CN105087414A

CN105087414A - 一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂及其制备方法

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Publication number: CN105087414A
Application number: CN201410208260.8A
Authority: CN
Inventors: 段一皋; 王羲元
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂及其制备方法，是由以下四个以下重量份组分菌种菌剂制备而成的菌剂复合液：豌豆根瘤菌剂10-30；豇豆根瘤菌剂10-30；紫云英根瘤菌剂40-50；慢生大豆根瘤菌剂10-30；将上述比例将豌豆根瘤菌剂、豇豆根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂、慢生大豆根瘤菌剂混合，得混合液，进行三级扩大培养：摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养，得菌数达到40-50亿/ml的高浓度成品。本发明对农作物进行浸种、拌种、处理种肥效果良好，一般可使花生、大豆、红薯、马铃薯等粮油作物增产15-30％，而且可使生姜、大蒜、地瓜、根茎药材等经济作物增产20-40％，实现投入小，效益高的效果。

Description

一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种根瘤菌肥料，尤其涉及一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂及其制备方法。

背景技术

根瘤菌与植物根系组织形成一种根瘤性结构，建立共生体系。在根瘤菌与大豆、花生、豇豆及紫云英等多种根茎作物共生体系中，豆科等作物向根瘤菌提供光合产物为固氮作用的能源，而根瘤中的根瘤菌固定的氮被从根瘤细胞运输到物体，为植物提供营养，形成大豆等作物与根瘤菌的共生固氮体系，对豆科作物和根茎类作物起到增产作用。根瘤菌的感染性、专一性和有效性各有不同。感染性是指根瘤菌侵入豆科植物根部后，在其中繁殖并生成根瘤。

专一性是指根瘤菌浸入豆科植物根系时是有一定的范围。如豌豆根瘤菌只感染豌豆、蚕豆、苕子、山薰豆、兵豆、鹰嘴豆。豇豆根瘤菌感染豇豆、花生、绿豆、赤豆、猪尿豆、胡枝子和大豆。紫云英根瘤菌对紫云英属、黄芪属和沙打旺感染率高。大豆根瘤菌感染、大豆属和野生大豆作物。

有效性是指根瘤菌能否进行固氮作用。具有固氮作用的根瘤称有效根瘤，有些菌株虽能形成根瘤，但不能固氮，这种根瘤称为无效根瘤。有效根瘤体积一般比较大，内部呈粉红色，无效根瘤比较小，内部呈浅白色或浅绿色。

根瘤优良菌株功能性很强，根瘤在大豆整个生育期每公顷固定75-100公斤氮，可提供大豆一生的氮需要量的50％-66％。根瘤固氮量与土壤、大豆品种、肥水条件有关。黑土根瘤菌固氮量为每公顷105公斤，可满足大豆对氮需求的62％。冲积土每公顷根瘤固氮量为115.5公斤，可满足大豆对氮需求的72％。花岗岩土每公顷根瘤固氮量为139.5公斤，可满足大豆对氮需求的68％。

共生固氮体系的固氮效率远比自生固氮体系的固氮效率高，原因是共生体系在生理上是一个整体，有利于固氮作用的进行。

在微生物肥料中，根瘤菌肥应用较早，其中大豆、花生、紫云英及豆科牧草接种面积最大，增产效果明显。在未种植过紫云英的地区使用紫云英根瘤菌，产草量可成倍增长；大豆接种根瘤菌每公顷增产225-300公斤；花生接种根瘤菌增产10％-50％，豆科作物从根瘤菌中获得的氮是其一生所需氮的30％-80％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种根瘤菌肥料，尤其提供一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂及其制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，是由以下四个菌种菌剂制备而成的菌剂复合液；所述四个菌种菌剂为以下重量份组分：

豌豆根瘤菌剂10-30；豇豆根瘤菌剂10-30；紫云英根瘤菌剂40-50；慢生大豆根瘤菌剂10-30；

所述豌豆根瘤菌剂为Rhizobiumleguminosarum(Frank1879)Frank1889豌豆根瘤菌ACCC-16104←中国农科院土肥所刘惠琴、宁国赞1986年从畜牧所采瘤分离，原编号CP8636，与豌豆、蚕豆、苕子共生固氮；28～30℃，培养而得；

所述豇豆根瘤菌剂为Bradyrhizobiumvigna豇豆根瘤菌ACCC14010←中国农业科学院土肥所从绿豆根瘤中分离1010，与花生共生固氮；培养基：53；培养温度：28～30℃，培养而得；

所述紫云英根瘤菌剂为Rhizobiumastragula紫云英根瘤菌ACCC13004←中国农业科学院土壤肥料研究所←浙江农科院微生物所；原始编号：38D；与紫云英共生固氮制氮肥；培养温度：28～30℃，培养而得；

所述慢生大豆根瘤菌为Bradyrhizobiumjaponicum(Kirchner)Jordan1982慢生大豆根瘤菌ACCC15005←中国农业科学院土肥所2005←美国根瘤菌公司(NitrogenCompany-Inc)3I1b39；培养温度：28～30℃，培养而得；这个比例有利于各种菌在成品占有均衡数量，提高本菌剂对作物病害种类的广谱性效力。

所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，所述四个菌种菌剂优选以下重量份组分：豌豆根瘤菌剂20；豇豆根瘤菌剂20；紫云英根瘤菌剂30；慢生大豆根瘤菌剂20。

本发明还提供了一种所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别用营养结瘤培养基制备豌豆根瘤菌剂、豇豆根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂占、慢生大豆根瘤菌剂；

所述营养结瘤培养基为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.22mg，氯化钾(KCl)140mg，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)70mg，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.25mg，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.25mg，硼酸(H₃BO₅)溶液0.25mg，钼酸钠(Ma₂MoO₄·2H₂O)0.05mg，柠檬酸铁(FeC₆H₅O₂)50mg，硝酸纳(NaNO₃)60mg，琼脂5-10g，水1000mL，pH7.0。

(2)将上述比例将豌豆根瘤菌剂、豇豆根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂、慢生大豆根瘤菌剂混合，得混合液；

(3)所述混合液进行三级扩大培养；所述三级扩大培养包括摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养；所述三级接种量为10％-20％；菌数达到40-50亿/ml的高浓度成品。

所述发酵是好氧发酵，整个发酵过程中通气和搅拌是提高好氧性微生物菌数的重要方法。所以无菌空气过滤和供给系统是高浓度根瘤菌剂制备的关键，优选发酵条件：灭菌的清洁空气通气量0.4-0.8L(m³·min)；搅拌速度120-200r/min；环境温度28-30℃度；培养72-96小时，即可得复合浓缩成品菌剂合格产品。

(4)镜检50亿/ml；制得扩大培养的复合浓缩成品菌剂。

本发明还提供了一种所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，包括以下重量份组分制备而成的符复合固体制剂：所述复合浓缩菌剂2-4、草炭固体物0.5-1.5。优选组分重量份：所述复合浓缩菌剂3、草炭固体物1。

本发明还提供了一种所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述液体浓缩制剂与草炭固体物混合，吸附，制成固体成品；

所述草炭含水量小于10％；所述草炭细度大于80目；

所述草炭与菌剂重量份组分为(2-4)∶1，优选3∶1；混合后快速搅拌均匀，

所述固体成品含水量30％-35％。

为了提高根瘤菌的增产效果，最好加入钼酸铵重量份0.025-0.075，优选加入重量份0.05。

本发明有益效果：

1.本发明精选的所述四种高感染率的根瘤菌种，它们对大豆、花生、豇豆、紫云英、豌豆、蚕豆等豆科作物根系感染力极强，结瘤率达89％；经过与有机肥料结合，对红薯、土豆、生姜、大蒜等根茎植物增产效果达15-30％，提高感染对象和感染强度，解决了本发明的技术问题。

2.用本发明复合菌液对农作物进行浸种、拌种、处理种肥，效果良好。特别是做成种子包衣剂，效果更好。一般可使花生、大豆、红薯、马铃薯等粮油作物增产15-30％，而且可使生姜、大蒜、地瓜、根茎药材等经济作物增产20-40％，实现例如投入小，效益高的效果。

具体实施方法

实施例1

一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，是由以下四个菌种菌剂制备而成的菌剂复合液(KG)：

豌豆根瘤菌剂10；豇豆根瘤菌剂10；紫云英根瘤菌剂40；慢生大豆根瘤菌剂10；

所述豇豆根瘤菌剂为Bradyrhizobiumvigna豇豆根瘤菌ACCC14010←中国农业科学院土肥所从绿豆根瘤中分离，与花生共生固氮；培养温度：28～30℃，培养而得；

所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，所述四个菌种菌剂组分(KG)：豌豆根瘤菌剂20；豇豆根瘤菌剂20；紫云英根瘤菌剂30；慢生大豆根瘤菌剂20。

制备方法：

(3)所述混合液进行三级扩大培养；所述三级扩大培养包括摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养；所述三级接种量为10％；菌数达到40亿/ml的高浓度成品。

所述发酵是好氧发酵，整个发酵过程中通气和搅拌是提高好氧性微生物菌数的重要方法。所以无菌空气过滤和供给系统是高浓度根瘤菌剂制备的关键，优选发酵条件：灭菌的清洁空气通气量0.4L(m³·min)；搅拌速度120r/min；环境温度28℃度；培养72小时，即可得复合浓缩成品菌剂合格产品。

(4)镜检，制得扩大培养的复合浓缩成品菌剂。

本实施例还提供了所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，以下组分制备(KG)：所述复合浓缩菌剂2、草炭固体物0.5；所述复合浓缩菌剂3、草炭固体物1。

所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法：

将所述液体浓缩制剂与草炭固体物混合，吸附，制成固体成品；所述草炭含水量小于10％；所述草炭细度大于80目；所述草炭与菌剂重量份组分为2∶1，；混合后快速搅拌均匀，所述固体成品含水量30％％。

为了提高根瘤菌的增产效果，最好加入钼酸铵0.025KG。

本实施例根瘤菌高浓度菌液在浸种中的效果明显，而且应用方法简易，适宜推广。用种子量的30％菌液，对种子保合浸种4-8小时，将种子凉干播种，一般增产效果在15％左右。在应用中必须随浸随用，浸完后的种子一般在12个小时内播入土壤，否则将影响发芽率。该菌有效期6个月以上。

实施例2

豌豆根瘤菌剂130；豇豆根瘤菌剂30；紫云英根瘤菌剂50；慢生大豆根瘤菌剂30；

所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法：

所述营养结瘤培养基为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.22m_g，氯化钾(KCl)140mg，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)70mg，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.25mg，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.25mg，硼酸(H₃BO₅)溶液0.25mg，钼酸钠(Ma₂MoO₄·2H₂O)0.05mg，柠檬酸铁(FeC₆H₅O₂)50mg，硝酸纳(NaNO₃)60mg，琼脂5-10g，水1000mL，pH7.0。

(3)所述混合液进行三级扩大培养；所述三级扩大培养包括摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养；所述三级接种量为20％；菌数达到50亿/ml的高浓度成品。

所述发酵是好氧发酵，整个发酵过程中通气和搅拌是提高好氧性微生物菌数的重要方法。所以无菌空气过滤和供给系统是高浓度根瘤菌剂制备的关键，优选发酵条件：灭菌的清洁空气通气量0.8L(m³·min)；搅拌速度200r/min；环境温度30℃度；培养96小时，即可得复合浓缩成品菌剂合格产品。

(4)镜检50亿/ml；制得扩大培养的复合浓缩成品菌剂。

本实施例还提供了一种所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，包括以下组分制备(KG)：所述复合浓缩菌剂4、草炭固体物1.5。优选组分重量份：所述复合浓缩菌剂3、草炭固体物1。

所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法：将所述液体浓缩制剂与草炭固体物混合，吸附，制成固体成品；所述草炭含水量小于10％；所述草炭细度大于80目；所述草炭与菌剂重量份组分为4∶1；混合后快速搅拌均匀，所述固体成品含水量35％。

为了提高根瘤菌的增产效果，加入钼酸铵份0.075KG。

本实施例高浓度液体菌剂和固体菌粉也可用于对种子的拌种处理，使农作物增产效果可达到10％-15％。拌种方法是：用种子量8％-10％固体菌剂，加入少量清水，进行搅拌，使种子和菌剂充分混合均匀，让每粒种子都能沾有菌剂，等凉干后播种。拌好的种子应及时播种，一般2-3天内播入土壤为宜，不会影响发芽率。液体拌种方法与固体方法相同。

实例例3

豌豆根瘤菌剂20；豇豆根瘤菌剂20；紫云英根瘤菌剂45；慢生大豆根瘤菌剂20；

所述紫云英根瘤菌剂为Rhizobiumastragula紫云英根瘤菌ACCC13004←中国农业科学院土壤肥料研究所←浙江农科院微生物所；原始编号：38D；与紫云英共生固氮制氮肥；培养基：54，培养温度：28～30℃，培养而得；

所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，所述四个菌种菌剂组分制备(KG)：豌豆根瘤菌剂20；豇豆根瘤菌剂20；紫云英根瘤菌剂30；慢生大豆根瘤菌剂20。

所述共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法：

(1)分别用营养结瘤培养基制备豌豆根瘤菌剂、豇豆根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂、慢生大豆根瘤菌剂；

所述营养结瘤培养基是一种促进结瘤快，结瘤数量多的一种改良培养基，成份为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.22mg，氯化钾(KCl)140mg，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)70mg，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.25mg，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.25mg，硼酸(H₃BO₅)溶液0.25mg，钼酸钠(Ma₂MoO₄·2H₂O)0.05mg，柠檬酸铁(FeC₆H₅O₂)50mg，硝酸纳(NaNO₃)60mg，琼脂5-10g，水1000mL，pH7.0。

(2)将上述比例将豌豆根瘤菌剂、豇豆根瘤菌剂、紫云英根瘤菌剂占、慢生大豆根瘤菌剂混合，得混合液；

(3)所述混合液进行三级扩大培养；所述三级扩大培养包括摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养；所述三级接种量为15％；菌数达到45亿/ml的高浓度成品。

所述发酵是好氧发酵，整个发酵过程中通气和搅拌是提高好氧性微生物菌数的重要方法。所以无菌空气过滤和供给系统是高浓度根瘤菌剂制备的关键，优选发酵条件：灭菌的清洁空气通气量0.6L(m³·min)；搅拌速度160r/min；环境温度26℃度；培养80小时，即可得复合浓缩成品菌剂合格产品。

(4)镜检50亿/ml；制得扩大培养的复合浓缩成品菌剂。

本实施例还提供一种共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，由以下组分制备(KG)：所述复合浓缩菌剂3、草炭固体物1。

所述共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述液体浓缩制剂与草炭固体物混合，吸附，制成固体成品；所述草炭含水量小于10％；所述草炭细度大于80目；所述草炭与菌剂重量比例为3∶1；混合后快速搅拌均匀，所述固体成品含水量30％。

为了提高根瘤菌的增产效果，最好加入钼酸铵0.05KG。

本实施例根瘤菌剂肥料与生物肥料混合施用效果获得了提高。方法是将生物肥料与占总重量20％高浓度菌液或固体菌粉混合，与生物肥料进行混合均匀后，用于作为种肥，条施、穴施为底肥和种肥，可使种子的发芽率提高30％左右。还可促进农作物根系生长增加一倍的生长量，可促使作物增产15-25％。使用的生物肥料质量应上呈，生物肥料的有机质含量应在50％以上配合施用较好。有机质含量较低，施用效果较差。生物肥料中化学元素肥料含量占总量的8％左右为宜，化学元素含量越高，对根瘤菌剂活性造成影响，减少菌剂的有效作用。

Claims

1.一种共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，是由以下四个以下重量份组分菌种菌剂制备而成的菌剂复合液：

所述慢生大豆根瘤菌为Bradyrhizobiumjaponicum(Kirchner)Jordan1982慢生大豆根瘤菌ACCC15005←中国农业科学院土肥所2005←美国根瘤菌公司(NitrogenCompany-Inc)3I1b39；培养温度：28～30℃，培养而得。

2.根据权利要求1的共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂，所述四个菌种菌剂为以下重量份组分：豌豆根瘤菌剂20；豇豆根瘤菌剂20；紫云英根瘤菌剂30；慢生大豆根瘤菌剂20。

包括以下步骤：

(3)所述混合液进行三级扩大培养；所述三级扩大培养包括摇床液体培养、种子罐液体培养、发酵液体罐扩大培养；菌数达到40-50亿/ml的高浓度成品。

3.根据权利要求2的共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法，所述营养结瘤培养基为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.22mg，氯化钾(KCl)140mg，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)70mg，硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)0.25mg，硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.25mg，硼酸(H₃BO₅)溶液0.25mg，钼酸钠(Ma₂MoO₄·2H₂O)0.05mg，柠檬酸铁(FeC₆H₅O₂)50mg，硝酸纳(NaNO₃)60mg，琼脂5-10g，水1000mL，pH7.0。

4.根据权利要求2的共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法，所述发酵是好氧发酵，发酵条件：灭菌的清洁空气通气量0.4-0.8L(m³·min)；搅拌速度120-200r/min；环境温度28-30℃度；培养72-96小时，即得复合浓缩成品菌剂。

5.根据权利要求1或4的共生固氮用高浓度复合根瘤菌剂的制备方法，还包括镜检40-50亿/ml以上，制得扩大培养的复合浓缩成品菌剂。

6.一种权利要求1-2之一的共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，包括以下重量份组分制备而成的复合固体制剂：所述复合浓缩菌剂2-4、草炭固体物0.5-1.5。

7.根据权利要求6的共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂，所述组分重量份为：所述复合浓缩菌剂3、草炭固体物1。

8.权利要求6或7的共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述液体浓缩制剂与草炭固体物混合，吸附，制成固体成品；所述草炭含水量小于10％；所述草炭细度大于80目；所述草炭与菌剂重量份组分为(2-4)：1，混合后快速搅拌均匀，所述固体成品含水量30％-35％。

9.根据权利要求8的述组分共生固氮用高浓度复合根瘤固体菌剂的制备方法，加入钼酸铵重量份0.025-0.075。