CN108795813A - 一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法包括草炭、过磷酸钙、碳源、石灰、钼酸铵、硼酸、硫酸锌和水。制备方法，包括以下步骤：S1：先将适量的钼酸铵、硼酸和硫酸锌溶于水中，将PH调至6.8‑7.0，S2：将460‑470g的草炭作为菌剂载体、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、溶于上述溶液中，121℃下灭菌30min，得到促进豆科植物结瘤固氮的组合物。铝酸盐及铁盐为豆科植物固氮酶中铝铁蛋白所必需的元素，硼与锌为豆科植物所必需的元素，添加上述物质可以保证豆科植物结瘤及固氮的正常进行。本发明得到的组合物溶于水中，该产品用来直接处理豆科植物或植物部分，可以刺激根瘤菌生长，刺激豆科植物结瘤量增加，提高单株植物结瘤固氮能力。

Description

一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体是一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法。

背景技术

自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常温常压下，将空气中的N2还原成NH3。由固氮微生物固定的氮素约占地表化合态氮的65％-70％，其中以根瘤菌与豆科植 物共生体系固氮能力最强，占生物固氮量的65％以上。

利用根瘤菌与豆科植物共生固氮提高土壤肥力和农作物产量是世界农业的经典经验。 如用豆科植物作绿肥，让豆科与非豆科作物轮作、间作和套作。通过接种根瘤菌提高豆科 作物的共生固氮效率和产量及土壤肥力已有100多年历史，广泛为各农业大国所用，是 当今发展可持续农业的重要措施之一。20世纪80年代以来，我国粮食作物的种植面积不断扩大，豆科作物和豆科绿肥的种植面积不断减少，化肥尤其是氮肥用量不断增加。由于高水平化合态氮阻遏根瘤菌结瘤固氮，接种根瘤菌的结瘤固氮效应在施用大量氮肥的农田里急剧下降，根瘤菌接种事业的发展随之被遏制。进入21世纪，中国实施西部大开发战 略和退耕还林还草工程，为扩大豆科树种、牧草的种植面积和加强与之相匹配的根瘤菌接 种技术应用提供了契机。

刺槐根瘤杆菌是从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中 慢生根瘤菌KDRM295及其应用。该中慢生根瘤菌KDRM295菌株已保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012331。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，以解决上 述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物，包括草炭、过磷酸钙、碳源、石灰、钼酸铵、硼酸、硫酸锌和水。

一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：先将适量的钼酸铵、硼酸和硫酸锌溶于水中，将PH调至6.8-7.0，

S2：将460-470g的草炭作为菌剂载体、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、 溶于上述溶液中，121℃下灭菌30min，得到促进豆科植物结瘤固氮的组合物。

以下为刺槐根瘤杆菌的制备：

刺槐根瘤杆菌的分离、纯化和保存：从在湖北省丹江口市龟山人工种植的刺槐中选择 健壮刺槐根上大且饱满的根瘤，用剪刀小心将根瘤连部分根剪下，将同一刺槐根部获得的 5-15个根瘤放入装有干燥变色硅胶并覆有脱脂棉的小管中。然后将采集的根瘤用无菌 水充分浸泡吸胀后，用95％的酒精浸泡30s，接着用0.1％的升汞表面灭菌5min，再用 无菌水冲洗6次，将每个根瘤编号后分别放入一个无菌的2-ml离心管中，用无菌的研磨 棒将根瘤研碎，用移液器加入1ml无菌水并吸排3次悬浮匀浆液，将悬浮液系列稀释10 倍，100倍和1000倍，然后分别吸取100μl悬浮液涂布在YMA固体培养基(每升含1 g酵母粉，10g甘露醇，0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4，0.1g NaCl，1.0g CaCO 3，pH6.8，15g琼脂粉)上，将培养平板放在28℃暗培养。培养3-5天后挑取 有典型根瘤菌菌落形态(圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑且因有丰富的 胞外多糖而粘稠、较湿润、稍透明)的菌落，在YMA平板上划线培养，重复3次划线纯 化菌落。将纯化的单菌落在无菌水中悬浮，经革兰氏染色后镜检，选出革兰氏染色阴性、 细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。所述纯化的根瘤菌菌株可接种在 TY培养液(每升含5g胰蛋白胨，3g酵母粉，0.33g CaCl2，pH6.8)中培养至 对数后期或稳定期，与30％(v/v)的甘油溶液等体积混匀，冷冻于-80℃长期保存。

上述发酵中，上述的刺槐根瘤杆菌将上述的发酵产物在60℃烘干得到粉末物质。将上 述的粉末物质溶于水中后再经5KDa的滤膜进行过滤，收集滤出部分(滤液)，60℃烘干， 即为发酵提取物，备用。发酵提取物的分子量小于5KDa。

作为本发明进一步的方案：在步骤S2中，所述草炭过100目筛

作为本发明再进一步的方案：所述根瘤菌液体培养基：蔗糖20g、大豆粉2.4g、K2HPO 4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL， pH6.8-7.0。

作为本发明再进一步的方案：所述YMA培养基：甘露醇10g、K2HPO4 0.25g、KH2 PO40.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母粉0.8g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL， pH6.8-7.0。

作为本发明再进一步的方案：所述水培营养液：KH2PO4 2.2g、KCl 15.5g、MgSO4·7H2O 25.0g、CaCl2·2H2O 21.5g、柠檬酸铁3.0g、NaNO3 3.0g、MnSO 4·H2O 0.1g、ZnSO4·7H2O 0.025g、CuSO4·5H200.025g、Na2MoO4·2H 2O 0.005g、H3BO3 0.025g，

作为本发明再进一步的方案：所述刺槐根瘤杆菌将上述的发酵产物在60℃烘干得到粉 末物质。将上述的粉末物质溶于水中后再经5KDa的滤膜进行过滤，收集滤出部分，60℃ 烘干，即为发酵提取。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：铝酸盐及铁盐为豆科植物固氮酶中铝铁蛋白 所必需的元素，硼与锌为豆科植物所必需的元素，添加上述物质可以保证豆科植物结瘤及 固氮的正常进行。本发明得到的组合物溶于水中，制备得到产品，该产品用来直接处理豆 科植物或植物部分，可以刺激根瘤菌生长，刺激豆科植物结瘤量增加，提高单株植物结瘤 固氮能力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。

一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物，包括草炭、过磷酸钙、碳源、石灰、钼酸铵、硼酸、硫酸锌和水。

一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：先将适量的钼酸铵、硼酸和硫酸锌溶于水中，将PH调至6.8-7.0，

S2：将460-470g的草炭作为菌剂载体、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、 溶于上述溶液中，121℃下灭菌30min，得到促进豆科植物结瘤固氮的组合物，其中草炭过 100目筛。

然后开始制备培养基，其中：根瘤菌液体培养基：蔗糖20g、大豆粉2.4g、K2HPO 40.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL， pH6.8-7.0。

YMA培养基：甘露醇10g、K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4·7H2 O 0.2g、酵母粉0.8g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0。

水培营养液：KH2PO4 2.2g、KCl 15.5g、MgSO4·7H2O 25.0g、CaCl2·2H 2O21.5g、柠檬酸铁3.0g、NaNO3 3.0g、MnSO4·H2O 0.1g、ZnSO4·7H2 O 0.025g、CuSO4·5H200.025g、Na2MoO4·2H2O 0.005g、H3BO3 0.025g， 以上组分依次溶于500mL蒸馏水中，用时稀释200倍。

以下为刺槐根瘤杆菌的制备：

刺槐根瘤杆菌的分离、纯化和保存：从在湖北省丹江口市龟山人工种植的刺槐中选择 健壮刺槐根上大且饱满的根瘤，用剪刀小心将根瘤连部分根剪下，将同一刺槐根部获得的 5-15个根瘤放入装有干燥变色硅胶并覆有脱脂棉的小管中。然后将采集的根瘤用无菌 水充分浸泡吸胀后，用95％的酒精浸泡30s，接着用0.1％的升汞表面灭菌5min，再用 无菌水冲洗6次，将每个根瘤编号后分别放入一个无菌的2-ml离心管中，用无菌的研磨 棒将根瘤研碎，用移液器加入1ml无菌水并吸排3次悬浮匀浆液，将悬浮液系列稀释10 倍，100倍和1000倍，然后分别吸取100μl悬浮液涂布在YMA固体培养基(每升含1 g酵母粉，10g甘露醇，0.5g K2HPO4，0.2g MgSO4，0.1g NaCl，1.0g CaCO 3，pH6.8，15g琼脂粉)上，将培养平板放在28℃暗培养。培养3-5天后挑取 有典型根瘤菌菌落形态(圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑且因有丰富的 胞外多糖而粘稠、较湿润、稍透明)的菌落，在YMA平板上划线培养，重复3次划线纯 化菌落。将纯化的单菌落在无菌水中悬浮，经革兰氏染色后镜检，选出革兰氏染色阴性、 细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。所述纯化的根瘤菌菌株可接种在 TY培养液(每升含5g胰蛋白胨，3g酵母粉，0.33g CaCl2，pH6.8)中培养至 对数后期或稳定期，与30％(v/v)的甘油溶液等体积混匀，冷冻于-80℃长期保存。

刺槐根瘤杆菌acdS基因的扩增和鉴定

将根瘤菌菌株接种到TY培养液中培养至对数后期或稳定期的100μl菌液移至1.5-ml离心管中，8000rpm离心5min，吸去上清液，用0.5ml灭菌双蒸水清洗2次， 用100μl灭菌双蒸水重新悬浮菌体，取1μl菌悬液进行PCR扩增；模板是菌体经PCR 预变性反应加热裂解后释放的DNA；引物是acdSf3：5’-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3’ 和acdSr3：5’-GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’，使用浓度为0.4μM。反应体系 用天根生化科技有限公司生产的2×Taq PCR MasterMix。PCR扩增在Bio-Rad S1000型 PCR仪上进行。扩增程序为94℃预变性4min；94℃变性45s，53℃退火45s， 72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶 电泳进行检测，然后送至英潍捷基(上海)生物技术有限公司用引物acdSf3和acdSr3进 行测序。将上述制备的刺槐根瘤杆菌培养液接入并充分混匀，在28℃温度下好氧发酵9 天，得到发酵产物。

上述发酵中，上述的刺槐根瘤杆菌将上述的发酵产物在60℃烘干得到粉末物质。将上 述的粉末物质溶于水中后再经5KDa的滤膜进行过滤，收集滤出部分(滤液)，60℃烘干， 即为发酵提取物1，备用。发酵提取物的分子量小于5KDa。

下述实施例中的根瘤固氮酶活性测定方法如下：采用乙炔(C2H2)还原法，用气相色谱分析仪测定固氮酶的活性。将冲洗好的植株根系，用滤纸吸去多余的水分后，用解剖刀切下根瘤，主根上的根瘤直接切下，侧根的根瘤切下时保留约0.5cm的根，以保存根瘤 的活性。

将切下的根瘤置于6mL的反应瓶中，盖上橡皮塞，抽取反应瓶中0.6mL气体，然后注入0.6mL高纯的乙炔气体，在28℃无光条件下反应1h后，抽取50μL待测气体，用上海 天美GC7890F气相色谱仪测定乙烯释放量，测定条件如下：柱温180℃、进样口温度150℃， 检测器温度170℃。N＝hx×C×V/hs×24.9×t(hx，样品峰面积；hs，标准C2H4峰面 积；C，标准C2H4浓度(μmol/mL)；V，样品管体积；t，C2H2反应时间(h)；N，C 2H4浓度(μmol·mL-1·h-1)计算得到各菌株的固氮酶活性。

促进植物结瘤固氮组合物的应用：

将刺槐根瘤杆菌使用YMA培养基，种子罐28℃培养53天，接入发酵罐相同条件发酵9天后，将发酵液稀释至刺槐根瘤杆菌培养液，备用。

将刺槐接种上述刺槐根瘤杆菌培养液1ml，待幼苗出芽时根灌0.2ml得到的促进植物 结瘤固氮的产品(小于5KDa)1，温室(白天250C，夜晚170C)条件下正常培养35天后， 测定单株刺槐的根瘤数及固氮活性(乙炔还原酶活性)。

实验重复三次，结果取平均值。

	根瘤数个/株	根瘤重g/株	乙炔还原酶活性nmolC2H4(株*h)-1
				对比例	47±1.2b	0.45±0.051b	23.01±2.81b
实验品	62±3.6b	0.615±0.115b	28.41±3.82b

表明使用本发明的产品1使单株刺槐的结瘤数增加31.9％，根瘤重增加36.6％，单株 刺槐的固氮酶活性增加23.47％.

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背 离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从 哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (8)

1.一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物，其特征在于：包括草炭、过磷酸钙、碳源、石灰、钼酸铵、硼酸、硫酸锌和水。

2.一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：先将适量的钼酸铵、硼酸和硫酸锌溶于水中，将PH调至6.8-7.0，

S2：将460-470g的草炭作为菌剂载体、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、溶于上述溶液中，121℃下灭菌30min，得到促进豆科植物结瘤固氮的组合物。

3.根据权利要求2所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：在步骤S2中，所述草炭过100目筛。

4.根据权利要求1所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：所述培养基包括根瘤菌液体培养基、YMA培养基和水培营养液。

5.根据权利要求4所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：所述根瘤菌液体培养基：蔗糖20g、大豆粉2.4g、K2HPO4 0.25g、KH2 PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。

6.根据权利要求4所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：所述YMA培养基：甘露醇10g、K2HPO4 0.25g、KH2 PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母粉0.8g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。

7.根据权利要求4所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：所述水培营养液：KH2 PO4 2.2g、KCl 15.5g、MgSO4·7H2O 25.0g、CaCl2·2H2O21.5g、柠檬酸铁3.0g、NaNO3 3.0g、MnSO4·H2O 0.1g、ZnSO4·7H2O 0.025g、CuSO4·5H2O0.025g、Na2MoO4·2H2O 0.005g、H3BO3 0.025g。

8.根据权利要求1所述的一种促进豆科植物结瘤固氮的组合物及其制备方法，其特征在于：所述刺槐根瘤杆菌将上述的发酵产物在60℃烘干得到粉末物质。将上述的粉末物质溶于水中后再经5KDa的滤膜进行过滤，收集滤出部分，60℃烘干，即为发酵提取物。