动脉。栓塞2h后，退出拴线进行再灌注72h。神经得分使用Longa方法。TTC染色方法如下：大脑迅速从大鼠中取出，-20℃冻存20min，冠状切片切5片，置TTC溶液中，37℃下30min。用数码相机拍摄TTC染色的脑切片。用Image-Pro plus计算大鼠梗死面积。所有老鼠采取造模前2h侧脑室注射给药。实验结果见图8，33较单一制化合物21和1b能够更明显的减少梗死面积，改善神经得分，33表现出更好的预保护作用。

实施例10活性化合物33对脑缺血再灌注损伤的治疗作用。

迄今为止，除了中风的预防性治疗之外，还需要在临床上开发有效的治疗方法。在中风发作后3-6h内被认为是缺血性脑中风的最佳时间，因此，我们接下来评估33 在缺血再灌注损伤后3h和6h是否有较好的治疗作用。ED是一种直接抗氧化剂，已被证明在临床上显示出对缺血性中风的治疗效果，在此研究中作为一种阳性对照。为了证明化合物33的脑治疗效果，MCAO大鼠模型再次用于该研究中。实验结果如图9A-C，33显示出比ED更好治疗效果。

已知脑缺血会造成严重的行为缺陷，双侧脑动脉闭塞(BCAO)作为另一种模型，通过评估小鼠自发活动能力，检测化合物33的治疗作用。如图9D和9E所示，在假手术组中没有观察到明显的缺血诱导的行为障碍。然而，与假手术组相比，I/R模型组和溶剂组的小鼠组表现明显的行为缺陷且运动活性降低。相反，化合物33或ED治疗的小鼠在脑缺血再灌注损伤后3h自发活动能力有明显改善。特别是，当I/R发作后甚至6h 腹腔注射33，其运动能力仍有显着改善，甚至比ED有更强的保护作用。总之，这些数据显示化合物33可能有希望成为的抗缺血性中风候选药物。

Claims (4)

1.如下所示的化合物在制备抗氧化药物中的应用：

；

所述抗氧化药物具有直接清除自由基和激活抗氧化信号通路间接清除自由基的双重抗氧化活性；

所述抗氧化药物用于预防或者治疗脑缺血再灌注损伤。

2.用于治疗氧化应激损伤的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其可药用盐和药用辅料，所述氧化应激损伤为脑缺血再灌注损伤。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中权利要求1所述的化合物或其可药用盐作为唯一的活性成分。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征是：所述药物组合物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。

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