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CN108610421A - Cx3cr1结合多肽 - Google Patents

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CN108610421A
CN108610421A CN201810147778.3A CN201810147778A CN108610421A CN 108610421 A CN108610421 A CN 108610421A CN 201810147778 A CN201810147778 A CN 201810147778A CN 108610421 A CN108610421 A CN 108610421A
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seq
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amino acid
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E.德普拉
T.拉尔里曼斯
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Abstract

本发明涉及CX3CR1‑结合多肽。具体地，本发明涉及CX3CR1‑结合多肽，特别是包含特异性免疫球蛋白域的多肽。本发明还涉及编码该多肽的核酸；制备该多肽的方法；表达或能够表达该多肽的宿主细胞；包含该多肽的组合物；及该多肽或该组合物特别是在预防、治疗及诊断目的中的用途。

Description

CX3CR1结合多肽
本发明申请是基于申请日为2013年2月25日、申请号为201380016996.9(国际申请号为PCT/US2013/027580)、名称为“CX3CR1结合多肽”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及CX3CR1-结合多肽，特别是包含特异性免疫球蛋白域的多肽。本发明还涉及编码该多肽的核酸；制备该多肽的方法；表达或能够表达该多肽的宿主细胞；包含该多肽的组合物；及该多肽或该组合物的用途，尤其是用于预防、治疗及诊断目的的用途。
发明背景
CX3CR1是G蛋白偶联整合膜蛋白，其是趋化因子受体。其主要在与动脉粥样硬化斑的起始及进展相关的细胞类型(例如单核细胞、树突细胞及T细胞)上表达。其在单核细胞上被经氧化脂质而上调，并介导这些细胞至斑中的迁移及在斑内的存活。其独特配体弗莱托肯趋化因子(fractalkine，FKN)是在病灶中的血管内皮细胞及平滑肌细胞的表面上表达的，在病灶中其调节白细胞粘附。弗莱托肯趋化因子也通过蛋白水解裂解释放至循环中，其中其作为趋化剂起作用。
在人类中，已显示具有降低的活性的CX3CR1变体(V249I/T280M)与心血管疾病(冠状动脉心脏病、脑血管疾病或外周血管疾病)(McDermott，2001；Circ Res 89：401)、冠状动脉疾病(狭窄的血管摄影证据)(McDermott，2003；J.Clin.Invest.111：1241)及颈动脉阻塞病(Ghilardi，2004；Stroke 35：1276)的风险降低相关。CX3CR1与显示增强的免疫染色的弗莱托肯趋化因子通过多克隆抗体共定位于动脉粥样硬化斑内(Wong，2002Cardiovasc.Path.11：332)。在非斑动脉区域中未观察到弗莱托肯趋化因子染色。
若干独立小鼠遗传研究已显示CX3CR1缺陷对动脉粥样硬化的有益效应。在喂养高脂肪饮食的CX3CRl-/-apoE-/-小鼠的两个独立衍生的品系中看到主动脉弧及胸主动脉中病灶面积减少以及斑中单核细胞/巨噬细胞累积降低(Combadière，2003；Circulation，107：1009，Lesnik，2003；J.Clin.Invest.111：333)。
此显示，CX3CR1参与心血管疾病且其活性的调节可提供有希望的疗法。因此，本领域需要具有有益药理性质的抵抗CX3CR1的拮抗剂分子，其可用作治疗剂在人类中治疗疾病，特别是心血管疾病。
因此，本发明的一个目标是提供抗CX3CR1拮抗剂分子，特别是对CX3CR1具有高结合亲和力的抗CX3CR1拮抗剂分子。
本发明的另一个目标是提供对CX3CR1具有高特异性的抗CX3CR1拮抗剂分子。
本发明的另一个目标是提供具有有效活性的抗CX3CR1拮抗剂。
本发明的另一个目标是提供具有有利生物利用度及半衰期的抗CX3CR1拮抗剂。
本发明的另一个目标是提供具有有利生物物理性质的抗CX3CR1拮抗剂。
本发明的其他目标包括任一上文所阐释目标的组合。
发明内容
本发明提供与人类CX3CR1结合且能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合的多肽。在一个方面中，该多肽是包含抗原结合域的免疫球蛋白，该抗原结合域包含三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3，其中该免疫球蛋白与人类CX3CR1结合且能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。在另一个方面中，该多肽包含一或多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中该多肽能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
在一个方面中，本发明多肽的特征在于一或多个以下性质：
●以高亲和力与人类CX3CR1结合；
●阻断可溶弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合；
●抑制弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用；
●抑制弗莱托肯趋化因子诱导的人类CX3CR1受体内在化(internalization)；
●以在人类CX3CR1的结合及功能抑制的E/IC50的10倍内的E/IC50与食蟹猴CX3CR1交叉反应。
在另一个方面中，本发明多肽包含抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域且还包含半衰期延长的部分，例如白蛋白结合部分、聚乙二醇分子或Fc域。在另一个方面中，本发明多肽包含两个或更多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。在一个方面中，该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是通过接头肽共价连接。在一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有相同氨基酸序列。在另一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有不同氨基酸序列。在一个方面中，本发明多肽包含两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域且还包含半衰期延长的部分，例如白蛋白结合部分、聚乙二醇分子或Fc域。
在一个方面中，本发明多肽包含通过第一接头肽与白蛋白结合部分共价连接的第一抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中该白蛋白结合部分进一步通过第二接头肽与第二抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域共价连接。
在一个方面中，本发明多肽包含通过接头肽与Fc域共价连接的抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。在一个方面中，包含通过接头肽与Fc域共价连接的抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域的该多肽是以(例如)借助二硫化物桥的二聚体形式提供。
本发明多肽是用于预防、治疗、缓和及/或诊断CX3CR1相关疾病、障碍或病症，特别是心血管疾病(例如动脉粥样硬化)。
在另一个方面中，本发明提供：
实施方案1：包含抗原结合域的免疫球蛋白，该抗原结合域包含三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3，其中该免疫球蛋白与人类CX3CR1结合且能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
实施方案2：包含一或多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中该多肽能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
实施方案3：根据实施方案2的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域基本上是由四个框架区(FR1、FR2、FR3及FR4)及三个互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)组成。
实施方案4：根据实施方案3的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
实施方案5：根据实施方案2至4中任一实施方案的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是抗体域。
实施方案6：根据实施方案5的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是VH、VL、VHH、骆驼化(camelized)VH或优化了稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性的VHH。
实施方案7：根据实施方案1至6中任一实施方案的多肽，其中所述多肽对人类CX3CR1在如下具有亲和力：
a)EC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM，如通过细胞结合FACS所测定的；或
b)IC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM，如通过竞争FACS所测定的。
实施方案8：根据实施方案1至7中任一实施方案的多肽，其中所述多肽以如下的IC50阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合：小于或等于300nM、或小于或等于100nM、或小于或等于20nM、或小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1nM。
实施方案9：根据实施方案1至8中任一实施方案的多肽，其中所述多肽以如以下的IC50抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用：小于或等于500nM、或小于或等于100nM、或小于或等于75nM、或小于或等于50nM、或小于或等于10nM或小于或等于5nM。
实施方案10：根据实施方案1至9中任一实施方案的多肽，其中所述多肽以如下的IC50抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子内在化：小于或等于10nM、或小于或等于5nM或小于或等于1nM。
实施方案11：根据实施方案3至10中任一实施方案的多肽，其中所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO：197)，其中：
-Xaa1是Pro、Ala或Gly；
-Xaa2是Asp或Asn；
-Xaa3是Thr或Ser；
-Xaa4是Arg、Lys、Ala或Gly；且
-Xaa5是Tyr或Phe。
实施方案12：根据实施方案3至11中任一实施方案的多肽，其中：
a)
-Xaa1是Pro、Ala或Gly；
-Xaa2是Asp或Asn；
-Xaa3是Thr；
-Xaa4是Arg或Lys；且
-Xaa5是Tyr，
及/或
b)其中所述CDR3选自SEQ ID No：186-190中的任一个。
实施方案13：根据实施方案3至12中任一实施方案的多肽，其中所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(SEQ ID NO：186)。
实施方案14：根据实施方案3至10中任一实施方案的多肽，其中：
i)所述CDR1：
a)具有SEQ ID NO：141的氨基酸序列；
b)具有与SEQ ID NO：141的氨基酸序列具有至少80％氨基酸一致性(identity)的氨基酸序列；
c)具有与SEQ ID NO：141的氨基酸序列具有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处S已变为T或G；
-于6位处S已变为R；
-于7位处N已变为T；及/或
-于9位处M已变为K；或
d)具有选自SEQ ID NO：141-145及213中的任一个的氨基酸序列；
ii)所述CDR2：
a)具有SEQ ID NO：164的氨基酸序列；
b)具有与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)具有与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于1位处G已变为A、L、V或S；
-于3位处N已变为D、S、Q、G或T；
-于4位处S已变为T、K、G或P；
-于5位处V已变为A；
-于6位处G已变为D；
-于7位处I已变为T或V；
-于8位处T已变为A；及/或
-于9位处K已变为R；或
d)具有选自SEQ ID NO：162-175及214-221中的任一个的氨基酸序列；且
iii)所述CDR3：
a)具有SEQ ID NO：186的氨基酸序列；
b)具有与SEQ ID NO：186的氨基酸序列具有至少70％氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)具有与SEQ ID NO：186的氨基酸序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处P已变为A或G；
-于7位处D已变为N；及/或
-于9位处R已变为K；或
d)具有选自SEQ ID NO：186-190中的任一个的氨基酸序列。
实施方案15：根据实施方案3至10中任一实施方案的多肽，其中
i)所述CDR1具有SEQ ID NO：146的氨基酸序列；
ii)所述CDR2具有a)与SEQ ID NO：176的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列：或b)具有SEQ ID NO：176或177的氨基酸序列；且
iii)所述CDR3具有SEQ ID NO：191的氨基酸序列。
实施方案16：根据实施方案3至10中任一实施方案的多肽，其中
i)所述CDR1：
a)具有SEQ ID NO：147的氨基酸序列；或
b)具有与SEQ ID NO：147的氨基酸序列具有6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于1位处G已变为K、R或A；
-于2位处T已变为I、P、S或L；
-于3位处I已变为V或T；
-于4位处F已变为L；
-于5位处S已变为R或D；
-于6位处N已变为S、T或D；及/或
-于7位处N已变为T或Y；或
c)具有选自SEQ ID NO：147-161中的任一个的氨基酸序列；
ii)所述CDR2：
a)具有SEQ ID NO：179的氨基酸序列；或
b)具有与SEQ ID NO：179的氨基酸序列具有4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于3位处S已变为T或G；
-于4位处N已变为S或I；
-于5位处S已变为T；
-于6位处G已变为Y；及/或
-于8位处T已变为A；或
c)具有选自SEQ ID NO：178-185中的任一个的氨基酸序列；且
iii)所述CDR3：
a)具有SEQ ID NO：192的氨基酸序列；或
b)具有与SEQ ID NO：192的氨基酸序列具有至少80％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)具有与SEQ ID NO：192的氨基酸序列具有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处A已变为G；
-于8位处T已变为S；
-于9位处A已变为G；及/或
-于位10处Y已变为F；或
d)具有选自SEQ ID NO：192-196中的任一个的氨基酸序列。
实施方案17：根据实施方案3的多肽，其中所述CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列阐述于以下中：
-分别为SEQ ID No：141、162及186；或
-分别为SEQ ID No：141、163及187；或
-分别为SEQ ID No：141、164及186；或
-分别为SEQ ID No：141、166及186；或
-分别为SEQ ID No：141、167及186；或
-分别为SEQ ID No：141、167及189；或
-分别为SEQ ID No：141、168及186；或
-分别为SEQ ID No：141、168及187；或
-分别为SEQ ID No：141、169及190；或
-分别为SEQ ID No：141、170及186；或
-分别为SEQ ID No：141、171及186；或
-分别为SEQ ID No：141、174及186；或
-分别为SEQ ID No：141、175及187；或
-分别为SEQ ID No：142、165及188；或
-分别为SEQ ID No：142、173及188；或
-分别为SEQ ID No：143、164及186；或
-分别为SEQ ID No：144、172及187；或
-分别为SEQ ID No：145、172及187；或
-分别为SEQ ID No：141、214及186；或
-分别为SEQ ID No：141、215及186；或
-分别为SEQ ID No：141、216及186；或
-分别为SEQ ID No：141、217及186；或
-分别为SEQ ID No：141、218及186；或
-分别为SEQ ID No：141、219及186；或
-分别为SEQ ID No：141、220及186；或
-分别为SEQ ID No：213、221及186；或
-分别为SEQ ID No：213、214及186。
实施方案18：根据实施方案3的多肽，其中实施CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列阐述于以下中：
-分别为SEQ ID No：146、176及191；或
-分别为SEQ ID No：146、177及191。
实施方案19：根据实施方案3的多肽，其中实施CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列阐述于以下中：
-分别为SEQ ID No：147、178及192；或
-分别为SEQ ID No：147、179及192；或
-分别为SEQ ID No：147、179及194；或
-分别为SEQ ID No：148、179及193；或
-分别为SEQ ID No：149、179及192；或
-分别为SEQ ID No：149、180及192；或
-分别为SEQ ID No：149、181及192；或
-分别为SEQ ID No：149、183及192；或
-分别为SEQ ID No：149、185及192；或
-分别为SEQ ID No：150、179及194；或
-分别为SEQ ID No：150、182及194；或
-分别为SEQ ID No：151、179及193；或
-分别为SEQ ID No：151、182及194；或
-分别为SEQ ID No：151、184及196；或
-分别为SEQ ID No：152、179及195；或
-分别为SEQ ID No：153、179及194；或
-分别为SEQ ID No：154、182及194；或
-分别为SEQ ID No：155、179及195；或
-分别为SEQ ID No：156、181及192；或
-分别为SEQ ID No：157、179及194；或
-分别为SEQ ID No：158、179及192；或
-分别为SEQ ID No：159、178及192；或
-分别为SEQ ID No：160、179及194；或
-分别为SEQ ID No：161、179及194。
实施方案20：根据实施方案3的多肽，其中所述CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列阐述于以下中：分别为SEQ ID NO：141、164及186，或分别为SEQ ID NO：141、162及186。
实施方案21：根据实施方案3的多肽，其中所述CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列阐述于以下中：分别为SEQ ID NO：213、214及186，分别为SEQ ID NO：213、221及186，或分别为SEQ ID NO：141、162及186。
实施方案22：根据实施方案2至10中任一实施方案的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：1-48、121-140或222-224中的任一个的氨基酸序列。
实施方案23：根据实施方案2至10中任一实施方案的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少95％氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：49-52中的任一个的氨基酸序列。
实施方案24：根据实施方案2至10中任一实施方案的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：67的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：53-120中的任一个的氨基酸序列。
实施方案25：根据实施方案2的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所述的序列。
实施方案26：根据实施方案2的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中的任一个中所述的序列。
实施方案27：根据上文实施方案中的任一实施方案的多肽，其针对稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性经人源化及/或优化。
实施方案28：根据实施方案27的多肽，其在以下位置(根据Kabat编号)中的一或多处经人源化及/或序列优化：1、11、14、16、74、83、108。
实施方案29：根据实施方案28的多肽，其包含以下突变中的一或多个：E1D、S11L、A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L。
实施方案30：根据实施方案3至29中任一实施方案的多肽，其中：
i)FR1选自SEQ ID NO：198-204；
ii)FR2选自SEQ ID NO：205-208；
iii)FR3选自SEQ ID NO：209-210；及/或
iv)FR4选自SEQ ID NO：211-212。
实施方案31：根据实施方案3至30中任一实施方案的多肽，其在以下位置(根据Kabat编号)中的一或多处经人源化及/或序列优化：52、53。
实施方案32：根据实施方案31的多肽，其包含以下突变中的一或多个：N52S、S53T。
实施方案33：根据实施方案3至32中任一实施方案的多肽，其中CDR2选自SEQ IDNO：214-221。
实施方案34：根据实施方案2至33中任一实施方案的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：138-140或222-224中的任一个中所述的序列。
实施方案35：根据实施方案22至26中任一实施方案的多肽，其中所述VHH域是由所述氨基酸序列中的任一个组成。
实施方案36：根据实施方案2至35中任一实施方案的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域交叉阻断SEQ ID NO：1-120、121-140及222-224的免疫球蛋白单一可变域中的至少一个与CX3CR1的结合。
实施方案37：根据实施方案2至35中任一实施方案的多肽，其中通过SEQ ID NO：1-120、121-140及222-224的氨基酸序列中的至少一个交叉阻断所述免疫球蛋白单一可变域与CX3CR1结合。
实施方案38：根据实施方案2至37中任一实施方案的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长的部分。
实施方案39：根据实施方案38的多肽，其中所述半衰期延长的部分与所述多肽共价连接且选自白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段、白蛋白结合肽或Fc域。
实施方案40：根据实施方案38或39的多肽，其中所述半衰期延长的部分是由抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域组成。
实施方案41：根据实施方案40的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自VHH域、人源化VHH域、骆驼化VH域、域抗体、单一域抗体及/或“dAb”。
实施方案42：根据实施方案41的多肽，其中所述抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域选自SEQ ID NO：230-232。
实施方案43：根据实施方案2至39中任一实施方案的多肽，其中所述多肽任选地经合适的接头或铰链区与Fc部分(例如人类Fc，例如如SEQ ID NO：252中所阐释)连接。
实施方案44：根据实施方案2至39中任一实施方案的多肽，其中所述多肽进一步与以下部分连接：一或多个恒定域(例如，2个或3个可用作Fc部分的一部分/用于形成Fc部分的恒定域)、Fc部分及/或赋予本发明多肽以一或多个效应器功能及/或可赋予任选地经合适的接头或铰链区与一或多个Fc受体结合的能力的一或多个抗体部分、片段或域。
实施方案45：根据实施方案2至37中任一实施方案的多肽，其中所述多肽还包含第二免疫球蛋白单一可变域、优选第二抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。
实施方案46：根据实施方案45的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域通过接头肽共价连接。
实施方案47：根据实施方案45或46的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域基本上是由四个框架区(FR1至FR4)及三个互补决定区(CDR1至CDR3)组成。
实施方案48：根据实施方案45至47中任一实施方案的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域是抗体域。
实施方案49：根据实施方案45至48中任一实施方案的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域是VH、VL、VHH、骆驼化VH或优化了稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性的VHH。
实施方案50：根据实施方案45至49中任一实施方案的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域的所述CDR1至CDR3如实施方案11至21中的任一个所述。
实施方案51：根据实施方案45至50中任一实施方案的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含相同CDR3。
实施方案52：根据实施方案51的多肽，其中所述CDR3如实施方案11至13中的任一个所述。
实施方案53：根据实施方案45至53中任一实施方案的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含相同CDR1、CDR2及CDR3。
实施方案54：根据实施方案53的多肽，其中所述CDR1至CDR3如实施方案11至21中的任一个所述。
实施方案55：根据实施方案45至54中任一实施方案的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含相同VHH域。
实施方案56：根据实施方案45至55中任一实施方案的多肽，其中所述VHH域如实施方案22至37中的任一个所述。
实施方案57：包含第一免疫球蛋白单一可变域及如实施方案2至37中的任一个中所述的第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，该第一免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：141、164及186或SEQ ID NO：141、162及186所述的CDR1、CDR2及CDR3。
特别是，该多肽是根据实施方案45至56中的任一个的多肽。
实施方案58：根据实施方案57的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：213、214及186、SEQ ID NO：213、221及186或SEQ ID NO：141、162及186中所述的CDR1、CDR2及CDR3。
实施方案59：根据实施方案57或58的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：141、164及186或SEQ ID NO：141、162及186所述的CDR1、CDR2及CDR3。
实施方案60：根据实施方案57或58的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域包含如下CDR1、CDR2及CDR3：SEQ ID NO：213、214及186、SEQ ID NO：213、221及186或SEQ IDNO：141、162及186。
实施方案61：包含第一免疫球蛋白单一可变域及根据实施方案2至37中任一实施方案的第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域是包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所述序列的VHH域。
特别是，该多肽是根据实施方案45至60中的任一个的多肽。
实施方案62：根据实施方案61的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域是包含SEQ ID NO：121-140或222-224中任一个所述的序列的VHH域。
实施方案63：根据实施方案61或62的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域是包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所述的序列的VHH域。
实施方案64：根据实施方案63的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域是包含SEQ ID NO：121-140或222-224中任一个所述的序列的VHH域。
实施方案65：根据实施方案45至64中任一实施方案的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长的部分。
实施方案66：根据实施方案65的多肽，其中所述半衰期延长的部分与所述多肽共价连接且选自白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段、白蛋白结合肽或Fc域。
实施方案67：根据实施方案66的多肽，其中所述半衰期延长的部分是由抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域组成。
实施方案68：根据实施方案67的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自VHH域、人源化VHH域、骆驼化VH域、域抗体、单一域抗体及/或“dAb”。
实施方案69：根据实施方案68的多肽，其中所述抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域选自SEQ ID NO：230-232。
实施方案70：根据实施方案45至64中任一实施方案的多肽，其中所述多肽任选地经合适的接头或铰链区与Fc部分(例如人类Fc，例如如SEQ ID NO：252中所阐释)连接。
实施方案71：根据实施方案45至66中任一实施方案的多肽，其中所述多肽进一步与以下部分连接：一或多个恒定域(例如，2个或3个可用作Fc部分的一部分/用于形成Fc部分的恒定域)、Fc部分及/或赋予本发明多肽以一或多个效应器功能及/或可赋予任选地经合适的接头或铰链区与一或多个Fc受体结合的能力的一或多个抗体部分、片段或域。
实施方案72：包含SEQ ID NO：225-227中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案73：包含SEQ ID NO：249或277-281中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案74：包含SEQ ID NO：257-262中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案75：包含SEQ ID NO：253或254中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案76：包含SEQ ID NO：263或266中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案77：包含SEQ ID NO：267-276及282中的任一个的氨基酸序列的多肽。
实施方案78：包含编码根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的区的核酸分子。
实施方案79：包含根据实施方案78的核酸分子的表达载体。
实施方案80：携带包含核酸分子的表达载体的宿主细胞，所述核酸分子包含编码根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的区，其中所述宿主细胞能够表达根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽，且其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
实施方案81：包含以下的药物组合物：(i)作为活性成分的根据实施方案1至77中任一实施方案的一或多种多肽、及(ii)药学上可接受的载体、及任选地(iii)稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂。
实施方案82：制造根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的方法，其包含以下步骤：
-在容许表现根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的条件下培养宿主细胞，
其中携带包含核酸分子的表达载体的所述宿主细胞，所述核酸分子包含编码根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的区，且其中所述宿主细胞是原核或真核细胞；
-回收所述多肽；及
-纯化所述多肽。
实施方案83：使用根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽在(特别是)人类中治疗、预防或缓和疾病、障碍或病症的方法。
实施方案84：如实施方案83的方法，其中所述疾病、障碍或病症是CX3CR1相关疾病、障碍或病症。
实施方案85：如实施方案83的方法，其中所述疾病、障碍或病症是动脉粥样硬化。
实施方案86：包含根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的可注射药物组合物，该组合物适于在人类中静脉内或皮下注射。
实施方案87：预防及/或治疗与CX3CR1相关的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向有此需要的个体给药药学上活性量的根据实施方案1至77中任一实施方案的至少一种多肽。
实施方案88：如实施方案85的方法，其还包含给药选自他汀类(statin)、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病剂及抗高血压剂的其他治疗剂。
实施方案89：抑制哺乳动物细胞中CX3CR1与弗莱托肯趋化因子结合的方法，其包括向细胞给药根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽，因此抑制通过弗莱托肯趋化因子介导的信号传导。
实施方案90：检测及/或量化生物样品中的CX3CR1水平的方法，其通过将样品与根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽接触并检测多肽与CX3CR1的结合来实现。
实施方案91：诊断CX3CR1相关病症或确定个体是否具有患CX3CR1相关病症的增加的风险的方法，其中该方法包含将来自个体的生物样品与根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽接触及检测多肽与CX3CR1的结合以测定CX3CR1的表达或浓度。
实施方案92.用于在人类中治疗、预防或缓和疾病、障碍或病症的根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽。
实施方案93.根据实施方案92使用的多肽，其中所述疾病、障碍或病症是CX3CR1相关疾病、障碍或病症。
实施方案94.根据实施方案92使用的多肽，其中所述疾病、障碍或病症选自心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)及华格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis))、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
实施方案95.根据实施方案92使用的多肽，其中所述疾病、障碍或病症是动脉粥样硬化。
实施方案96.根据实施方案1至77中的任一个的多肽在制备用于在人类中治疗、预防或缓和疾病、障碍或病症的药物中的用途。
实施方案97.根据实施方案87的方法，其中所述疾病或病症选自心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及华格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
实施方案98.根据实施方案87的方法，其中所述疾病、障碍或病症是动脉粥样硬化。
实施方案99.包含根据实施方案1至77中任一实施方案的多肽的诊断试剂盒或诊断方法或其用途。
实施方案100.根据实施方案99的诊断试剂盒或诊断方法，其用于诊断至少一种以下疾病：心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及华格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
发明详述
定义
根据本文中的其他说明，本发明的以上及其他方面及实施方案将变得显而易见，其中：
a)除非另外指明或定义，否则所用的所有术语具有其本领域的常用含义，此为本领域技术人员将了解的。参照(例如)标准手册，例如Sambrook等人，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”(第2版)，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)，及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower Medical Publishing，London，New York(1989)，以及本文所引用的一般背景；此外，除非另外指明，否则可以本身已知的方法实施并已实施未详细地具体阐述的所有方法、步骤、技术及操作，如本领域技术人员将了解的。再次参照(例如)标准手册、上文所提及的一般背景技术及其中引用的其他参考文献。
b)除非另外指明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”-不论在本文中用于指重链抗体或常规4链抗体-是用作包括全长抗体、其个别链以及其所有部分、域或片段(分别包括(但不限于)抗原结合域或片段，例如VHH域或VH/VL域)的一般术语。另外，除非上下文需要更有限解释，否则本文所用术语“序列”(例如，在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”等术语中)通常应理解为包括编码其的相关氨基酸序列以及核酸序列或核苷酸序列。
c)本文所用术语(多肽或蛋白质的)“域”是指折叠蛋白质结构，其具有保留其独立于蛋白质的剩余部分的三级结构的能力。通常，域负责蛋白质的离散功能性质，且在许多情形下可添加、移除或转移至其他蛋白质中而不损失蛋白质及/或域的剩余部分的功能。
d)本文所用术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体或重链抗体的链)的球形区，或是指基本上是由此球形区组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性，其由布置成2个β片且任选地由保守二硫键稳定的约7条反平行β链的2层夹层组成。
e)本文所用术语“免疫球蛋白可变域”意指基本上是由4个“框架区”组成的免疫球蛋白域，这些框架区在本领域及下文中分别称作“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”及“框架区4”或“FR4”，这些框架区杂有3个“互补决定区”或“CDR”，其在本领域及下文中分别称作“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，可如下指示免疫球蛋白可变域的通用结构或序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性。
f)本文所用术语“免疫球蛋白单一可变域”及“单一可变域”意指能够与抗原的表位特异性结合而不与另一可变免疫球蛋白域配对的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一实例是“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例是下文所定义骆驼化“VHH域”(或简写为“VHH”)。
鉴于上述定义，常规4链抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知)或源自该常规4链抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫键键结的Fv或scFv片段)或双抗体(所有均为本领域已知)的抗原结合域通常将不被视为免疫球蛋白单一可变域，因为在这些情形下通常将不由一个(单一)免疫球蛋白域而是由一对(结合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即由与各别抗原的表位共同结合的免疫球蛋白域的VH-VL对与抗原的各别表位结合。
f1)“VHH域”也称作VHH、VHH域、VHH抗体片段及VHH抗体，其最初阐述为“重链抗体”(即“无轻链的抗体”；Hamers-Casterman C、Atarhouch T、Muyldermans S、Robinson G、Hamers C、Songa EB、Bendahman N、Hamers R.：“Naturally occurring antibodiesdevoid of light chains”；Nature 363，446-448(1993))的抗原结合免疫球蛋白(可变)域。选择术语“VHH域”以区分这些可变域与常规4链抗体中存在的重链可变域(其在本文中称作“VH域”或“VH域”)及常规4链抗体中存在的轻链可变域(其在本文中称作“VL域”或“VL域”)。VHH域可在无另一抗原结合域情况下与表位特异性结合(与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情形下由VL域与VH域一起识别表位)。VHH域是由单一免疫球蛋白域形成的小的稳健且有效抗原识别单元。
在本发明上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及及“域”(“纳米抗体”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用且可代表免疫球蛋白单一可变域(具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4并与表位特异性结合而无需第二免疫球蛋白可变域的存在)，且通过如(例如)WO2009/109635的图1中所定义所谓“标志残基”将其与VH域区分。
根据Kabat等人所给的针对VH域的通用编号对VHH域的氨基酸残基编号(“Sequence of proteins ofimmunologicalinterest”，US Public Health Services，NIHBethesda，MD，公开第91号)，如适于来自骆驼化VHH域如(例如)Riechmann andMuyldermans，J.Immunol.Methods 231，25-38(1999)的图2中所显示。根据此编号，
-FR1包含1位至30位处的氨基酸残基，
-CDR1包含31位至35位处的氨基酸残基，
-FR2包含36位至49位处的氨基酸，
-CDR2包含50位至65位处的氨基酸残基，
-FR3包含66位至94位处的氨基酸残基，
-CDR3包含95位至102位处的氨基酸残基，且
-FR4包含103位至113位处的氨基酸残基。
然而，应注意-如针对VH域及VHH域本领域所熟知-CDR中的每一个中的氨基酸残基的总数量可有所变化且可不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数量(即，实际序列中可不占据根据Kabat编号的一或多个位置，或实际序列可含有比由Kabat编号容许的数量更多的氨基酸残基)。这指的是，根据Kabat的编号通常可对应于或可不对应于实际序列中的氨基酸残基的实际编号。
本领域已知对VH域的氨基酸残基编号的替代方法，这些方法也可以相似方式适于VHH域。然而，除非另外指明，否则在本发明说明书、权利要求书及图中，遵循如上文所述根据Kabat且适于VHH域的编号。
VHH域中的氨基酸残基的总数量通常将在110至120的范围内，经常介于112与115之间。然而，应注意，较小且较长序列也可适于本文所述目的。
VHH域及含有其的多肽的其他结构特性及功能性质可总结如下：
VHH域(其已经天然“设计”以在不存在轻链可变域且不与轻链可变域相互作用的情况下与抗原功能结合)可用作单一且相对较小的功能性抗原结合结构单元、域或多肽。此区分VHH域与常规4链抗体的VH及VL域，这些VH及VL域自身通常不适于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变域进行实践应用，但需要以某种形式或另一形式组合以提供功能性抗原结合单元(如呈(例如)诸如Fab片段等常规抗体片段的形式；呈由与VL域共价连接的VH域组成的scFv的形式)。
由于这些独特性质，使用VHH域-单独或作为较大多肽的一部分-提供许多优于使用常规VH及VL域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势：
-仅需要单一域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独域，也不需要确保该两个域以适当空间构象及构型存在(即与scFv一般，借助使用经特别设计的接头)；
-VHH域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH域可容易地改造成多价及多特异性格式(如本文进一步论述)；
-VHH域高度可溶且无聚集(如Ward等人，Nature 341：544-546(1989)所述的小鼠源性抗原结合域一样)趋势；
-VHH域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；
-VHH域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此。例如，VHH域及含有其的多肽可使用微生物发酵(例如，如下文进一步阐述)产生且如(例如)常规抗体片段一样不需使用哺乳动物表达系统；
-VHH域与常规4链抗体及其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，且因此相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，
--显示较高的组织渗透性且
--可以较高剂量给药。
-VHH域可显示所谓腔结合性质(尤其由于与常规VH域相比其延长的CDR3环)且从而也可到达常规4链抗体及其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
先前已在(例如)WO2006/040153及WO2006/122786中阐述获得与特异性抗原或表位结合的VHH域的方法。其中也详细阐述，源自骆驼化VHH域可通过出现在通常来自人类的4链抗体的VH域中的相应位置处一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中一或多个氨基酸残基来进行“人源化”。人源化VHH域可含有一或多个完整人类框架区序列，且在甚至更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分的人类框架区序列，其任选地与JH序列(例如JH5)组合。
f2)“域抗体(Domain antibodies)”也称作“Dab”及“dAb”(术语“域抗体”及“dAb”是GlaxoSmithKline公司集团使用的商标)，其阐述于(例如)Ward，E.S.等人：“Bindingactivities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secretedfrom Escherichia coli”；Nature 341：544-546(1989)；Holt，L.J.等人：“Domainantibodies：proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology 21(11)：484-490(2003)；及WO2003/002609中。
域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物，特别是人类4链抗体的VH或VL域。为结合作为单一抗原结合域的表位，即不分别与VL或VH域配对，需要通过(例如)使用人类单一VH或VL域序列的文库明确选择这些抗原结合性质。
与VHH一样，域抗体具有大约13kDa至大约16kDa的分子量，且若源自完整人类序列，则不需要针对(例如)用于人类的治疗用途进行人源化。如在VHH域的情形下，其也在原核表达系统中充分表达，从而显著降低整体制造成本。
域抗体及VHH域可通过在一或多个CDR的氨基酸序列中引入一或多个改变来进行亲和力突变，这些改变导致与各别亲本分子相比，可以改善所得免疫球蛋白单一可变域对其各别抗原的亲和力。本发明的亲和力成熟免疫球蛋白单一可变域分子可通过本领域已知的方法制得，如(例如)Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas，等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson and RE Hawkins，“Affinitymaturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996所述。
f3)此外，本领域技术人员也将了解，可将上文所提及一或多个CDR“移植”于其他“架构”(包括(但不限于)人类架构或非免疫球蛋白架构)上。本领域已知适宜架构及该CDR移植的技术。
g)术语“表位”及“抗原决定簇”可互换使用，其是指由抗原结合分子(例如本发明常规抗体或多肽)且更特别是由这些分子的抗原结合位点识别的大分子(例如多肽)的一部分。表位界定免疫球蛋白的最小结合位点，且因此代表免疫球蛋白的特异性的靶。
抗原结合分子(例如本发明常规抗体或多肽)中识别表位的部分称作互补位。
h)本文所用术语“双互补位”(抗原-)结合分子或“双互补位”多肽应意指如本文所定义包含第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中该两个可变域能够与一抗原的两个不同表位结合，这些表位通常不同时由一单特异性免疫球蛋白(例如常规抗体或一免疫球蛋白单一可变域)结合。双互补位多肽可由具有不同表位特异性的可变域，且不含与同一表位结合的互补可变域对组成。因此，该两个可变域不彼此竞争与靶结合。
i)据称可与某一表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)“结合”或“特异性结合”且对其“具有亲和力”及/或“具有特异性”的多肽(例如本发明免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域、或通常抗原结合分子或其片段)是“针对”(“against”或“directedagainst”)该表位、抗原或蛋白质或涉及该表位、抗原或蛋白质的“结合”分子，据称该多肽是“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质(例如抗CX3CR1)。
k)术语“特异性”通常是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或多肽)可结合的不同类型抗原或表位的数量。抗原结合蛋白的特异性可基于其亲和力及/或亲合力测定。亲和力由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)代表，其是表位与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值愈小，则表位与抗原结合分子之间的结合强度愈强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其是1/KD)。如本领域技术人员将了解的(例如，基于本文其他揭示内容)，视目标特异性抗原而定，可以本身已知方式测定亲和力。亲合力是抗原结合分子(例如本发明免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或多肽)与有关抗原之间的结合强度的量度。亲合力(Avidity)与表位与其在抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力及抗原结合分子上存在的有关结合位点的数量有关。
1)根据标准的三个字母或一个字母氨基酸代码指示氨基酸残基，如本领域通常所知并认可。在比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差别”是指与第二序列相比在参照序列位置处的所指示数量的氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情形下，该(等)取代优选为保守氨基酸取代，这指的是氨基酸残基经具有相似化学结构且对多肽的功能、活性或其他生物性质具有极小或基本上无影响的另一氨基酸残基替代。这些保守氨基酸取代已为本领域自(例如)WO 98/49185所熟知，其中保守氨基酸取代优选是以下群组(i)-(v)中的一氨基酸经同一群组中的另一氨基酸残基取代的取代：(i)小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性、带正电荷的残基：His、Arg及Lys；(iv)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳香族残基：Phe、Tyr及Trp。尤其是优选保守氨基酸取代是如以下：
Ala取代为Gly或取代为Ser；
Arg取代为Lys；
Asn取代为Gln或取代为His；
Asp取代为Glu；
Cys取代为Ser；
Gln取代为Asn；
Glu取代为Asp；
Gly取代为Ala或取代为Pro；
His取代为Asn或取代为Gln；
Ile取代为Leu或取代为Val；
Leu取代为Ile或取代为Val；
Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；
Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；
Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；
Ser取代为Thr；
Thr取代为Ser；
Trp取代为Tyr；
Tyr取代为Trp或取代为Phe；
Val取代为Ile或取代为Leu。
m)例如，在与获得核酸或多肽分子的天然生物来源及/或反应培养基或培养基相比时-若核酸或多肽分子已与通常在该来源或培养基中与其结合的至少一种其他组份(例如另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物组份或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组份)分离，则将其视为“(呈)基本上分离(形式)”。特别是，若核酸或多肽分子已纯化至少2倍，特别是至少10倍、更特别是至少100倍及高达1000倍或更多倍，则将其视为“基本上分离”。“呈基本上分离形式”的核酸或多肽分子优选基本上均匀，如使用适宜技术(例如适宜层析技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳)所测定。
n)例如两个免疫球蛋白单一可变域序列之间的“序列一致性”指示该两个序列之间一致的氨基酸的百分比。其可如WO08/020079第49及50页上第f)段中所述计算或测定。“序列相似性”指示一致或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
靶特异性
本发明多肽对人类CX3CR1具有特异性。因此，本发明多肽优选与人类CX3CR1(SEQID NO：255)结合。在一个方面中，本发明多肽也与食蟹猴CX3CR1(SEQ ID NO：256)结合。
本发明多肽
本发明提供预防、治疗、缓和及/或诊断CX3CR1相关疾病、障碍或病症(例如心血管疾病)的新的药学上的活性剂。特别是，本发明提供与人类CX3CR1结合且能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合的多肽。在一个方面中，该多肽是包含抗原结合域的免疫球蛋白，该抗原结合域包含三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3，其中该免疫球蛋白与人类CX3CR1结合且能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。在另一个方面中，该多肽包含一或多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中该多肽能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
在一个方面中，本发明多肽的特征在于一或多个以下性质：
●以高亲和力与人类CX3CR1结合，例如EC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM，如通过细胞结合FACS所测定的；
●以(例如)如下的IC50阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合：小于或等于300nM、或小于或等于100nM、或小于或等于20nM、或小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1nM；
●以(例如)如下的IC50抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用：小于或等于500nM或小于或等于100nM、或小于或等于75nM、或小于或等于50nM、或小于或等于10nM或小于或等于5nM；所获得的抑制效力超过或等于15％、或超过或等于50％、或超过或等于80％或超过或等于95％；
●以(例如)如下的IC50抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子诱导的内在化：小于或等于10nM或小于或等于5nM；
●以在(例如)人类CX3CR1的结合及功能抑制的E/IC50的10倍内的E/IC50与食蟹猴CX3CR1交叉反应。
在另一个方面中，本发明多肽还包含半衰期延长的部分，例如白蛋白结合部分、聚乙二醇分子或Fc域。在另一个方面中，本发明多肽包含两个或更多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。在一个方面中，该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是通过接头肽共价连接。在一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有相同氨基酸序列。在另一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有不同氨基酸序列。在一个方面中，本发明多肽包含两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域且还包含半衰期延长的部分，例如白蛋白结合部分、聚乙二醇分子或Fc域。
在一个方面中，本发明多肽包含通过第一接头肽与白蛋白结合部分共价连接的第一抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中该白蛋白结合部分进一步通过第二接头肽与第二抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域共价连接。
在一个方面中，本发明多肽包含通过接头肽与Fc域共价连接的抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。在一个方面中，包含通过接头肽与Fc域共价连接的抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域的该多肽是以(例如)借助二硫化物桥的二聚体形式提供。
本发明多肽是如下文所述获得。总而言的，自表达源自用编码人类CX3CR1的DNA进行免疫的骆驼(llama)的单一可变域(VHH)的文库识别本发明单一可变域。在hCX3CR1病毒性脂质颗粒上淘选噬菌体文库，且针对竞争与Alexa-fluor标记弗莱托肯趋化因子(AF-FKN)结合的受体的能力筛选结合噬菌体。本文进一步阐述本发明的代表性单一可变域。
在一个方面中，本发明的免疫球蛋白单一可变域基本上是由四个框架区(FR1、FR2、FR3及FR4)及三个互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)组成。特别是，免疫球蛋白单一可变域具有结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在一个方面中，免疫球蛋白单一可变域是抗体域。
在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明的免疫球蛋白单一域的CDR3具有SEQID NO：197中所阐释的氨基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5，其中：
-Xaa1是Pro、Ala或Gly；
-Xaa2是Asp或Asn；
-Xaa3是Thr或Ser；
-Xaa4是Arg、Lys、Ala或Gly；且
-Xaa5是Tyr或Phe。
在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域的CDR3具有SEQ IDNO：197中所阐释的氨基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5，其中：
-Xaa1是Pro、Ala或Gly；
-Xaa2是Asp或Asn；
-Xaa3是Thr；
-Xaa4是Arg或Lys；且
-Xaa5是Tyr。
在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域的CDR3具有SEQ IDNO：186中所阐释的Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：
-CDR1：
a)具有氨基酸序列GSIFSSNAMA(SEQ ID NO：141)；或
b)具有与SEQ ID NO：141的氨基酸序列具有至少80％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)具有与SEQ ID NO：141的氨基酸序列具有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处S已变为T或G；
-于6位处S已变为R；
-于7位处N已变为T；及/或
-于9位处M已变为K；或
d)具有选自SEQ ID NO：141-145及213中的任一个的氨基酸序列；
-CDR2：
a)具有氨基酸序列GINSVGITK(SEQ ID NO：164)；或
b)具有与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)具有与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于1位处G已变为A、L、V或S；
-于3位处N已变为D、S、Q、G或T；
-于4位处S已变为T、K、G或P；
-于5位处V已变为A；
-于6位处G已变为D；
-于7位处I已变为T或V；
-于8位处T已变为A；及/或
-于9位处K已变为R；或
d)具有选自SEQ ID NO：162-175及214-221中的任一个的氨基酸序列；且
-CDR3：
a)具有氨基酸序列DPRRGWDTRY(SEQ ID NO：186)；或
b)具有与SEQ ID NO：186的氨基酸序列具有至少70％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)具有与SEQ ID NO：186的氨基酸序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处P已变为A或G；
-于7位处D已变为N；及/或
-于9位处R已变为K；或
d)具有选自SEQ ID NO：186-190中的任一个的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3，其中：
-该CDR1具有氨基酸序列GRTFSSYAMG(SEQ ID NO：146)；
-该CDR2具有a)与氨基酸序列GISGSASRKY(SEQ ID NO：176)具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列，或b)具有SEQ ID NO：176或177的氨基酸序列；且
-该CDR3具有氨基酸序列SNSYPKVQFDY(SEQ ID NO：191)。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：
-该CDR1：
a)具有氨基酸序列GTIFSNNAMG(SEQ ID NO：147)；或
b)具有与SEQ ID NO：147的氨基酸序列具有6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于1位处G已变为K、R或A；
-于2位处T已变为I、P、S或L；
-于3位处I已变为V或T；
-于4位处F已变为L；
-于5位处S已变为R或D；
-于6位处N已变为S、T或D；及/或
-于7位处N已变为T或Y；或
c)具有选自SEQ ID NO：147-161中的任一个的氨基酸序列；
-该CDR2：
a)具有氨基酸序列SISNSGSTN(SEQ ID NO：179)；或
b)具有与SEQ ID NO：179的氨基酸序列具有4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于3位处S已变为T或G；
-于4位处N已变为S或I；
-于5位处S已变为T；
-于6位处G已变为Y；及/或
-于8位处T已变为A；或
c)具有选自SEQ ID NO：178-185中的任一个的氨基酸序列；且
-该CDR3：
a)具有氨基酸序列DARRGWNTAY(SEQ ID NO：192)；或
b)具有与SEQ ID NO：192的氨基酸序列具有至少80％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)具有与SEQ ID NO：192的氨基酸序列具有2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中
-于2位处A已变为G；
-于8位处T已变为S；
-于9位处A已变为G；及/或
-于位10处Y已变为F；或
d)具有选自SEQ ID NO：192-196中的任一个的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：
-分别为SEQ ID No：141、162及186；或
-分别为SEQ ID No：141、163及187；或
-分别为SEQ ID No：141、164及186；或
-分别为SEQ ID No：141、166及186；或
-分别为SEQ ID No：141、167及186；或
-分别为SEQ ID No：141、167及189；或
-分别为SEQ ID No：141、168及186；或
-分别为SEQ ID No：141、168及187；或
-分别为SEQ ID No：141、169及190；或
-分别为SEQ ID No：141、170及186；或
-分别为SEQ ID No：141、171及186；或
-分别为SEQ ID No：141、174及186；或
-分别为SEQ ID No：141、175及187；或
-分别为SEQ ID No：142、165及188；或
-分别为SEQ ID No：142、173及188；或
-分别为SEQ ID No：143、164及186；或
-分别为SEQ ID No：144、172及187；或
-分别为SEQ ID No：145、172及187；或
-分别为SEQ ID No：141、214及186；或
-分别为SEQ ID No：141、215及186；或
-分别为SEQ ID No：141、216及186；或
-分别为SEQ ID No：141、217及186；或
-分别为SEQ ID No：141、218及186；或
-分别为SEQ ID No：141、219及186；或
-分别为SEQ ID No：141、220及186；或
-分别为SEQ ID No：213、221及186；或
-分别为SEQ ID No：213、214及186。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：
-分别为SEQ ID No：146、176及191；或
-分别为SEQ ID No：146、177及191。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有以下CDR1、CDR2及CDR3：
-分别为SEQ ID No：147、178及192；或
-分别为SEQ ID No：147、179及192；或
-分别为SEQ ID No：147、179及194；或
-分别为SEQ ID No：148、179及193；或
-分别为SEQ ID No：149、179及192；或
-分别为SEQ ID No：149、180及192；或
-分别为SEQ ID No：149、181及192；或
-分别为SEQ ID No：149、183及192；或
-分别为SEQ ID No：149、185及192；或
-分别为SEQ ID No：150、179及194；或
-分别为SEQ ID No：150、182及194；或
-分别为SEQ ID No：151、179及193；或
-分别为SEQ ID No：151、182及194；或
-分别为SEQ ID No：151、184及196；或
-分别为SEQ ID No：152、179及195；或
-分别为SEQ ID No：153、179及194；或
-分别为SEQ ID No：154、182及194；或
-分别为SEQ ID No：155、179及195；或
-分别为SEQ ID No：156、181及192；或
-分别为SEQ ID No：157、179及194；或
-分别为SEQ ID No：158、179及192；或
-分别为SEQ ID No：159、178及192；或
-分别为SEQ ID No：160、179及194；或
-分别为SEQ ID No：161、179及194。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有如下CDR1、CDR2及CDR3：
-SEQ ID NO：141、164及186；或
-SEQ ID NO：141、162及186。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一域具有如下CDR1、CDR2及CDR3：
-SEQ ID NO：213、214及186；或
-SEQ ID NO：213、221及186；或
-SEQ ID NO：141、162及186。
具有上文所述CDR的本发明代表性多肽是显示于表1、表2、表3(分别如家族101、9及13的代表性多肽)及表4(家族101的优化变体的代表性多肽)中。
表1：家族101
*根据Antibody Engineering，第2卷，Konetermann及Dübel(编辑)，SpringerVerlag Heidelberg Berlin，2010测定CDR序列。表(SEQ)中的序列编号是指本申请的序列清单中的序列。
表2：家族9
*根据Antibody Engineering，第2卷，Konetermann及Dübel(编辑)，SpringerVerlag Heidelberg Berlin，2010测定CDR序列。表(SEQ)中的序列编号是指本申请的序列清单中的序列。
表3：家族13
*根据Antibody Engineering，第2卷，Konetermann及Dübel(编辑)，SpringerVerlag Heidelberg Berlin，2010测定CDR序列。表(SEQ)中的序列编号是指本申请的序列清单中的序列。
表4：优化变体
*根据Antibody Engineering，第2卷，Konetermann及Dübel(编辑)，SpringerVerlag Heidelberg Berlin，2010测定CDR序列。表(SEQ)中的序列编号是指本申请的序列清单中的序列。
在另一个方面中，本发明提供具有一或多个VHH域的多肽。
在一个方面中，本发明VHH域包含如下序列或基本上是由其组成：
a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或
b)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：1-48或SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中的任一个的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明VHH域包含如下序列或基本上是由其组成：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列；或
b)与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少95％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：49-52中的任一个的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明VHH域包含如下序列或基本上是由其组成：
a)SEQ ID NO：67的氨基酸序列；或
b)与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或
d)SEQ ID NO：53-120中的任一个的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明VHH域包含SEQ ID NO：121-140或SEQ ID NO：222-224中的任一个中所述的氨基酸序列或基本上是由其组成。
在另一个方面中，本发明VHH域包含SEQ ID NO：138-140中的任一个中所述的氨基酸序列或基本上是由其组成。
在另一个方面中，本发明VHH域包含SEQ ID NO：222-224中的任一个中所述的氨基酸序列或基本上是由其组成。
本发明的代表性VHH域是显示于表5中且本发明的代表性经优化VHH域是显示于下表6中：
表5：VHH域
SEQ ID NO：1-48是家族101的VHH域。SEQ ID NO：49-52是家族9的VHH域。SEQ IDNO：53-120是家族13的VHH域。
表6：优化VHH域
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域针对稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性经人源化及/或优化。例如，该多肽在以下位置(根据Kabat编号)中的一或多个经人源化及/或序列优化：1、11、14、16、74、83、108。在一个方面中，该多肽包含以下突变中的一或多个：E1D、S11L、A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L。
在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域的一或多个框架区经人源化及/或序列优化。在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域包含如(例如)下文所阐释的框架区(FR)：
i)FR1选自SEQ ID NO：198-204中的任一个；
ii)FR2选自SEQ ID NO：205-208中的任一个；
iii)FR3选自SEQ ID No：209-210中的任一个；及/或
iv)FR4选自SEQ ID NO：211-212中的任一个。
本领域已知也可用作上文所述免疫球蛋白单一可变域的框架区序列的人类免疫球蛋白框架区序列(FR)。本领域也已知使源自除人类以外物种的免疫球蛋白单一可变域的框架区人源化的方法。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域的一或多个CDR区经人源化及/或序列优化。在一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域在以下位置(根据Kabat编号)中的一或多个经人源化及/或序列优化：52、53。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域包含以下突变中的一或多个：N52S、S53T。
在另一个方面中，本发明多肽，特别是本发明免疫球蛋白单一可变域包含选自SEQID NO：214-221中的任一个的CDR2。
本发明的代表性人源化及/或优化序列是显示于上文表4及表6及下表7中。
表7：序列经优化变体
表7a显示序列经优化变体的FR1-CDR1-FR2-CRD2，表7b显示这些变体的FR3-CDR3-FR4-CDR4。表中的序列编号(SEQ)是指本申请的序列清单中的序列。
表7a：序列经优化变体(FR1-CDR1-FR2-CDR2)
表7b：序列经优化变体(FR3-CDR3-FR4)
在本发明的一个方面中，本发明多肽可另外含有修饰，例如糖基残基、经修饰氨基酸侧链等。
本领域技术人员将了解，对于在人类中的药学上的用途，本发明多肽优选是针对人类CX3CR1，而出于兽医目的，本发明多肽优选是针对来自待治疗物种的CX3CR1。
本领域技术人员也将了解，当用作人类的治疗剂时，本发明多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域优选是人源化免疫球蛋白单一可变域。
根据本发明，免疫球蛋白单一可变域可为域抗体(即VL或VH抗体)及/或上文所述VHH域及/或任一其他种类的免疫球蛋白单一可变域(例如骆驼化VH)，前提条件是这些免疫球蛋白单一可变域是抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。
在本发明的一个方面中，免疫球蛋白单一可变域基本上是由域抗体序列或上文所述VHH域序列组成。特别是，免疫球蛋白单一可变域基本上是由VHH域序列组成。
在另一个方面中，本发明多肽包含两个或更多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。在另一个方面中，本发明多肽包含两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，例如抗CX3CR1VHH。在一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有相同氨基酸序列。在另一个方面中，本发明多肽中的该两个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域具有不同氨基酸序列。
根据本发明的另一实施方案，存在于本发明多肽中的至少两个免疫球蛋白单一可变域可彼此直接(即不使用接头)连接或经由接头连接。该接头优选是接头肽，且根据本发明将选择可以容许在同一个CX3CR1分子内或在两个不同分子内结合至少两个免疫球蛋白单一可变域与CX3CR1。
适宜的接头尤其取决于表位且特别是免疫球蛋白单一可变域所结合CX3CR1上的表位之间的距离，且本领域技术人员将可基于本文揭示内容，任选地在有限程度的常规实验后了解适宜的接头。
而且，当两个或更多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是域抗体或VHH域时，其也可经由第三域抗体或VHH域彼此连接(其中该两个或更多个免疫球蛋白单一可变域可与第三域抗体或VHH域直接连接或经由适宜的接头连接)。该第三域抗体或VHH域可(例如)为半衰期延长的域抗体或VHH域，如前文所述。例如，后一域抗体或VHH域可为能够与(人类)血清蛋白(例如(人类)血清白蛋白或(人类)转铁蛋白)结合的域抗体或VHH域。
或者，两个或更多个抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域可串联连接(直接或经由适宜的接头)且第三(单一)域抗体或VHH域(其可延长半衰期，如上文所述)可与该两个或更多个上述免疫球蛋白序列中的一个直接连接或经由接头连接。
适宜的接头是在本文中所述的结合本发明的具体多肽，且可-例如且不限于-包含氨基酸序列，该氨基酸序列的长度优选为5个或更多个氨基酸、7个或更多个氨基酸、9个或更多个氨基酸、11个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或至少17个氨基酸，例如约20个至40个氨基酸。然而，上限并非关键的，但出于便于(例如)该多肽的生物医药生产的原因进行选择。
接头序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若用于治疗目的，则接头优选在给药本发明多肽的个体中具有非免疫原性的。
接头序列的一个有用群组是源自重链抗体的铰链区的接头，如WO 96/34103及WO94/04678中所述。
其他实例是聚丙氨酸接头序列，例如Ala-Ala-Ala。
接头序列的更优选实例是不同长度的Gly/Ser接头，例如(glyxsery)z接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3及(gly3ser2)3。
若通过附接聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)修饰本发明多肽，则接头序列优选包括氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸，其容许在接头区中进行该修饰(例如聚乙二醇化)。
接头的实例是：
GGGGS(5GS接头，SEQ ID NO：233)
SGGSGGS(7GS接头，SEQ ID NO：234)
GGGGCGGGS(8GS接头，SEQ ID NO：235)
GGGGSGGGS(9GS接头，SEQ ID NO：236)
GGGGSGGGGS(10GS接头，SEQ ID NO：237)
GGGGSGGGGSGGGGS(15GS接头，SEQ ID NO：238)
GGGGSGGGGSGGGGGGGS(18GS接头，SEQ ID NO：239)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(20GS接头，SEQ ID NO：240)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(25GS接头，SEQ ID NO：241)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(30GS接头，SEQ ID NO：242)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS接头，SEQ ID NO：243)
EPKSCDKTHTCPPCP(G1铰链接头，SEQ ID NO：244)
GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(9GS-G1铰链接头，SEQ ID NO：245)
EPKTPKPQPAAA(骆驼上游长铰链区，SEQ ID NO：246)
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(G3铰链，SEQ ID NO：247)
AAA(Ala接头，SEQ ID NO：248)
此外，接头也可为聚(乙二醇)部分，如(例如)WO04/081026中所显示。
包含两个或更多个抗CX3CRl免疫球蛋白单一可变域或由其组成的多肽的非限制性实例在表8a中给出。
表8a：二价抗CX3CR1多肽
在另一实施方案中，本发明多肽的至少两个免疫球蛋白单一可变域经由另一部分(任选地经由一或多个接头)，例如在优选但非限制性实施方案中可为上文已阐述的另一免疫球蛋白单一可变域的多肽彼此连接。该部分可基本上无活性或可具有生物效应(例如提高多肽的期望性质)或可赋予多肽一或多个其他期望性质。例如且不限于，该部分可提高蛋白质或多肽的半衰期，及/或可降低其免疫原性或提高任一其他期望性质。
在一个方面中，本发明多肽尤其在用作治疗剂时包括延长本发明多肽在血清或患者的其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”意指(经修饰)多肽的血清浓度因(例如)多肽的降解及/或由天然机制进行的清除及/或隔离在体内降低50％所耗费的时间。
根据本发明的另一实施方案，两个免疫球蛋白单一可变域可与血清白蛋白分子融合，例如于(例如)WO01/79271及WO03/59934中所述。
或者，该半衰期延长的部分可与多肽共价连接或融合且可为(不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白部分的片段、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚环氧烷分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。
在另一实施方案中，本发明多肽包含与血液中发现的抗原(例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、血纤维蛋白原或转铁蛋白)结合的部分，因此赋予本发明所得的多肽延长的体内半衰期。根据一实施方案，该部分是白蛋白结合免疫球蛋白且特别是白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。
在另一实施方案中，本发明多肽包含与血清白蛋白结合的部分，其中该部分是白蛋白结合肽，如(例如)国际专利公开WO2008/068280及WO2009/127691中所述。
若旨在用于人类中，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域(也称作抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)将优选与人血清白蛋白结合，且将优选为人源化白蛋白结合VHH域。
与人血清白蛋白结合的免疫球蛋白单一可变域为本领域已知的且进一步详细阐述于(例如)WO2006/122786中。特别有用的白蛋白结合VHH域是由SEQ ID NO：230-232中的任一个中所述的氨基酸序列组成或含有其：
表8b
根据一实施方案，本发明多肽可与赋予本发明多肽一或多个效应器功能及/或可赋予与一或多个Fc受体结合的能力的一或多个抗体部分、片段或域连接。例如，出于此目的，且不限于此，抗体部分可为或可包含抗体、例如重链抗体(如上文所述)且更优选常规人类4链抗体的CH2及/或CH3域；具体而言，本发明多肽可与来自(例如)人类IgG、人类IgE或另一人类Ig的Fc区连接。例如，WO 94/04678阐述包含骆驼科VHH域或其人源化衍生物的重链抗体，其中骆驼科CH2及/或CH3域已被人类CH2及/或CH3域替代，以提供由2个重链组成的免疫球蛋白，每一重链包含-任选地人源化-VHH域及人类CH2及CH3域(但无CH1域)，该免疫球蛋白具有由CH2及CH3域提供的效应器功能，可在不存在任何轻链的情况下起作用，且与无该修饰的相应VHH域相比具有延长的半衰期。
在一个方面中，本发明多肽包含两个抗CX3CR1 VHH及能够与血清白蛋白结合的VHH。在一个方面中，使用接头肽融合VHH。本发明该多肽的代表性实例是显示于下文中。
在一个方面中，本发明多肽包含与第一接头肽融合的第一抗CX3CR1 VHH，该第一接头肽自身与能够与血清白蛋白结合的VHH融合，该VHH自身与第二接头肽融合，该第二接头肽自身与第二抗CX3CR1 VHH融合。在一个方面中，第一或第二接头肽是9GS接头，在一个方面中，第一及第二接头肽是9GS接头。在一个方面中，能够与血清白蛋白结合的VHH能够与人血清白蛋白结合。在一个方面中，能够与血清白蛋白结合的VHH具有SEQ ID NO：231中所述的氨基酸序列。在一个方面中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有相同氨基酸序列。在一个方面中，第一或第二抗CX3CR1 VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：
-SEQ ID NO：213、214及186；或
-SEQ ID NO：213、221及186；或
-SEQ ID NO：141、162及186。
在一个方面中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：
-SEQ ID NO：213、214及186；或
-SEQ ID NO：213、221及186；或
-SEQ ID NO：141、162及186。
在一个方面中，第一或第二抗CX3CR1 VHH具有SEQ ID NO：138至140或SEQ ID NO：222至224中的任一个中所述的氨基酸序列。在一个方面中，第一及第二抗CX3CR1 VHH具有相同氨基酸序列，其中该氨基酸序列是SEQ ID NO：138至140或SEQ ID NO：222至224中的任一个中所述的序列。
本发明多肽的非限制性实例是SEQ ID NO：225至227、249或277至281中的任一个的多肽。
表9
在另一个方面中，本发明多肽包含抗CX3CR1 VHH及Fc域。在一个方面中，本发明多肽包含与接头肽融合的抗CX3CR1 VHH，该接头肽自身与Fc域融合。在一个方面中，接头肽是15GS接头。在一个方面中，Fc域具有SEQ ID NO：250或252中所述的氨基酸序列。在一个方面中，VHH具有如下CDR1、CDR2及CDR3：
-SEQ ID NO：213、214及186；或
-SEQ ID NO：213、221及186；或
-SEQ ID NO：141、162及186。
在一个方面中，VHH具有SEQ ID NO：138至140或SEQ ID NO：222至224中的任一个中所述的氨基酸序列。在一个方面中，多肽是呈二聚体的形式，例如其中二聚体是通过一或多个二硫化物桥形成。
本发明多肽的非限制性实例是SEQ ID NO：251、253或254的多肽。
表10
本发明多肽可经修饰以提高其性质。在一个方面中，本发明多肽可经修饰以增加其储存时的稳定性。在一个方面中，本发明多肽可经修饰以促进其在特定宿主系统中的表达。例如，可修饰本发明多肽的第一密码子。在一个方面中，本发明多肽以谷氨酸(glu)作为其第一氨基酸开始。在另一个方面中，本发明多肽以天冬氨酸(asp)作为其第一氨基酸开始，以(例如)降低储存期间N端处的焦谷氨酸盐形成，从而增加产物稳定性。在另一个方面中，本发明多肽以丙氨酸(ala)或缬氨酸(val)作为其第一氨基酸开始，以(例如)促进多肽在原核表达系统(例如大肠杆菌(Escherichia coli))中的表达。使用本领域已知技术进行本发明多肽的修饰。
具有经修饰第一密码子的本发明多肽的代表性实例阐释于SEQ ID NO：257-262及263-266中的任一个中，且显示于下表11及表12中：
表11
表12
在另一个方面中，本发明多肽的特征在于以下性之中的一或多个：
●以高亲和力与人类CX3CR1结合；
●抑制可溶弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合；
●抑制弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用；
●抑制弗莱托肯趋化因子诱导的人类CX3CR1受体内在化；
●以在人类CX3CR1的结合及功能抑制的E/IC50的10倍内的E/IC50与食蟹猴CX3CR1交叉反应。
因此，在一个方面中，本发明多肽对人类CX3CR1具有IC50小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1nM的亲和力，如通过竞争FACS所测定的。
在另一个方面中，本发明多肽对人类CX3CR1具有EC50小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1nM的亲和力，如通过细胞结合FACS所测定的。
在另一个方面中，本发明多肽以或高于50％、或以或高于60％、或以或高于70％、或以或高于80％、或以或高于90％或以或高于95％阻断人类CX3CR1与人类弗莱托肯趋化因子的结合，如通过竞争FACS利用人类弗莱托肯趋化因子来测定。
在另一个方面中，本发明多肽以如下的IC50阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合：小于或等于300nM、或小于或等于100nM、或小于或等于20nM、或小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM，如通过竞争FACS利用人类弗莱托肯趋化因子来测定。
在另一个方面中，本发明多肽以或高于10％、或以或高于30％、或以或高于40％、或以或高于50％、或以或高于60％、或以或高于70％、或以或高于80％或以或高于90％抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用。
在另一个方面中，本发明多肽以如下的IC50抑制由人类CX3CR1介导的弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用：小于或等于500nM、或小于或等于100nM、或小于或等于75nM、或小于或等于50nM、或小于或等于10nM或小于或等于5nM。
在另一个方面中，本发明多肽以如下的IC50抑制弗莱托肯趋化因子诱导的人类CX3CR1受体内在化：小于或等于10nM、或小于或等于5nM或小于或等于1nM。
根据再一实施方案，本发明多肽的半衰期延长修饰(该修饰也降低多肽的免疫原性)包含附接适宜的药理学上可接受的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可使用任一适宜形式的聚乙二醇化，例如本领域针对抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv)所用的聚乙二醇化；例如，参见：Chapman，Nat.Biotechnol.，54，531-545(2002)；Veronese及Harris，Adv.DrugDeliv.Rev.54，453-456(2003)；Harris及Chess，Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；WO 04/060965；及US6,875,841。
用于多肽的聚乙二醇化的各种试剂也可购自，例如Nektar Therapeutics，USA、或NOF公司，Japan，例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。
优选地，特别是经由半胱氨酸残基使用定点聚乙二醇化(例如，参见Yang等人，Protein Engineering 16，761-770(2003))。例如，出于此目的，可将PEG附接至本发明多肽中天然存在的半胱氨酸残基，本发明多肽可经修饰以便适宜引入一或多个用于附接PEG的半胱氨酸残基，或可将包含一或多个用于附接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列与N端及/或C端融合，及/或可将PEG附接至桥连本发明多肽的两个或更多个功能域的连接区，其均使用本身为本领域技术人员已知的蛋白质改造技术。
优选地，对于本发明多肽而言，所用PEG的分子量超过5kDa，例如超过10kDa且小于200kDa，例如小于100kDa；例如在20kDa至80kDa的范围内。
关于聚乙二醇化，应注意，本发明通常也涵盖在一或多个氨基酸位置处、优选以使该聚乙二醇化出现以下情况的方式聚乙二醇化的任一本发明多肽：(1)延长体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)为聚乙二醇化提供一或多个本身已知的其他有益性质；(4)基本上不会影响多肽对CX3CR1的亲和力(例如，不会将该亲和力降低超过50％，且更优选不超过10％，如通过适宜分析，例如下文实例中所述的那些测定)；及/或(5)不会影响本发明多肽的其他期望性质中的任一个。适宜PEG基团及附接其的方法，特别或非特别地，对本领域技术人员而言将了解的。
根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括分子量为40kDa或60kDa的直链PEG的一个PEG部分，其中将该PEG部分附接至连接区中的多肽，且具体而言在Cys残基处，例如SEQ ID NO：235中所显示GS8-接头肽的5位处附接。
本发明聚乙二醇化多肽的优选实例为优选用上文所提及的PEG试剂中的一个聚乙二醇化的，这些试剂是例如“ME-400MA”，如以下化学式中所显示：
其具有40kDa的平均分子量。
治疗用途
在一个方面中，本发明提供本发明多肽或包含用作药物的所述多肽的药物组合物。
在一个方面中，本发明提供本发明多肽或包含该多肽的药物组合物在治疗或预防以下疾病中的用途：心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及华格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
在另一个方面中，本发明提供本发明多肽或包含该多肽的药物组合物在治疗或预防动脉粥样硬化中的用途。
在另一个方面中，本发明提供本发明多肽或包含该多肽的药物组合物在治疗或预防动脉粥样硬化中的用途，此通过预防及/或减缓新动脉粥样硬化病灶或斑(plaque)的形成及/或通过预防或减慢现有病灶及斑的进展来实现。
在另一个方面中，本发明提供本发明多肽或包含该多肽的药物组合物在治疗或预防动脉粥样硬化中的用途，此通过改变斑的组成以降低斑破裂及动脉粥样硬化血栓形成事件的风险来实现。
在一个方面中，本发明也提供在患有或具有以下疾病或障碍的人中治疗或降低所述疾病的风险的方法：心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及华格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症，其中该方法包括向此人给药治疗有效量的本发明多肽或包含该多肽的药物组合物。
在一个方面中，本发明也提供在患有或具有以下疾病或障碍的风险的人中治疗或降低动脉粥样硬化的风险的方法，其中该方法包括向此人给药治疗有效量的本发明多肽或包含该多肽的药物组合物。
在一个方面中，本发明也提供在患有或具有该疾病或障碍的风险的人中治疗或降低动脉粥样硬化的风险的方法，此通过预防及/或减缓新动脉粥样硬化病灶或斑的形成及/或通过预防或减慢现有病灶及斑的进展来实现，其中该方法包括向此人给药治疗有效量的本发明多肽或包含该多肽的药物组合物。
在一个方面中，本发明也提供在患有或具有该疾病或障碍的风险的人中治疗或降低动脉粥样硬化的风险的方法，此通过改变斑的组成以降低斑破裂及动脉粥样硬化血栓形成事件的风险来实现，其中该方法包括向此人给药治疗有效量的本发明多肽或包含该多肽的药物组合物。
在一个方面中，本发明多肽适用于治疗或预防与CX3CR1相关的疾病或障碍。
在一个方面中，本发明多肽适用于治疗或预防疾病或障碍，在所述疾病或障碍中，需要调节CX3CR1受体处的活性。在一个方面中，本发明也提供治疗或降低疾病或障碍的风险的方法，在所述疾病或障碍中，对CX3CR1受体的拮抗作用是有益的，该方法包括向患有或具有该疾病或障碍的人给药本发明多肽。
预期预防与对已遭受所讨论疾病或障碍的先前发作或认为具有所讨论疾病或障碍的增加的风险的人的治疗尤其相关。具有患特定疾病或障碍的风险的人通常包括具有该疾病或障碍的家族史的那些如或已通过遗传测试或筛选识别出尤其易于患该疾病或障碍的那些人。
在本发明的上下文中，术语“预防、治疗及/或缓和”不仅包含预防及/或治疗及/或缓和该疾病，且也通常包含预防疾病的发作、减慢或逆转疾病的进展、预防或减慢一或多个与疾病相关的症状的发作、减轻及/或缓和一或多个与疾病相关的症状、减轻疾病及/或与其相关的任何症状的严重性及/或持续时间及/或预防疾病及/或与其相关的任何症状的严重性的进一步恶化，预防、减轻或逆转由疾病引起的任何生理损伤，及通常对所治疗患者有益的任何药理作用。
待治疗个体将是哺乳动物，且更特别是为人类。如本领域技术人员将了解的，待治疗个体尤其是患有或具有上文所提及疾病、障碍或病症的风险的人。
本领域技术人员也将了解，治疗疾病的以上方法包括制备用于治疗该疾病的药物。此外，很明显，本发明多肽可用作旨在用于治疗以上疾病的药物或药物组合物中的活性成分。因此，本发明还涉及本发明多肽在制备用于预防、治疗及/或缓和上文所提及疾病、障碍或病症中的任一个的药物组合物中的用途。本发明还涉及用于治疗或预防用途、且具体而言用于预防、治疗及/或缓和上文所提及疾病、障碍或病症中的任一个的本发明多肽。本发明进一步涉及用于预防、治疗及/或缓和上文所提及疾病、障碍或病症的药物组合物，其中该组合物包含至少一种本发明多肽。
本发明多肽及/或包含其的组合物可以任一适宜方式向有此需要的患者给药，此取决于欲使用的具体药物制剂或组合物。因此，本发明多肽及/或包含其的组合物可(例如)经静脉内、经皮下、经肌内、经腹膜内、经皮、口服、经舌下(例如呈置于舌下且在舌下吸收穿过粘膜进入毛细血管网中的舌下锭剂、喷雾或滴剂的形式)、经鼻(内)(例如以鼻喷雾及/或气溶胶的形式)、局部地、栓剂、吸入、经玻璃体内(尤其用于治疗干性AMD或青光眼)或任一其他适宜方式以有效量或剂量给药。
根据适于预防、治疗及/或缓和欲预防、治疗或缓和的疾病、障碍或病症的治疗方案给药本发明多肽及/或包含其的组合物。临床医师通常将能够确定适宜治疗方案，此取决于诸如以下等因素：欲预防、治疗或缓和的疾病、障碍或病症、疾病的严重性、其症状的严重性、欲使用的具体本发明多肽、欲使用的具体给药途径及药物制剂或组合物、年龄、性别、体重、饮食、患者的一般状况及临床医师所熟知的相似因素。通常，治疗方案将包含以治疗及/或预防有效量或剂量给药一或多种本发明多肽或一或多种包含其的组合物。
通常，为预防、治疗及/或缓和本文所提及的疾病、病症及病状且视待治疗的具体疾病、障碍或病症、欲使用的具体本发明多肽的效能、具体给药途径及所使用的具体药物制剂或组合物而定，本发明多肽通常将以以下的量连续地(例如通过输注)或以单一剂量(例如每天、每周或每月剂量；参见下文)给药：每公斤体重及每剂量0.005mg至20.0mg、优选0.05mg/kg/剂量至10.0mg/kg/剂量且更优选0.5mg/kg/剂量至10mg/kg/剂量，但可视(尤其)前述参数而显著不同。
对于预防应用，含有本发明多肽的组合物也可以相似或稍微较低剂量给药。也可由个别内科医师在任一并发症的事件中调整剂量。
视具体本发明多肽及其具体药物动力学及其他性质而定，其可每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每六天、每周、每月等给药。给药方案可包括长期、每周治疗。“长期”是指持续至少两周且优选若干月或年。
视所涉及的具体疾病而定，可使用任一适宜体外分析、基于细胞的分析、体内分析及/或本身已知的动物模型或其任一组合测试本发明多肽及包含其的组合物的效力。本领域技术人员将了解适宜的分析及动物模型，且包括(例如)下文实例中所用的分析及动物模型。
对于药学上的用途，可将本发明多肽配制成包含以下的药物制剂：(i)至少一种本发明多肽，及(ii)至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂，及(iii)任选地一或多种其他药学上的活性多肽及/或化合物。“药学上可接受”是指各材料在向个体给药时不显示任何生物效应或在其他方面的不期望的效应，且不以有害方式与含有其的药物组合物的任一其他组份(例如药学上的活性成分)相互作用。具体实例可参见标准手册，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing公司，USA(1990)。例如，本发明多肽可经调配，并以任一本身已知用于常规抗体及抗体片段及其他药学上的活性蛋白质的方式给药。因此，根据另一实施方案，本发明涉及含有至少一种本发明多肽及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂及任选地一或多种其他药学上的活性物质的药物组合物或制剂。
对于非限制性实例，该调配物可以如下形式给药：口服给药、胃肠外给药(例如通过静脉内、肌内、皮下、鞘内、海绵体内或腹膜内注射或静脉内输注)、局部给药、舌下给药、吸入给药、透皮贴剂、植入物、栓剂给药、经皮、经鼻、玻璃体内、经直肠或阴道内给药等。这些适宜的给药形式-其可为固体、半固体或液体，取决于给药方式-以及用于其制备的方法及载体将为本领域技术人员将了解的。
用于胃肠外给药(例如静脉内、肌内、皮下注射或静脉内输注)的药物制剂可为(例如)包含活性成分且任选地在另一溶解或稀释步骤后适于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散液、乳液或粉剂。适于这些制剂的载体或稀释剂包括(例如，但不限于)无菌水及药学上可接受的水性缓冲液及溶液(例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’ssolutions)、右旋糖溶液及汉克氏溶液(Hanks’solution))；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及矿物油、动物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及其适宜混合物。
活性化合物或其盐的溶液也可含有防止微生物生长的防腐剂，例如抗细菌及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙汞硫柳酸钠(硫柳汞(thiomersal))等。在许多情形下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。可通过(例如)形成脂质体、在分散液的情形下通过维持所需粒径或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。也可添加其他延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝及明胶。
在所有情形下，最终剂量形式必须在制造及储存的条件下为无菌、流体且稳定的。通过将所需量的活性化合物与(视需要)各种上文所列举的其他成分并纳入适当溶剂中、接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在使用无菌粉剂来制备无菌可注射溶液的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻干燥技术，其产生由预先经无菌过滤的溶液中所存在的活性成分加任一其他期望成分构成的粉剂。
通常，将优选水性溶液或悬浮液。通常，适于治疗性蛋白(例如本发明多肽)的调配物是缓冲蛋白质溶液，例如包括适宜浓度(例如0.001mg/ml至400mg/ml、优选0.005mg/ml至200mg/ml、更优选0.01mg/ml至200mg/ml、更优选1.0mg/ml至100mg/ml，例如1.0mg/ml(i.v.给药)或100mg/ml(s.c.给药))蛋白质的溶液；及水性缓冲液，例如：
-磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，
-其他磷酸盐缓冲液，pH 6.2至8.2，
-组氨酸缓冲液，pH 5.5至7.0，
-琥珀酸盐缓冲液，pH 3.2至6.6，及
-柠檬酸盐缓冲液，pH 2.1至6.2，
及任选地，用于为溶液提供等渗性的盐(例如NaCl)及/或糖或多元醇(例如海藻糖、甘露醇或甘油)。
优选缓冲蛋白质溶液为包含溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的约0.05mg/ml本发明多肽且通过添加220mM海藻糖调整至等渗的溶液。另外，这些溶液中可包括其他试剂，例如清洁剂，例如0.02％Tween-20或Tween-80。用于皮下施用的调配物可包括显著较高浓度的本发明多肽，例如高达100mg/ml或甚至100mg/ml以上。然而，本领域技术人员将了解，上文所给成分及其量仅代表一优选选择。其替代选择及变化形式将为本领域技术人员立即了解，或可容易地自上文揭示内容想到。
本发明多肽也可使用适于(例如)注射的适宜储库、缓慢释放或持续释放调配物、使用用于皮肤下植入的受控释放器件及/或使用给药泵或本身已知用于给药药学上的活性物质或成分的其他器件来给药。另外，可将本发明多肽调配成若置于皮肤上则穿过皮肤的凝胶、乳膏、喷雾、滴剂、贴片或薄膜的形式。
而且，与常规抗体或抗体片段相比，使用本发明多肽的一主要优势在于，其也可容易地经由除胃肠外给药以外的途径来给药且可容易地经调配用于该给药。例如，如国际申请案WO2004/041867中所述，该多肽可经调配用于口服、鼻内、肺内及经皮给药。
根据本发明的另一实施方案，提供药物组合，其包含至少一种本文所揭示的本发明多肽及至少一种选自他汀类、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病剂及抗高血压剂的其他治疗剂。
该药物组合任选地可另外包含稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂。
当欲使用两种或更多种物质或成分作为组合治疗方案的一部分时，其可经由同一给药途径或经由不同给药途径基本上同时或在不同时间(例如基本上同时、连续地或根据交替方案)给药。当欲经由同一给药途径同时给药这些物质或成分时，其可作为不同药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的一部分给药。而且，当欲使用两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分时，每一物质或成分可以与当单独使用化合物或成分时所用的量相同的量并根据与其方案相同的方案给药，且该组合使用可导致或可不导致协同效应。然而，当组合使用两种或更多种活性物质或成分导致协同效应时，也可能降低欲给药物质或成分中的一个、更多个或所有的量，而仍达成期望治疗作用。此可用于(例如)避免、限制或减轻与当这些物质或成分中的一或多个以其常用量使用时其的使用相关的任何不期望副效应，而仍获得期望医药或治疗效应。
再者，本发明的另一实施方案是治疗上文所阐释疾病及病症的方法，该方法包括向个体同时、单独或依序给药有效量的至少一种本发明多肽及至少一种选自他汀类、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病剂及抗高血压剂的药剂。
根据本发明的另一个方面，本发明多肽经制备以与治疗上文所阐释疾病及病症所用的其他药物组合给药，这些其他药物选自他汀类、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病剂及抗高血压剂。
根据本发明的再一个方面，治疗上文所阐释疾病及病症所用的药物经制备以与本发明多肽组合给药，这些药物选自他汀类、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病剂及抗高血压剂。
根据本发明的另一个方面，本发明多肽是与用于给药多肽的器件(例如注射器、注射笔或其他器件)组合使用。
根据本发明的再一实施方案，提供诊断通过CX3CR1功能障碍介导的疾病、障碍或病症的方法，该方法包含以下步骤：
a)自个体获得样品，及
b)在体外将样品与上文所定义的本发明多肽接触，及
c)检测该多肽与该样品的结合，及
d)将步骤(c)中所检测的结合与标准物比较，其中相对于该样品的结合差异对特征在于CX3CR1功能障碍的疾病、障碍或病症具有诊断性。
根据本发明的另一实施方案，提供诊断通过CX3CR1功能障碍介导的疾病、障碍或病症的方法，该方法包含以下步骤：
a)自个体获得样品，及
b)将样品与上文所定义的本发明多肽接触；
c)测定样品中CX3CR1的量；及
d)将步骤(c)中所测定的量与标准物比较，其中相对于该样品的量的差异对特征在于CX3CR1功能障碍的疾病、障碍或病症具有诊断性。
以上诊断方法也可用于监测个体的治疗性治疗的有效性。
根据本发明的另一实施方案，提供诊断通过CX3CR1功能障碍介导的疾病、障碍或病症且用于上文所定义的方法的试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明多肽及任选地一或多种培养基、检测构件及/或体外或体内显像剂及进一步任选地使用说明书。适宜体内显像剂包括99mTc、111铟、123碘及用于磁共振成像的顺磁化合物。
本发明进一步提供试剂盒，该试剂盒包含至少一种本发明多肽及另外一或多种选自由治疗上文所述疾病及病症所用的其他药物的其他组份及上文所述器件。
本发明进一步提供制造本发明多肽的方法，这些方法通常包括以下步骤：
-在容许表现本发明多肽的条件下培养包含能够编码本发明多肽的核酸(下文：“本发明核酸”)的宿主细胞；及，
-自培养基回收或分离由宿主细胞表现的多肽；及
-任选地进一步纯化及/或修饰及/或调配本发明多肽。
本发明核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如特别适于在预期宿主细胞或宿主有机体中表现的使用密码子的DNA)。根据本发明的一实施方案，本发明核酸呈基本上分离形式，如上文所定义。
本发明核酸也可呈载体(例如质粒、黏粒或YAC)形式，可存于该载体中及/或可为该载体的一部分，该载体又可呈基本上分离形式。载体尤其可为表达载体，即可在体外及/或体内(即在适宜宿主细胞、宿主有机体及/或表达系统中)表达多肽的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明核酸，其与一或多种适宜调控要素(例如启动子、增强子、终止子等)可操作连接。这些调控要素及表达本发明多肽所用或所必需的其他要素(例如整合因子、选择标记、信号或前导序列、报告基因等)的具体实例公开于(例如)WO2006/040153的第131页至第133页。
本发明核酸可以本身已知的方式(例如，通过自动DNA合成及/或重组DNA技术)基于本文所给出的关于本发明多肽的氨基酸序列的信息制备或获得，及/或可分离自适宜天然来源。
根据另一实施方案，本发明涉及表达或能够表达本发明多肽；及/或含有编码本发明多肽的核酸的宿主或宿主细胞。根据尤其优选的实施方案，这些宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适宜的细菌细胞包括来自革兰氏(gram)阴性细菌菌株(例如大肠杆菌、变形杆菌属(Proteus)及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽胞杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)及乳球菌属(Lactococcus)等菌株)的细胞。适宜真菌细胞包括来自木霉属(Trichoderma)、红霉菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的细胞。适宜酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)及甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉逊氏酵母属(Hansenula)的细胞。
适宜的哺乳动物细胞包括(例如)CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、NS0细胞、HEK细胞等。然而，也可使用本领域用于表达异源蛋白的两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及任何其他细胞。
为以工业规模生产，用于(工业)生产免疫球蛋白单一可变域多肽及含有其的蛋白质治疗剂的优选异源宿主包括适于大规模表达、生产及发酵、且特别是适于大规模(生物-)医药表达、生产及发酵的大肠杆菌、甲醇酵母及啤酒酵母菌株。
具体表达系统的选择将部分取决于对某些翻译后修饰、更具体而言糖基化的需要。期望或需要糖基化的本发明多肽的产生将必须使用具有使所表达蛋白质糖基化的能力的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解，所获得的糖基化模式(即所附接残基的种类、数量及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞系。
在上文所阐释细胞中产生的本发明多肽可在细胞内(例如，在细胞溶质中、在胞外质中或在包涵体中)产生且随后自宿主细胞分离并任选地进一步纯化；或其可在细胞外(分泌至培养宿主细胞的培养基中)产生且随后自培养基分离并任选地进一步纯化。
本领域用于多肽的重组产生的其它方法及试剂(例如，适宜表达载体、转化或转染方法、选择标记、诱导蛋白质表现的方法、培养条件等)是已知的。相似地，本领域技术人员熟知用于本发明多肽的制造方法中的蛋白质分离及纯化技术。
与也需要昂贵哺乳动物细胞培养设施的常规抗体相比，借助发酵在便利的重组宿主有机体(例如大肠杆菌及酵母)中产生本发明多肽是成本有效的。此外，可达成的表达位准较高，且本发明多肽的产率是在1g/l至10g/l的范围内(大肠杆菌)且高达10g/l(酵母)及更多。
实施例
过表达人类CX3CR1或食蟹猴CX3CR1的CHO、Baf/3、Caki及HEK293细胞系的生成
使用本领域已知技术生成过表达人类或食蟹猴CX3CR1的CHO及Baf/3细胞。也使用本领域已知技术生成表达人类CCR2或CCR5的细胞。
对于人类CX3CR1，将cDNA克隆至pCDNA3.1(+)-neo中，而对于小鼠CX3CR1，使用pcDNA-DEST40-neo。
人类CX3CR1及食蟹猴CX3CR1的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：255及256中。
为产生过表达人类CX3CR1或小鼠CX3CR1的骆驼肾(Caki)细胞，分别用pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1或pcDNA-DEST40-neo-mCX3CR1对亲代Caki细胞实施电穿孔。对于所有条件，通过添加1mg/mL遗传霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)选择转染子。
在人类胎肾(HEK293)亲代细胞系中分别利用pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CR1或cyCX3CR1质粒的Fugene(Roche)通过脂质介导的转染来生成过表达人类CX3CR1或食蟹猴CX3CR1的HEK293细胞。这些细胞是用作瞬时转染子且因此不进行选择。简言之，每个T75接种2*10E6个细胞，且将这些细胞在转染前培育过夜。移除培养基后，根据制造商说明书用各别质粒(9μg)及Fugene(27μl)转染细胞。转染后48小时，收获细胞并将其冷冻以供进一步使用。
实施例1：在骆驼中利用CX3CR1的免疫诱导体液免疫反应
1.1.免疫
伦理委员会(University Antwerp，Belgium，UA2008A1，2008/096，2007/068)批准后，对9只骆驼(指定编号368、369、370、381、382、384、312、313及314)进行免疫。
利用4次肌内注射(每周或每两周2mg/剂量)的pVAX1-huCX3CR1质粒载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对6只骆驼(312、313、314、381、382及384)进行免疫。随后3只骆驼(381、382及384)接受4次皮下注射的如上文所述产生的过表达人类CX3CR1的Caki细胞。将细胞再悬浮于D-PBS中并在注射前置于冰上。
根据标准方案利用4次皮下注射的如上文所述产生的过表达人类CX3CR1的Caki细胞对三只另外骆驼(指定编号368、369及370)进行免疫。将细胞再悬浮于D-PBS中并在注射前置于冰上。随后，向三只骆驼给药两次具有与BSA偶合的重组CX3CR1 NT/EC3片段的注射物(表13)。肽是定购于NeoMPS(Polypeptidegroup，Strasbourg，France)并根据标准方案与BSA偶合。
表13用于免疫加强的肽片段的序列
将第一次注射物调配于弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)(Difco，Detroit，MI，USA)中，而将后续注射物调配于弗氏不完全佐剂(Difco，Detroit，MI，USA)中。
1.2.对骆驼中所诱导免疫反应的评估
为通过ELISA或FACS评估对动物中针对人类CX3CR1的免疫反应的诱导，在第0天(免疫前)及免疫时间表中的不同时间点(外周血淋巴细胞[PBL]收集的时间)从骆驼312、313及314收集血清。
简而言之，在4℃，将Neutravidin(2μg/ml)在96孔Maxisorb板(Nunc，Wiesbaden，Germany)固定，过夜。用存于PBS中的酪蛋白溶液(1％)封阻各孔。随后在2μg/ml捕获CX3CR1的生物素化重组NT片段(Polypeptide，Strasbourg，France)或生物素化EC3片段(Polypeptide，Strasbourg，France)。添加血清稀释液后，使用辣根过氧化酶(HRP)偶联的山羊抗骆驼免疫球蛋白(Bethy1Laboratories公司，Montgomery，TX，USA)及在受质TMB One(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)(Promega，Mannheim，Germany)存在下的后续酶促反应检测特异性结合的免疫球蛋白，此显示肽免疫后针对CX3CR1的显著抗体依赖性免疫反应经诱导。
另外，通过对活跃生长的过表达人类CX3CR1的CHO细胞的FACS分析证实经细胞免疫动物的血清效价。利用4次细胞免疫(第49天)、4次细胞免疫及1次肽加强(第77天)及4次细胞免疫及2次肽加强(第81天)后所取样的血清测定骆驼368、369及370的CX3CR1血清效价反应。收获细胞并洗涤，然后利用血清稀释液培育。利用山羊抗骆驼IgG(Bethyl，Montgomery，TX，USA)、随后利用与PE偶合的驴抗山羊抗体(Jackson Laboratories，Suffolk，UK)实施检测并通过FACSArray(BD Biosciences)上的分析读出。如通过ELISA或FACS测定所获得的血清反应的总结是显示于14及15中。
表14经细胞/肽免疫动物的血清效价分析
表15经DNA/细胞免疫动物的血清效价分析
对于仅经DNA免疫的骆驼(312、313及314)而言，未测定到血清效价。
实施例2：仅有重链的抗体片段谱的克隆及噬菌体的制备
在每一亚群的最后一次免疫原注射后，从经免疫的骆驼中收集作为产生重链抗体的B细胞的来源的免疫组织。对于骆驼312、313及314而言，在最后一次抗原注射后4天及8天每一动物收集两个150ml血液样品。对于骆驼368、369及370而言，在最后一次细胞免疫后5天及7天且另外在最后一次肽免疫后4天及8天收集四个150ml血液样品。在这些操作之后，在最后一次细胞免疫后12天且在最后一次肽免疫后12天取得两个淋巴结生检。对于骆驼381、382及384而言，在最后一次DNA免疫后8天且另外在第一次细胞加强后4天、在第二次细胞加强后8天及11天及在最后一次细胞免疫后8天，收集五个150ml血液样品。在这些操作之后，在第二次细胞免疫后8天取得一个淋巴结生检。
使用Ficoll-Hypaque根据制造商说明书(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)自血液样品制备外周血淋巴细胞(PBL)。自PBL及淋巴结生检(LN)提取总RNA，将其用作RT-PCR的起始材料来扩增编码DNA区段的VHH。
对于每个免疫的骆驼而言，通过汇集分离自源于免疫时间表的一亚群(即在一类免疫抗原之后)的样品的总RNA来构建文库，且对于一些骆驼而言，将来自不同动物的样品汇集成一个文库(表16)。
表16汇集不同样品用于文库构建
文库名称 骆驼 样品
368-PBL1+2+LN-V-100209 368 PBL 1及2、LN
369+370-PBL1+2+LN-V-100209 36、370 PBL 1及2、LN
368-PBL3+4-V-280909 368 PBL 3及4
369-PBL3+4-V-070409 369 PBL 3及4
370-PBL3+4-V-070409 370 PBL 3及4
381-PBL1-V-180310 381 PBL 1
382-PBL1-V-180310 382 PBL1
384-PBL1-V-180310 384 PBL1
381-PBL1+2+3+4+5+LN-V-280909 381 PBL 1、2、3、4、5及LN
382-PBL1+2+3+4+5+LN-V-280909 382 PBL 1、2、3、4、5及LN
384-PBL1+2+3+4+5+Ln-V-280909 384 PBL 1、2、3、4、5及LN
312+313+314-PBL1+2-V-220210 312、313及314 PBL 1及2
312-PBL1+2-V-180310 312 PBL1及2
313-PBL1+2-V-180310 313 PBL1及2
314-PBL1+2-V-180310 314 PBL1及2
简而言之，经由具体限制位点将PCR扩增的VHH谱克隆至指定载体中以促进VHH文库的噬菌体的展示。载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白质编码序列、氨苄青霉素(ampicillin)或卡本西林(carbenicillin)的抗性基因、多克隆位点及杂合gIII-pelB前导序列(pAX050)。在具有VHH编码序列的框架中，载体编码C端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，并在过滤灭菌后将其于4℃或-80℃下储存于20％甘油中以供进一步使用。
实施例3：经由噬菌体展示选择CX3CR1特异性VHH
将自所有骆驼获得并克隆为噬菌体文库的VHH谱用于应用大量选择条件的不同选择策略。变量包括i)CX3CR1蛋白质的呈递形式(于不同细胞背景上或于脂质体/VLP上)、ii)抗原呈递方法(当使用细胞时存于溶液中或当使用VLP时涂覆至板上)、iii)抗原浓度、iv)所用直系同源物(人类或食蟹猴)、v)选择轮数及vi)不同洗脱方法(非特异性的经由胰蛋白酶或特异性的经由配体弗莱托肯趋化因子)。所有固体涂覆相选择均是在Maxisorp 96孔板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中实施。
如下实施选择：如上文所述以多个浓度呈递用于固体及溶液相选择格式的CX3CR1抗原制剂。与噬菌体文库一起培育2h、接着充分洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/mL)将所结合噬菌体洗脱15分钟。当使用胰蛋白酶用于噬菌体洗脱时，立即通过施加0.8mM蛋白酶抑制剂或ABSF来中和蛋白酶活性。作为对照，平行实施无抗原的选择。
使用噬菌体输出物感染大肠杆菌，然后进而使用大肠杆菌制备噬菌体用于下一轮选择(噬菌体营救)。在第二轮选择后，使用噬菌体输出物感染大肠杆菌，然后将大肠杆菌平铺于琼脂板(LB+carb+葡萄糖2％)上以供分析个别VHH克隆。为筛选具体结合剂的选择输出物，自琼脂板挑选单一克隆并使其在1mL 96深孔板中生长。在葡萄糖的不存在下通过添加IPTG(最终1mM)诱导LacZ控制的VHH表达。根据标准方案制备周质提取物(体积为约80μL)。
实施例4：在CX3CR1-弗莱托肯趋化因子竞争FACS分析中筛选周质提取物
在人类CX3CR1/人类弗莱托肯趋化因子FACS竞争分析中筛选周质提取物以评价所表达的VHH的阻断能力。人类CX3CR1存在于过表达CX3CR1的CHO细胞上。利用使用自活跃生长的培养物收获的细胞的设定及使用冷冻细胞的设定。使用经alexa647标记(A647-弗莱托肯趋化因子)且标记度为1的经标记弗莱托肯趋化因子(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)作为检测试剂。为设定该分析，首先于CHO-huCX3CR1细胞上实施一系列剂量递增的经标记弗莱托肯趋化因子以测定结合的EC50值。以较高浓度的弗莱托肯趋化因子(3nM)实施初始筛选以提高分析稳健性。为将筛选的灵敏度提高至最大，选择EC30浓度(1nM)用于后续筛选。简言之，将50μl周质提取物添加至6nM经标记弗莱托肯趋化因子(50μl)及200 000个CHO-huCX3CR1细胞中。于4℃下培育1小时后，将细胞洗涤三次，然后于FACS阵列(BectonDickinson)上实施读数。首先如自散射谱(scatter profile)所测定在完整细胞上设门。接着，通过来自PI染色剂(Sigma，St Louis，US)的荧光谱门控选出死细胞。测定每一样品来自alexa647标记的荧光谱并使用该荧光谱计算阻断能力。作为对照，采取周质提取物中不存在VHH或包括已知不相关VHH及样品且包括过量冷弗莱托肯趋化因子的条件。对于每一样品，使用对照样品测定分析窗来测定阻断百分比。
根据此筛选选择VHH，且序列分析揭露120个属于3个不同B细胞谱系的独特VHH。针对每一B细胞谱系所发现的变体总数描述于表17中。
表17用于识别人类CX3CR1特异性VHH B细胞谱系的选择参数
关于所有VHH，对初始筛选期间的选择程序及性能的概述于表18中给出。
表18 huCX3CR1特异性VHH的选择条件及主要筛选结果
所有所获得独特VHH的氨基酸序列是显示于序列清单及上文中(标明CDR及框架区)。
实施例5：对经纯化VHH的表征
进一步纯化并表征选自实施例4中所述筛选的抑制性抗CX3CR1 VHH。所选VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc，His6标记的蛋白质。通过添加1mM IPTG诱导表达并允许于37℃下继续表达4小时。在使细胞培养物旋转后，通过使沉淀冷冻-解冻来制备周质提取物。使用这些提取物作为起始材料，且经由IMAC及大小排阻层析法纯化VHH，产生95％纯度，如经由SDS-PAGE所评价。
通过抗CX3CR1 VHH抑制人类弗莱托肯趋化因子与BA/F3细胞上所表达的人类CX3CR1结合
在实施例4中所概述的人类CX3CR1竞争FACS中评估对VHH的配体弗莱托肯趋化因子的阻断能力。使用CHO-huCX3CR1细胞、BA/F3-huCX3CR1细胞或经瞬时转染HEK293T细胞。不同竞争设定中所用的经标记配体的量也有所不同。VHH阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的相互作用的IC50值是描述于表19中。
表19配体竞争FACS中VHH的效能及效力
VHH编号 家族 细胞系 IC50 阻断％ 重复
11H11 9 CHO-huCX3CR1 1.7E-8 100 4
18E06 13 CHO-huCX3CR1 1.8E-9 33 4
54A12 101 CHO-huCX3CR1 2.1E-9 104 2
54D08 101 CHO-huCX3CR1 1.5E-8 101 2
54A07 101 CHO-huCX3CR1 1.1E-8 78 2
54D05 101 CHO-huCX3CR1 2.7E-9 102 2
54B03 101 CHO-huCX3CR1 2.5E-8 108 1
54G03 101 CHO-huCX3CR1 5.6E-8 107 1
11H11 9 BA/F3-huCX3CR1 8.1E-9 100 3
18E06 13 BA/F3-huCX3CR1 2.8E-9 71 3
54A12 101 BA/F3-huCX3CR1 4.0E-9 100 4
54D08 101 BA/F3-huCX3CR1 3.8E-8 99 1
54A07 101 BA/F3-huCX3CR1 1.5E-8 81 4
54D05 101 BA/F3-huCX3CR1 5.5E-9 99 1
54B03 101 BA/F3-huCX3CR1 3.3E-8 99 1
54G03 101 BA/F3-huCX3CR1 9.8E-8 98 1
54A12 101 HEK293-huCX3CR1 6.8E-9 96 5
54D08 101 HEK293-huCX3CR1 8.4E-8 95 2
54A07 101 HEK293-huCX3CR1 2.3E-8 52 2
54D05 101 HEK293-huCX3CR1 5.3E-9 94 5
54B03 101 HEK293-huCX3CR1 6.7E-8 92 2
54G03 101 HEK293-huCX3CR1 2.7E-7 89 2
61E02 101 HEK293-huCX3CR1 8.2E-8 98 2
61B04 101 HEK293-huCX3CR1 5.7E-8 97 2
61B02 101 HEK293-huCX3CR1 1.0E-8 94 2
54H01 101 HEK293-huCX3CR1 1.0E-8 64 2
54A04 101 HEK293-huCX3CR1 4.9E-8 100 2
61F11 101 HEK293-huCX3CR 1 4.6E-8 96 2
61G03 101 HEK293-huCX3CR 1 6.0E-8 96 2
61G04 101 HEK293-huCX3CR1 4.2E-8 96 2
66B02 101 HEK293-huCX3CR1 2.5E-9 102 2
66G01 101 HEK293-huCX3CR 1 1.4E-8 99 2
通过抗CX3CR1 VHH抑制过表达人类CX3CR1的BA/F3细胞的人类弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用
为评估对弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用的抑制，使用具有5μm孔径的ChemoTx可弃式室(Neuroprobe，Gaithersburg，US)设定趋化作用分析。自活跃生长的培养物收获细胞并洗涤，然后用于分析培养基(即补充有0.1％BSA的RPMI(Gibco，Carlsbad，US))。用总体积为300μl的320pM人类弗莱托肯趋化因子填充底部室。在施加膜之后，将总体积为70μl的0.13E6个细胞沉积于膜的顶部。使趋化作用于37℃下在具有CO2的潮湿室中进行3小时。此培育期之后，移除膜，且再悬浮底部室中的细胞。使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega，Madison WI，US)测定孔中存在的ATP量。利用发光读数的标准设定在Envision(PerkinElmer，Massachusetts，US)上实施读数。以一式三份实施剂量递增系列，且每一板也以一式三份含有对照样品。作为对照，包括无VHH的样品以及未向底部室中添加人类弗莱托肯趋化因子的样品。结果的总结是显示于表20中。
表20 VHH在阻断弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用中的效能及效力
VHH编号 家族 IC50 阻断％ 重复
11H11 9 2E-7 89 5
18E06 13 NA 17 4
54A12 101 8E-8 84 6
54D08 101 NA 33 2
54A07 101 5E-8 45 4
54D05 101 7E-8 81 4
54B03 101 1E-7 73 1
54G03 101 NA 40 1
66B02 101 2E-8 87 2
66G01 101 4E-7 54 2
对抗CX3CR1 VHH对食蟹猴CX3CR1的交叉反应性的评估
最初，使用基于FACS的结合设定评估食蟹猴交叉反应性。为此，于4℃下将VHH与各细胞一起培育30分钟，接着进行三个洗涤步骤，且随后利用检测试剂培育。作为检测，使用小鼠抗cmyc抗体(Serotec，MCA2200)、接着使用与PE偶合的山羊抗小鼠抗体(Jackson 115-116-071)，各自于4℃下培育30分钟，接着进行三个洗涤步骤。分析结果是显示于表21中。
表21各VHH对人类CX3CR1或对食蟹猴CX3CR1的结合的EC50值
VHH编号 家族 人类EC50(M) 食蟹猴EC50(M) 比率 重复
11H11 9 8.0E-10 NA NA 2
18E06 13 1.5E-9 1.4E-8 9 2
54A12 101 3.5E-8 1.1E-7 3.3 1
54A07 101 5.4E-7 3.0E-8 0.1 1
54D05 101 8.4E-10 5.0E-8 59.6 1
对于稍后识别的VHH，使用HEK293T细胞中所表达的人类或食蟹猴CX3CR1设定人类弗莱托肯趋化因子竞争FACS。在HEK293T细胞中瞬时转染人类及食蟹猴受体，且通过结合经标记配体人类弗莱托肯趋化因子来匹配转染。使用EC30浓度的弗莱托肯趋化因子评估竞争，且如此获得的IC50值是对Ki值的良好评估，即对亲和力(22)的量度。如实例4中所述实施实验。使用食蟹猴及人类CX3CR1的IC50值的比率评估CX3CR1在两个物种中的亲和力的潜在差异。
表22 VHH在配体竞争FACS中对人类及食蟹猴CX3CR1的效力及效能
抗人类CX3CR1 VHH与人类CCR2、人类CCR5或小鼠CX3CR1的结合
通过在表达huCCR2、huCCR5或msCX3CR1的CHO-K1亲代细胞或CHO细胞上实施FACS结合实验来评估对huCX3CR1受体的特异性。在4℃，将VHH与各细胞系一起培育30分钟，接着进行三个洗涤步骤，且随后利用检测试剂培育。作为检测，使用小鼠抗cmyc抗体(Serotec，MCA2200)、接着使用与PE偶合的山羊抗小鼠抗体(Jackson 115-116-071)，各自于4℃培育30分钟，接着进行三个洗涤步骤。对于每一细胞系，包括利用受体特异性抗体的品质控制。另外，也将最高浓度的每一VHH与表达huCX3CR1的CHO细胞一起培育作为阳性对照。未观测到与msCX3CR1、huCCR2或huCCR5的结合。
表位框的测定
设定竞争性结合实验以确定VHH是否结合CX3CR1上的重迭表位。为此，在竞争FACS中于表达huCX3CR1的BA/F3细胞上使用经alexa647标记的VHH 66B02。使用来自三个功能家族的代表性VHH作为结合经标记66B02的竞争者。所获得的Ic50值是显示于表23中。
表23基于竞争FACS的表位框并法(binning)
VHH编号 家族 IC50(M) 阻断％
11H11 9 4.9E-09 100
18E06 13 2.3E-09 100
66B02 101 1.5E-09 100
由于通过来自不同配体阻断家族的所有代表性VHH可获得对66B02结合的完全抑制，故可得出结论，所有功能家族彼此紧邻结合以便其与66B02的结合竞争。
实例6：将VHH格式化成二价
二价体的构建
为自对所获得VHH的选择提高效能及/或效力，用遗传工程来构建二价分子。将两个VHH以介于该两个建构组元之间的35GS接头遗传连接在一起，且随后如上文针对单价VHH所述于大肠杆菌中表达。如表24中所列示来制造不同二价构建体。
表24代表性二价格式
构建体编号 VHH种类 家族 接头 VHH种类 家族
CX3CR1BII007 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII18E6 13
CX3CR1BII009 CX3CR1BII18E6 13 35GS CX3CR1BII11H11 9
CX3CR1BII012 CX3CR1BII54D08 101 35GS CX3CR1BII18E06 101
CX3CR1BII016 CX3CR1BII54A12 101 35GS CX3CR1BII54A12 101
CX3CR1BII017 CX3CR1BII54D5 101 35GS CX3CR1BII54D5 101
CX3CR1BII018 CX3CR1BII66B02 101 35GS CX3CR1BII66B02 101
CX3CR1BII019 CX3CR1BII66G01 101 35GS CX3CR1BII66G01 101
CX3CR1BII020 CX3CR1BII54B5 101 35GS CX3CR1BII54B5 101
CX3CR1BII026 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII66B02 101
CX3CR1BII027 CX3CR1BII11H11 9 35GS CX3CR1BII54B5 101
通过抗CX3CR1 VHH抑制人类弗莱托肯趋化因子与BA/F3细胞上所表达的人类CX3CR1结合
如实施例4中所述研究不同格式对人类CX3CR1的配体结合的抑制。对于此表征，使用显示人类CX3CR1受体的稳定表达的BA/F3-huCX3CR1细胞系。以EC30浓度使用经alexa647标记的配体弗莱托肯趋化因子，且由此获得的IC50值反映Ki值。对所获得数据的概述是显示于表25中。
表25二价格式在配体竞争中的效能
通过抗CX3CR1 VHH抑制过表达人类CX3CR1的BA/F3细胞的人类弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用
与针对单价抗CX3CR1 VHH所述相似，评估二价构建体对BA/F3-huCX3CR1细胞上弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用的抑制。使用与上文所述相同的分析设定，且所获得的结果是总结于表26中。
表26二价VHH构建体对弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用的抑制
构建体编号 细胞系 IC50(M) 阻断％ 重复
CX3CR1BII007 BA/F3-huCX3CR1 4E-9 101 5
CX3CR1BII009 BA/F3-huCX3CR1 2E-8 79 5
CX3CR1BII012 BA/F3-huCX3CR1 4E-9 78 1
CX3CR1BII016 BA/F3-huCX3CR1 2E-9 88 3
CX3CR1BII017 BA/F3-huCX3CR1 3E-9 89 3
CX3CR1BII018 BA/F3-huCX3CR1 6E-10 98 6
CX3CR1BII019 BA/F3-huCX3CR1 2E-9 85 3
CX3CR1BII020 BA/F3-huCX3CR1 2E-9 85 3
CX3CR1BII026 BA/F3-huCX3CR1 3E-10 98 1
CX3CR1BII027 BA/F3-huCX3CR1 9E-10 98 1
对抗CX3CR1 VHH对食蟹猴CX3CR1的交叉反应性的评估
而且，对于二价构建体，评估对食蟹猴CX3CR1的交叉反应性并将其与人类反应性相比较。如先前所述，使用经瞬时转染HEK293T细胞应用结合设定(27)或配体竞争设定(28)。各批的经瞬时转染细胞系通过其受体表达位准来匹配。
表27二价构建体与人类或食蟹猴CX3CR1的结合
构建体编号 细胞系 人类EC50(M) 食蟹猴EC50(M) 比率 重复
CX3CR1BII007 HEK293T 3.1E-10 4.8E-8 154 2
CX3CR1BII009 HEK293T 2.0E-9 6.8E-9 3.3 2
CX3CR1BII012 HEK293T 5.6E-11 6.3E-11 1.1 1
表28二价构建体对人类或食蟹猴CX3CR1的配体竞争
实施例7：对接头长度及半衰期延长的探究
对接头长度的评估及alb11 VHH的定位
由于二价格式中所用接头长度可对所获得的效能产生极大影响，故评估不同接头长度。
另外，包括与人血清白蛋白结合的纳米抗体Alb11以延长格式化分子的体内半衰期(WO 06/122787)。制造包括所用接头长度的变化也及不同组成VHH的定位的不同格式。对所探究格式的总结是显示于表29中。
表29对半衰期延长及接头长度的探究
将格式化VHH的编码序列克隆至内部构建质粒中，容许在甲醇酵母中表达并分泌至培养基中。表达载体源自pPICZa(Invitrogen)且含有用于经紧密调控且经甲醇诱导的表达的AOX1启动子、ZeocinTM的抗性基因、多克隆位点及α因子分泌信号。转化后，使表达培养物生长，且通过添加甲醇来诱导VHH表达并使VHH表达于30℃下继续48小时。
使用上文所述的配体竞争分析评估这些不同格式的效能。由于所用配体浓度低于EC50值，故所获得的IC50值等于Ki值。不同格式的所获得的Ki是总结于30中。
表30半衰期延长的格式在配体竞争中的效能
人血清白蛋白对效能的影响
人血清白蛋白(HSA)与alb11 VHH的结合可对格式的效能产生影响，且因此在HSA的存在下重复配体竞争。简言之，为容许HSA与alb11 VHH结合，将评估中的构建体及弗莱托肯趋化因子与HSA一起预培育30分钟，然后添加至细胞中。也将细胞再悬浮于补充有HSA的FACS缓冲液中。所用HSA最终浓度超过所用最高VHH浓度50倍。随后，使竞争进行2小时，且如实施例4中所述进行进一步处理。
构建体编号 细胞系 IC50(M) 阻断％ 重复
CX3CR1BII032 BA/F3-huCX3CR1 1.4E-9 100 2
CX3CR1BII034 BA/F3-huCX3CR1 1.3E-9 100 2
CX3CR1BII036 BA/F3-huCX3CR1 1.4E-9 100 2
也在经调适趋化作用设定中评估HSA的潜在干预，该设定在分析的不同隔室中包括HSA。所用HSA浓度再次超过所用的最高构建体浓度50倍，且向构建体加载HSA并持续30分钟，然后开始分析。分析缓冲液也补充有HSA，以便在整个实验期间存在HSA。如上文所述，使用具有5μm孔径的可弃式ChemoTx室(Neuroprobe，Gaithersburg，MD，USA)。自活跃生长的培养物收获细胞并在用于补充有0.1％BSA及62.5μM HSA(Sigma，A8763)的分析培养基RPMI(Gibco，Carlsbad，US)中的前洗涤。用总体积为300μl的320pM人类弗莱托肯趋化因子填充底部室。在施加膜之后，将总体积为70μl的0.13E6个细胞沉积于膜的顶部。使趋化作用于37℃下在具有CO2的潮湿室中进行3小时。此培育期之后，移除膜，且再悬浮底部室中的细胞。使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega，Madison WI，USA)测定孔中存在的ATP量。利用发光读数的标准工业设定在Envision(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)上实施读数。以一式三份实施剂量递增系列，且每一板也以一式三份含有对照样品。作为对照，包括无VHH的样品以及未向底部室中添加人类弗莱托肯趋化因子的样品。所获得的IC50值系列示于表31中。
表31在HSA的存在下弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用
构建体编号 细胞系 IC50(M) 阻断％ 重复
CX3CR1BII032 BA/F3-huCX3CR1 6E-10 98 2
CX3CR1BII034 BA/F3-huCX3CR1 9E-10 100 2
CX3CR1BII036 BA/F3-huCX3CR1 6E-10 102 2
半衰期延长的经格式化二价多肽对弗莱托肯趋化因子内在化的抑制
实施其他功能分析以展示半衰期延长的二价多肽的拮抗剂活性。评估多肽在CHOhuCX3CR1细胞中抑制A647-弗莱托肯趋化因子内在化的能力。简言之，将1E4个细胞/孔平铺于具有黑色透明底部的96孔板(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)中并生长过夜。将细胞洗涤一次，且然后在分析缓冲液(补充有10mM HEPES及0.1％BSA的具有钙及镁的HBSS(Gibco))中平衡。添加格式化多肽构建体，且于37℃下将这些板培育15分钟。然后以8nM的最终浓度添加A647-弗莱托肯趋化因子，且于37℃下将细胞培育60分钟。移除培养基，且利用3.7％甲醛溶液(Polysciences，Warrington，PA，USA)将细胞固定10分钟。用PBS将细胞冲洗一次，且利用Hoechst染料(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)标记细胞核。为定量内在化经标记弗莱托肯趋化因子，使用BD Pathway生物成像系统使细胞成像。通过识别经标记细胞核并在该领域(mask)周围画一个3像素环来实施影像分割。量测细胞质环中的平均A647强度。格式化多肽有效地抑制弗莱托肯趋化因子内在化，如表32中所总结：
表32对A647-弗莱托肯趋化因子内在化的抑制
构建体编号 细胞系 IC50(M) 重复
CX3CR1BII032 CHO-huCX3CR1 4.0E-10 5
CX3CR1BII034 CHO-huCX3CR 1 7.4E-10 3
CX3CR1BII036 CHO-huCX3CR1 4.9E-10 8
CX3CR1BII040 CHO-huCX3CR1 1.0E-9 3
CX3CR1BII041 CHO-huCX3CR1 1.1E-9 2
CX3CR1BII042 CHO-huCX3CR1 8.5E-10 2
半衰期延长的经格式化二价抗CX3CR1多肽缺乏激动剂活性
为证实半衰期延长的二价抗CX3CR1多肽不具有激动剂活性，评估CX3CR1BII036对CHO huCX3CR1细胞中钙流入的诱导。弗莱托肯趋化因子介导这些细胞中的细胞溶质钙含量以CX3CR1依赖性方式提高，且CX3CR1BII036抑制此反应。
以5E4个细胞/孔将CHO huCX3CR1细胞平铺于具有黑色透明底部的96孔板(BD)中并生长过夜。于37℃下，将细胞与钙-4染料/2mM丙磺舒(probenicid，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)在补无有20mM HEPES的HBSS中一起培育60分钟。为展示多肽拮抗作用，将CX3CR1BII036与细胞一起预培育15分钟，然后以其EC80值添加弗莱托肯趋化因子。根据制造商说明书于FLIPR Tetra系统(Molecular Devices)上监测钙动员。为测定激动作用，不用多肽进行预培育，而是使用CX3CR1BII036代替弗莱托肯趋化因子刺激。虽然CX3CR1BII036以1.3nM的IC50抑制弗莱托肯趋化因子介导的钙流入，但当以高达1μM的浓度仅添加多肽时，未观察到细胞溶质钙含量提高。
实施例8：使用小鼠Fc探究半衰期延长格式
为研究替代半衰期延长形式，66B02 VHH域是以具有小鼠IgG2 Fc域的融合蛋白(66B02-mFc)的形式产生。将天冬氨酸至丙氨酸突变(D265A)纳入CH2域中以消除此构建体中的潜在的Fc介导效应器功能(Baudino，J.Immunol.，181，6664-6669(2008))。66B02-mFc是在HEK293T细胞或NS0细胞中表达，且通过蛋白质A亲和力层析法、接着离子交换层析法纯化。利用实施例7中所述的分析格式测试此分子的活性。结果是总结于表33中：
表33 66B02-mFc活性
分析 细胞系 IC50(M) 重复
配体竞争 BA/F3-huCX3CR1 5.7E-10 2
趋化作用 BA/F3-huCX3CR1 8.9E-10 3
配体内在化 CHO-huCX3CR1 5.2E-10 5
钙流入 CHO-huCX3CR1 9.8E-10 5
虽然66B02-mFc有效地抑制弗莱托肯趋化因子介导的CX3CR1活化，但其不展示激动剂活性。利用1μM的此分子治疗未观察到细胞溶质钙含量提高。
实施例9：半衰期延长的二价多肽对小鼠动脉粥样硬化模型中的斑进展的抑制
人类CX3CR1基因敲入Apo E-/-小鼠的生成
考虑到小鼠CX3CR1的所识别VHH缺乏交叉反应性(实例5)，在TaconicArtemis(Koeln，Germany)生成人类CX3CR1基因敲入小鼠品系(hu CX3CR1 KI)，以使能够测试小鼠疾病模型中的分子。采用容许人类趋化因子受体在相应小鼠启动子的控制下的表达同时中断内源性小鼠蛋白质的表达的策略。简言之，构建如下靶向载体：其中外显子2中的小鼠CX3CR1编码区经完整人类CX3CR1开放读码框替代并由选择标记物及loxP位点侧接。将靶向载体引入小鼠ES细胞中，且使用已成功经历同源重组的克隆生成嵌合小鼠。将这些小鼠喂养成高效Flp-deleter小鼠以达成选择标记物的移除及种系传递。然后将C57BL/6背景下的所得hu CX3CR1 KI小鼠与Apo E-/-小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，USA)杂交，以生成hu CX3CR1 KI Apo E-/-小鼠。Apo E-/-小鼠模型提供引发在斑形成的位点特异性定位、组织学组成及已知风险因素(胆固醇、发炎、高血压等)方面与人类疾病极相似的广泛动脉粥样硬化斑形成的稳健方法。
在小鼠Apo E-/-动脉粥样硬化模型中对半衰期延长的二价抗CX3CR1多肽的评估
自4周龄开始向雌性hu CX3CR1KI Apo E-/-小鼠喂养含有1.5％胆固醇的高脂肪/高胆固醇饮食并持续16周。10周后，通过腹膜内注射向动物给药媒剂(20mM柠檬酸钠pH6.0、115mM NaCl)、10mg/kg 66B02-mFc(每周一次或两次)或30mg/kg CX3CR1BII036(每周两次)并持续6周。通过气体麻醉使动物麻醉并向其灌注0.9％盐水。小心移除降主动脉至回肠分岔点并将其于福马林(formalin)中固定。然后将其纵向打开，并利用苏丹IV(SudanIV)染色15分钟，接着利用70％甲醇染色2分钟。在流水下洗涤血管并用PBS覆盖。用使用SPOT Advanced软体的数位相机(SPOT Imaging Solutions，Sterling Heights，MI，USA)对组织拍照。利用影像分析软体(Image-Pro Plus，MediaCybernetics，Rockville，MD，USA)测定脂质染色百分比并表示为血管的阳性染色百分比。此研究的结果是总结于表34中：
表34对雌性hu CX3CR1 KI Apo E-/-小鼠中的降主动脉中的斑大小的量化
群组 剂量 动物编号 斑面积％ 斑面积的降低％
对照(10周) N/A 6 3.4 N/A
对照(16周) 媒剂 17 14.8 N/A
66B02-mFc 10mg/kg(1×周) 17 13.0 16
66B02-mFc 10mg/kg(2×/周) 17 10.3 39(p＜0.05)
CX3CR1BII036 30mg/kg(2×/周) 17 10.1 41(p＜0.05)
当每周给药两次时，66B02-mFc及CX3CR1BII036均显著抑制斑进展。此与覆盖率相关，此乃因可证实在整个研究中均维持这些分子的血浆含量。对于每周给药一次66B02-mFc，未维持可检测血浆含量，且此与6周治疗后未观察到显著效力相关。两种分子均不显著影响血浆胆固醇或三酸甘油酯含量。
实施例10：亲代VHH的序列优化
通常，在VHH序列优化期间，使亲代野生型VHH序列突变以产生与人类VH3-JH种系一致序列更一致的VHH序列。以保持蛋白质结构、活性及稳定性完整的方式将框架区中在VHH与人类VH3-JH种系一致序列之间不同的具体氨基酸改变成人类对应物。为研究此，在三种不同分析中将所有序列优化变体与亲代VHH比较：(i)在热移位分析(TSA)中测定熔解温度(Tm)、(ii)在弗莱托肯趋化因子竞争FACS中分析体外效能，且对于一些构建体(iii)在弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用分析中分析体外效能。
框架残基的突变
对于序列优化，研究以下突变：E1D、S11L、A14P、E16G、R44Q、D46E、A74S、K83R及Q108L。CX3CR1BII66B02的亲代序列中所生成的个别突变体是描述于35中：
表35 66B02的序列优化期间所研究的突变
克隆编号 所引入的突变
C100CX3CR1BII043 A14P、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII045 E1D、A14P、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII047 S11L、A14P、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII048 A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII049 A14P、R44Q、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII050 A14P、D46E、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII061 S11L、A14P、E16G、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII056 S11L、A14P、E16G、R44Q、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII057 S11L、A14P、E16G、D46E、A74S、K83R、Q108L
C100CX3CR1BII060 S11L、A14P、E16G、R44Q、D46E、A74S、K83R、Q108L
将所有构建体克隆于大肠杆菌表达载体中，并在0.25L至0.5L培养物体积的TB培养基中于大肠杆菌中表达为经myc/His标记的蛋白质。通过添加1mM IPTG来诱导表达并允许于37℃及250rpm下继续表达4小时。使细胞沉淀，且通过冷冻-解冻及再悬浮于dPBS中来制备周质提取物。使用这些提取物作为起始材料用于使用Histrap FF粗柱(GEhealthcare)的固定化金属亲和力层析法(IMAC)。用250mM咪唑自该柱洗脱纳米抗体，且随后利用dPBS去盐。通过还原性SDS-PAGE来验证纳米抗体的纯度及完整性。
如表36中所总结，A14P、A74S、K83R及Q108L突变对效能没有明显效应，如自竞争FACS所测定。相似地，其他突变E1D、S11L及E16G不影响效能。另一方面，R44Q或D46E的引入使得效能显著下降，若引入两种突变则效能下降甚至更明显。
表36通过配体竞争FACS测定的序列优化构建体的效能
也评估预测VHH的稳定性的熔解温度。大多数个别突变效应有限甚至没有效应，但D46E突变除外，其使熔解温度提高大约6℃。组合突变的引入也增强热稳定性，参见057及060。
由于在配体竞争FACS中对效能具有显著效应，突变R44Q及D46E不包括在最终序列中。
CDR残基的突变
基于亲代序列的电脑上分析，预测糖基化位点在52位处。因此构建两个文库；一个文库是针对52位且一个文库是针对53位，其经设计以在各别位置处包括所有可能氨基酸。在配体竞争FACS中以周质提取物形式筛选文库。首先，自亲代序列制造周质材料的稀释系列且选择三个稀释液用于进一步筛选。选择第一稀释点(2倍)以完全阻断配体相互作用，而另两个稀释点(128倍及512倍)应分别导致70％及40％阻断。自文库产生周质提取物后，将所有样品分为两部分，且使其中的一个进行热处理。随后在配体竞争FACS中于三个稀释点处分析未经处理及热处理样品。可通过比较该所获得的阻断与自亲代序列所获得的阻断来估计突变的影响。对热处理样品的分析提供对突变稳定性的潜在影响的量度。
基于初始筛选结果，选择三种突变用于经一步表征。配体竞争FACS中所获得的效能是显示于37中。
表3752位处糖基化位点的移除
构建体 IC50(M) 阻断％ 于pH 7下的Tm
C100CX3CR1BII66B02 2.5E-09 98.0 65.66
CX3CR1BII66B02(N52S、Q108L) 1.7E-09 98.0 66.07
CX3CR1BII66B02(N52Q、Q108L) 2.1E-09 97.9 59.83
CX3CR1BII66B02(N52G、Q108L) 1.1E-09 98.0 59.83
CX3CR1BII66B02(N52T、Q108L) 2.8E-09 98.0 66.07
CX3CR1BII66B02(S53T、Q108L) 1.3E-09 98.1 66.07
CX3CR1BII66B02(S53G、Q108L) 1.2E-09 98.3 64.83
CX3CR1BII66B02(S53P、Q108L) 8.0E-10 98.2 66.91
自此分析(即与人类参照序列的序列比对)且基于电脑上T细胞表位识别预测程式，显然序列中包括突变N52S及S53T。
由于稳定性原因，针对32位制造其他文库。以与上文所述相似的方式设定配体竞争筛选。再次筛选周质提取物的三个稀释液，且将所获得的阻断％与针对亲代序列所获得的阻断％比较。分析各种突变体后，N32T的取代经选择且包括在最终序列经优化变体中。
实施例11：对优化变体的分析
在最后一轮表征中，表征38中所列示构建体。
表38前导VHH 66B02的序列经优化变体
如上文所述实施竞争FACS实验以及熔解温度的测定。所获得的值是呈现于表39中。
表39序列经优化变体的竞争FACS及Tm
构建体 IC50(M) 阻断％ 于pH7下的Tm
C100CX3CR1BII66B02 2.5E-09 98.0 65.05
CX3CR1BII00306 1.7E-09 97.0 68.54
CX3CR1BII00307 1.9E-09 97.0 68.13
CX3CR1BII00308 1.6E-09 97.0 68.13
CX3CR1BII00312 4.6E-10 100.0 59.37
CX3CR1BII00313 4.0E-10 100.0 58.88
CX3CR1BII00314 6.5E-10 100.0 58.40
也在上文所述弗莱托肯趋化因子诱导的趋化作用中表征这些构建体(表40)。
表40序列经优化变体的经配体诱导趋化作用
构建体 IC50(M) 阻断％ n
C100CX3CR1BII66B02 3.6E-08 91 3
CX3CR1BII00306 6.3E-08 95 2
CX3CR1BII00307 6.3E-08 100 2
CX3CR1BII00308 4.4E-08 89 2
CX3CR1BII00312 2.7E-09 99 3
CX3CR1BII00313 2.7E-09 99 3
CX3CR1BII00314 3.6E-09 100 3
评估所选择构建体在CHO huCX3CR1细胞中对A647-弗莱托肯趋化因子诱导的内在化的抑制。结果是总结于表41中：
表41序列经优化变体的经配体诱导内在化
构建体 IC50(M) n
CX3CR1BII00312 5.5E-10 1
CX3CR1BII00313 3.3E-10 6
序列经优化的半衰期延长的抗CX3CR1多肽缺乏激动剂活性
为证实序列经优化的半衰期延长的抗CX3CR1多肽不具有激动剂活性，评估CX3CR1BII00313在CHO huCX3CR1细胞中对钙流入的诱导。虽然与CX3CR1BII00313一起的预培育以1.3nM的IC50抑制弗莱托肯趋化因子介导的钙流入，但当以高达1μM的浓度仅添加多肽时，未观察到细胞溶质钙含量提高。
实施例12：使用人类Fc探究半衰期延长格式
为研究其他半衰期延长形式，CX3CR1BII00306及CX3CR1BII00307序列经优化的VHH域是以具有人类IgG1 Fc域的融合蛋白(306D-hFc及307D-hFc)的形式产生。将两种突变纳入CH2域中以消除此构建体中潜在的Fc介导效应器功能。306D-hFc及307D-hFc是在HEK293T细胞或NS0细胞中表达，且通过蛋白质A亲和力层析法、接着离子交换层析法纯化。利用实例7中所述的分析格式测试这些分子的功能活性。结果是总结于表42中：
表42 hFc融合蛋白的活性
虽然这些分子有效地抑制弗莱托肯趋化因子介导的CX3CR1活化，但其不展示激动剂活性。仅利用高达1μM的纳米抗体治疗未观察到细胞溶质钙含量提高。
实施例13：序列经优化的抗CX3CR1纳米抗体对小鼠动脉粥样硬化模型中的斑进展的抑制
自4周龄开始向雌性hu CX3CR1KI Apo E-/-小鼠喂养含有1.5％胆固醇的高脂肪/高胆固醇饮食并持续16周。10周后，通过腹膜内注射向动物给药媒剂(20mM柠檬酸钠pH6.0、115mM NaCl)、30mg/kg CX3CR1BII00313(每周一次或两次)或30mg/kg CX3CR1BII036(每周两次)并持续6周。将动物处死，且如上文所述定量降主动脉中斑面积的百分比。此研究的结果是总结于表43中：
表43对雌性hu CX3CR1 KI Apo E-/-小鼠中的降主动脉中的斑大小的量化
群组 剂量 动物编号 斑面积％ 斑面积的减少％
对照(10周) N/A 6 2.1 N/A
对照(16周) 媒剂 18 12.0 N/A
CX3CR1BII00313 30mg/kg(1×周) 17 10.7 13
CX3CR1BII00313 30mg/kg(2×/周) 18 5.9 62(p＜0.01)
CX3CR1BII036 30mg/kg(2×/周) 17 6.8 52(p＜0.01)
当每周给药两次时，CX3CR1BII00313及CX3CR1BII036均显著抑制斑进展。此与覆盖率相关，此乃因可证实在整个研究中均维持这些分子的血浆含量。对于每周给药一次CX3CR1BII00313，未维持可检测血浆含量且此与6周治疗后未观察到显著效力相关。两种分子均不显著影响血浆胆固醇或三酸甘油酯含量。
实例14：纳米抗体与全血中的原代人类及食蟹猴CD14+细胞结合
经格式化且序列经优化的抗CX3CR1纳米抗体的竞争FACS
为证实经格式化且序列经优化的抗CX3CR１纳米抗体与人类原代细胞的结合，在全血中的竞争FACS分析中展示CX3CR１BII00313与经A647标记的CX3CR1BII018(A647-018)竞争结合CD14+细胞。简言之，将与eFluor 450(eBioscience，San Diego，CA，USA)偶联的小鼠抗人类CD14抗体1∶10稀释于来自健康人类供体的经EDTA处理的全血中。以40μl/孔添加至96孔聚苯乙烯圆底板中，接着以在100nM至0.002pM范围内的最终浓度添加10μl/孔稀释于具有BSA的染色缓冲液(BD Pharmingen)中的CX3CR1BII00313，且将样品于室温下培育20分钟。然后添加10μl/孔存于染色缓冲液中的A647-018，从而得到1nM的最终浓度(A647-018结合的EC80)，且将样品于室温下再培育20分钟。然后添加220μl/孔的1步式固定/裂解溶液(eBioscience)。在室温下培育10分钟后，使细胞沉淀，在染色缓冲液中洗涤两次并使其再悬浮于此缓冲液中。在BD LSR II流式细胞仪上分析样品。量化门CD14阳性细胞群针对AlexaFluor 647的中值萤光强度。CX3CR1BII00313在人类血液中以0.35nM的IC50有效地抑制A647-018与CD14阳性细胞的结合(n＝8)。
为证实经格式化且序列经优化的抗CX3CR1纳米抗体与食蟹猴原代细胞的结合，在食蟹猴全血中的竞争FACS分析中展示CX3CR1BII00313与A647标记的CX3CR1BII018(A647-018)竞争与CD14+细胞结合。所用方法与上文所概述者类似，只是A647-018的最终浓度为3nM(A647-018结合的EC80)且使用ACK裂解缓冲液(Life Technologies)替代1步式固定/裂解溶液。在分析的前将细胞再悬浮于补充有1％甲醛的染色缓冲液中。CX3CR1BII00313以0.43nM的IC50有效地抑制A647-018与食蟹猴血液中的CD14阳性细胞结合(n＝4)。
实施例15：食蟹猴中的药物动力学(PK)
在2岁至5岁大且体重在2.4kg至3.5kg范围内的未处理雄性食蟹猴(马来猴(Macaca fascicularis))中实施药物动力学研究。将这些猴分成四个治疗群组。群组1(n＝3)接受0.2mg/kg的CX3CR1BII00313 i.v.；群组2(n＝3)接受2mg/kg的CX3CR1BII00313i.v.；群组3(n＝3)接受2mg/kg CX3CR1BII00313 s.c.且群组4(n＝3)接受5mg/kgCX3CR1BII00313 i.v.。以存于柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠/115mM氯化钠，pH 6.0)中的2mg/ml溶液的形式给药CX3CR1BII00313。6周后自外周静脉收集血液样品并收集至血清分离管中用于PK分析。
使用MSD(Meso Scale Discovery)格式分析血清样品。简言之，使生物素化抗纳米抗体抗体与MSD标准链霉抗生物素蛋白板(Meso Scale Discovery，Rockville，MD，USA)结合。利用存于磷酸盐缓冲盐水中的0.05％Tween 20洗涤这些板并利用5％w/v的SeraCareBSA(SeraCare Life Sciences，Milford，MA，USA)进行阻断，然后与血清样品一起培育。利用硫标记抗纳米抗体纳米抗体检测CX3CR1BII00313，且在Sector Imager 2400(MesoScale Discovery)上分析这些板。使用存于5％猴血清中5000ng/ml至0.5ng/ml的不同浓度的CX3CR1BII0313作为标准物。通过监测游离CX3CR1在CD14+门控单核细胞上的含量来评价靶接合。此分析与实施例14中所总结的竞争FACS分析类似，只是不添加其他CX3CR1BII00313。也监测血清样品中是否存在灵长动物抗人类抗体(PAHA)，此乃因其可影响对PK及游离CX3CR1的评价。
使用ForteBio RED96来检测PAHA。简言之，在链霉抗生物素蛋白感测器上方捕获生物素化CX3CR1BII0313。然后使用经汇集纯真猴血清作为阴性对照来计算截止值(定义为高于纯真血清的平均结合信号两倍)。将所有血清样品于缓冲液中稀释20倍，且若结合信号大于截止值，则PAHA反应经测定为阳性。
自PK/PD分析排除PAHA检测后的时间点的数据。PK数据是总结于下表44中。
表44 CX3CR1BII00313的药物动力学参数
**末期表征的数据不足
静脉内2.0mg/kg的清除率及半衰期分别为9.4mL/d/kg及9.6天。在静脉内0.2mg/kg下，清除率显著较高(113mL/d/kg)，此结果符合可饱和靶介导配置(TMD)药物动力学。在2mg/kg与5mg/kg静脉内剂量之间，随剂量调整的AUC(0-14d)相当，此表示在2mg/kg剂量下TMD已饱和。在静脉内或皮下给药纳米抗体后2周时，暴露浓度＞70nM，且在皮下给药后生物利用度为54％。以大于90％的靶覆盖率暴露浓度所追踪的游离受体维持在＞10nM的暴露浓度下。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.多肽，其包含抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中所述多肽能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
2.如项1的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域基本上是由四个框架区(FR1、FR2、FR3及FR4)及三个互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)组成。
3.如项1或2的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是VH、VL、VHH、骆驼化VH或优化了稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性的VHH。
4.如项1至3中任一项的多肽，其中所述多肽对人类CX3CR1在如下具有亲和力：
a)如通过细胞结合FACS所测定的，EC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM；或
b)如通过竞争FACS所测定的，IC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM。
5.如项1至4中任一项的多肽，其中所述多肽在如下IC50阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合，所述IC50为：小于或等于300nM、或小于或等于100nM、或小于或等于20nM、或小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1 nM。
6.如项1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有氨基酸序列Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO：197)的CDR3，其中：
Xaal是Pro、Ala或Gly；
Xaa2是Asp或Asn；
Xaa3是Thr或Ser；
Xaa4是Arg、Lys、Ala或Gly；且
Xaa5是Tyr或Phe。
7.如项6的多肽，其中所述CDR3具有氨基酸序列
Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(SEQ ID NO：186)。
8.如项1至6中任一项的多肽，其中该多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID NO：213、221及186；或
分别为SEQ ID NO：141、162及186；或
分别为SEQ ID NO：141、163及187；或
分别为SEQ ID NO：141、164及186；或
分别为SEQ ID NO：141、166及186；或
分别为SEQ ID NO：141、167及186；或
分别为SEQ ID NO：141、167及189；或
分别为SEQ ID NO：141、168及186；或
分别为SEQ ID NO：141、168及187；或
分别为SEQ ID NO：141、169及190；或
分别为SEQ ID NO：141、170及186；或
分别为SEQ ID NO：141、171及186；或
分别为SEQ ID NO：141、174及186；或
分别为SEQ ID NO：141、175及187；或
分别为SEQ ID NO：142、165及188；或
分别为SEQ ID NO：142、173及188；或
分别为SEQ ID NO：143、164及186；或
分别为SEQ ID NO：144、172及187；或
分别为SEQ ID NO：145、172及187；或
分别为SEQ ID NO：141、214及186；或
分别为SEQ ID NO：141、215及186；或
分别为SEQ ID NO：141、216及186；或
分别为SEQ ID NO：141、217及186；或
分别为SEQ ID NO：141、218及186；或
分别为SEQ ID NO：141、219及186；或
分别为SEQ ID NO：141、220及186；或
分别为SEQ ID NO：213、214及186。
9.如项1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID NO：146、176及191；或
分别为SEQ ID NO：146、177及191。
10.如项1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID NO：147、178及192；或
分别为SEQ ID NO：147、179及192；或
分别为SEQ ID NO：147、179及194；或
分别为SEQ ID NO：148、179及193；或
分别为SEQ ID NO：１49、179及192；或
分别为SEQ ID NO：149、180及192；或
分别为SEQ ID NO：149、181及192；或
分别为SEQ ID NO：149、183及192；或
分别为SEQ ID NO：149、185及192；或
分别为SEQ ID NO：150、179及194；或
分别为SEQ ID NO：150、182及194；或
分别为SEQ ID NO：151、179及193；或
分别为SEQ ID NO：151、182及194；或
分别为SEQ ID NO：151、184及196；或
分别为SEQ ID NO：152、179及195；或
分别为SEQ ID NO：153、179及194；或
分别为SEQ ID NO：154、182及194；或
分别为SEQ ID NO：155、179及195；或
分别为SEQ ID NO：156、181及192；或
分别为SEQ ID NO：157、179及194；或
分别为SEQ ID NO：158、179及192；或
分别为SEQ ID NO：159、178及192；或
分别为SEQ ID NO：160、179及194；或
分别为SEQ ID NO：161、179及194。
11.如项1的多肽，其中所述多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：分别为SEQ ID NO：141、164及186，分别为SEQ ID NO：141、162及186，分别为SEQ ID NO：213、214及186，或分别为SEQ ID NO：213、221及186。
12.如项1至5中任一项的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)SEQ ID NO：1至48、121至140或222至224中的任一个的氨基酸序列。
13.如项1至5中任一项的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：49的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：49的氨基酸序列具有至少95％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)SEQ ID NO：49至52中的任一个的氨基酸序列。
14.如项1至5中任一项的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是包含如下序列的VHH域：
a)SEQ ID NO：67的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少90％氨基酸一致性的氨基酸序列；或
c)SEQ ID NO：53至120中的任一个的氨基酸序列。
15.如项1的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：121至140或SEQ ID NO：222至224所述的序列。
16.如项1至15中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白单一可变域
a)交叉阻断SEQ ID NO：1至120、121至140及222至224的免疫球蛋白单一可变域中的至少一个与CX3CR1的结合，或
b)被SEQ ID NO：1至120、121至140及222至224的免疫球蛋白单一可变域中的至少一个交叉阻断与CX3CR1的结合。
17.如项1至16中任一项的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长的部分。
18.如项17的多肽，其中所述半衰期延长的部分与所述多肽共价连接且选自白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人类血清白蛋白的片段、白蛋白结合肽或Fc域。
19.如项17或18的多肽，其中所述半衰期延长的部分是由抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域组成。
20.如项19的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自VHH域、人源化VHH域、骆驼化VH域、域抗体、单一域抗体及/或“dAb”。
21.如项20的多肽，其中所述抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域包含选自SEQ IDNO：230至232中的任一个序列。
22.如项1至18中任一项的多肽，其中所述多肽任选地经合适的接头或铰链区连接Fc部分。
23.如项1至16中任一项的多肽，其中所述多肽还包含第二免疫球蛋白单一可变域。
24.如项23的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域包含第二抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域。
25.如项23或24的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域是VH、VL、VHH、骆驼化VH或优化了稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性的VHH。
26.如项23至25中任一项的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域包含如项6至11中任一项所述的CDR1、CDR2及CDR3氨基酸序列。
27.如项26的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含相同CDR1、CDR2及CDR3。
28.如项23至27中任一项的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含具有如项12至15中任一项所述的氨基酸序列的VHH域。
29.如项28的多肽，其中所述第一及第二免疫球蛋白单一可变域包含相同VHH域。
30.如项1的多肽，其包含第一免疫球蛋白单一可变域及如项1至16中任一项所述的第二免疫球蛋白单一可变域，该第一免疫球蛋白单一可变域包含具有SEQ ID NO：141、164及186、或SEQ ID NO：141、162及186、或SEQ ID NO：213、214及186、或SEQ ID NO：213、221及186中所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。
31.如项30的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域包含具有SEQ ID NO：141、164及186、或SEQ ID NO：141、162及186、或SEQ ID NO：213、214及186、或SEQ ID NO：213、221及186所述的氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。
32.如项1的多肽，其包含第一免疫球蛋白单一可变域及如项1至16中任一项的第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域是包含所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：121至140或222至224中的任一个序列的VHH域。
33.如项32的多肽，其中所述第二免疫球蛋白单一可变域是包含所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：121至140或222至224中的任一个序列的VHH域。
34.如项23至33中任一项的多肽，其中该多肽还包含半衰期延长的部分。
35.如项34的多肽，其中所述半衰期延长的部分与所述多肽共价连接且选自白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白的片段、白蛋白结合肽或Fc域。
36.如项35的多肽，其中该半衰期延长的部分是由抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域组成。
37.如项36的多肽，其中该免疫球蛋白单一可变域选自VHH域、人源化VHH域、骆驼化VH域、域抗体、单一域抗体及/或“dAb”。
38.如项37的多肽，其中该抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域选自SEQ ID NO：230至232。
39.如项35的多肽，其中该多肽任选地经合适的接头或铰链区连接Fc部分。
40.如项1至5中任一项的多肽，其包含SEQ ID NO：225至227或257至262中的任一个的氨基酸序列。
41.如项1至5中任一项的多肽，其包含SEQ ID NO：253、254或263至266中的任一个的氨基酸序列。
42.如项1至5中任一项的多肽，其包含SEQ ID NO：249、277至281及267至276中的任一个的氨基酸序列。
43.核酸分子，其编码如项1至42中任一项的多肽。
44.表达载体，其包含如项43的核酸分子。
45.宿主细胞，其包含编码如项1至42中任一项的多肽的核酸分子，其中该宿主细胞能够表达所述多肽。
46.药物组合物，其包含(i)如项1至42中任一项的多肽，及(ii)药学上可接受的载体，及任选地(iii)稀释剂、赋形剂、佐剂及/或稳定剂。
47.如项46的药物组合物，其中所述药物组合物适于在人类中经静脉内或皮下注射。
48.制造如项1至42中任一项的多肽的方法，其包括以下步骤：
-在容许表达如项1至42中任一项的多肽的条件下培养宿主细胞，
其中所述宿主细胞携带包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码如项1至42中任一项的多肽的区，且其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
49.如项48的方法，其进一步包括以下步骤：
-回收所述多肽；及
-纯化所述多肽。
50.如项1至42中任一项的多肽，其用于在人类中治疗、预防或缓和疾病、障碍或病症。
51.如项50所使用的多肽，其中所述疾病、障碍或病症是CX3CR1相关疾病、障碍或病症。
52.如项51所使用的多肽，其中该所述疾病、障碍或病症选自心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及韦格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
53.如项52所使用的多肽，其中所述疾病、障碍或病症是动脉粥样硬化。
54.如项1至42中任一项的多肽在制备用于在人类中治疗、预防、或缓和疾病、障碍或病症的药物中的用途。
55.治疗或预防CX3CR1相关疾病或障碍的方法，其包括向有此需要的个体给药药学上活性量的如项1至42中任一项的多肽。
56.如项55的方法，其中所述疾病或病症选自心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及韦格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
57.如项55的方法，其中所述疾病或病症是动脉粥样硬化。
58.诊断试剂盒或诊断方法，其包括如项1至42中任一项的多肽，或其用途。
59.如项58的诊断试剂盒或诊断方法，其用于诊断至少一种以下疾病：心脑血管动脉粥样硬化病症、外周动脉疾病、再狭窄、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、人类新月体性肾小球性肾炎、IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、血管炎(包括过敏性紫癜及华格纳氏肉芽肿病)、类风湿性关节炎、骨关节炎、同种异体移植物排斥、全身性硬化症、神经变性疾病及脱髓鞘病、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默氏病、肺部疾病(例如COPD)、哮喘、神经性疼痛、炎性疼痛或癌症。
序列表
<110> Singh, Sanjaya
Waterman, Alisa
Depla, Erik
Laeremans, Toon
Van Hoorick, Diane
Ververken, Cedric J
<120> CX3CR1结合多肽
<130> 09-0569-CN-1
<150> 61/603,622
<151> 2012-02-27
<160> 282
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
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Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Asp Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
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Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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115
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 10
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 23
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<220>
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<400> 25
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<220>
<223> 纳米体序列
<400> 26
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1 5 10 15
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<220>
<223> 纳米体序列
<400> 27
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 29
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 32
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Arg Asn
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<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Ser Val Lys
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
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100 105 110
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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<213> 人工序列
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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Ala Leu Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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<220>
<223> 纳米体序列
<400> 52
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<220>
<223> 纳米体序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 55
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<220>
<223> 纳米体序列
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<220>
<223> 纳米体序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 62
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<220>
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<400> 63
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<210> 64
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<220>
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<400> 64
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 118
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
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<220>
<223> 纳米体序列
<400> 122
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 123
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 133
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 25
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<223> Framework sequence
<400> 199
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 200
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 201
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 202
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 202
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 203
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 203
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> Framework sequence
<400> 204
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
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<213> 人工序列
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<223> Framework sequence
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<213> 人工序列
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<223> Framework sequence
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<223> Framework sequence
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<213> 人工序列
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<223> Framework sequence
<400> 209
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
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<211> 39
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<213> 人工序列
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<400> 210
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 211
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> Framework sequence
<400> 212
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala
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<213> 人工序列
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<400> 214
Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
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Ala Ile Gln Ser Val Gly Val Thr Lys
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<211> 9
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<220>
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Ala Ile Gly Ser Val Gly Val Thr Lys
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 217
Ala Ile Thr Ser Val Gly Val Thr Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR sequence
<400> 218
Ala Ile Asn Thr Val Gly Val Thr Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR sequence
<400> 219
Ala Ile Asn Gly Val Gly Val Thr Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR sequence
<400> 220
Ala Ile Asn Pro Val Gly Val Thr Lys
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR sequence
<400> 221
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1 5
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 222
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 223
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 223
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 224
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 224
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 225
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 225
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 226
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 226
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Thr
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 227
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 227
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 228
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1 N-terminal sequence
<400> 228
Met Asp Gln Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Cys
20
<210> 229
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CX3CR1-EC3
<400> 229
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 230
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 230
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 231
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 231
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 232
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 232
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn
20 25 30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 7
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<220>
<223> Linker sequence
<400> 234
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 235
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 236
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> Linker sequence
<400> 237
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 238
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 239
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 241
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 242
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 243
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 243
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 244
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 244
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 245
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20
<210> 246
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 246
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1 5 10
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<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 247
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 248
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker sequence
<400> 248
Ala Ala Ala
1
<210> 249
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 249
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 250
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mouse Fc domain
<400> 250
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
20 25 30
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
35 40 45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
50 55 60
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
130 135 140
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
145 150 155 160
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
180 185 190
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
195 200 205
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 251
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nanobody with Fc domain
<400> 251
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
145 150 155 160
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser
165 170 175
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
180 185 190
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
210 215 220
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
245 250 255
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
260 265 270
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
275 280 285
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
305 310 315 320
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
325 330 335
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
340 345 350
Thr Pro Gly Lys
355
<210> 252
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Human Fc domain
<400> 252
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 253
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nanobody with Fc domain
<400> 253
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 254
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nanobody with Fc domain
<400> 254
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 255
<211> 355
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 255
Met Asp Gln Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Gly Asp Ile Val Val Phe Gly Thr Val
20 25 30
Phe Leu Ser Ile Phe Tyr Ser Val Ile Phe Ala Ile Gly Leu Val Gly
35 40 45
Asn Leu Leu Val Val Phe Ala Leu Thr Asn Ser Lys Lys Pro Lys Ser
50 55 60
Val Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe
65 70 75 80
Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Gly
85 90 95
Leu His Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe Ile Gly
100 105 110
Phe Phe Gly Ser Ile Phe Phe Ile Thr Val Ile Ser Ile Asp Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gln
130 135 140
His Gly Val Thr Ile Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala Ile Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Gln Phe Met Phe Thr Lys Gln Lys Glu Asn Glu Cys Leu
165 170 175
Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gln Glu Ile Trp Pro Val Leu Arg Asn
180 185 190
Val Glu Thr Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ile Met Ser
195 200 205
Tyr Cys Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His
210 215 220
Lys Lys Ala Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Leu Val Val Ile Val Phe
225 230 235 240
Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met Ile Phe Leu Glu Thr Leu
245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu
275 280 285
Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
His Val Asp Phe Ser Ser Ser Glu Ser Gln Arg Ser Arg His Gly Ser
325 330 335
Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Leu
340 345 350
Leu Leu Leu
355
<210> 256
<211> 355
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 256
Met Asp Pro Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Gly Asp Ile Val Ala Phe Gly Thr Val
20 25 30
Phe Leu Ser Ile Phe Tyr Ser Val Val Phe Ala Ile Gly Leu Val Gly
35 40 45
Asn Leu Leu Val Val Phe Ala Leu Thr Asn Ser Lys Lys Pro Lys Ser
50 55 60
Val Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe
65 70 75 80
Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Val Ile Asn Glu Glu Gly
85 90 95
Leu Gln Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe Ile Gly
100 105 110
Phe Phe Gly Ser Ile Phe Phe Ile Thr Ile Ile Ser Ile Asp Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gln
130 135 140
His Gly Val Thr Ile Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala Ile Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Gln Phe Met Phe Thr Lys Gln Lys Glu Asn Glu Cys Leu
165 170 175
Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gln Glu Ile Trp Pro Val Leu Arg Asn
180 185 190
Val Glu Ala Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ile Met Ser
195 200 205
Tyr Cys Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His
210 215 220
Lys Lys Ala Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Leu Val Val Val Val Phe
225 230 235 240
Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met Ile Phe Leu Glu Thr Leu
245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Arg Asp Leu Arg
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu
275 280 285
Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
His Val Asp Phe Ser Pro Ser Glu Ser Gln Arg Ser Arg Gln Gly Ser
325 330 335
Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Ser
340 345 350
Leu Leu Leu
355
<210> 257
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 257
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
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Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
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Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
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<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 258
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
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<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 259
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
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210 215 220
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
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Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
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130 135 140
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Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
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195 200 205
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Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 261
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Ser Thr Val
290 295 300
Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305 310 315 320
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 262
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Val
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
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<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 263
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
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Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
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290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 264
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 264
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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325 330 335
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340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 265
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 265
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys
<210> 266
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 266
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala Ile Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys
<210> 267
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 267
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly Trp Tyr
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val Ala Ser Ile Ser Ser
195 200 205
Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Ala Arg Arg
245 250 255
Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 268
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 268
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ala
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val
165 170 175
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala Gly Ile Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro
245 250 255
Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 269
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 269
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 270
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 270
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Val Ile Asn Ser Val Gly
195 200 205
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210 215 220
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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp
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Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 271
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 271
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Leu Ile Asn Ser
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 272
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 272
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
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Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
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Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly
195 200 205
Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
210 215 220
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245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 273
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 273
Glu Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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Ala Leu Ile Asn Ser Val Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Met Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Leu Ile Asn Ser Val Gly
195 200 205
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Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 274
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln
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Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gly Ile Asn Ser Val Gly
195 200 205
Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
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Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 275
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 275
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser
195 200 205
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Ser
<210> 276
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 276
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Gly Ile Asn Ser
195 200 205
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Ser
<210> 277
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<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 277
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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260 265 270
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Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 278
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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195 200 205
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245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
290 295 300
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
305 310 315 320
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325 330 335
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Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395
<210> 279
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 279
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala
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Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
165 170 175
Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
210 215 220
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
290 295 300
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
340 345 350
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
355 360 365
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395
<210> 280
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 280
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser Val Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
325 330 335
Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
340 345 350
Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp
355 360 365
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385 390 395 400
Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu
405 410 415
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420
<210> 281
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 281
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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245 250 255
Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
290 295 300
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn Ala
325 330 335
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
340 345 350
Ala Ile Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
355 360 365
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
370 375 380
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
385 390 395 400
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
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Val Thr Val Ser Ser
420
<210> 282
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米体序列
<400> 282
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe
180 185 190
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225 230 235 240
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Ser
245 250 255
Tyr Pro Lys Val Gln Phe Asp Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser
275

Claims (10)

1.多肽，其包含抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域，其中所述多肽能够阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合。
2.如权利要求1的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域基本上是由四个框架区(FR1、FR2、FR3及FR4)及三个互补决定区(CDR1、CDR2及CDR3)组成。
3.如权利要求1或2的多肽，其中所述抗CX3CR1免疫球蛋白单一可变域是VH、VL、VHH、骆驼化VH或优化了稳定性、效能、可制造性及/或与人类框架区的相似性的VHH。
4.如权利要求1至3中任一项的多肽，其中所述多肽对人类CX3CR1在如下具有亲和力：
a)如通过细胞结合FACS所测定的，EC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM；或
b)如通过竞争FACS所测定的，IC50小于或等于10nM、小于或等于5nM、小于或等于2.5nM或小于或等于1nM。
5.如权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述多肽在如下IC50阻断人类弗莱托肯趋化因子与人类CX3CR1的结合，所述IC50为：小于或等于300nM、或小于或等于100nM、或小于或等于20nM、或小于或等于10nM、或小于或等于5nM、或小于或等于2.5nM或小于或等于1nM。
6.如权利要求1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有氨基酸序列Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO:197)的CDR3，其中：
Xaa1是Pro、Ala或Gly；
Xaa2是Asp或Asn；
Xaa3是Thr或Ser；
Xaa4是Arg、Lys、Ala或Gly；且
Xaa5是Tyr或Phe。
7.如权利要求6的多肽，其中所述CDR3具有氨基酸序列Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr(SEQ ID NO:186)。
8.如权利要求1至6中任一项的多肽，其中该多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID No:213、221及186；或
分别为SEQ ID No:141、162及186；或
分别为SEQ ID No:141、163及187；或
分别为SEQ ID No:141、164及186；或
分别为SEQ ID No:141、166及186；或
分别为SEQ ID No:141、167及186；或
分别为SEQ ID No:141、167及189；或
分别为SEQ ID No:141、168及186；或
分别为SEQ ID No:141、168及187；或
分别为SEQ ID No:141、169及190；或
分别为SEQ ID No:141、170及186；或
分别为SEQ ID No:141、171及186；或
分别为SEQ ID No:141、174及186；或
分别为SEQ ID No:141、175及187；或
分别为SEQ ID No:142、165及188；或
分别为SEQ ID No:142、173及188；或
分别为SEQ ID No:143、164及186；或
分别为SEQ ID No:144、172及187；或
分别为SEQ ID No:145、172及187；或
分别为SEQ ID No:141、214及186；或
分别为SEQ ID No:141、215及186；或
分别为SEQ ID No:141、216及186；或
分别为SEQ ID No:141、217及186；或
分别为SEQ ID No:141、218及186；或
分别为SEQ ID No:141、219及186；或
分别为SEQ ID No:141、220及186；或
分别为SEQ ID No:213、214及186。
9.如权利要求1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID No:146、176及191；或
分别为SEQ ID No:146、177及191。
10.如权利要求1至5中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有如下氨基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：
分别为SEQ ID No:147、178及192；或
分别为SEQ ID No:147、179及192；或
分别为SEQ ID No:147、179及194；或
分别为SEQ ID No:148、179及193；或
分别为SEQ ID No:149、179及192；或
分别为SEQ ID No:149、180及192；或
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分别为SEQ ID No:150、182及194；或
分别为SEQ ID No:151、179及193；或
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