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JP7577435B2 - Ｃｌｄｎ１８．２及びｃｄ３に対する抗体コンストラクト - Google Patents

Ｃｌｄｎ１８．２及びｃｄ３に対する抗体コンストラクト Download PDF

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Description

本発明は、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に結合するドメインと、ＣＤ３に結合する別のドメインとを含む抗体コンストラクトに関する。更に、本発明は、この抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び前記ポリヌクレオチド又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。更に、本発明は、本発明の抗体コンストラクトを作製する方法、前記抗体コンストラクトの医学的使用及び前記抗体コンストラクトを含むキットを提供する。
クローディンは、上皮タイトジャンクションの重要な構造的及び機能的成分であり、細胞間透過性を調節し、イオン恒常性を維持し、細胞接着及び極性を支える役割を果たす。クローディンは、細胞膜内で又は細胞膜を越えて多量体化することにより防護壁を形成する２２～２７ｋＤの４回膜貫通型タンパク質である。既報告の２４個のクローディンタンパク質は、その組織局在の特異性及び他のタンパク質とのその相互作用が異なっている。
クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）は、当初、転写因子Ｔ／ＥＢＰ／ＮＫＸ２．１の標的遺伝子として同定された。他のクローディンファミリーメンバーとのその相同性と一致して、ＣＬＤＮ１８は、マウス及びヒトの細胞タイトジャンクションに局在することが確認された。ＣＬＤＮ１８は、選択的スプライシングによって生成される２つのアイソフォーム：正常肺に特異的に発現するＣＬＤＮ１８．１及び胃粘膜の分化型細胞に発現するＣＬＤＮ１８．２をコードすることが示された。
ＣＬＤＮ１８．２は、２つの細胞外ループを含む２６１アミノ酸タンパク質であり、ＣＬＤＮ１８．１と９２％の配列同一性を有する。第２の細胞外ループと異なり、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループは、ＣＬＤＮ１８．１と８アミノ酸の差を有する。他のファミリーメンバーとのＣＬＤＮ１８．２の相同性は、より限られたものであり、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ７との全体的同一性は、２９～３４％である。
ＣＬＤＮ１８．２は、胃がん、膵がん、食道がん、ムチン性卵巣がん及び非小細胞肺がんを含め、幾つかの腫瘍型に発現する。胃がんにおけるＣＬＤＮ１８．２発現は、浸潤最深部及び転移部位を含むが、しかし、これらの状況では、絶対的ＣＬＤＮ１８レベルが低下することが報告される。複数の腫瘍型でのＣＬＤＮ１８．２の発現は、正常組織発現が主に胃の分化型細胞に限定されることと併せて、ＣＬＤＮ１８．２を胃がん及び他の対象疾患の治療標的として考えることにつながっている。
胃がん及び胃食道がんは、依然として医療ニーズがありながらも未だ対処されていない疾患であり、毎年世界で少なくとも１４０万件の新規症例及び１１０万件の死亡例が報告されている（Ｌｏｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｎｊｉｇｉａｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６）。典型的な第一選択治療には、手術並びに白金及びフルオロピリミジン化合物を含む併用化学療法が関わる。このレジメンによってクオリティオブライフが向上し、生存が中央値で８～１０ヵ月延びる可能性があり得るものの、５年生存率は、依然として低い。
ターゲット療法は、代替的治療戦略を提供する。化学療法との併用でＨｅｒ２陽性胃がん及び胃食道がんの第一選択治療として抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブが承認されている（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０１０）。化学療法後に進行した胃がん及び胃食道がんの治療のために抗ＶＥＧＦＲ２抗体ラムシルマブが承認されている（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０１４）。これらの標的化薬剤により、化学療法単独と比較して生存率が更に上昇するが、その有効性は、標的発現の不均一さ及び耐性機構によって制限されている。
近年、免疫チェックポイント療法が特定の状況で活性を実証している。ペンブロリズマブは、胃がんを含めた高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）腫瘍の治療（Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７）及び２次以上の化学療法ライン後に進行した切除不能な進行又は再発胃がんの治療（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１７）のために米国で承認された。ニボルマブは、化学療法後に進行した切除不能な進行又は再発胃がんの治療のために日本で承認された（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，２０１７）。これらの試験において完全奏効を示したのは、任意抽出集団における患者の僅か１～２％及びＭＳＩ－Ｈ（高頻度マイクロサテライト不安定性）集団の６０％（胃及び胃食道全症例の９％）であった。従って、より大きい患者集団に持続的奏効をもたらす潜在的能力のある新規療法がなおも必要とされている。
膵がんは、利用可能な療法に対する奏効性が胃がん又は胃食道がんよりも更に低いことが分かっている。毎年世界で膵がんによる少なくとも３３８，０００症例及び３３１，０００死亡例が報告されており、生存期間中央値は、６ヵ月である（Ｉｌｉｃ ａｎｄ Ｉｌｉｃ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１６）。外科的切除の候補となるのは、僅か２０～３０％の患者である。これまで、ゲムシタビンが第一選択療法と考えられてきたが、最近になって併用化学療法レジメン、フォルフィリノックス（５－フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、イリノテカン）及びゲムシタビンとｎａｂ－パクリタキセルは、ゲムシタビン治療単独と比べて全生存を約２～５ヵ月上昇させることが示された（Ｕｃｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ ２０１８）。第二選択療法では、典型的には他の化学療法併用が用いられる。進行膵がんにおける幾つかのターゲット療法及び免疫療法薬剤が評価されているが、成功は限られている。膵腫瘍は、この奏効性の欠如に至らしめる線維形成及び免疫抑制性免疫浸潤によって特徴付けられる。この免疫抑制環境を克服し、生存を延長させる潜在的能力のある新規療法が必要とされている。
Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する１つのドメインと、標的細胞上に発現するタンパク質に結合する１つのドメインとを含む二特異性抗体コンストラクトは、Ｔ細胞を標的細胞に直接結び付けてＴ細胞リダイレクト溶解を誘導する。この作用機序は、それが、共刺激活性化シグナルとは独立に任意のＣＤ３陽性Ｔ細胞で機能し得る点で化学療法、ターゲット療法及び他の免疫療法と異なる（Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１６）。胃がん、胃食道がん及び膵がんの細胞表面上におけるＣＬＤＮ１８．２の発現は、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによるこれらの腫瘍型のターゲティングに向けた基礎を提供する。更に、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ムチン性卵巣がん、結腸直腸がん及び非小細胞肺がんを含め、ＣＬＤＮ１８．２を発現する更なる腫瘍型を標的とする潜在的能力を有する。
Ｌｏｒｄｉｃｋ ａｎｄ Ｊａｎｊｉｇｉａｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６ Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０１０ Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０１４ Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７ Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１７ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，２０１７ Ｉｌｉｃ ａｎｄ Ｉｌｉｃ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１６ Ｕｃｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ ２０１８ Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１６
このように、一態様において、本発明は、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインと、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む抗体コンストラクトを提供する。
また、
（１）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループ（ループ１）に結合し；
（２）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと同じＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合し；
（３）本発明の抗体コンストラクトは、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと結合に関して競合し；
（４）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号２２に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号２４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号２３に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合せず；
（５）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体及び／又はアミノ酸配列、配列番号１５を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０及び２１に示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上の１つ以上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号１８に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合せず；
（６）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、ここで、ヒトＣＬＤＮ１８．２の５６位のＧｌｕ（Ｅ）は、第１のドメインの結合に必須であり、ヒトＣＬＤＮ１８．２の４２位のＡｌａ（Ａ）及び／又は４５位のＡｓｎ（Ｎ）は、第１のドメインの結合に必須でなく；及び／又は
（７）本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号２６６に示されるとおりのアミノ酸配列を含むが、配列番号２６５に示されるとおりのアミノ酸配列を含まず、任意選択で、配列番号２６７に示されるとおりのアミノ酸配列も含まないＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する
ことも想定される。
有利には、本発明の抗体コンストラクトによって認識されるＣＬＤＮ１８．２のエピトープのターゲティングは（実施例２も参照されたい）、以下の利益を提供する：
（１）ＣＬＤＮ１８．１に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの選択性（実施例６を参照されたい）、及び
（２）ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの予想外に高い細胞傷害能（実施例７．４を参照されたい）。
用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が抗体、例えば完全長免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能をベースとする分子を指す。従って、抗体コンストラクトは、その標的又は抗原に免疫特異的に結合し、且つ／又は抗体コンストラクトは、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、又はそれに由来するドメインを含む。本発明に係る抗体コンストラクトは、免疫特異的標的結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含む。この最小限の要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義付けられ得る。従って、抗体コンストラクトは、いずれか一方又は両方の結合ドメインにおける３つ又は６つのＣＤＲの存在によって特徴付けられ得、当業者は、結合ドメイン内でそれらのＣＤＲがいずれの箇所に（どのような順序で）位置するかを分かっている。
本発明に係る「抗体」の定義は、ラクダ科動物抗体及びバイオテクノロジー又はプロテインエンジニアリングの方法又はプロセスによって作成される他の免疫グロブリンも含め、完全長抗体を含む。こうした完全長抗体は、例えば、モノクローナル、組換え、キメラ、脱免疫化、ヒト化及びヒト抗体並びにマウス、ハムスター、ウサギ、ラット、ヤギ又は非ヒト霊長類などの他の種からの抗体であり得る。
本発明の「抗体コンストラクト」は、それが天然に存在するとおりの完全長免疫グロブリンの構造を有し得る。例えば、抗体コンストラクトは、（少なくとも）２つの完全長抗体重鎖と２つの完全長抗体軽鎖とを含み得る。しかしながら、本発明に係る抗体コンストラクトが、ＣＬＤＮ１８．２に結合する１つのドメインと、ＣＤ３に結合する別のドメインとを含むことを考えれば、これは、天然に存在せず、天然に存在する産物とその機能が著しく異なる。従って、本発明の抗体コンストラクトは、特異性が異なる少なくとも２つの個別の結合ドメインを含む人工「ハイブリッド」分子である。
本発明の「抗体コンストラクト」は、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）、Ｆｄ（ＶＨ－ＣＨ１）、重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒ ＩｇＧ」（重鎖と軽鎖とからなる「半抗体」）など、完全長抗体の断片も含み得る。本発明に係る抗体コンストラクトは、抗体変異体又は抗体誘導体とも称される抗体の修飾断片も含み得る。例としては、限定されないが、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、以下のとおりの構造：（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３）又は（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２によって例示される「ミニボディ」、トリアボディ又はテトラボディなどのマルチボディ及び他の可変領域又はドメインと無関係に抗原又は標的に特異的に結合する、ＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つのみの可変領域を含むナノボディ又はシングル可変ドメイン抗体などのシングルドメイン抗体が挙げられる。本発明に係る抗体コンストラクトの更なる可能なフォーマットは、クロスボディ、マキシボディ、ヘテロＦｃコンストラクト、モノＦｃコンストラクト及びｓｃＦｃコンストラクトである。これらのフォーマットの例については、本明細書で以下に記載する。
更に、用語「抗体コンストラクト」の定義には、２、３つ又はそれを超える抗原構造に異なる結合ドメインを介して特異的に結合する二価及び多価／多原子価コンストラクト並びに二特異性及び多特異性／多重特異性コンストラクトが含まれる。抗体コンストラクトは、特異性よりも大きい結合価を有することもあり、例えば、それが第１の標的（Ｃｌｄｎ１８．２）に対して２つの結合ドメインを有し、第２の標的（ＣＤ３）に対して１つの結合ドメインを有する場合又はその逆の場合であり、この場合、コンストラクトは、三価であり且つ二特異性である。一般に、用語「二特異性」には、抗体コンストラクトがＣｌｄｎ１８．２及びＣＤ３など、（少なくとも）２つの異なる抗原に結合するという意味が含まれる。
更に、用語「抗体コンストラクト」の定義には、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子が含まれると共に、２、３、４つ又はそれを超えるポリペプチド鎖からなる分子も含まれ、これらの鎖は、同じであるか（ホモ二量体、ホモ三量体又はホモオリゴマー）又は異なり得る（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体又はヘテロオリゴマー）。上記に特定した抗体及びその断片、変異体、誘導体並びにそれに由来する抗体コンストラクトの例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０；及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９に記載されている。
用語「結合ドメイン」又は「～に結合するドメイン」は、本発明に関連して、標的又は抗原（ここでは、第１のドメインの場合にＣＬＤＮ１８．２及び第２のドメインの場合にＣＤ３）上のエピトープに免疫特異的に結合する／それと相互作用する／それを認識する抗体コンストラクトのドメインを特徴付ける。第１のドメインの構造及び機能（ＣＬＤＮ１８．２への結合）並びにまた好ましくは第２のドメインの構造及び／又は機能（ＣＤ３への結合）は、抗体、例えば完全長免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能をベースとする。従って、「結合ドメイン」又は「～に結合するドメイン」は、免疫特異的標的結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含み得る。第１のドメインのこの最小限の構造要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義付けられ得る。第２のドメインも、免疫特異的標的結合を可能にする抗体のこの最小限の構造要件を含むことが想定される。より好ましくは、第２のドメインも少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲを含む。「～に結合するドメイン」（又は「結合ドメイン」）は、典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み得る。しかしながら、それが両方を含む必要はなく、ＶＨ又はＶＬの一方のみを含み得る。Ｆｄ断片は、例えば、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持していることが多い。
「～に結合するドメイン」（又は「結合ドメイン」）のフォーマットの例としては、限定されないが、完全長抗体、完全長抗体の断片（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬなど）、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）、Ｆｄ（ＶＨ－ＣＨ１）、重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）、抗体変異体又は誘導体、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、（ＶＨ－ＶＬ－ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）２、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３＋ＣＨ３）、（（ｓｃＦｖ）２－ＣＨ３）又は（ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ｓｃＦｖ）２などのフォーマットから選択される「ミニボディ」、トリアボディ又はテトラボディなどのマルチボディ及びＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つのみの可変領域を含むナノボディ又はシングル可変ドメイン抗体などのシングルドメイン抗体が挙げられる。「～に結合するドメイン」（又は「結合ドメイン」）のフォーマットの更なる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１を含む抗体断片又は変異体（Ｆａｂなど）；（２）２つの連結したＦａｂ断片を含む抗体断片又は変異体（Ｆ（ａｂ’）２など）；（３）ＶＨ及びＣＨ１を含む抗体断片又は変異体（Ｆｄなど）；（４）ＶＬ及びＣＬを含む抗体断片又は変異体（軽鎖など）；（５）ＶＬ及びＶＨを含む抗体断片又は変異体（Ｆｖなど）；（６）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、これは、ＶＨドメインを有する；（７）重鎖及び／又は軽鎖の少なくとも３つの単離されたＣＤＲを含む抗体変異体；及び（８）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。本発明に係る抗体コンストラクト又は結合ドメインの実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７８３８号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットに記載されている。
本発明の抗体コンストラクトについて、
ａ）抗体コンストラクトは、単鎖ポリペプチド又は単鎖抗体コンストラクトであり、
ｂ）第１のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
ｃ）第２のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
ｄ）第１のドメイン及び第２のドメインは、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、より好ましくはグリシン／セリンリンカーを介して接続されており、及び／又は
ｅ）抗体コンストラクトは、Ｆｃベースのドメインなど、延長された血清半減期をもたらすドメインを含む
ことが想定される。
本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、「インビトロ生成抗体コンストラクト」及び／又は「組換え抗体コンストラクト」である。本発明との関連において、用語「インビトロ生成」は、結合ドメイン又は可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）の全て又は一部がタンパク質チップ上の非免疫細胞選択、例えばインビトロファージディスプレイ又は候補アミノ酸配列をその抗原への結合能力に関して試験することのできる任意の他の方法で生成されている上記の定義に従う抗体コンストラクトを指す。従って、この用語は、好ましくは、単に動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によって生成された配列を除外する。抗体コンストラクトの第１及び／又は第２のドメインは、既存の（モノクローナル）抗体からのＣＤＲ配列を足場にグラフトすることによるよりむしろ、ファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング方法によって作製されるか又はそれによって入手可能であることが想定される。「組換え抗体コンストラクト」は、（とりわけ）組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学を用いて生成又は作製された抗体コンストラクトである。
本発明の抗体コンストラクトは、モノクローナルであることが想定される。本明細書で使用されるとき、「モノクローナル」（ｍＡｂ）と称される抗体又は抗体コンストラクトは、実質的に均一な抗体／抗体コンストラクトの集団から入手され、即ち、集団中に含まれる個々の抗体／抗体コンストラクトは、微量で存在し得る天然に起こる可能な突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除けば（詳細にはそのアミノ酸配列の点で）同一である。モノクローナル抗体／抗体コンストラクトは、高度に特異的であり、抗原内の単一のエピトープを対象とし、これは、典型的には異なる決定基（又はエピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的である。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、従って他の免疫グロブリンによる汚染を受けない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から入手されるものとしての抗体／抗体コンストラクトの性質を指し示し、いずれかの特定の方法による抗体の作製が必要なものと解釈されてはならない。
モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養物によって作製される抗体を提供する任意の技法を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作られ得、又は組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作られ得る。ヒトモノクローナル抗体を作製する更なる技法の例としては、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。
次に、ハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準方法を用いてスクリーニングして、特定の抗原に免疫特異的に結合する抗体を作製する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。免疫原としては、任意の形態の関連抗原、例えば組換え抗原、天然に存在する形態、その任意の変異体又は断片並びにその抗原ペプチドを使用し得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システムで利用されているとおりの表面プラズモン共鳴を用いると、標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体／抗体コンストラクトの効率を増加させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。
抗体コンストラクト又は結合ドメインを作製する別の例示的方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して非ヒト動物、例えばげっ歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大型断片を有するマウス抗体産生が欠損したマウス系統をエンジニアリングすることが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から入手し、次に当該技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法を用いて修飾する、例えばヒト化する、脱免疫化する、キメラにするなども行うことができる。修飾された抗体コンストラクト又は結合ドメインの例としては、非ヒト抗体／抗体コンストラクトのヒト化変異体、「親和性成熟」抗体コンストラクト又は結合ドメイン（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照されたい）及び改変されたエフェクター機能を有する抗体変異体又は突然変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），ｌｏｃ．ｃｉｔ．及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照されたい）が挙げられる。
免疫学では、親和性成熟は、免疫応答の過程でＢ細胞が抗原親和性の増加した抗体を産生するプロセスである。同じ抗原への曝露が繰り返されると、宿主は、連続してより高い親和性の抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、突然変異と選択の原理に基づく。インビトロ親和性成熟は、抗体、抗体断片、抗体変異体、抗体コンストラクト又は結合ドメインの最適化に成功裏に用いられている。放射線、化学的突然変異原又はエラープローンＰＣＲを用いてＣＤＲ内部にランダム突然変異が導入される。加えて、チェインシャッフリングにより遺伝的多様性を増加させることができる。通常、ファージディスプレイなどのディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの突然変異及び選択により、低ナノモル濃度範囲の親和性の抗体、抗体断片、抗体変異体、抗体コンストラクト又は結合ドメインが得られる。
本発明の抗体コンストラクト又は結合ドメインの好ましい種類のアミノ酸置換変異には、親抗体構造（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体構造）の超可変領域内の１つ以上の残基を置換することが関わる。概して、結果として得られた、更なる開発のために選択された１つ又は複数の変異体は、その生成の元になった親抗体構造と比べて向上した生物学的特性を有することになる。かかる置換変異体の好都合な生成方法には、ファージディスプレイを用いた親和性成熟が関わる。簡潔に言えば、超可変領域の幾つかの部位（例えば、６～７部位）を突然変異させて、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生成する。このように生成された変異体を、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として繊維状ファージ粒子から一価方式で提示させる。次に、ファージに提示された変異体を、本明細書に開示されるとおりその生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングする。抗原結合に大きく寄与する候補超可変領域部位（修飾候補）を同定するため、アラニンスキャニング突然変異誘発も実施し得る。代わりに又は加えて、抗原と抗体コンストラクト又は結合ドメインとの間の複合体の結晶構造の解析は、結合ドメインとその特異的抗原との間の接触点の同定に有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述する技法による置換の候補である。かかる変異体が生成されたら、変異体のパネルを本明細書に記載されるとおりのスクリーニングに供し、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体、その抗原結合断片、抗体コンストラクト又は結合ドメインを更なる開発のために選択し得る。
本発明の抗体コンストラクト及び結合ドメインは、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方、残りの鎖が、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びに所望の生物学的活性を呈する限り、かかる抗体の断片又は変異体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」バージョンを含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体コンストラクト又は結合ドメインには、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体コンストラクトが含まれる。キメラ抗体又は抗体コンストラクトを作製する種々の手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
抗体、抗体コンストラクト、抗体断片、抗体変異体又は結合ドメインは、例えば、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット又は国際公開第００／３４３１７号パンフレットに開示される方法を用いて、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても修飾され得る。簡潔に言えば、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインの重鎖及び軽鎖可変領域を分析することができる。これらのペプチドは、潜在的Ｔ細胞エピトープに相当する（例えば、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義されるとおり）。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のため、「ペプチドスレッディング」と称されるコンピュータモデリング手法を適用することができ、加えて、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されるとおり、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフに関してヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩｌ ＤＲアロタイプのいずれかに結合し、従って潜在的Ｔ細胞エピトープを成す。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン又は可変領域内の少数のアミノ酸残基の置換によって又は好ましくは単一アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換が行われる。多くの場合、限定されないが、ヒト生殖細胞系列抗体配列においてある位置に共通するアミノ酸を使用し得る。ヒト生殖系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリ（ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な要覧を提供する（編纂者Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲのヒト配列供給源として使用することができる。コンセンサスヒトフレームワーク領域も、例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるとおり使用することができる。
「ヒト化」抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、主としてヒト配列の免疫グロブリンをベースとし、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する１つ又は複数の最小限の配列を含有する。ほとんどの場合、ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）をベースとし、超可変領域又はＣＤＲからの残基は、所望の特異性、親和性、能力及び／又は生物学的活性を有するげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット又はウサギ）などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域又はＣＤＲ残基に置き換えられている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、本明細書で使用されるとおりの「ヒト化」抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に改良し、最適化するために行われる。ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃなど）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含み得る。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、抗原結合に直接関わらない（Ｆｖ）可変領域の配列をヒト（Ｆｖ）可変領域からの均等な配列に置き換えることにより作成され得る。かかる分子の例示的作成方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７により；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４により；及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６１号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，８５９，２０５号明細書；及び米国特許第６，４０７，２１３号明細書により提供される。これらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも一方からの免疫グロブリン（Ｆｖ）可変領域の全て又は一部をコードする核酸配列を単離すること、操作すること、及び発現させることを含む。かかる核酸は、上記に記載したとおり、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から入手され得る。次に、ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト又は結合ドメインをコードする組換えＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト及び結合ドメインは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子の発現能を有しないマウスなど、トランスジェニック動物を使用しても作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化分子の調製に用い得る例示的ＣＤＲグラフト方法について記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト配列のＣＤＲの全てが非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分に置き換えら得るか、又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲに置き換えられ得る。ヒト化分子が所定の抗原に結合するのに必要な数のＣＤＲを置き換えるのみで十分である。
ヒト化抗体、その変異体又は断片、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰突然変異の導入によって最適化することができる。かかる改変された免疫グロブリン分子は、当該技術分野において公知の幾つかの技法のいずれによって作られ得る（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２及び欧州特許第２３９ ４００号明細書）。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応のため、この業界では、キメラ又は他のヒト化抗体／抗体コンストラクトが調製されるようになった。しかしながら、特に抗体又は抗体コンストラクトの慢性又は多用量利用において、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が観察されるであろうことが予想される。従って、ＨＡＭＡ又はＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は効果を払拭するため、ＣＬＤＮ１８．２に対するヒト結合ドメイン及び／又はＣＤ３に対するヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいであろう。
従って、一実施形態によれば、抗体コンストラクト、第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、「ヒト」である。用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」及び「ヒト結合ドメイン」には、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）により記載されるものを含め、当該技術分野において公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメインなどの抗体由来領域を有するそれぞれ抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインが含まれる。本発明のヒト抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム又は部位特異的突然変異誘発により導入されるか、又はインビボで体細胞突然変異により導入された突然変異）を例えばＣＤＲ、詳細にはＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基に置き換えられた少なくとも１、２、３、４、５つ又はそれを超える位置を有し得る。本明細書で使用されるとおりのヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを用いて誘導し得るもののように、抗体の人工的及び／又は遺伝的に改変されていないヒト配列のみを含む完全ヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインも企図する。
少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトは、非ヒト、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター又はウサギ）可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体コンストラクトに関連する問題の一部を回避する。かかるげっ歯類由来のタンパク質の存在は、抗体若しくは抗体コンストラクトの急速なクリアランスにつながることもあり、又は患者による抗体若しくは抗体コンストラクトに対する免疫応答の発生につながることもある。げっ歯類由来の抗体コンストラクトの使用を回避するため、げっ歯類が完全ヒト抗体を産生するようにげっ歯類にヒト抗体機能を導入してヒト化又は完全ヒト抗体コンストラクトを作成することができる。
ＹＡＣにメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築し、そのＹＡＣをマウス生殖細胞系列に導入可能であることにより、極めて大きい又は大雑把にのみマッピングされる遺伝子座の機能的構成要素を解明し、且つ有用なヒト疾患モデルを作成する強力な手法が得られる。更に、マウス遺伝子座をそのヒト均等物に置換するためのかかる技術を用いれば、発生中のヒト遺伝子産物の発現及び調節、他のシステムとのそのコミュニケーション及び疾患の誘導及び進行におけるその関与に関してユニークな洞察を得ることができるであろう。
かかる戦略の実際上重要な適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することにより、抗体のプログラム化された発現及びアセンブリの根底にある機構並びにＢ細胞発生におけるその役割を研究する機会がもたらされる。更に、かかる戦略であれば、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製に理想的な供給源 － ヒト疾患における抗体療法の有望さの実現に向けた重要なマイルストーンがもたらされ得る。完全ヒト抗体又はそれに由来する抗体コンストラクトは、マウス又はマウス誘導体化ｍＡｂに固有の免疫原性反応及びアレルギー反応を最小限に抑え、従って投与された抗体／抗体コンストラクトの有効性及び安全性が高まることが期待される。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトの使用は、反復的な化合物投与が必要な慢性及び再発性ヒト疾患、例えば炎症、自己免疫及びがんの治療において実質的な利点をもたらすことを期待できる。
この目標に向けた１つの手法は、マウス抗体産生が欠損したマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大型断片でエンジニアリングすることであり、かかるマウスであればマウス抗体の非存在下で大きいレパートリーのヒト抗体を産生し得ることを見越したものであった。大型ヒトＩｇ断片であれば、大きい可変遺伝子多様性並びに抗体産生及び発現の適切な調節を維持し得る。マウスの抗体多様化及び選択機構並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を利用することにより、こうしたマウス系統で再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含め、任意の目的抗原に対して高親和性抗体をもたらすはずである。ハイブリドーマ技術を用いれば、所望の特異性を備える抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の作成に関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、コア可変領域配列及び定常領域配列を含有した、ヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）でエンジニアリングされた。ヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再配列及び発現の両方についてマウスシステムと適合性があることが分かり、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子の置換能を有した。これは、Ｂ細胞発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、且つ抗原特異的ヒトｍＡｂを作成するその能力によって実証された。これらの結果は、より多数のＶ遺伝子、追加的な調節エレメント及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座のより大きい部分を導入すれば、感染及び免疫化に対するヒト体液性応答に特有の実質的に完全なレパートリーが再現され得ることも示唆した。Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の研究は、それぞれヒト重鎖遺伝子座及びκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣ断片を導入することによる約８０％超のヒト抗体レパートリーの導入にまで拡張された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及び米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅモデルの作製については、米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書及び同第０８／７５９，６２０号明細書；及び米国特許第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，９３９，５９８号明細書並びに日本国特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号公報、同第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号公報及び同第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号公報に更に考察及び詳説されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、欧州特許第０ ４６３ １５１ Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット及び国際公開第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。
代替的な手法において、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含めた他の研究者らは、「ミニ遺伝子座」手法を利用している。ミニ遺伝子座手法では、Ｉｇ遺伝子座からのピース（個々の遺伝子）を含めることにより外因性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。従って、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域及び第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が動物への挿入用コンストラクトとして形成される。この手法については、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書及び各々Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，６２５，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，７７０，４２９号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３，０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書；同第５，７２１，３６７号明細書；及び同第５，７８９，２１５号明細書、及びＣｈｏｉ ａｎｄ Ｄｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書、及びＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット及び米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。更に、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。
Ｋｉｒｉｎもマウスからのヒト抗体の作成を実証しており、ここでは、マイクロセル融合によって大型の染色体ピース又は染色体全体が導入されている。欧州特許出願第７７３ ２８８号明細書及び同第８４３ ９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的作成技術を開発中である。この技術では、ＳＣＩＤマウスがヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成される。次に、マウスは、抗原で免疫化され、その抗原に対して免疫応答を生じ得る。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；同第５，６９８，７６７号明細書；及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。
一部の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトは、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗体コンストラクトである。「単離された」又は「実質的に純粋な」は、本明細書に開示される抗体コンストラクトの記載に使用されるとき、その産生環境の成分から同定、分離及び／又は回収されている抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境からの他の全ての成分との関連を含まないか又は実質的に含まない。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなど、その産生環境の夾雑成分は、抗体コンストラクトの診断又は治療使用を妨げ得る材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性化合物を挙げることができる。単離された又は実質的に純粋な抗体コンストラクトは、状況に応じて、所与の試料における全タンパク質／ポリペプチド含量の５重量％～９９．９重量％を占め得ることが理解される。所望の抗体コンストラクトは、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターを使用することにより大幅に高い濃度で産生され得る。この定義には、当該技術分野において公知の多様な生物及び／又は宿主細胞における抗体コンストラクトの産生が含まれる。特定の実施形態において、抗体コンストラクトは、（１）スピニングカップシークエネーターを用いることによりＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クマシーブルー又は好ましくは銀染色法を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されることになる。しかしながら、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
一実施形態によれば、抗体コンストラクト全体及び／又は結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態又はタンパク質の形態である。タンパク質性の部分に加えて、かかるポリペプチド又はタンパク質は、非タンパク質性の部分（例えば、化学的リンカー又は化学的架橋剤、例えばグルタルアルデヒド）を含み得る。
ペプチドは、共有結合性ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の短鎖である。従って、ペプチドは、広範な化学的クラスの生物学的オリゴマー及びポリマーに分類される。ペプチド又はポリペプチド鎖の一部であるアミノ酸は、「残基」と称され、連続番号が付され得る。環状ペプチドを除く全てのペプチドは、ペプチドの一端にＮ末端残基を有し、他端にＣ末端残基を有する。オリゴペプチドは、ごく少数のアミノ酸からなる（通常、２～２０個）。ポリペプチドは、より長い連続した非分岐ペプチド鎖である。ペプチドは、タンパク質とサイズを基準として区別され、独断的な基準として約５０アミノ酸以下を含むものと理解され得る。タンパク質は、通常、生物学的に機能的な方法で配置された１つ以上のポリペプチドからなる。ペプチドとポリペプチド及びタンパク質に適用される実験技法の態様（例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー等の詳細）が異なるが、ペプチドをポリペプチド及びタンパク質と区別するサイズ境界は、絶対的ではない。従って、本発明との関連において、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され得、用語「ポリペプチド」が好ましいことが多い。
ポリペプチドは、二量体、三量体及び更に高次のオリゴマーなど、２つ以上のポリペプチド分子からなる多量体を更に形成し得る。かかる二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であっても又は同一でなくてもよい。このため、高次のかかる多量体の対応する構造は、ホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ三量体又はヘテロ三量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然に存在する形態で２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖と２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖とからなる抗体又は免疫グロブリン分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、天然の修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指し、ここで、修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾により達成される。「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書において言及されるとき、ペグ化など、化学的にも修飾され得る。かかる修飾は、当該技術分野において周知であり、本明細書において以下に記載する。
用語「～に（特異的又は免疫特異的に）結合する」、「～を（特異的又は免疫特異的に）認識する」又は「～と（特異的又は免疫特異的に）反応する」は、本発明によれば、抗体コンストラクト又は結合ドメインが、標的分子（抗原）、ここでは、それぞれＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３上の所与のエピトープと相互作用するか又は（免疫）特異的に相互作用することを意味する。この相互作用又は会合は、代替的物質（非標的分子）と比べて特定の標的上のエピトープに対してより高頻度に、より迅速に、より長い持続期間で、より高い親和性で又は前述の何らかの組み合わせで起こる。しかしながら、異なる種における相同タンパク質間の配列類似性のため、その標的（ヒト標的など）に免疫特異的に結合する抗体コンストラクト又は結合ドメインは、異なる種（非ヒト霊長類など）からの相同標的分子と交差反応し得る。従って、用語「特異的／免疫特異的結合」は、抗体コンストラクト又は結合ドメインによる２つ以上の種におけるエピトープ又は構造的に関連性のあるエピトープへの結合を含み得る。
本発明との関連において、用語「エピトープ」は、結合ドメインによって認識される／免疫特異的に認識される抗原の一部又は領域を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、従って、用語のエピトープは、時に「抗原構造」又は「抗原決定基」とも称される。結合ドメインのうち、エピトープに結合する部分は、パラトープと呼ばれる。特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列における特異的モチーフによって達成されると考えられる。従って、結合は、その一次、二次及び／又は三次構造の結果として且つ前記構造の潜在的な二次修飾の結果として実現する。パラトープがその抗原決定基と特異的に相互作用すると、前記部位が抗原に単純に結合し得る。ある場合には、代わりに又は加えて、特異的相互作用により、例えば抗原のコンホメーション変化の誘導、抗原のオリゴマー形成等に起因してシグナルが惹起され得る。
タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びパラトープとの相互作用に基づいて２つのカテゴリー、立体エピトープと線状エピトープとに分類される。立体エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションで構成される。こうしたエピトープは、抗原の三次元表面特徴及び形状又は三次構造（折り畳み）に基づいてパラトープと相互作用する。エピトープのコンホメーションの決定方法としては、限定されないが、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光法及び部位特異的スピン標識及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられる。対照的に、線状エピトープは、その一次構造に基づいてパラトープと相互作用する。線状エピトープは、抗原からの連続アミノ酸配列によって形成され、典型的には、ユニーク配列に少なくとも３又は少なくとも４及びより通常には少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、例えば約８～約１０アミノ酸を含む。
ＣＬＤＮ１８．２エピトープマッピング方法を以下に記載する：ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質の細胞外ループ内の予め定義付けられた領域（連続アミノ酸ストレッチ）をＣＬＤＮ１８．２パラログ（ヒトＣＬＤＮ６又はヒトＣＬＤＮ９など、但し使用するパラログと結合ドメインとが交差反応性でない限り、他のパラログも企図可能である）の対応する領域に交換／置換する。これらのヒトＣＬＤＮ１８．２／パラログキメラを宿主細胞（ＣＨＯ細胞など）の表面上に発現させる。抗体又は抗体コンストラクトの結合をＦＡＣＳ分析で試験することができる。抗体又は抗体コンストラクトによるキメラ分子への結合が完全になくなったとき又は大幅な結合の低下が観察されたとき、このキメラ分子から取り除かれたヒトＣＬＤＮ１８．２の領域が免疫特異的エピトープ－パラトープ認識に関連すると結論付けることができる。前記結合の低下は、ヒト（野生型）ＣＬＤＮ１８．２への結合と比較して好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又は更に１００％（ここでは、ヒトＣＬＤＮ１８．２への結合を１００％とする）である。或いは、上述のエピトープマッピング分析は、ＣＬＤＮ１８．２の配列、具体的には細胞外ループ１又はループ２の配列に１つ以上の点突然変異を導入することにより修正され得る。これらの点突然変異は、例えば、ＣＬＤＮ１８．２とその近縁パラログＣＬＤＮ１８．１との違いを反映し得る。例えば、突然変異は、Ｑ２９Ｍ、Ｎ３７Ｄ、Ａ４２Ｓ、Ｎ４５Ｑ、Ｑ４７Ｅ、Ｅ５６Ｑ、Ｇ６５Ｐ及びＬ６９Ｉからなる群から選択することができる。実施例１及び２を参照されたい。
抗体コンストラクト又は結合ドメインによる認識に対する標的抗原の特定の残基の寄与を決定する更なる方法は、アラニンスキャニングであり（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２－７を参照されたい）、ここでは、分析する各残基が例えば部位特異的突然変異誘発によってアラニンに置き換えられる。アラニンが使用されるのは、そのバルキーでない、化学的に不活性なメチル官能基が理由であり、それにも関わらず、他のアミノ酸の多くが有する二次構造優先性を模倣するためである。時に、突然変異残基のサイズの保存が所望される場合、バリン又はロイシンなどのバルキーなアミノ酸が使用され得る。
結合ドメインと標的抗原のエピトープとの間の相互作用は、結合ドメインがエピトープ／標的抗原（ここでは、それぞれＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３）に対して認識可能な又は有意な親和性を呈し、概して標的抗原（ここでは、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３）以外のタンパク質又は抗原に対して － 上記で考察した他の種由来の相同標的との交差反応性があったとしても － 有意な親和性を呈しないことを含意する。「有意な親和性」としては、≦１０－６Ｍの親和性（解離定数、ＫＤ）での結合が挙げられる。好ましくは、結合は、結合親和性が≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ又は更に≦１０－１１Ｍ若しくは≦１０－１２Ｍのとき、特異的と見なされる。結合ドメイン（免疫）が標的と特異的に反応又は結合するかどうかは、例えば、その所望の標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの親和性を非標的タンパク質又は抗原（ここでは、それぞれＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３以外のタンパク質）に対する前記結合ドメインの親和性と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、それぞれＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に有意に結合しない（即ち、第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．２以外のタンパク質に結合せず、第２のドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合しない）－ 但し、別の標的に対する任意の更なる１つ又は複数の結合ドメインが本発明の抗体コンストラクトに意図的に導入される場合を除き、その場合、その結合ドメインのその特異的標的への結合も本発明によって提供される。
ＣＬＤＮ１８．２（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）に対する第１のドメインの親和性は、≦１００ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ又は≦２０ｎＭであることが想定される。これらの値は、好ましくは、スキャッチャードアッセイなど、細胞ベースのアッセイで測定される。実施例４を参照されたい。他の親和性決定方法も周知である。更に、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に対する第２のドメインの親和性は、≦１００ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ又は≦１０ｎＭであることが想定される。これらの値は、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイなど、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される。実施例３を参照されたい。
用語「有意に結合しない」は、本発明の抗体コンストラクト又は結合ドメインがＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対し、前記タンパク質又は抗原が細胞の表面上に発現するときに結合しないことを意味する。従って、抗体コンストラクトは、ＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原と（前記タンパク質又は抗原が細胞の表面上に発現するときに）≦３０％、好ましくは≦２０％、より好ましくは≦１０％、特に好ましくは≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％、≦４％、≦３％、≦２％又は≦１％の反応性（ここでは、それぞれＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３への結合を１００％とする）を示す。「反応性」は、例えば、親和性値（上記を参照されたい）で表すことができる。
本発明の抗体コンストラクト（及びより具体的にはその第１のドメイン）は、ＣＬＤＮ１８．２パラログ、より具体的にはヒトＣＬＤＮ１８．２パラログ及び／又はマカク／カニクイザルＣＬＤＮ１８．２パラログに結合しないか又は有意に結合しないことが想定される。また、抗体コンストラクトが標的細胞の表面上の（ヒト又はマカク／カニクイザル）ＣＬＤＮ１８．２パラログに結合しないか又は有意に結合しないことも想定される。ＣＬＤＮ１８．２パラログとしては、－ 限定されないが － ＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９が挙げられる。一実施形態によれば、ＣＬＤＮ１８．２のヒトパラログは、配列番号２～１０に示されるとおりの配列を有する。実施例６及び図６を参照されたい。従って、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及び／又はＣＬＤＮ９（標的細胞の表面上）に結合しないか又は有意に結合しないことが想定される。
本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する。「標的細胞」は、その表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現する任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。好ましくは、標的細胞は、特定のＣＬＤＮ１８．２発現がん若しくは腫瘍細胞又はＣＬＤＮ１８．２陽性新生物の細胞など、ヒト又は動物の体の一部の細胞である。用語「表面上」は、本発明との関連において、抗体コンストラクトの第１のドメインが、第１のＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ（ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１）内、第２のＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ（ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ２）内に含まれるか、又は両方のループの組み合わせの範囲内に含まれるエピトープに特異的に結合することを意味するものと理解される。従って、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループに結合することが想定される。細胞外ループは、第１のループ又は第２のループであり得る。また、両方のループが結合に寄与することも想定される。この場合、一方のループ（第１のループなど）は、抗体コンストラクトの主要な結合パートナーに相当し、他方のループ（第２のループなど）は、例えば、安定化パートナーとして結合に寄与するが、結合に絶対的に不可欠というわけではない可能性がある。従って、本発明に係る第１のドメインは、天然に発現する細胞又は細胞株（ヒト胃がん株ＳＮＵ－６０１、ＳＮＵ－６２０又はまたＳＮＵ－１６、ＮＵＧＣ、ＮＵＧ－Ｃ４、ＧＳＵ又はＩＭ９５など）及び／又はＣＬＤＮ１８．２で形質転換又は（安定に／一過性に）トランスフェクトされた細胞又は細胞株によってＣＬＤＮ１８．２が発現されると、それに結合し得る。一実施形態において、第１のドメインは、スキャッチャードなどの細胞ベースの結合アッセイにおいてＣＬＤＮ１８．２が標的分子として使用されるとき、ＣＬＤＮ１８．２に結合する（例えば、実施例４を参照されたい）。更に、抗体コンストラクト／その第１のドメインが標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合することが想定される。ヒトＣＬＤＮ１８．２の好ましいアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
本発明に係る抗体コンストラクト（及びより具体的には前記抗体コンストラクトの第１のドメイン）は、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループ（ＥＣＬ１、ループ１）に結合することが想定される。これは、第２の細胞外ループも、程度は低いながらパラトープ－エピトープ相互作用部位に寄与することを必ずしも除外しない。用語「ＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ」（ＥＣＬ＝細胞外ループ）は、ＣＬＤＮ１８．２のうち、ＣＬＤＮ１８．２の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを本質的に含まない部分を指す。本発明のＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドについて同定される膜貫通ドメインは、当該技術分野においてそのタイプの疎水性ドメインの同定に日常的に用いられる基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、本明細書において具体的に言及されるドメインのいずれかの末端において最も高い可能性として約５アミノ酸以下だけ変わり得る。好ましいヒトＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ１は、配列番号２に示され、好ましいヒトＣＬＤＮ１８．２ ＥＣＬ２は、配列番号３に示される。
本発明は、
・本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと同じＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合し；
・本発明の抗体コンストラクトが、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと結合に関して競合し；
・本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号２２に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号２４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号２３に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合せず；
・本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号１４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体及び／又はアミノ酸配列、配列番号１５を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０及び２１に示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上の１つ以上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号１８に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合せず；
・本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、ここで、第１のドメインの結合にヒトＣＬＤＮ１８．２の５６位のＧｌｕ（Ｅ）が必須であり、ヒトＣＬＤＮ１８．２の４２位のＡｌａ（Ａ）及び／又は４５位のＡｓｎ（Ｎ）が必須でなく；及び／又は
・本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが、配列番号２６６に示されるとおりのアミノ酸配列を含むが、配列番号２６５に示されるとおりのアミノ酸配列を含まず、任意選択で配列番号２６７に示されるとおりのアミノ酸配列も含まないＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する
ことを更に提供する。
他の抗ＣＬＤＮ１８．２結合体（ＣＬ－３、ＣＬ－４）も、エピトープマッピング時のそのＣＬＤＮ１８．２結合特異性に関して分析した（実施例２を参照されたい）。これらのＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、異なるエピトープ特異性を有することが分かったと同時に、本発明の抗体コンストラクトと比較して大幅に低い細胞傷害能を有することが示された。実施例７．４において、本発明の抗体コンストラクトは、２桁ピコモル濃度範囲のＥＣ５０値を示す一方、比較コンストラクトは、ＣＬＤＮ１８．２に対して同様の親和性を有するにも関わらず、３桁～５桁にまで至るピコモル濃度範囲のＥＣ５０値を示したことが実証された。後者の範囲の細胞傷害活性を示す抗体コンストラクトは、患者の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性をがん細胞に対して仕向けることに治療的に使用するには十分に強力でない可能性がある。他方では、本発明に係る抗体コンストラクトは、極めて好ましいエピトープ－活性関係を示し、従って強力な抗体コンストラクト媒介性細胞傷害活性が裏付けられる。
抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインが別の所与の抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインと標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２の同じエピトープに結合するか否かは、本明細書に記載されるとおりの種々の分析、例えば本明細書において上記又は実施例１及び２に記載されるとおり、キメラ又は突然変異ＣＬＤＮ１８．２分子でのエピトープマッピングにより測定することができる。アラニンスキャニングなど、他のエピトープ決定方法が本明細書に記載される。
抗体又は抗体コンストラクトが別の所与の抗体又は抗体コンストラクトと標的細胞の表面上の抗原（ＣＬＤＮ１８．２など）への結合に関して競合するか否かは、競合ＥＬＩＳＡなどの競合アッセイで測定することができる。アビジンがカップリングされたマイクロパーティクル（ビーズ）も使用することができる。アビジンでコートされたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応すると、これらのビーズの各々は、そこでアッセイを実施し得る基質として使用することができる。抗原をビーズにコーティングし、次に第１の抗体でプレコーティングする。二次抗体を加え、任意の更なる結合を決定する。フローサイトメトリーで読み取りを行う。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２を天然に発現する細胞又はＣＬＤＮ１８．２で安定に若しくは一過性に形質転換した細胞のいずれかを使用して、細胞ベースの競合アッセイを用いる。用語「結合に関して競合する」は、これに関連して、上記に開示されるアッセイのいずれか１つ、好ましくは細胞ベースのアッセイによって決定したとき、２つの試験抗体間に少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の競合が起こることを意味する。当然ながら、ＣＤ３などの他の標的についても同じ分析を適用することができる。
競合的抗体結合アッセイは、２つの抗体／抗体コンストラクトと細胞表面結合抗原との競合的結合を決定するアッセイを含む。一般的な方法は、２つの抗体／抗体コンストラクトＡ及びＢによる細胞の表面上の同じ抗原への結合を検出することを目標とし、
ａ）細胞を抗体／抗体コンストラクトＡとプレインキュベートすることにより細胞表面抗原を遮断し、続いて標識した抗体／抗体コンストラクトＢを最大下で添加するステップ、及びＡの非存在下における結合と比較したＢの結合を検出するステップ；
ｂ）最大下量の標識抗体／抗体コンストラクトＢの存在下における抗体／抗体コンストラクトＡのタイトレーションステップ（即ち種々の量を添加するステップ）、及びＢの結合に対する効果を検出するステップ；又は
ｃ）両方の抗体／抗体コンストラクトが最大濃度で併せてインキュベートされるＡとＢとの共タイトレーションステップ、及び全結合量がＡ又はＢのいずれか一方単独の結合量と等しいか又はそれを上回るかどうかを検出するステップ、即ち抗体／抗体コンストラクトの添加順序又は相対量の影響を受け得ない方法
を含み得る。
２つの抗体／抗体コンストラクトＡ及びＢが細胞表面結合抗原に関して競合するとき、これらの抗体は、非常に多くの場合に遮断アッセイにおいて抗体の添加順序とは無関係に互いに競合することになる。換言すれば、アッセイがいずれの方向で行われる場合にも競合が検出される。しかしながら、常にそうとは限らず、ある状況下では、抗体の添加順序又はアッセイの方向が生成されるシグナルに効果を及ぼし得る。これは、潜在的に競合する抗体／抗体コンストラクトの親和性又はアビディティの差に起因し得る。添加順序が生成されるシグナルに大きい効果を及ぼす場合、少なくとも一方の順序で競合が検出されたならば、それらの２つの抗体／抗体コンストラクトは、確かに競合すると結論付けられる。
一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインが標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、ここで、ヒトＣＬＤＮ１８．２の５６位のＧｌｕ（Ｅ）は、第１のドメインの結合に必須であり、ヒトＣＬＤＮ１８．２の４２位のＡｌａ（Ａ）及び／又は４５位のＡｓｎ（Ｎ）は、第１のドメインの結合に必須でない。これに関連して、用語「～は結合に必須である」とは、抗体コンストラクトによるＣＬＤＮ１８．２への結合が起こるために指定のアミノ酸（５６位のＧｌｕ）が必要であることを意味する。５６位のアミノ酸Ｇｌｕが例えばＧｌｎに交換された場合（→Ｅ５６Ｑ）、抗体コンストラクトの結合は、消失するか又は大幅に低下する（図４、「Ｐ６」と表示された列を参照されたい）。用語「～は結合に必須でない」とは、抗体コンストラクトによるＣＬＤＮ１８．２への結合が起こるために指定のアミノ酸（４２位のＡｌａ及び／又は４５位のＡｓｎ）が必要でないことを意味する。４２位のアミノ酸Ａｌａ及び／又は４５位のＡｓｎが例えば４２位においてＳｅｒ（→Ａ４２Ｓ）及び／又は４５位においてＧｌｎ（→Ｎ４５Ｑ）に交換されても、抗体コンストラクトの結合は、低下しないか又は大幅には低下しない（図４、「Ｐ３」及び「Ｐ４」と表示された列を参照されたい）。
一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３；及び
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む。
本発明との関連において、用語「可変」は、抗体又は免疫グロブリンドメインのうち、その配列において可変性を呈し、且つ特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関わる一部分（即ち１つ又は複数の「可変領域」）を指す。通常、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とが一緒になって対を成し、単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変領域全体にわたって均一に分布せず、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変領域のうち、より保存性の高い（即ち超可変性でない）部分は、「フレームワーク」（ＦＲ）領域と呼ばれ、６つのＣＤＲが抗原結合表面を形成するための三次元空間における足場を提供する。天然に存在する抗体重鎖及び軽鎖の可変領域は、主としてβシート配置をとる４つのＦＲ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含む。ＦＲ領域は、可変重鎖又は軽鎖内でＣＤＲと一緒になって以下の配列を形成する：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。各鎖の超可変領域は、フレームワーク領域によってごく近接して一体に保持され、通常、他方の鎖の超可変領域と一緒になって抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照されたい）。
用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」は、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）相補性決定領域を指す。ＣＤＲは、抗体（又は抗体コンストラクト又は結合ドメイン）による抗原との特異的相互作用に関与する残基の大半を含有し、従って抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定基である。
ＣＤＲ境界及び長さの正確な定義は、異なる分類及び付番方式に依存する。従って、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含め、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、コンタクト又は任意の他の境界定義によって参照され得る。異なる境界にも関わらず、これらの方式の各々は、可変配列内においていわゆる「超可変領域」を構成するものがある程度重複している。従って、これらの方式によるＣＤＲ定義は、長さ及び隣接フレームワーク領域に対する境界範囲が異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照されたい。抗原結合部位の特徴付けのためのなおも別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技法が、重複する領域ながら同一ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従う付番が好ましい。
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することのできるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖コンホメーションを指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、限られたレパートリーのコンホメーションのみが利用可能であることが分かっている。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。従って、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分でアミノ酸配列可変性が高いにも関わらず、極めて類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。更に、とられるループ構造と、その周囲のアミノ酸配列との間に関係がある。特定のカノニカルクラスのコンホメーションは、ループの長さ及びループ内並びに保存されたフレームワーク内（即ちループ外）で重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決まる。従って、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて特定のカノニカルクラスへの割り当てを行うことができる。
用語「カノニカル構造」は、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって列挙されたとおりの、抗体の線状配列に関する考慮事項も含み得る。Ｋａｂａｔ付番スキーム（方式）は、一貫した方法での抗体可変領域のアミノ酸残基の付番に広く採用されている標準であり、本明細書の他の部分でも言及されるとおり、本発明において適用される好ましいスキームである。追加の構造的考慮事項も用いて抗体のカノニカル構造を決定することができる。例えば、Ｋａｂａｔ付番によっては完全に反映されない差異は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．の付番方式によって記述し、且つ／又は他の技法、例えば結晶学及び二次元又は三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。従って、所与の抗体配列は、あるカノニカルクラスに分けられ得、それにより、数ある中でも特に適切なクラス配列の同定が可能になる（例えば、ライブラリに種々のカノニカル構造を含める要望に基づく）。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔ付番及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．により記載されるとおりの構造的考慮事項並びに抗体構造のカノニカルな側面を解釈する上でのこれらの含意するところは、文献に記載されている。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当該技術分野において周知である。抗体構造のレビューについては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内で抗原結合における最も重要な決定基を構成し得る。一部の抗体又は抗体コンストラクト／結合ドメインでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触範囲を構成するように見える。ＣＤＲ３単独を変異させるインビトロ選択スキームを用いると、抗体又は抗体コンストラクト／結合ドメインの結合特性を変えるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。従って、ＣＤＲ３は、典型的には抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、ＣＤＲ－Ｈ３は、僅か２アミノ酸残基ほどであることも又は２６アミノ酸より長いこともある。
古典的完全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じた１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近い重鎖定常（ＣＨ）ドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体活性化（補体依存性細胞傷害、ＣＤＣ）など、様々なエフェクター機能を呈する。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する古典的抗体の「テール」領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２及び第３の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）に由来する２つの同一のタンパク質断片で構成される。ＩｇＭ及びＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を含有する。Ｆｃ領域は、１つ以上のジスルフィド及び非共有結合性相互作用によって一体に保持されたいわゆる「ヒンジ」領域の一部も含有する。天然に存在するＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を担持している。Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ受容体媒介活性に必須である。
ＡＤＣＣは、膜表面抗原に特異抗体が結合した標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が能動的に溶解する細胞媒介性免疫防御機構である。ＡＤＣＣには、典型的にはＩｇＧ抗体と相互作用するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であることが古典的に公知の免疫エフェクター細胞が必要である。しかしながら、ＡＤＣＣは、マクロファージ、好中球及び好酸球によっても媒介され得る。ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞がＦｃ部分を発現する抗体によって活性化されることを伴う。例えば、ＮＫ細胞の表面上の最も一般的なＦｃ受容体は、ＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩと呼ばれる。Ｆｃ受容体がＩｇＧのＦｃ領域に結合すると、ＮＫ細胞は、細胞傷害性因子を放出し、標的細胞の死滅が引き起こされる。同様に、好酸球のＦｃ受容体（ＦｃｅＲＩ）は、ＩｇＥを認識することになる。対照的に、ＣＤＣでは、補体系の分子「Ｃ１ｑ」が抗体Ｆｃ領域に結合し、この結合が補体カスケードを惹起して、それが古典経路補体活性化の結果としての標的細胞の表面における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成につながる。治療用抗体又は抗体コンストラクトでは、Ｆｃアイソタイプのエンジニアリング、Ｆｃ遺伝子突然変異又はＦｃグリコシル化プロファイル修飾によってＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を調節することができる。
アセンブリ及び体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列に高度なばらつきがあり、これらのばらつきのある遺伝子は、１０１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。従って、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体的に又は部分的に由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この１つ又は複数の配列は、重鎖のＶ、Ｄ及びＪセグメント並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成によって生成され得る。或いは、１つ又は複数の配列は、いずれの再編成が起こるか、例えばインビトロ刺激に応じて細胞から生成されることもある。或いは、１つ又は複数の配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発及び他の方法によって得ることができ、例えば米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい。レパートリーは、１つの配列のみを含み得るか、又は遺伝的に多様なコレクションのものを含め、複数の配列を含み得る。
抗体コンストラクトは、第１のドメイン内にシステインクランプを有することが想定される。このシステインクランプは、コンストラクトの安定性を向上させるために導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１９３２９５号明細書を参照されたい。
本発明の一実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１２７又は配列番号１３９に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。更なる実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１２８又は配列番号１４０に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。別の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１２７＋１２８（ＶＨ＋ＶＬ）又は配列番号１３９＋１４０（ＶＨ＋ＶＬ）に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。更に別の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１２９又は配列番号１４１に示されるとおりのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
本明細書において上記に記載されるとおり、本発明は、抗体コンストラクトが、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖシングルドメインｍＡｂ、ダイアボディ及び前述のフォーマットのいずれかのオリゴマーからなる群から選択されるフォーマットである実施形態を提供する。用語「フォーマットである」は、コンストラクトが本明細書に記載されるとおり、例えば他の部分への付加又は融合によって更に修飾され得ることを除外しない。本発明の抗体コンストラクトの一実施形態によれば、第１及び／又は第２のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットである。ｓｃＦｖでは、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの順序（Ｎ末端からＣ末端に）で配置される。第１及び／又は第２の結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して接続されることが想定される。第１及び／又は第２のドメインの一実施形態によれば、ＶＨ領域がリンカーのＮ末端側に位置し、ＶＬ領域がリンカーのＣ末端側に位置する。換言すれば、第１及び／又は第２のドメインの一実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含む。更に、抗体コンストラクトの第１のドメイン及び第２のドメインがリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して接続されることが想定される。抗体コンストラクトは、例えば、（Ｎ末端からＣ末端に）第１のドメイン－リンカー－第２のドメインの順序でドメインを含み得る。逆の順序（第２のドメイン－リンカー－第１のドメイン）も可能である。
リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカー、より好ましくは短鎖ペプチドリンカーである。本発明において、「ペプチドリンカー」は、抗体コンストラクトの１つのドメインのアミノ酸配列を別の（可変及び／又は結合）ドメイン（例えば、可変ドメイン又は結合ドメイン）と接続するアミノ酸配列を含む。かかるペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、本発明の抗体コンストラクトに他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を付加するためにも使用することができる。有用なペプチドリンカーの例は、配列番号１５５～１６８に示される。これに関連して、「短鎖」リンカーは、２～５０アミノ酸、好ましくは３～３５、４～３０、５～２５、６～２０又は６～１７アミノ酸を有する。１つの結合ドメインの２つの可変領域間のリンカーは、２つの結合ドメイン間のリンカーと異なる長さを有し得る（例えば、それより長いものであり得る）。例えば、１つの結合ドメインの２つの可変領域間のリンカーは、７～１５アミノ酸、好ましくは９～１３の長さを有し得、２つの結合ドメイン間のリンカーは、３～１０アミノ酸、好ましくは４～８の長さを有し得る。更に、ペプチドリンカーは、配列番号１５６及び１５８～１６８に示されるものなど、グリシン／セリンリンカーであることが想定される。グリシン／セリンリンカーのアミノ酸の大部分は、グリシン及びセリンから選択される。
リンカーが使用される場合、そのリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインの各々が、互いに独立に、その差異のある結合特異性を保持し得ることを確実にするのに十分な長さ及び配列である。抗体コンストラクトにおいて少なくとも２つの結合ドメイン（又は１つの結合ドメインを形成する２つの可変領域）を接続するペプチドリンカーについては、ごく少数のアミノ酸残基のみ、例えば１２アミノ酸残基以下を含むペプチドリンカーが想定される。従って、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、ここでは、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」との関連において「単一アミノ酸」リンカーは、Ｇｌｙである。ペプチドリンカーの別の実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、即ちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１５６）又はそのポリマー、即ち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ（式中、ｘは、１以上の整数（例えば、２又は３）である）によって特徴付けられる。使用可能なリンカーは、配列番号１５５～１６３に示される。前記ペプチドリンカーの特徴は、当該技術分野において公知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）に記載されている。いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの互いの連結は、例えば、遺伝子工学によって提供されることができる。融合した且つ作動可能に連結した二特異性単鎖コンストラクトを調製して、それを哺乳類細胞又は細菌で発現させる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
本発明の一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトは、「単鎖抗体コンストラクト」である。また、第１又は第２のいずれか一方又は両方の結合ドメインが「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）のフォーマットであり得ることも想定される。Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて人工リンカーによって － 前述のとおり － つなぎ合わせることができ、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが構成されることがリンカーによって可能になる。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。このような抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、断片は、完全長抗体又はＩｇＧと同じように機能に関して評価される。従って、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、通常、短鎖リンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためグリシンリッチであると共に溶解度のためにセリン又は同様にスレオニンリッチであり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
二特異性単鎖分子は、当該技術分野において公知であり、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６に記載されている。単鎖抗体コンストラクトの作製について記載される技法（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），ｌｏｃ．ｃｉｔ．及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照されたい）は、選択された１つ又は複数の標的を特異的に認識する単鎖抗体コンストラクトの作製に採用することができる。
フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有する二価（二原子価）とも称される）又は二特異性単鎖可変断片（ｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、前述のとおりのリンカーで）連結することによりエンジニアリングし得る。連結は、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域とを有する単一ポリペプチド鎖を作製してタンデムｓｃＦｖを生じさせることにより行われ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域が一体に折り畳まれるには短か過ぎるため（例えば、約５アミノ酸）、強制的にｓｃＦｖを二量化させるリンカーペプチドを含むｓｃＦｖ分子の作成である。この場合、結合ドメイン（標的抗原ＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３のいずれかに結合する）のＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーによって直接接続されない。従って、ＣＤ３結合ドメインのＶＨがＣＬＤＮ１８．２結合ドメインのＶＬにペプチドリンカーを介して例えば融合し得、ＣＬＤＮ１８．２結合ドメインのＶＨがかかるペプチドリンカーを介してＣＤ３結合ドメインのＶＬに融合する。このタイプは、ダイアボディとして公知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８．を参照されたい）。
「シングルドメイン抗体」と称される抗体コンストラクトは、他の可変領域とは無関係に、特異的抗原に選択的に結合することが可能な１つの（単量体）抗体可変領域を含む。最初のシングルドメイン抗体は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体からエンジニアリングされたものであり、これは、ＶＨＨ断片と呼ばれる。軟骨魚類も、それからＶＮＡＲ断片と呼ばれるシングルドメイン抗体を得ることのできる重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有する。代替的な手法は、共通の免疫グロブリンからの二量体可変領域を単量体に分割し、従ってＶＨ又はＶＬをシングルドメインＡｂとして得ることである。現在、シングルドメイン抗体に関する研究のほとんどは、重鎖可変領域をベースとしているが、軽鎖に由来するナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示された。シングルドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ又はシングル可変ドメイン抗体と呼ばれる。従って、（シングルドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つのシングルドメインモノクローナル抗体コンストラクトで構成されたモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖシングルドメインｍＡｂ」は、上記に記載したとおりの少なくとも１つのシングルドメイン抗体と、上記に記載したとおりの１つのｓｃＦｖ分子とで構成されたモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合もやはり、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。
また、本発明の抗体コンストラクトは、標的分子ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３に結合するその機能に加えて更なる機能を有することも想定される。このフォーマットでは、抗体コンストラクトは、ＣＬＤＮ１８．２結合を通じて標的細胞を標的化し、ＣＤ３結合を通じて細胞傷害性Ｔ細胞活性を媒介し、且つ血清半減期を亢進又は延長させる手段又はドメイン、エフェクター細胞の動員を通じてＡＤＣＣを媒介する完全に機能性の又は修飾されたＦｃ定常ドメイン、標識（蛍光等）、毒素又は放射性核種などの療法用薬剤など、更なる機能を提供することにより、三機能又は多機能抗体コンストラクトであり得る。
本発明の抗体コンストラクトの血清半減期を延長させる手段又はドメインの例としては、抗体コンストラクトに融合されるか又は他の方法で付加されたペプチド、タンパク質又はタンパク質のドメインが挙げられる。ペプチド、タンパク質又はタンパク質ドメインの群には、血清アルブミンなど、人体において好ましい薬物動態プロファイルで他のタンパク質に結合するペプチドが含まれる（国際公開第２００９／１２７６９１号パンフレットを参照されたい）。かかる半減期延長ペプチドの代替的な概念には、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、国際公開第２００７／０９８４２０号パンフレットを参照されたい）に結合するペプチドが含まれ、これも本発明の抗体コンストラクトに使用することができる。タンパク質の大型ドメイン又は完全なタンパク質を付加する概念には、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの変異体又は突然変異体（国際公開第２０１１／０５１４８９号パンフレット、国際公開第２０１２／０５９４８６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５０３１９号パンフレット、国際公開第２０１３／１３５８９６号パンフレット、国際公開第２０１４／０７２４８１号パンフレット、国際公開第２０１３／０７５０６６号パンフレットを参照されたい）又はそのドメインの融合並びに免疫グロブリン定常領域（Ｆｃドメイン）及びその変異体の融合が含まれる。Ｆｃドメインのかかる変異体は、Ｆｃベースのドメインと呼ばれ、例えば二量体又は多量体の所望の対形成を可能にするため、Ｆｃ受容体結合を消失させる（例えば、それによりＡＤＣＣ又はＣＤＣを回避する）ために又は他の理由で最適化／修飾され得る。人体における物質又は分子の半減期を延長させるための当該技術分野において公知の更なる概念は、そうした分子（本発明の抗体コンストラクトなど）のペグ化である。
一実施形態において、本発明に係る抗体コンストラクトは、例えば、コンストラクトの血清半減期の延長を目的として、融合パートナー（タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなど）と（例えば、ペプチド結合で）連結される。こうした融合パートナーは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」又は「ＨＡＬＢ」）並びにその配列変異体、ＨＳＡに結合するペプチド、ＦｃＲｎに結合するペプチド（「ＦｃＲｎ ＢＰ」）又は（抗体由来の）Ｆｃ領域を含むコンストラクトから選択することができる。これらの融合パートナーの例示的配列は、配列番号１７０～２３２に示される。一般に、融合パートナーは、本発明に係る抗体コンストラクトのＮ末端又はＣ末端に直接（例えば、ペプチド結合で）又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、「ｎ」は、２以上の整数、例えば２又は３又は４である）などのペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結され得る。好適なペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６３に示される。
従って、本発明に係る抗体コンストラクトは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・任意選択で、例えば配列番号１６９、２６９、２７０又は２７１から選択されるＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・任意選択で、配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１７０及び１７６～２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・任意選択で、例えば配列番号１６９、２６９、２７０又は２７１から選択されるＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・アミノ酸配列ＱＲＦＶＴＧＨＦＧＧＬＸ１ＰＡＮＧ（配列番号１７１）（式中、Ｘ１は、Ｙ又はＨである）を有するポリペプチド；及び
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１７３又は配列番号１７５に示されるとおりのアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・任意選択で、例えば配列番号１６９、２６９、２７０又は２７１から選択されるＨｉｓタグ
を含むポリペプチド；
（ｄ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号３４、配列番号４３、配列番号５２、配列番号６１、配列番号７０、配列番号７９、配列番号８８、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１１５及び配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１２８及び配列番号１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それに続くＣ末端のセリン残基；
・配列番号２０６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；及び
Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２７及び配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、配列番号１０７、配列番号１１６及び配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；それに続くＣ末端のセリン残基；及び
・配列番号２０７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｅ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号３４、配列番号４３、配列番号５２、配列番号６１、配列番号７０、配列番号７９、配列番号８８、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１１５及び配列番号１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号１２８及び配列番号１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
・配列番号２０８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；及び
Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２７及び配列番号１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
・配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号９８、配列番号１０７、配列番号１１６及び配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、それに続くＣ末端のセリン残基；及び
・配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｆ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号２１０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
配列番号２１１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｇ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・配列番号２１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；及び
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
（ｈ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；及び
Ｎ末端から開始して以下の順序で、
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・配列番号２１５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド；
又は
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に以下の順序で、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５～１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；及び
・配列番号２１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むポリペプチド
を含むことが想定される。
別の実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを各々含む２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインを（第１及び第２のドメインに加えて）含み、ここで、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合している。前記第３のドメインは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むことが想定される。前記第３のドメインに使用することのできるアミノ酸配列は、配列番号２２５～２３２に示される。前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号２１７～２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列又はそれらの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し得る。別の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの第１及び第２のドメインは、配列番号１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２又は１６３からなる群から例えば選択されるペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。
本発明によれば、「ヒンジ」は、ＩｇＧヒンジ領域である。この領域は、Ｋａｂａｔ付番を用いた類推によって同定することができ、例えばＫａｂａｔ位置２２３～２４３を参照されたい。上記によれば、「ヒンジ」としての最小限の要件は、Ｋａｂａｔ付番に基づくとき、Ｄ２３１～Ｐ２４３のＩｇＧ１配列ストレッチに対応するアミノ酸残基である。用語「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」は、免疫グロブリン重鎖定常領域２及び３を指す。これらの領域も同様にＫａｂａｔ付番を用いた類推によって同定することができ、例えばＣＨ２についてＫａｂａｔ位置２４４～３６０及びＣＨ３についてＫａｂａｔ位置３６１～４７８を参照されたい。免疫グロブリン間には、そのＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域及びＩｇＥ Ｆｃ領域に関して幾らかのばらつきがあることが理解される（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９－２１７（１９９３）を参照されたい）。用語のＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの重鎖定常領域並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの重鎖定常領域を指す。Ｆｃ領域は、これらのドメインのＮ末端側にある可動性ヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭについて、Ｆｃ領域は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。免疫グロブリンのＦｃ領域の境界は、様々であり得るが、機能性ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、ＩｇＧ４について、それぞれ（ヒンジドメインの）残基Ｄ２３１～（ＣＨ３ドメインのＣ末端の）Ｐ４７６又はＤ２３１～Ｌ４７６（ここで、付番は、Ｋａｂａｔに基づく）を含むものと定義し得る。
従って、本発明の抗体コンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１５６、１６２及び１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６２及び１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）；
（ｆ）配列番号１６５、１６６、１６７及び１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）
を含み得る。
また、本発明の抗体コンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端に順番に、
・配列番号１２９及び配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のドメイン；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５６、１６２及び１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
・配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のドメイン；ここで、これらの配列内に含まれる、配列番号１６３を有するペプチドリンカーは、配列番号１５５～１６２及び１６４～１６８のいずれか１つに置き換えることができる；
・配列番号１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６２及び１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
・配列番号２２５～２３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第３のドメイン
を含むことも想定される。
従って、一実施形態において、本発明の抗体コンストラクトは、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４３又は配列番号１４４に示されるものの群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか又はそれからなる。
抗体コンストラクトの共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれ、これは、必ずしもというわけではないが、概して翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択の側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基との反応能を有する有機誘導体化剤と反応させることにより、抗体コンストラクトの幾つかのタイプの共有結合修飾が分子に導入される。二官能性薬剤による誘導体化は、種々の方法で用いられる水不溶性支持体マトリックス又は表面に本発明の抗体コンストラクトを架橋結合するのに有用である。高頻度でグルタミニル及びアスパラギニル残基が脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基にされる。或いは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトの別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの改変を含む。当該技術分野において公知のとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在、以下で考察する）又はタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生物の両方に依存し得る。特定の発現システムを以下で考察する。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の付加を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素的付加の際の認識配列である。従って、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンも使用し得るが、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖類Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの付加を指す。
抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上述のトリペプチド配列の１つ以上が含まれるようにアミノ酸配列を改変することにより達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。この改変は、出発配列に対する１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又はそれによる置換によっても行われ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。容易にするため、抗体コンストラクトのアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更を通じて、特にポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基で突然変異させて、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンを生じさせることにより改変され得る。
抗体コンストラクト上の糖質部分の数を増やす別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。このような手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化に際してグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生が必要ない点で有利である。用いるカップリングモードに依存して、１つ又は複数の糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６に記載されている。
出発抗体コンストラクト上に存在する糖質部分の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物に曝露する必要がある。この処理により、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖類に切断が生じる一方、ポリペプチドは。インタクトなまま残る。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１により記載されている。ポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載されるとおり、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって実現することができる。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるとおり、化合物ツニカマイシンの使用によって防止し得る。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド連結の形成を阻止する。
抗体コンストラクトの他の修飾も本明細書において企図される。例えば、抗体コンストラクトの別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に示される方法で抗体コンストラクトをポリオール類を含めた様々な非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。加えて、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーの付加を促進するため、当該技術分野において公知のとおり、抗体コンストラクト内の様々な位置にアミノ酸置換が作られ得る。
一部の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの共有結合修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。標識基は、立体障害の可能性を低減するため様々な長さのスペーサーアームを介して抗体コンストラクトにカップリングされ得る。様々なタンパク質標識方法が当該技術分野において公知であり、本発明の実施に用いることができる。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能標識を指す。一般に、標識は、それを検出するアッセイに応じて種々のクラスに分けられる － 限定されないが、以下の例が挙げられる：
ａ）同位体標識、これは、ラジオアイソトープ又は放射性核種などの放射性同位体又は重同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）であり得る
ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）
ｃ）酸化還元活性のある部分
ｄ）蛍光群（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光群及び「小分子」蛍光又はタンパク質性蛍光のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（限定されないが、発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含む）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化群
ｇ）二次レポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を用いて検出し得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン類、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられる。フルオロフォアを含めた好適な光学色素がＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
好適なタンパク質性蛍光標識としては、限定されないが、ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プティロサルクス属（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）又はオワンクラゲ属（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ種（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２－８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号Ｕ５５７６２）を含めた緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． １８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３－２６０７）及びウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；同第５，４１８，１５５号明細書；同第５，６８３，８８８号明細書；同第５，７４１，６６８号明細書；同第５，７７７，０７９号明細書；同第５，８０４，３８７号明細書；同第５，８７４，３０４号明細書；同第５，８７６，９９５号明細書；同第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられる。
ロイシンジッパードメインは、それが存在するタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初、幾つかのＤＮＡ結合タンパク質に同定されたものであり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、以来、種々の異なるタンパク質に見付け出されてきた。公知のロイシンジッパーの中には、天然に存在するペプチド及び二量化又は三量化するその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質の作製に好適なロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願の国際公開第９４／１０３０８号パンフレットに記載されており、且つ肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーがＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載されている。それに融合した異種タンパク質の安定三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用がＦａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７－７８に記載されている。
本発明の抗体コンストラクトは、例えば、分子の分離に役立つか、又は分子の適合薬物動態プロファイルに関係する追加的なドメインも含み得る。抗体コンストラクトの分離に役立つドメインは、分離方法、例えば分離カラムにおいて捕捉することのできるペプチドモチーフ又は二次的に導入された部分から選択され得る。かかる追加的なドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変異体（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）及びＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴付けられる本明細書に開示される抗体コンストラクトの全ては、概して、分子のアミノ酸配列における連続したＨｉｓ残基、例えば５個のＨｉｓ残基（配列番号２６９）又は６個のＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン、配列番号１６９）の繰り返しとして知られるＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体コンストラクトのＮ末端又はＣ末端に位置し得る。一実施形態では、本発明に係る抗体コンストラクトのＣ末端にペプチド結合によってヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）が連結される。
また、本発明の抗体コンストラクトは、配列番号１３０及び１４２に示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、且つそのＮ末端又はそのＣ末端でタンパク質精製タグに好ましくはペプチド結合（アミド結合）によって連結されるポリペプチドを含むか又はそれからなることも想定される。ポリペプチドのＣ末端におけるタンパク質精製タグの連結が好ましい。タンパク質精製タグは、短鎖ペプチドであることが想定される。例えば、短鎖ペプチドの長さは、２～３０アミノ酸、４～２５アミノ酸、５～２０アミノ酸又は６～１９アミノ酸であり得る。タンパク質精製タグの例としては、限定されないが、ＡＵ１エピトープ（例えば、配列番号２７２に示されるとおり）、ＡＵ５エピトープ（例えば、配列番号２７３に示されるとおり）、Ｔ７タグ（例えば、配列番号２７４に示されるとおり）、Ｖ５タグ（例えば、配列番号２７５に示されるとおり）、Ｂタグ（例えば、配列番号２７６に示されるとおり）、Ｅ２エピトープ（例えば、配列番号２７７に示されるとおり）、ＦＬＡＧエピトープ／ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号２７８に示されるとおり）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ（例えば、配列番号２７９又は２８０に示されるとおり）、ＨＡタグ、ヒスチジンアフィニティータグ（例えば、配列番号２８１に示されるとおり）、ＨＳＶエピトープ（例えば、配列番号２８２に示されるとおり）、ＫＴ３エピトープ（例えば、配列番号２８３に示されるとおり）、Ｍｙｃエピトープ（例えば、配列番号２８４に示されるとおり）、ポリアルギニンタグ（５～６個のＡｒｇ残基）、ポリアスパルテートタグ（５～１６個のＡｓｐ残基）、ポリヒスチジンタグ（２～１０個のＨｉｓ残基、通常６個のＨｉｓ残基、例えば配列番号１６９及び２６９～２７１を参照されたい）、ポリフェニルアラニンタグ（通常１１個のＰｈｅ残基）、Ｓ１タグ（例えば、配列番号２８５に示されるとおり）、Ｓタグ（例えば、配列番号２８６に示されるとおり）、Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号２８７又は２８８に示されるとおり）、ユニバーサルタグ（例えば、配列番号２８９に示されるとおり）、ＶＳＶ－Ｇ（例えば、配列番号２９０に示されるとおり）、プロテインＣ（例えば、配列番号２９１に示されるとおり）及びプロテインＡが挙げられる。ヒスチジンタグ、特に６×Ｈｉｓタグ（配列番号１６９）が好ましい。従って、本発明の抗体コンストラクトは、配列番号１３０及び１４２に示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、且つそのＣ末端でペプチド結合によって６×Ｈｉｓタグに連結されるポリペプチドからなることが更に想定される。本発明の抗体コンストラクトの実施形態は、配列番号１３１又は配列番号１４３に示されるとおりのアミノ酸配列を有する。
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種（それ自体白血球細胞の一種）である。Ｔ細胞のサブセットが幾つかあり、各々が異なる機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によってＢ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖で構成される。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とからなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と会合すると、関連する酵素、共受容体、特殊化したアダプター分子及び活性化した又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的イベントを通じてＴリンパ球が活性化される。
本発明の抗体コンストラクトは、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合するドメインを含む。「ＣＤ３」（分化クラスター３）は、４つの鎖で構成されるＴ細胞共受容体である。哺乳類では、ＣＤ３タンパク質複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの４つの鎖がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と結び付いて「Ｔ細胞受容体複合体」を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連性のある細胞表面タンパク質であり、各々が単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する。ＣＤ３分子の細胞内テールは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られる単一の保存モチーフを含有し、これは、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である。ＣＤ３ε分子は、ヒトでは１１番染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
Ｔ細胞上のＣＤ３及び標的細胞上の標的タンパク質に結合する抗体コンストラクトによるＴ細胞の動員を介してリダイレクトされた標的細胞の溶解には、概して、細胞溶解性シナプス形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達が関わる。会合したＴ細胞は、一連の標的細胞溶解能力を有し、ペプチド抗原プロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫エスケープ機構の影響を受けない。例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい。
ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。実施例７を参照されたい。「最大半量有効濃度」（ＥＣ５０）は、本発明の抗体コンストラクトなど、生物学的に活性な分子の効力の尺度として一般的に使用される。これは、モル濃度単位で表され得る。この場合の細胞傷害性の測定では、ＥＣ５０値は、ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性応答（標的細胞の溶解）を生じさせる抗体コンストラクトの濃度を指す。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、例えば、刺激されたエンリッチ（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は刺激されていない（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。典型的には、エフェクター細胞として刺激／エンリッチされたＣＤ８＋ Ｔ細胞を使用したとき、刺激されていないＰＢＭＣと比較して、ＥＣ５０値は、低くなると予想され得る。標的細胞がマカク由来であるか、又はマカクＣＬＤＮ１８．２を発現するか若しくはトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなど、マカク由来でなければならない。標的細胞は、細胞表面上にヒト又はマカクＣＬＤＮ１８．２などのＣＬＤＮ１８．２を発現するはずである。好ましくは、標的細胞は、細胞表面上にＣＬＤＮ１８．２ループ１及び／又はループ２など、ＣＬＤＮ１８．２の１つ又は複数の細胞外ループを少なくとも発現するはずである。標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２、例えばヒト又はマカクＣＬＤＮ１８．２を安定に又は一過性にトランスフェクトされている細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。或いは、標的細胞は、ヒト胃がん株ＳＮＵ－６０１又はＳＮＵ－６２０又は同様にＳＮＵ－１６、ＮＵＧＣ、ＮＵＧ－Ｃ４、ＧＳＵ又はＩＭ９５など、ＣＬＤＮ１８．２陽性の天然発現体である細胞株であり得る。通常、細胞表面上に高レベルのＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞を使用したとき、それより標的発現率が低い標的細胞と比較して、ＥＣ５０値は、低くなると予想される。
細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であり、しかし、これはまた、異なり得る。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、５１－クロム遊離アッセイ（例えば、約１８時間のインキュベーション時間を伴う）又はＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイ（例えば、約４８時間のインキュベーション時間を伴う）において測定することができる。インキュベーション時間（細胞傷害性反応）の修正も想定される。他の細胞傷害性測定方法は、周知であり、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含めたＡＴＰベースのアッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン形成アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。
一実施形態によれば、本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定される。これは、５１－クロム遊離アッセイでも測定され得る。本発明の抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦３００ｐＭ、≦２８０ｐＭ、≦２６０ｐＭ、≦２５０ｐＭ、≦２４０ｐＭ、≦２２０ｐＭ、≦２００ｐＭ、≦１８０ｐＭ、≦１６０ｐＭ、≦１５０ｐＭ、≦１４０ｐＭ、≦１２０ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１５ｐＭ、≦１０ｐＭ又は≦５ｐＭであることが想定される。
上記に示したＥＣ５０値は、種々のアッセイにおいて種々の条件下で測定することができる。例えば、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣが使用され、且つ標的細胞としてＣＨＯ細胞などのＣＬＤＮ１８．２トランスフェクト細胞が使用されるとき、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦５００ｐＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２８０ｐＭ、≦２６０ｐＭ、≦２５０ｐＭ、≦２４０ｐＭ、≦２２０ｐＭ、≦２００ｐＭ、≦１８０ｐＭ、≦１６０ｐＭ、≦１５０ｐＭ、≦１４０ｐＭ、≦１２０ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１５ｐＭ、≦１０ｐＭ又は≦５ｐＭであることが想定される。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣが使用されるとき、且つ標的細胞がＳＮＵ－６０１又はＳＮＵ－６２０などのＣＬＤＮ１８．２陽性細胞株であるとき、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦３００ｐＭ、≦２８０ｐＭ、≦２６０ｐＭ、≦２５０ｐＭ、≦２４０ｐＭ、≦２２０ｐＭ、≦２００ｐＭ、≦１８０ｐＭ、≦１６０ｐＭ、≦１５０ｐＭ、≦１４０ｐＭ、≦１２０ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１５ｐＭ、≦１０ｐＭ又は≦５ｐＭであることが想定される。
一実施形態によれば、本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ＣＨＯ細胞など、その表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現しない細胞（ＣＬＤＮ１８．２陰性細胞）の溶解を誘導／媒介せず、又はその溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」又は「溶解を本質的に媒介しない」は、本発明の抗体コンストラクトが、ＣＬＤＮ１８．２陰性細胞の３０％を超える溶解を誘導又は媒介しない、好ましくは２０％を超えない、より好ましくは１０％を超えない、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％を超えない（ここでは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞（ＣＬＤＮ１８．２で形質転換又はトランスフェクトされた細胞又はヒト胃がん株ＳＮＵ－６０１若しくはＳＮＵ－６２０などの天然の発現体である細胞株など）の溶解を１００％とする）ことを意味する。これは、通常、最高５００ｎＭまでの抗体コンストラクトの濃度に適用される。細胞溶解測定は、ルーチンの技法である。更に、本明細書は、細胞溶解の測定方法についての具体的な指示を教示する。
個々のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの細胞傷害活性の差は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップは、例えば、分子の単量体型と二量体型とのＥＣ５０値間の比として計算することができる。このギャップを決定する１つの方法では、後述するとおり（実施例７．１及び７．２）、精製抗体コンストラクト単量体及び二量体で１８時間５１－クロム遊離アッセイ又は４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイが実施される。エフェクター細胞は、刺激されたエンリッチヒトＣＤ８＋Ｔ細胞又は刺激されていないヒトＰＢＭＣである。標的細胞は、ｈｕ ＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞である。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１である。本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力ギャップは、好ましくは、≦５、より好ましくは≦４、更により好ましくは≦３、更により好ましくは≦２及び最も好ましくは≦１である。
本発明の抗体コンストラクトの第１及び／又は第２のドメインは、好ましくは、マカクなどの霊長類の哺乳類目のメンバーに異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインについては、例えば、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載されている。一実施形態によれば、第２のドメインは、ヒトＣＤ３への結合に加えて、（限定されないが）新世界霊長類（コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル、オランウータン及び非ヒトのヒト亜科（Ｈｏｍｉｎｉｎａｅ）を含め、霊長類のＣＤ３にも結合することになる。Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２のドメインは、少なくともマカクＣＤ３にも結合することが想定される。好ましいマカクは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（赤毛猿）も想定される。本発明の１つの抗体コンストラクトは、標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインと、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３及び少なくともマカクＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む。
一実施形態において、マカクＣＤ３と比べたヒトＣＤ３への結合に関する本発明に係る抗体コンストラクトの親和性ギャップ［ＫＤ ｍａ ＣＤ３：ＫＤ ｈｕ ＣＤ３］は、（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ又はスキャッチャード分析によって決定したとき）、０．０１～１００、好ましくは０．１～１０、より好ましくは０．２～５、より好ましくは０．３～４、更により好ましくは０．５～３又は０．５～２．５及び最も好ましくは０．５～１である。実施例３を参照されたい。
本発明の抗体コンストラクトの第２のドメインは、ＣＤ３に結合する。より好ましくは、これは、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する。更に、第２のドメインは、ヒトＣＤ３、好ましくはＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合することが想定される。また、第２のドメインは、ＣＤ３εに結合することも想定される。より好ましくは、これは、ヒトＣＤ３ε、例えばＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３εに結合する。ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインについて好ましいアミノ酸配列は、配列番号２５６に示す。
本発明の一実施形態において、抗体コンストラクトの第２のドメインは、ヒトＣＤ３ε（又はＴ細胞の表面上のヒトＣＤ３ε）及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３εに結合する。また、第２のドメインは、ＣＤ３εの細胞外エピトープ、好ましくはヒトＣＤ３εの細胞外エピトープに結合することも想定される。また、第２のドメインは、ヒト及びマカク属（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することも想定される。ＣＤ３εの１つの好ましいエピトープは、ヒトＣＤ３ε細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲内に含まれる（配列番号２５７を参照されたい）。更により具体的には、エピトープは、少なくともアミノ酸配列Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｕを含む。コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）は、マーモセット科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）に属する新世界霊長類である一方、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル科（Ｃｅｂｉｄａｅ）に属する新世界霊長類である。かかる特徴を有する結合体が国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに詳細に記載されている。
（ヒト）ＣＤ３に対する又は具体的にはＣＤ３εに対する抗体又は二特異性抗体コンストラクトは、当該技術分野において公知であり、そのＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ配列は本発明の抗体コンストラクトの第２の結合ドメインのベースとしての役割を果たし得る。例えば、Ｋｕｎｇ ｅｔ ａｌ．は、１９７９年、ヒトＴ細胞上のＣＤ３（具体的にはＣＤ３のε鎖）を認識する最初のｍＡｂであるＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ Ｋｕｎｇ Ｔ３）の開発を報告した。ＯＫＴ３（ムロモナブ）は、ヒトにおける治療に利用可能になった最初のマウス由来モノクローナル抗体であった。最近の抗ＣＤ３モノクローナル抗体には、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、フォラルマブ及びビジリズマブが含まれ、いずれもＣＤ３のε鎖を標的とする。（がん）標的及びＣＤ３に対する二特異性抗体コンストラクトも開発及び（前）臨床試験が行われているところであり、そのＣＤ３結合ドメイン（ＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ）は、本発明の抗体コンストラクトの第２の結合ドメインのベースとしての役割を果たし得る。例としては、限定されないが、ブリナツモマブ、ソリトマブ（ＭＴ１１０、ＡＭＧ１１０）、カツマキソマブ、デュボルツキシズマブ、エルツマキソマブ、モスネツズマブ、ＦＢＴＡ０５（Ｂｉ２０、ＴＰＢｓ０５）、ＣＥＡ－ＴＣＢ（ＲＧ７８０２、ＲＯ６９５８６８８）、ＡＦＭ１１及びＭＧＤ００６（Ｓ８０８８０）が挙げられる。ＣＤ３結合ドメインの他の例は、例えば、米国特許第７，９９４，２８９ Ｂ２号明細書、米国特許第７，７２８，１１４ Ｂ２号明細書、米国特許第７，３８１，８０３ Ｂ１号明細書、米国特許第６，７０６，２６５ Ｂ１号明細書に開示されている。
本発明の抗体コンストラクトについて、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインは、
（ａ）配列番号３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３；
（ｂ）配列番号８２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３；及び
（ｃ）配列番号１００に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが想定される。
また、本発明の抗体コンストラクトについて、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインは、
（ａ）配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｂ）配列番号４０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｃ）配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号５１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｅ）配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｆ）配列番号７６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号７８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｇ）配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号８７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｈ）配列番号９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｉ）配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；及び
（ｊ）配列番号１１２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１１４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含むことも想定される。
更に、本発明の抗体コンストラクトについて、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、
（ａ）配列番号２８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｂ）配列番号３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号３９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号４０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｃ）配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号４８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号４９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号５１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｅ）配列番号６４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｆ）配列番号７３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号７４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号７６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号７８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｇ）配列番号８２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号８７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｈ）配列番号９１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号９３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；
（ｉ）配列番号１００に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１０３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３；及び
（ｊ）配列番号１０９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、配列番号１１２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１１４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３
から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域、並びにＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含むことが想定される。
本発明の抗体コンストラクトについて、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインは、配列番号４４、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号２３３、配列番号２３４及び配列番号２３５のいずれか１つに示されるとおりのＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことが想定される。
また、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインは、配列番号３４、配列番号４３、配列番号５２、配列番号６１、配列番号７０、配列番号７９、配列番号８８、配列番号９７、配列番号１０６、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４及び配列番号２４５のいずれか１つに示されるとおりのＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことも想定される。
より好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、
（ａ）配列番号３５又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号３４又は２３６に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｂ）配列番号４４又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号４３又は２３７に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｃ）配列番号５３又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号５２又は２３８に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｄ）配列番号６２又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号６１又は２３９に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｅ）配列番号７１又は２３４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号７０又は２４０に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｆ）配列番号８０又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号７９又は２４１に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｇ）配列番号８９又は２３４に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号８８又は２４２に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｈ）配列番号９８又は２３３に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号９７又は２４３に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｉ）配列番号１０７又は２３５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１０６又は２４４に示されるとおりのＶＨ領域；
（ｊ）配列番号１１６又は２３５に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１１５又は２４５に示されるとおりのＶＨ領域；及び
（ｋ）配列番号１１９に示されるとおりのＶＬ領域及び配列番号１１８に示されるとおりのＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＴ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
本発明の上述の抗体コンストラクトの好ましい実施形態は、配列番号３６、４５、５４、６３、７２、８１、９０、９９、１０８、１１７、１２０、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４及び２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
本明細書に記載される抗体コンストラクトのアミノ酸配列修飾も企図される。例えば、抗体コンストラクトの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合もある。抗体コンストラクトのアミノ酸配列変異体は、ペプチド合成によるか、又は抗体コンストラクトをコードする核酸分子に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。以下に記載するアミノ酸配列修飾の全ては、非修飾親分子の所望の生物学的活性（ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３への結合、ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞に対する細胞傷害性の誘導など）を保持している抗体コンストラクトをもたらすはずである。
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、典型的には、アラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）：ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸など、その当該技術分野で認められている定義を有するアミノ酸を指し、但し、必要に応じて修飾された、合成の又は稀なアミノ酸が使用され得る。基本的に、異なる側鎖によって決まる４つの異なるアミノ酸クラスがある。
（１）非極性及び中性（非荷電）：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ
（２）極性及び中性（非荷電）：Ａｓｎ、Ｃｙｓ（ごく僅かに極性である）、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ（ごく僅かに極性である）、Ｔｙｒ
（３）酸性及び極性（負電荷）：Ａｓｐ及びＧｌｕ
（４）塩基性及び極性（正電荷）：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ
疎水性アミノ酸は、脂肪族側鎖を有するか、又は芳香族側鎖を有するかに応じて分けることができる。Ｐｈｅ及びＴｒｐ（疎水性が極めて高い）、Ｔｙｒ及びＨｉｓ（疎水性が低い）は、芳香族アミノ酸に分類される。厳密に言えば、脂肪族とは、側鎖が水素及び炭素原子のみを含有することを意味する。この厳密な定義上、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン（またノルロイシン）、プロリン及びバリンである。極めて短いものであるアラニンの側鎖は、それが特に疎水性でないことを意味し、プロリンは、タンパク質においてそれに特別な役割を与える独特な幾何学を有する。多くの場合、メチオニンをイソロイシン、ロイシン及びバリンと同じカテゴリーと考えることが好都合であるが、メチオニンは、硫黄原子も含有する。統一テーマは、これらのアミノ酸が概して非反応性且つ可動性の側鎖を含有することである。アミノ酸アラニン、システイン、グリシン、プロリン、セリン及びスレオニンは、いずれもサイズが小さいという理由から、多くの場合に一緒にまとめられる。Ｇｌｙ及びＰｒｏは、鎖配向に影響し得る。
アミノ酸修飾としては、例えば、抗体コンストラクトのアミノ酸配列からの残基の欠失、そこへの残基の挿入及び／又はその範囲内での残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び／又は置換の任意の組み合わせが設けられることにより最終的な抗体コンストラクトに至り、但し、最終的なコンストラクトは、非修飾親分子の所望の特性、例えば生物学的活性（ＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３への結合、ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞に対する細胞傷害性の誘導など）を有するものとする。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、抗体コンストラクトの翻訳後プロセスも改変し得る。
例えば、ＣＤＲの各々において１、２、３、４、５又は６アミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換され得る（当然ながらＣＤＲのそれぞれの長さに依存する）一方、ＦＲの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５アミノ酸が挿入、欠失及び／又は置換され得る。アミノ酸配列挿入には、長さが例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基～１０残基超、例えば１００残基以上を含有するポリペプチドに及ぶ範囲のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端付加並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。本発明の抗体コンストラクトの挿入変異体は、抗体コンストラクトの血清半減期を増加又は延長させるポリペプチドが抗体コンストラクトのＮ末端又はＣ末端に融合したものを含む。また、かかる挿入が抗体コンストラクト内、例えば第１のドメインと第２のドメインとの間に行われることも企図可能である。
アミノ酸修飾、詳細にはアミノ酸置換に最も有利な部位としては、重鎖及び／又は軽鎖の超可変領域、詳細には個々のＣＤＲが挙げられ、しかし、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書に記載されるとおりの保存的置換であり得る。好ましくは、それぞれＣＤＲ又はＦＲの長さに依存して、ＣＤＲの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸が置換され得る一方、フレームワーク領域（ＦＲ）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５アミノ酸が置換され得る。例えば、ＣＤＲ配列が６アミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２又は３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５アミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５又は６個が置換されることが想定される。
突然変異誘発に好ましい位置にある抗体コンストラクト内の特定の残基又は領域を同定する有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、例えばＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｂ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９ Ｊｕｎ ２；２４４（４９０８）：１０８１－５）に記載されている。ここでは、抗体コンストラクト内にある残基又は残基の群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕなどの荷電残基）、中性又は非極性アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置き換えられることにより、標的タンパク質のエピトープとのそれぞれのアミノ酸の相互作用に影響が及ぶ。アラニンスキャニングは、所与のタンパク質の安定性又は機能に対する特定の残基の寄与を決定するために用いられる技法である。アラニンが使用されるのは、そのバルキーでない、化学的に不活性なメチル官能基が理由であり、それにも関わらず、他のアミノ酸の多くが有する二次構造優先性を模倣するためである。時に、突然変異残基のサイズの保存が必要な場合、バリン又はロイシンなどのバルキーなアミノ酸が使用され得る。この技法は、特定の残基の側鎖が生物活性において重要な役割を果たすかどうかの決定にも有用であり得る。アラニンスキャニングは、通常、部位特異的突然変異誘発又はランダムにＰＣＲライブラリの作成によって達成される。更に、理論的アラニン置換に基づいて熱力学的パラメータを推定する計算的方法が開発されている。データは、ＩＲ、ＮＭＲ分光法、数学的方法、バイオアッセイ等により試験することができる。
次に、置換部位に又は置換部位に向けて更なる又は他の変異体を導入することにより、置換に対して（例えば、アラニンスキャニングによって決定したときに）機能的感受性を示すアミノ酸位置を精緻化することができる。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位又は領域は、予め決定されているが、突然変異自体の性質が予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位における突然変異のパフォーマンスを分析又は最適化するため、標的コドン又は領域においてアラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発を実施し得、発現させた抗体コンストラクト変異体が所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位における置換突然変異の作成技法、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発は、周知である。突然変異体のスクリーニングは、例えば、抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２又はＣＤ３）結合活性及び／又は細胞傷害活性のアッセイを用いて行われる。
概して、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、そうして得られた「置換後の」配列は、「元の」又は「親」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、更により好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一／相同であることが想定される。これは、元の配列と置換後の配列との間の同一性／相同性の程度がＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、合計５アミノ酸を有し、且つ１つのアミノ酸置換を含むＣＤＲは、「元の」又は「親」ＣＤＲ配列と８０％同一である一方、合計１０アミノ酸を有し、且つ１つのアミノ酸置換を含むＣＤＲは、「元の」又は「親」ＣＤＲ配列と９０％同一である。従って、本発明の抗体コンストラクトの置換後のＣＤＲは、その元の配列と種々の程度の同一性を有し得、例えば、ＣＤＲＬ１は、８０％の相同性を有し得る一方、ＣＤＲＬ３は、９０％を有し得る。同じ考察がフレームワーク領域並びにＶＨ及びＶＬ領域全体にも当てはまる。
「変異ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲと特定の配列相同性、類似性又は同一性を有するＣＤＲであり、限定されないが、親ＣＤＲの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含め、親ＣＤＲと生物学的機能を共有する。概して、個々の変異ＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される親配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には、少なくとも６５％又は７０％、好ましくは少なくとも７５％又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％及び最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％の増加する相同性、類似性又は同一性を伴う。同じことが「変異ＶＨ」及び「変異ＶＬ」にも当てはまる。一実施形態によれば、「変異ＶＨ」及び／又は「変異ＶＬ」の範囲内における配列変異は、ＣＤＲに及ばない。従って、本発明は、本明細書に定義するとおりの特定の配列（「親」ＶＨ及びＶＬ）と特定の配列相同性（上記を参照されたい）を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む本明細書に定義するとおりの抗体コンストラクトに関し、ここで、ＣＤＲ配列は、本明細書に定義するとおりの特定のＣＤＲ配列（「親」ＣＤＲ）と１００％同一である。
好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、抗体コンストラクトが第１のドメインによってＣＬＤＮ１８．２に結合し、第２のドメインによってＣＤ３又はＣＤ３εに結合するその能力を保持している限り、且つ／又はそのＣＤＲ、ＦＲ、ＶＨ及び／又はＶＬ配列が元の配列又は親配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは少なくとも７０％又は７５％、更により好ましくは少なくとも８０％又は８５％及び特に好ましくは少なくとも９０％又は９５％の程度の同一性を有しているならば、任意の置換（非保存的置換又は以下の表１に挙げられる「例示的置換」からの１つ以上を含む）が想定される。
保存的置き換え（保存的突然変異又は保存的置換とも称される）は、所与のアミノ酸を同様の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、サイズ）の別のアミノ酸に変えるアミノ酸置換である。タンパク質における保存的置き換えは、多くの場合にタンパク質機能に及ぼす効果が非保存的置き換えよりも小さい。保存的置換を表１に示す。例示的な保存的置換は、「例示的置換」として示される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、アミノ酸クラスに関して本明細書に更に記載するとおり、より実質的な変化が導入され、産物が所望の特性に関してスクリーニングされ得る。
Figure 0007577435000001
本発明の抗体コンストラクトの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーションなど、置換範囲におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルク性の維持に対するその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。非保存的置換は、通常、上記に定義されるアミノ酸クラス（極性、中性、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、小型など）の１つのメンバーから別のクラスへの交換を必然的に伴うことになる。抗体コンストラクトの酸化安定性を向上させるため、抗体コンストラクトの正しいコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を概してセリンと置換し得る。
アミノ酸配列の配列同一性、相同性及び／又は類似性は、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９７０ Ｍａｒ；４８（３）：４４３－５３）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８８ Ａｐｒ；８５（８）：２４４４－８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４ Ｊａｎ １１；１２（１ Ｐｔ １）：３８７－９５）によって記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムであって、好ましくはデフォルト設定を用いるもの、又は目視によることを含め、当該技術分野において公知の標準技法を用いることにより決定される。パーセント同一性は、ＦａｓｔＤＢにより、以下のパラメータ：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；及びジョイニングペナルティ３０に基づいて計算されることが想定される。“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．も参照されたい。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連配列の群から累進的ペアワイズアラインメントを用いて多重配列アラインメントを生成する。これは、アラインメントの生成に用いられるクラスタリング関係を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９８７；２５（４）：３５１－６０）の累進的アラインメント方法の単純化を用いる。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９ Ａｐｒ；５（２）：１５１－３）によって記載されるものと類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、デフォルトギャップ加重３．００、デフォルトギャップ長加重０．１０及び加重付き末端ギャップが挙げられる。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｏｃｔ ５；２１５（３）：４０３－１０．）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９－４０２）；及びＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９３ Ｊｕｎ １５；９０（１２）：５８７３－７）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２プログラムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６；２６６：４６０－８０）から得られたものである。ＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２は、幾つかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩで設定される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは、ダイナミック値であり、特定の配列の組成及び目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって確立される。しかしながら、感度を増加させるために値が調整され得る。
更なる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９－４０２）によって報告されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；２ヒット法によるギャップなし伸長の開始、ｋのギャップ長に１０＋ｋのコストを課し；１６に設定されたＸｕ及びデータベース検索段階について４０に設定され、アルゴリズムの出力段階について６７に設定されたＸｇを使用する。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによって開始される。
これと一致して、本明細書に同定される抗体コンストラクトをコードする核酸配列に関する用語「パーセント（％）核酸配列同一性／相同性／類似性」は、抗体コンストラクトのコード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。２つの配列をアラインメントし、それによりその相同性を決定する１つの方法は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションをそれぞれ１及び０．１２５に設定したデフォルトパラメータ設定のＷＵ－Ｂｌａｓｔ２のＢＬＡＳＴＮモジュールを使用する。概して、個々の変異ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列と間の核酸配列相同性、類似性又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％及びほぼ１００％の増加する相同性、類似性又は同一性を伴う。この場合も、「変異ＶＨ」及び／又は「変異ＶＬ」をコードする核酸配列に同じことが当てはまる。
一実施形態において、本発明に係る抗体コンストラクト又はこれらの抗体コンストラクトの第１及び第２のドメイン（結合ドメイン）のヒト生殖細胞系列との同一性パーセンテージは、≧７０％又は≧７５％、より好ましくは≧８０％又は≧８５％、更により好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％又は更に≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物との同一性は、治療用タンパク質が治療中の患者において薬物に対する免疫応答を引き起こすリスクを低減するのに重要な特徴と考えられる。Ｈｗａｎｇ Ｗ．Ｙ．ａｎｄ Ｆｏｏｔｅ Ｊ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５ Ｍａｙ；３６（１）：３－１０）は、薬物抗体コンストラクトの非ヒト部分を減らすと、治療中の患者に抗薬物抗体を生じさせるリスクの低下につながることを実証している。網羅的な数の臨床的に評価された抗体薬物及びそれぞれの免疫原性データの比較により、タンパク質の免疫原性が、改変されていない非ヒト可変領域を有する抗体／抗体コンストラクト（平均２３．５９％の患者）と比べて、抗体／抗体コンストラクトの可変領域のヒト化によって低くなる傾向が示される（平均５．１％の患者）。従って、可変領域をベースとする抗体コンストラクトの形態のタンパク質療法薬には、ヒト配列との高度な同一性が望ましい。生殖細胞系列同一性を決定することを目的として、ＶＬのＶ領域をヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／）のアミノ酸配列とＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いてアラインメントし、同一のアミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の総数で除すことによりアミノ酸配列をパーセントで計算することができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／）についても同様に行うことができ、但し、ＶＨ ＣＤＲ３は多様性が高く、且つヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３アラインメントパートナーが存在しないために除外し得る点が異なる。次に、組換え技術を用いてヒト抗体生殖系列遺伝子との配列同一性を高めることができる。
更なる実施形態において、本発明の抗体コンストラクトは、標準的な研究スケール条件下において、例えば標準的な二段階精製プロセスで高い単量体収率を呈する。本発明に係る抗体コンストラクトの単量体収率は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清（ＳＮ）、好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ ＳＮ、より好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ ＳＮ、更により好ましくは≧２ｍｇ／Ｌ ＳＮ及び最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ ＳＮであることが想定される。「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓ」と称される抗体コンストラクトの収率は、４．１ｍｇ／Ｌ上清であることが示され、「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ」と称される抗体コンストラクトの収率は、３６．５ｍｇ／Ｌ上清であることが示された。
同様に、二量体抗体コンストラクトアイソフォームの収率、従って抗体コンストラクトの単量体パーセンテージ（即ち単量体：（単量体＋二量体））を決定することができる。単量体及び二量体抗体コンストラクトの生産性並びに単量体パーセンテージ計算値は、例えば、ローラーボトルにおける標準化された研究スケール生産からの培養上清のＳＥＣ精製ステップで求めることができる。一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトの単量体パーセンテージは、≧８０％、より好ましくは≧８５％、更により好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９５％である。
一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトは、血漿安定性（血漿なしでのＥＣ５０に対する血漿ありでのＥＣ５０の比）が≦５又は≦４、より好ましくは≦３．５又は≦３、更により好ましくは≦２．５又は≦２及び最も好ましくは≦１．５又は≦１である。抗体コンストラクトの血漿安定性は、ヒト血漿中で精製コンストラクトを例えば２～２０μｇ／ｍｌの濃度において３７℃で２４～９６時間インキュベートし、続いて１８時間５１－クロム遊離又は４８時間ＦＡＣＳ細胞傷害性アッセイ（例えば、実施例７．１及び７．２に記載されるとおりのアッセイ）でＥＣ５０を決定することにより試験し得る。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激されたエンリッチヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞（好ましい）又は刺激されていないヒトＰＢＭＣであり得る。標的細胞は、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１であり得る。細胞傷害性アッセイにおける抗体コンストラクトの出発濃度は、０．０１～０．１μｇ／ｍｌであり得る。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコートしたシリンジによって採取された健常ドナーの血液に由来する。細胞成分を遠心によって除去し、上部血漿相を収集し、続いてプールする。対照として、インキュベートしていない抗体コンストラクトを希釈した後、直ちにＲＰＭＩ－１６４０などの適切な培地で細胞傷害性アッセイを行う。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照／インキュベーションなし）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比として計算する。
更に、本発明の抗体コンストラクトの単量体から二量体への変換率は、低いことが想定される。変換は、種々の条件下で測定し、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。実施例８を参照されたい。例えば、抗体コンストラクトの単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーターにおいて汎用製剤化緩衝液中、例えば１００μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で７日間行うことができ、続いて高性能ＳＥＣにより、当初単量体であったのが二量体抗体コンストラクトに変換された抗体コンストラクトのパーセンテージを決定することができる。これらの条件下において、本発明の抗体コンストラクトは、≦８％、好ましくは≦６％、より好ましくは≦５％、より好ましくは≦４％、更により好ましくは≦３％、更により好ましくは≦２．５％、更により好ましくは≦２％、更により好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又は更に０％の二量体パーセンテージを示すことが想定される。
同様に、本発明の抗体コンストラクトは、数回の凍結／融解サイクル後にも極めて低い二量体変換率を呈することが想定される。例えば、抗体コンストラクト単量体を例えば汎用製剤化緩衝液中に２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整して３回の凍結／融解サイクルに供し（－８０℃で３０分間凍結、続いて室温で３０分間融解）、続いて高性能ＳＥＣにより、当初単量体であったのが二量体抗体コンストラクトに変換された抗体コンストラクトのパーセンテージを決定する。抗体コンストラクトの二量体パーセンテージは、例えば、３回の凍結／融解サイクル後に≦８％、好ましくは≦６％、より好ましくは≦５％、より好ましくは≦４％、更により好ましくは≦３％、更により好ましくは≦２．５％、更により好ましくは≦２％、更により好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又は更に０％であることが想定される。
一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトは、凝集温度≧４５℃又は≧４６℃、より好ましくは≧４７℃又は≧４８℃、更により好ましくは≧４９℃又は≧５０℃及び最も好ましくは≧５１℃の好ましい熱安定性を示す。熱安定性パラメータは、以下のとおり抗体凝集温度に関して決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を使い捨てキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置に置く。定期的に半径測定値を取得しながら試料を０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃に加熱する。タンパク質の融解及び凝集の指標である半径の増加を用いて抗体の凝集温度を計算する。実施例９を参照されたい。
或いは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により温度融解曲線を決定して、抗体コンストラクトの固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定することができる。このような実験は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して行うことができる。製剤化緩衝液のみを含有する試料と比較した抗体コンストラクト含有試料の２０℃から９０℃へのエネルギー吸収を記録する。抗体コンストラクトは、例えば、ＳＥＣランニング緩衝液中２５０μｇ／ｍｌの最終濃度に調整する。それぞれの融解曲線を記録するため、全体の試料温度を段階的に上昇させる。各温度における試料及び製剤化緩衝液参照のエネルギー吸収を記録する。試料から参照を差し引いたエネルギー吸収の差Ｃｐ（ｋｃａｌ／モル／℃）をそれぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、最初のエネルギー吸収最大値における温度として定義される。
本発明の抗体コンストラクトは、濁度が≦０．２又は≦０．１５、好ましくは≦０．１０又は≦０．０８、より好ましくは≦０．０６又は≦０．０５及び最も好ましくは≦０．０４又は≦０．０３であることも想定される。濁度は、２．５ｍｇ／ｍｌの抗体コンストラクト濃度及び５℃で１６時間のインキュベーションにおけるＯＤ３４０によって測定することができる。実施例１０を参照されたい。
Ｔ細胞の非存在下における標的細胞上のコンストラクトのプレインキュベーションに応じた標的×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力の変化を測定することができる。抗体コンストラクトがインターナライズされた場合、それは、リソソーム分解を受けるものと予想される。従って、有効濃度は、時間と共に低下するものと予想され、従って見かけの効力も同様に低下するはずである。一部の標的でこの効果が観察されており、そのため、これは、公知の現象である。本発明の抗体コンストラクトは、標的細胞によってインターナライズされないか、又はそれによる有意なインターナリゼーションを受けないことが想定される。インターナリゼーション率は、例えば、以下に記載されるとおりアッセイすることができる：Ｔ細胞をカウントし、アッセイ培地中に１×１０５／ｍｌの濃度に希釈する。標的陽性標的細胞をカウントし、例えば２５００細胞／ウェル（ｃｐｗ）でプレーティングする。抗体コンストラクトを例えば１００ｎＭの出発濃度で１：２段階希釈する。抗体コンストラクトを培養アッセイプレートに加えて０時間、１時間又は２時間インキュベートさせた後、Ｔ細胞を加える。次に、Ｔ細胞を２５０００ｃｐｗでプレーティングし（Ｅ：Ｔ＝１０：１）、アッセイを３７℃で４８時間インキュベートする。標的細胞生存を例えばＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）システム（２５μｌ／ウェル）で分析する。好ましくは、抗体コンストラクトを標的細胞と２時間（プレ）インキュベートした後のインターナリゼーション率（例えば、細胞傷害性の低下として測定される）は、≦２０％、より好ましくは≦１５％、更により好ましくは≦１０％及び最も好ましくは≦５％である。
更に、本発明の抗体コンストラクトについて、シェディングされた又は可溶性の標的は、その有効性又は生物活性を著しく損なうことがないと想定される。これは、例えば、可溶性標的をアッセイに漸増濃度、例えば０ｎＭ－０．３ｎＭ－０．７ｎＭ－１ｎＭ－３ｎＭ－７ｎＭ－１２ｎＭで加える細胞傷害性アッセイにおいて測定することができる。例示的Ｅ：Ｔ値は、１０：１である。試験した抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、可溶性標的の存在下で有意に増加しないはずである。
更なる実施形態において、本発明に係る抗体コンストラクトは、酸性ｐＨで安定している。ｐＨ５．５などの非生理的ｐＨ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーの実行に必要なｐＨ）で挙動する抗体コンストラクトの耐性が高いほど、ロードしたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出した抗体コンストラクトの回収率が高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、陽イオン）交換カラムからの抗体コンストラクトの回収率は、好ましくは、≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、更により好ましくは≧６０％、更により好ましくは≧７０％、更により好ましくは≧８０％及び最も好ましくは≧９５％である。パーセンテージは、主ピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ）に相当する。実施例１１を参照されたい。
更に、本発明の抗体コンストラクトは、治療有効性を呈し、それが抗腫瘍活性又は腫瘍成長阻害として現れることが想定される。これは、例えば、実施例１３又は１４に開示されるとおりの試験で評価することができる。一実施形態において、本発明の抗体コンストラクトの腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０、≦６０、≦５０、≦４０、≦３０、≦２０、≦１０、≦５、≦４、≦３又は≦２である。こうした試験の特定のパラメータ（注入する腫瘍細胞の数、注入部位、移植するヒトＴ細胞の数、抗体コンストラクトの投与量及びタイムラインなど）の修正又は調整も想定されるが、それでもなお有意味且つ再現可能な結果に至る。
本発明は、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子を更に提供する。核酸分子は、ヌクレオチドで構成されるバイオポリマーである。ポリヌクレオチドは、鎖状に共有結合的に結合した１３個以上のヌクレオチド単量体で構成されるバイオポリマーである。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、個別的な生物学的機能を備えたポリヌクレオチド／核酸分子の例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子の単量体又はサブユニットとしての役割を果たす有機分子である。本発明の核酸分子又はポリヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖、線状又は環状であり得る。核酸分子又はポリヌクレオチドは、ベクターに含まれることが想定される。更に、かかるベクターは、宿主細胞に含まれることが想定される。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクター又はポリヌクレオチド／核酸分子による形質転換又はトランスフェクション後、抗体コンストラクトの発現能を有する。この目的で、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。
遺伝子コードは、遺伝物質（核酸）内にコードされる情報がタンパク質に翻訳される際に従う一連の規則である。生細胞における生物学的解読は、ｍＲＮＡが指定する順序にアミノ酸を連結するリボソームが、ｔＲＮＡ分子を用いてアミノ酸を運び、ｍＲＮＡを一度に３ヌクレオチドずつ読み取ることにより達成される。コードは、タンパク質合成中に次にいずれのアミノ酸が付加されるかについて、コドンと呼ばれるこれらのヌクレオチドトリプレットの配列がどのように指定するかを定義する。幾つかの例外があるものの、核酸配列中の３ヌクレオチドコドンは、単一のアミノ酸を指定する。大多数の遺伝子は、正確に同じコードでコードされるため、多くの場合、この特定のコードがカノニカル又は標準遺伝子コードと称される。
コドンの縮重は、アミノ酸を指定する３塩基対コドンの組み合わせの多重性として示される遺伝子コードの重複性である。縮重は、コード可能なアミノ酸よりコドンが多いために生じる。１つのアミノ酸をコードするコドンは、その３つの位置のいずれかにおいて異なり得る。しかしながら、多くの場合、この違いは、２番目又は３番目の位置である。例えば、コドンＧＡＡ及びＧＡＧの両方は、グルタミン酸を指定し、重複性を呈する。しかし、いずれも、いかなる他のアミノ酸も指定せず、従って曖昧さを示さない。異なる生物の遺伝子コードは、同じアミノ酸をコードする幾つかのコドンのうち、他と比べてある１つの使用に偏り得る － 即ち、ある１つが、偶然に予想されるよりも高頻度に見られ得る。例えば、ロイシンは、６つの個別的なコドンによって指定され、そのうちの幾つかは、ほとんど使用されない。多くの生物についてのゲノムコドン使用頻度を詳述するコドン使用表が利用可能である。組換え遺伝子技術では、コドン最適化と称される技法を実施することによりこの効果がよく利用され、ここでは、例えば、タンパク質発現を増加させるため、ポリヌクレオチドの設計にそれぞれの宿主細胞（ヒト、ハムスター由来の細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞など）が優先するコドンが使用される。従って、本開示のポリヌクレオチド／核酸分子はコドン最適化されることが想定される。それにも関わらず、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子は、所望のアミノ酸をコードする任意のコドンを使用して設計され得る。
一実施形態によれば、本発明の抗体コンストラクトをコードする本発明のポリヌクレオチド／核酸分子は、１つの単一分子の形態又は２つ以上の別個の分子の形態である。本発明の抗体コンストラクトが単鎖抗体コンストラクトである場合、かかるコンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子も１つの単一分子の形態である可能性が最も高いことになる。しかしながら、また抗体コンストラクトの異なる成分（異なるドメイン、例えばＣＬＤＮ１８．２に結合するドメイン、ＣＤ３に結合するドメイン及び／又は抗体定常ドメインなどの更なるドメインなど）が別個のポリペプチド鎖上に位置することも想定され、この場合、ポリヌクレオチド／核酸分子は、２つ以上の別個の分子の形態である可能性が最も高い。
同じことが本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターにも当てはまる。本発明の抗体コンストラクトが単鎖抗体コンストラクトである場合、１つのベクターは、１つの単一の位置に（１つの単一のオープンリーディングフレーム、ＯＲＦとして）抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含み得る。１つのベクターは、別個の位置に（個別のＯＲＦで）２つ以上のポリヌクレオチド／核酸分子も含み、その各々が本発明の抗体コンストラクトの異なる成分をコードし得る。本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターは、１つの単一のベクター又は２つ以上の別個のベクターの形態であることが想定される。一実施形態において及び宿主細胞において抗体コンストラクトを発現させる目的上、本発明の宿主細胞は、抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子又はかかるポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを全体として含まなければならず、これは、即ち抗体コンストラクトの全ての成分が － １つの単一分子としてコードされるか、又は別個の分子／位置でコードされるかに関わらず － 翻訳後にアセンブルし、一緒になって本発明の生物学的に活性な抗体コンストラクトを形成するであろうことを意味する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターも提供する。ベクターは、通常、複製及び／又は発現を目的として（外来性）遺伝物質を細胞に移入させるための媒体として使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、－ 限定されないが － プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含する。あるベクターは、特にクローニングのために設計され（クローニングベクター）、他はタンパク質発現のために設計される（発現ベクター）。そのインサートの増幅には、いわゆる転写ベクターが主に使用される。ＤＮＡの操作は、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクター上に行われ、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＤＮＡの維持に必要なエレメントを含む。しかしながら、ベクターは、酵母、植物又は哺乳類細胞などの別の生物におけるその維持を可能にするエレメントも有することができ、こうしたベクターは、シャトルベクターと呼ばれる。標的又は宿主細胞へのベクターの挿入は、通常、細菌細胞について形質転換、真核細胞についてトランスフェクションと呼ばれる一方、ウイルスベクターの挿入は、形質導入と呼ばれることが多い。
一般に、エンジニアリングされたベクターは、複製起点、多クローニング部位及び選択可能マーカーを含む。ベクター自体は、概して、インサート（トランス遺伝子）及びベクターの「骨格」としての役割を果たすより大型の配列を含むヌクレオチド配列、一般にはＤＮＡ配列である。遺伝子コードは、所与のコード領域のポリペプチド配列を決定する一方、他のゲノム領域は、そうしたポリペプチドがいずれの時点及びいずれの箇所で産生されるかに影響し得る。従って、現代のベクターは、トランス遺伝子インサート及び骨格以外にも追加的な特徴：プロモーター、遺伝マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、ターゲティング配列、タンパク質精製タグを包含し得る。特に発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、標的細胞におけるトランス遺伝子の発現のためのものであり、概して制御配列を有する。
用語「制御配列」は、作動可能に連結されたコード配列が特定の宿主生物において発現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に好適な制御配列としては、プロモーター、任意選択でオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、コザック配列及びエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されているか、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか、又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置に置かれる場合、コード配列に作動可能に連結されている。概して、「作動可能に連結されている」とは、連結されているヌクレオチド配列が連続的であり、分泌リーダーの場合に連続的で且つ読み取りフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーが連続的である必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、従来の慣習に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
「トランスフェクション」は、標的細胞に核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に導入するプロセスである。この用語は、主として真核細胞における非ウイルス方法に用いられる。核酸分子又はポリヌクレオチドのウイルス媒介移入の記載には、形質導入が用いられることが多い。動物細胞のトランスフェクションには、典型的には、細胞膜に一過性の細孔又は「穴」を開けて材料の取り込みを可能にすることが関わる。トランスフェクションは、生物学的粒子（ウイルス形質導入とも称される、ウイルストランスフェクションなど）、化学ベースの方法（リン酸カルシウム、リポフェクション、Ｆｕｇｅｎｅ、カチオン性ポリマー、ナノ粒子を用いるなど）又は物理的処理（電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃、細胞スクイージング、マグネトフェクション、静水圧、インペイルフェクション、音波処理、光学的トランスフェクション、熱ショックなど）を用いて行うことができる。
用語「形質転換」は、細菌への、また植物細胞を含めた非動物真核細胞への核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス移入の記載に用いられる。従って、形質転換は、その周囲からの１つ又は複数の細胞膜を通じた直接的な取り込み及び続く外因性遺伝物質（核酸分子）の組み込みによって生じる細菌又は非動物真核細胞の遺伝子改変である。形質転換は、人為的手段によって達成することができる。形質転換が起こるには、細胞又は細菌が形質転換受容状態でなければならず、これは、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時間的に限られた反応として起こる可能性があり、また人為的に生じさせることもできる。
更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子又は本発明のベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」には、本発明の抗体コンストラクトをコードするベクター、外因性核酸分子及び／又はポリヌクレオチドのレシピエント；及び／又は抗体コンストラクト自体のレシピエントであることができるか、又はそれであった任意の個々の細胞又は細胞培養物が含まれることが意図される。細胞へのそれぞれの材料の導入は、形質転換、トランスフェクションなどを用いて行われる（上記を参照されたい）。用語「宿主細胞」には、単細胞の子孫又は潜在的子孫が含まれることも意図される。後続の世代で、天然の、偶然の又は計画的な突然変異のいずれかに起因した又は環境の影響に起因したある種の修飾が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と（形態又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体が）完全に同一でないこともあるが、それもなお、本明細書で使用されるとおりのこの用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞には原核細胞又は真核細胞が含まれ、また、－ 限定されないが － 細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、並びに昆虫細胞及び哺乳類細胞、例えばハムスター、マウス、ラット、マカク又はヒトなどの動物細胞も含まれる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が本発明の抗体コンストラクトに好適なクローニング又は発現宿主である。下等真核生物宿主微生物の中でも、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、即ち一般的なパン酵母が最も一般的に用いられる。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカーハミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２ ２２６号明細書）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３ ０７０号明細書）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４ ２３４号明細書）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌、例えばアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）など、幾つもの他の属、種及び株が一般的に利用可能であり、本明細書において有用である。
グリコシル化された抗体コンストラクトの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主から、多くのバキュロウイルス株及び変異体並びに対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体及びカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、本明細書において本発明に係るウイルスとして使用し得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生において有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に公知である。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照されたい。
しかしながら、最も高い関心が持たれてきたのは、脊椎動物細胞であり、培養下（細胞培養下）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１など）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は浮遊培養で成長させるためサブクローニングされた２９３細胞など、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０など）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯなど、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４など、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０など）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７など）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２など）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４など）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２など）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５など）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，１４１３ ８０６５など）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－５１など）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２など）である。
更なる実施形態において、本発明は、本発明の抗体コンストラクトを作製する方法を提供し、前記方法は、本発明の抗体コンストラクトの発現を許容する条件下において、本発明の宿主細胞を培養することと、作製された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「培養すること」は、培地中における好適な条件下での細胞のインビトロでの維持、分化、成長、増殖及び／又は伝播を指す。細胞は、適切な温度及び混合気体で細胞成長培地中において成長及び維持される。培養条件は、細胞型毎に幅広く異なる。典型的な成長条件は、約３７℃の温度、約５％のＣＯ２濃度及び約９５％の湿度である。成長培地のレシピは、例えば、ｐＨ、炭素源（グルコースなど）の濃度、成長因子の性質及び濃度並びに他の栄養素（アミノ酸又はビタミンなど）の存在が異なり得る。補足培地に使用される成長因子は、胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、仔ウシ血清（ＦＣＳ）、ウマ血清及びブタ血清など、動物血液の血清に由来することが多い。細胞は、浮遊培養液中でも又は付着培養物としても成長させることができる。また、浮遊培養下で生存可能であるように修飾された、従って付着条件で可能であろうよりも高密度に成長することができる細胞株もある。
用語「発現」には、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、折り畳み、翻訳後修飾、特定の細胞内又は細胞外位置へのターゲティング及び分泌を含め、本発明の抗体コンストラクトの作製に関わる任意のステップが含まれる。用語「回収」は、細胞培養物から抗体コンストラクトを単離することを意図した一連のプロセスを指す。「回収」又は「精製」プロセスでは、細胞培養物のタンパク質部分と非タンパク質部分とが分離され、最終的に他の全てのポリペプチド及びタンパク質から所望の抗体コンストラクトが分離される。分離ステップは、通常、タンパク質サイズ、物理化学的特性、結合親和性及び生物学的活性の違いを利用する。分取的精製は、後続の使用のため比較的多量の精製タンパク質を生じさせることを目指す一方、分析的精製は、種々の研究又は分析目的で比較的少量のタンパク質を生じさせる。
組換え技術を用いるとき、抗体コンストラクトは、細胞内に産生され得るか、細胞膜周辺腔に産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体コンストラクトが細胞内に産生される場合、最初のステップとして、粒子状デブリ、宿主細胞又は溶解断片のいずれかが例えば遠心又は限外ろ過によって除去される。本発明の抗体コンストラクトは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌で産生され得る。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからコンストラクトが単離され、これは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はサイズ排除によって精製することができる。最終的な精製は、哺乳類細胞で発現して培地中に分泌した抗体コンストラクトの精製プロセスと同じように行うことができる。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９２ Ｆｅｂ；１０（２）：１６３－７）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体の単離手順について記載している。
抗体が培地中に分泌される場合、概して、かかる発現システムからの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば限外ろ過ユニットを使用して初めに濃縮される。
宿主細胞から調製された本発明の抗体コンストラクトは、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて回収又は精製することができる。回収しようとする抗体コンストラクトに応じて、イオン交換カラムでの分画、混合モードイオン交換、ＨＩＣ、エタノール沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、イムノアフィニティー（プロテインＡ／Ｇ／Ｌなど）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、超遠心法及び硫安塩析など、他のタンパク質精製技法も利用可能である。
前述のステップのいずれにも、タンパク質分解を阻害するためプロテアーゼ阻害薬が含まれ得、汚染物質の成長を防止するため抗生物質が含まれ得る。
更に、本発明は、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法によって作製された抗体コンストラクトを含む医薬組成物又は製剤を提供する。
本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、好ましくは、治療有効量である本発明の抗体コンストラクトを１つ又は複数含む。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤の好適な製剤を更に含む。本組成物の許容可能な構成成分は、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で被投与者にとって非毒性である。本発明の医薬組成物としては、限定されないが、液体、凍結及び凍結乾燥組成物が挙げられる。
本組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。一般に、本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」は、製剤投与、詳細には非経口投与と適合性のあるあらゆる水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルションなどのエマルション、各種湿潤剤、リポソーム、分散媒及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるかかる培地及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知であり、かかる担体を含む組成物は、周知の従来方法によって製剤化することができる。
特定の実施形態は、本発明の抗体コンストラクトと、本節及び本明細書の他の部分で例示的に記載されるものなどの更なる１つ以上の賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、本発明では、本発明の方法及び／又は粘度の調整など、製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整など、多様な目的で使用して有効性を向上させ、且つ／又は例えば製造、出荷、貯蔵、使用前準備、投与中及びその後に起こるストレスに起因する分解及び変質に対してかかる製剤及びプロセスを安定化させることができる。賦形剤は、一般にその最低有効濃度で使用されるべきである。
特定の実施形態において、本医薬組成物は、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は透過など、組成物の特定の特徴を修正、維持又は保存する目的で製剤化材料を含有し得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。かかる実施形態において、好適な製剤化材料としては、限定されないが、以下を挙げることができる。
・アミノ酸
・抗細菌剤及び抗真菌剤などの抗微生物薬
・抗酸化剤
・組成物を生理的ｐＨ又はそれより僅かに低いｐＨ、典型的には約５～約８又は９のｐＨ範囲内に維持するために使用される緩衝液、緩衝系及び緩衝剤
・非水性溶媒、植物油及び注射用有機エステル
・生理食塩水及び緩衝媒体を含め、水を含めた水性担体、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー
・増量剤
・キレート剤
・等張剤及び吸収遅延剤
・錯化剤
・充填剤
・糖質
・好ましくはヒト由来の（低分子量）タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質性担体
・着色剤及び香味剤
・含硫還元剤
・希釈剤
・乳化剤
・親水性ポリマー
・塩形成対イオン
・保存剤
・金属錯体
・溶媒及び共溶媒
・糖類及び糖アルコール類
・懸濁剤
・界面活性剤又は湿潤剤
・安定促進剤
・等張化促進剤
・非経口送達媒体
・静脈内送達媒体
医薬組成物の種々の構成成分が異なる効果を有し得ることは常識であり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定剤及び／又は抗酸化剤としての役割を果たし得；マンニトールは、増量剤及び／又は等張化促進剤としての役割を果たし得；塩化ナトリウムは、送達媒体及び／又は等張化促進剤としての役割を果たし得る等である。
本発明との関連において、医薬組成物は、
（ａ）本明細書に記載されるとおりの抗体コンストラクト、
（ｂ）少なくとも１つの緩衝剤、
（ｃ）少なくとも１つの糖、及び
（ｄ）少なくとも１つの界面活性剤
を含み得、ここで、医薬組成物のｐＨは、３．５～６の範囲である。
上記に記載される組成物において、第１のドメインは、好ましくは、４～９．５の範囲の等電点（ｐＩ）を有し；第２のドメインは、８～１０、好ましくは８．５～９．０の範囲のｐＩを有し；及び抗体コンストラクトは、任意選択で、ヒンジと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを各々含む２つのポリペプチド単量体を含む第３のドメインを含み、ここで、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーによって互いに融合されている。
上記に記載される組成物において、更に、少なくとも１つの緩衝剤は、５～２００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは１０～５０ｍＭの濃度範囲で存在することが想定される。また、少なくとも１つの糖は、単糖、二糖、環状多糖、糖アルコール、線状分岐デキストラン又は線状非分岐デキストランからなる群から選択されることも想定される。また、二糖は、スクロース、トレハロース及びマンニトール、ソルビトール及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることも想定される。更に、糖アルコールは、ソルビトールであることが想定される。また、少なくとも１つの糖は、１～１５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度、好ましくは９～１２％（ｍ／Ｖ）の濃度範囲で存在することも想定される。更に、抗体コンストラクトは、０．１～８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２～２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することが想定される。
上記に記載される組成物の一実施形態によれば、少なくとも１つの界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニックＦ６８、トリトンＸ－１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。更に、少なくとも１つの界面活性剤は、０．００４～０．５％（ｍ／Ｖ）の範囲、好ましくは０．００１～０．０１％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在することが想定される。組成物のｐＨは、４．０～５．０の範囲、好ましくは４．２であることが想定される。また、医薬組成物は、１５０～５００ｍＯｓｍの範囲のオスモル濃度を有することも想定される。更に、医薬組成物は、１つ以上のポリオール及び１つ以上のアミノ酸からなる群から選択される賦形剤を更に含むことが想定される。本発明との関連において、前記１つ以上の賦形剤は、０．１～１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが想定される。
本発明は、
（ａ）好ましくは、０．１～８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２～２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の、本明細書に記載されるとおりの抗体コンストラクト；
（ｂ）１０ｍＭグルタミン酸塩又は酢酸塩；
（ｃ）９％（ｍ／Ｖ）スクロース又は６％（ｍ／Ｖ）スクロース及び６％（ｍ／Ｖ）ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン；
（ｄ）０．０１％（ｍ／Ｖ）ポリソルベート８０
を含む医薬組成物も提供し、ここで、液体医薬組成物のｐＨは、４．２である。
本発明の組成物は、本明細書に定義される本発明の抗体コンストラクトに加えて、組成物の使用目的に応じて更なる生物学的に活性な薬剤を含む可能性があることが想定される。かかる薬剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫応答を抑制する薬物、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物及び／又は当該技術分野において公知のサイトカインなどの薬剤である可能性がある。また、本発明の抗体コンストラクトは、併用療法で、即ち別の抗がん医薬と組み合わせて適用されることも想定される。
これに関連して、本発明の医薬組成物（これは、本明細書において上記に更に詳細に記載したとおり、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインとＴ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む抗体コンストラクトを含む）は、免疫チェックポイント経路のタンパク質（ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４など）又は共刺激免疫チェックポイント受容体（４－１ＢＢなど）に結合する薬剤、好ましくは抗体又は抗体コンストラクトを更に含むことが想定される。本発明は、本発明に係る抗体コンストラクト（これは、本明細書において上記に更に詳細に記載したとおり、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインとＴ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む抗体コンストラクトを含む）と、免疫チェックポイント経路のタンパク質（ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４など）又は共刺激免疫チェックポイント受容体（４－１ＢＢなど）に結合する薬剤、好ましくは抗体又は抗体コンストラクトとの併用にも関する。この併用の少なくとも２つの成分の性質、即ちそれらの薬学的活性のため、この併用は、治療的併用と称することもできる。一部の実施形態において、併用は、医薬組成物の形態又はキットの形態であり得る。一実施形態によれば、医薬組成物又は併用は、本発明の抗体コンストラクトと、ＰＤ－１に結合する抗体又は抗体コンストラクトとを含む。この目的に有用な抗ＰＤ－１結合タンパク質については、例えば、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０１３２０５号明細書に詳細に記載されている。
従って、更なる態様において、本発明は、
・本明細書において上記に更に詳細に記載したとおりの、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインと、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む抗体コンストラクト、及び
・ＰＤ－１に結合し、且つ
ａ）配列番号２９２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２９３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号２９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号２９７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号３０２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３０３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３０４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３０７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号３１２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３１４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３１５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３１７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｄ）配列番号３２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３２７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｅ）配列番号３３２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｆ）配列番号３４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３４３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３４４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３４５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３４６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３４７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｇ）配列番号３５２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；又は
ｈ）配列番号３６２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３６３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号３６４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに／又は配列番号３６５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３６６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域
を含む抗体又は抗体コンストラクト
を含む医薬組成物又は併用に関する。
一実施形態において、ＰＤ－１に結合する上述の抗体又は抗体コンストラクトは、
ａ）配列番号２９８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号２９９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｂ）配列番号３０８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３０９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｃ）配列番号３１８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３１９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｄ）配列番号３２８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３２９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｅ）配列番号３３８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３３９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｆ）配列番号３４８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３４９に示されるとおりのＶＬ領域；
ｇ）配列番号３５８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３５９に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｈ）配列番号３６８に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号３６９に示されるとおりのＶＬ領域
を含む。
一実施形態において、ＰＤ－１に結合する上記の抗体又は抗体コンストラクトは、
ａ）配列番号３００に示されるとおりの重鎖及び配列番号３０１に示されるとおりの軽鎖；
ｂ）配列番号３１０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３１１に示されるとおりの軽鎖；
ｃ）配列番号３２０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３２１に示されるとおりの軽鎖；
ｄ）配列番号３３０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３３１に示されるとおりの軽鎖；
ｅ）配列番号３４０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３４１に示されるとおりの軽鎖；
ｆ）配列番号３５０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３５１に示されるとおりの軽鎖；
ｇ）配列番号３６０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３６１に示されるとおりの軽鎖；又は
ｈ）配列番号３７０に示されるとおりの重鎖及び配列番号３７１に示されるとおりの軽鎖
を含む。
特定の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達フォーマット及び所望の投薬量に応じて決まる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｕｐｒａを参照されたい。特定の実施形態において、かかる組成物は、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響し得る。特定の実施形態において、医薬組成物中の主要な媒体又は担体は、本質的に水性又は非水性のいずれでもあり得る。例えば、好適な媒体又は担体は、場合により非経口投与用組成物によく見られる他の材料が補足された注射用水又は生理食塩水溶液であり得る。特定の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトを含む組成物は、所望の程度の純度を有する選択の組成物を任意選択の製剤化薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｕｐｒａ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で貯蔵のために調製され得る。更に、特定の実施形態において、本発明の抗体コンストラクトは、適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化され得る。
非経口投与が企図される場合、本発明に用いられる治療組成物は、薬学的に許容可能な媒体中に本発明の所望の抗体コンストラクトを含むパイロジェンフリーの非経口的に許容可能な水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適な媒体は、滅菌蒸留水であり、その中に本発明の抗体コンストラクトが滅菌等張液として製剤化され、適切に保存される。特定の実施形態において、この調製には、デポー注射によって送達することのできる製剤の制御放出又は持続放出をもたらし得る薬剤又は循環中における有効時間の持続を促進し得る薬剤と共に所望の分子を製剤化することが関わり得る。特定の実施形態では、植込み型薬物送達を用いて所望の抗体コンストラクトを導入し得る。
当業者には、持続送達又は制御送達製剤状の本発明の抗体コンストラクトが関わる製剤を含め、更なる医薬組成物が明らかであろう。種々の持続送達又は制御送達手段を製剤化する技法は、当業者に公知である。抗体コンストラクトは、例えば、コアセルベーション技法によるか、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、コロイド薬物送達システム又はマクロエマルションにも取り込まれ得る。かかる技法については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｕｐｒａに開示されている。
生体内投与に使用される医薬組成物は、典型的には滅菌製剤として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜でのろ過により達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成前又は後のいずれでも行われ得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中に貯蔵することができる。非経口組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグ又はバイアルに入れられる。
本発明の別の態様は、本発明の抗体コンストラクトを含む自己緩衝製剤を含み、国際公開第２００６／１３８１８１号パンフレットに記載されるとおり、これは、医薬組成物として使用することができるものである。この関連で有用なタンパク質安定化及び製剤化材料及び方法に関しては、Ａｒａｗａｋａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９９１ Ｍａｒ；８（３）：２８５－９１；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ”ｉｎ：Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；１３：１５９－７５など、種々の文献が利用可能であり、特に自己緩衝タンパク質製剤のための賦形剤及び方法に関する部分、特に獣医学的及び／又はヒト医学的使用のためのタンパク質医薬製品及び方法に関して参照されたい。
本発明の特定の実施形態において、例えば組成物又は製剤のイオン強度及び／又は等張性を調整するため、及び／又は本発明に係る組成物の抗体コンストラクト又は他の成分の溶解度及び／又は物理的安定性を向上させるため、塩が使用され得る。イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質の荷電基及び極性基を遮蔽して、その静電相互作用、引力及び斥力相互作用の強度を低下させることにより、天然状態のタンパク質を安定化させることができる。イオンは、タンパク質の特に変性ペプチド連結（－－ＣＯＮＨ）に結合することにより、変性状態のタンパク質を安定化させることもできる。更に、タンパク質の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低下させ、それによりタンパク質凝集及び不溶を防止又は低減することもできる。
イオン種は、タンパク質に対するその効果が著しく異なる。イオン及びそれがタンパク質に及ぼす効果について幾つものカテゴリー別順位付けが開発されており、本発明に係る医薬組成物の製剤化において用いることができる。一例は、ホフマイスター系列であり、これは、溶液中のタンパク質のコンホメーション安定性に対するその効果によってイオン性及び極性非イオン性溶質を順位付けする。安定化溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿させるため高濃度で使用される（「塩析」）。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化させるために使用される（「塩溶」）。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的有効性がホフマイスター系列におけるその順位を定義する。
本発明の様々な実施形態において本発明の抗体コンストラクトを含む製剤又は組成物には、増量剤、安定剤及び抗酸化剤として並びに他の標準的な用途において遊離アミノ酸を使用することができる。ある種のアミノ酸は、製剤中のタンパク質を安定化させるために使用することができ、他のアミノ酸は、凍結乾燥中に正しいケーキ構造及び活性成分の特性を確保するのに有用である。一部のアミノ酸は、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方でタンパク質凝集の阻害に有用であり得、他のアミノ酸は、抗酸化剤として有用である。
ポリオール類は、コスモトロピックであり、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方で安定化剤としてタンパク質を物理的及び化学的分解過程から保護するのに有用である。ポリオール類は、製剤の張性の調整及び輸送中の凍結融解ストレスからの保護又は製造過程におけるバルク調製にも有用である。ポリオール類は、本発明との関連において凍結保護物質としての役割を果たすこともできる。
本発明の抗体コンストラクトを含む製剤又は組成物の特定の実施形態は、界面活性剤を含み得る。タンパク質は、表面上への吸着及び変性並びに結果として生じる気液、固液及び液液界面での凝集を起こし易いものであり得る。これらの有害相互作用は、概してタンパク質濃度と逆比例して規模が増減し、典型的には、製品の配送及び出荷中に生じるものなど、物理的動揺によって悪化する。界面活性剤は、表面吸着を防止するか、最小限に抑えるか、又は低減するために日常的に使用されている。界面活性剤は、タンパク質コンホメーション安定性の制御にもよく使用されている。これに関して、１つの特定の界面活性剤が典型的には一部のタンパク質を安定化させ、他のタンパク質を不安定化させるであろうことから、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
本発明の抗体コンストラクトを含む製剤又は組成物の特定の実施形態は、１つ以上の抗酸化剤を含み得る。医薬製剤においてタンパク質の有害な酸化は、適切な周囲酸素及び温度レベルを維持することにより、及び光への曝露を回避することにより、ある程度防ぐことができる。抗酸化賦形剤は、タンパク質の酸化分解の防止にも使用することができる。本発明に係る治療用タンパク質製剤に用いられる抗酸化剤は、水溶性であり得、製品（抗体コンストラクトを含む組成物）の有効期間全体を通じてその活性を維持し得ることが想定される。抗酸化剤は、タンパク質に損傷を与えることもあり、従って － 数ある中でも特に － 抗酸化剤が抗体コンストラクト又は製剤中の他のタンパク質に損傷を与える可能性がなくなるか又は十分に低くなるように選択されなければならない。
本発明の抗体コンストラクトを含む製剤又は組成物の特定の実施形態は、１つ以上の保存剤を含み得る。保存剤は、例えば、同じ容器から２回以上取り出すことが関わる複数回用量非経口製剤の開発時に必要である。その主な機能は、微生物増殖を抑制し、薬物製品の有効期間又は使用期間全体を通じて製品の無菌性を確保することである。保存剤には、小分子非経口物質で使用されてきた長い歴史があるが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は難題であり得る。保存剤は、タンパク質に不安定効果（凝集）を及ぼすことが極めて多く、これは、複数回用量タンパク質製剤におけるその使用が制限される主因になっている。これまで、多くのタンパク質薬物は、単回使用向けにのみ製剤化されてきた。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、そうした製剤には、患者の利便性を実現し、市場性を高めるという追加的な利点がある。好例がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のそれであり、この場合、保存剤入り製剤の開発は、より利便性の高い複数回使用のペン型注射体裁の商業化につながっている。保存剤入り投薬形態の製剤化及び開発時、幾つかの側面を考慮する必要がある。薬物製品中における有効保存剤濃度が最適化されなければならない。これには、タンパク質安定性を損なうことなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲に関して投薬形態における所与の保存剤を試験する必要がある。
当然ながら、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤と比べて更に難題である。フリーズドライ製品は、保存剤なしに凍結乾燥し、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。これにより、保存剤が抗体コンストラクトと接触している時間が短縮され、付随する安定性リスクが大幅に小さく抑えられる。液体製剤では、製品の全有効期間にわたって保存剤の有効性及び安定性が維持されなければならない。留意すべき重要な点は、保存剤の有効性が、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終的な製剤で実証されなければならないことである。医薬組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、結晶として又は脱水若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに貯蔵され得る。かかる製剤は、即時使用可能な形態又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれでも貯蔵され得る。
本明細書に定義される医薬組成物の生物学的活性は、以下の実施例において、国際公開第９９／５４４４０号パンフレットにおいて、又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）によって記載されるとおり、例えば細胞傷害性アッセイにより決定することができる。「有効性」又は「インビボ有効性」は、本明細書で使用されるとき、例えば標準化されたＮＣＩ奏効基準を使用した、本発明の医薬組成物又は製剤による治療の奏効性を指す。本発明の医薬組成物を使用した治療の成功又はインビボ有効性は、その意図した目的に関する組成物の有効性、即ち組成物がその所望の効果を生じさせる能力、即ち病的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇を指す。インビボ有効性は、限定されないが、白血球数、分画、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含め、それぞれの疾患実体についての確立された標準方法によってモニタされ得る。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準方法が用いられ得る。更に、コンピュータ支援断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影、陽電子放射断層撮影スキャン、リンパ節生検／組織像及び他の確立された標準方法が用いられ得る。
本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の大きい課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的で、薬物候補の薬物動態プロファイル、即ち特定の薬物が所与の病態を治療する能力に影響を及ぼす薬物動態パラメータのプロファイルを確立し得る。薬物が特定の疾患実体を治療する能力に影響する薬物の薬物動態パラメータとしては、限定されないが、半減期、分布容積、肝臓初回通過代謝及び血清結合度が挙げられる。所与の薬物剤の有効性には、上述のパラメータの各々が影響し得る。
「半減期」は、ある分量がその初期値の半分に減るまでに要する時間である。医科学では、人体における物質又は薬物の半減期を指す。医学的に関連して、半減期とは、物質／薬物がその活性、例えば薬理学的、生理学的又は放射線学的活性の２分の１を失うまでにかかる時間を指し得る。半減期は、薬物又は物質（例えば、本発明の抗体コンストラクト）の血漿中／血清中濃度がその定常状態値の２分の１に達するまでにかかる時間も表し得る（「血清半減期」）。典型的には、投与された物質／薬物の排出又は除去は、代謝、排泄などの生物学的過程を通じた、また腎臓及び肝臓の機能も関わる体の清浄化作用を指す。「初回通過代謝」は、薬物が循環に達する前にその濃度が低下する薬物代謝現象である。これは、吸収過程で失われた薬物の割合である。従って、「肝臓初回通過代謝」とは、薬物が肝臓との最初の接触で、即ち肝臓を通るその初回通過時に代謝される傾向を意味する。「分布容積」（ＶＤ）は、薬物が血漿でなく、むしろ生体組織に分布する程度を意味し、高いＶＤほど組織分布量が多いことを示す。薬物の滞留は、細胞内及び細胞外間隙、組織及び器官など、体の様々なコンパートメントにわたって起こり得る。「血清結合程度」は、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用してそれに結合することにより薬物の生物学的活性の低下又は消失につながる傾向を意味する。
薬物動態パラメータには、投与された所与の量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、遅延時間（Ｔ ｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度及び／又はＣｍａｘも含まれる。「バイオアベイラビリティ」は、薬物／物質の投与用量のうち、体循環（血液コンパートメント）に達する割合を指す。薬物治療が静脈内投与される場合、そのバイオアベイラビリティは、１００％と見なされる。しかしながら、薬物治療が他の経路（経口など）で投与される場合、そのバイオアベイラビリティは、概して低下する。「遅延時間」は、薬物の投与から血中又は血漿中でそれが検出される及び測定可能となるまでの時間遅延を意味する。Ｃｍａｘは、薬物がその投与後（及び２回目の用量の投与前）に実現する最高血漿濃度である。Ｔｍａｘは、Ｃｍａｘに達したときの時間である。その生物学的効果に必要な薬物の血中又は組織内濃度に達するまでの時間は、あらゆるパラメータの影響を受ける。異種間特異性を呈する抗体コンストラクトの薬物動態パラメータは、上記に概説したとおり及び例えばＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）に示されるとおり、前臨床動物試験において非チンパンジー霊長類で決定し得る。
一実施形態は、疾患、好ましくは新生物の予防、治療又は改善における使用のための本発明の抗体コンストラクト（又は本発明の方法によって作製される抗体コンストラクト）を提供する。別の実施形態は、疾患、好ましくは新生物の予防、治療又は改善のための医薬の製造における本発明の抗体コンストラクトの（又は本発明の方法によって作製される抗体コンストラクトの）使用を提供する。また、本発明の抗体コンストラクト（又は本発明の方法によって作製される抗体コンストラクト）を、それを必要としている対象に投与するステップを含む、疾患、好ましくは新生物の予防、治療又は改善方法を提供することも想定される。用語「必要としている対象」、「患者」又は「治療を必要としている」それらの者には、既に疾患を有するそれらの者、並びに疾患を予防すべきそれらの者が含まれる。これらの用語には、予防的治療又は療法的治療のいずれを受けるヒト及び他の哺乳類対象も含まれる。
本発明の抗体コンストラクト及び本明細書に記載される製剤／医薬組成物は、それを必要としている患者における本明細書に記載されるとおりの医学的状態の治療、改善及び／又は予防において有用である。用語「治療」は、療法的治療及び予防的又は防御的手段の両方を指す。治療には、疾患、疾患の症状又は疾患に罹り易い素因を根治し、治癒し、軽減し、緩和し、改変し、修復し、改善し、向上させるか、又はそれに作用することを目的とした、本明細書に記載されるとおりの疾患／障害、かかる疾患／障害の症状又はかかる疾患／障害に罹り易い素因を有する必要としている患者又は対象の体、又は摘出組織、又は細胞への抗体コンストラクト／医薬組成物の適用又は投与が含まれる。用語「改善」は、本明細書で使用されるとき、患者の疾患状態が、それを必要としているかかる患者又は対象への本発明に係る抗体コンストラクトの投与によって何らか向上することを指す。かかる向上は、患者の疾患の進行の減速若しくは停止として、及び／又は疾患症状の重症度の低下、無疾患症状期間の頻度若しくは持続時間の増加又は疾患に起因する機能障害若しくは能力障害の予防として見られ得る。用語「予防」は、本明細書で使用されるとき、それを必要としている対象への本発明に係る抗体コンストラクトの投与によって本明細書に指定されるとおりの疾患の発生又は再発が回避されることを意味する。
用語「疾患」は、本明細書に記載される抗体コンストラクト又は医薬組成物による治療から利益を受け得る任意の病態を指す。これには、哺乳類において問題の疾患の素因になる病理学的状態を含めた慢性及び急性障害又は疾患が含まれる。疾患は、好ましくは、新生物、がん又は腫瘍である。疾患、新生物、がん又は腫瘍は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２陽性であり、即ち、それは、ＣＬＤＮ１８．２の発現又は過剰発現によって特徴付けられる。
「新生物」は、必ずというわけではないが、通常、腫瘤を形成する組織の異常な成長である。腫瘤も形成する場合、それは、一般に「腫瘍」と称される。脳腫瘍では、細胞の無制御な分裂とは、新生物の腫瘤のサイズが増加することを意味し、頭蓋内腔などの閉鎖空間では、腫瘤が脳の空間に浸潤してそれを押しのけ、脳組織の圧迫及び頭蓋内圧の上昇及び脳実質の破壊につながるため、これは、急速に問題化する。新生物又は腫瘍は、良性、潜在的に悪性（前がん性）又は悪性（がん性）であり得る。悪性新生物／腫瘍は、一般にがんと呼ばれる。これは、通常、周囲組織に浸潤してそれを破壊し、且つ転移を形成することもあり、即ち体の他の部分、組織又は器官に広がり得る。「原発腫瘍」は、腫瘍進行が始まり、進行してがん性腫瘤をもたらした解剖学的部位で成長する腫瘍である。例えば、脳腫瘍は、脳内で異常細胞が形成されると起こる。多くのがんは、その原発部位で発達するが、次に体の他の部分（例えば、組織及び器官）に転移するか又は広がる。こうした更なる腫瘍は、「二次性腫瘍」である。多くのがんは、体の他の部分に広がった後でもその原発部位にちなんで呼ばれ続ける。
リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的上、これらも用語「腫瘍」又は「がん」に包含される。本発明の目的上、用語「新生物」、「腫瘍」及び「がん」は、同義的に使用され得、これらは、原発腫瘍／がん及び二次性腫瘍／がん（又は「転移」）の両方並びに腫瘤形成新生物（腫瘍）及びリンパ系新生物（リンパ腫及び白血病など）及びまたＭＲＤも含む。
用語「微小残存病変」（ＭＲＤ）は、がん治療後、例えば患者が寛解状態（疾患の症状又は徴候なし）にあるときの患者に残る少数の残存がん細胞の存在のエビデンスを指す。残っているがん細胞が極めて少数であれば、がんの評価又は検出に用いられる標準検査は、ＭＲＤを検出するのに感度が不十分であるため、通常、常法手段によって検出できない。最近では、フローサイトメトリー、ＰＣＲ及び次世代シーケンシングなど、極めて高感度の分子生物学的ＭＲＤ検査が利用可能である。これらの検査では、時に百万個の正常細胞中僅か１個のがん細胞ほどの組織試料中の最小限レベルのがん細胞を測定することができる。本発明との関連において、がんの「予防」、「治療」又は「改善」という用語は、ＭＲＤが検出されたか否かに関わらず、「ＭＲＤの予防、治療又は改善」も包含することが想定される。
本発明の一実施形態において、新生物、がん又は腫瘍は、限定されないが、消化管がん、卵巣がん及び肺がんを含む（又はそれからなる）群から選択される。本発明の一実施形態によれば、消化管がんは、胃がん又は胃のがん、食道がん、胃食道がん、膵がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される。本発明の別の実施形態によれば、卵巣がんは、ムチン性卵巣がんである。本発明の更なる実施形態によれば、肺がんは、非小細胞肺がんである。
本発明の抗体コンストラクトは、概して、数ある中でも特に、特定の投与経路及び投与方法のために、特定の投薬量及び投与頻度のために、特定の疾患の特定の治療のために、バイオアベイラビリティ及び持続性の範囲と共に設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容可能な濃度で製剤化される。従って、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達のために設計され得る。本発明との関連において、投与経路としては、限定されないが、局所経路、経腸経路及び非経口経路が挙げられる。
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥された材料は、投与前に初めに適切な液体で再構成される。凍結乾燥された材料は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はタンパク質が凍結乾燥前にあったのと同じ製剤で再構成され得る。本発明の医薬組成物及び抗体コンストラクトは、非経口投与、例えば静脈内送達（例えば、注射又は注入による）に特に有用である。医薬組成物は、医療装置を使用して投与され得る。医薬組成物の投与用医療装置の例については、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
本発明の組成物は、例えば、用量漸増試験で決定することのできる好適な用量で対象に投与し得る。上記に示されるとおり、本明細書に記載されるとおりの異種間特異性を呈する本発明の抗体コンストラクトも、有利には、非チンパンジー霊長類での前臨床試験において使用することができる。投薬量レジメンは主治医及び臨床学的因子によって決定されることになる。医学分野で周知のとおり、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する詳細な化合物、性別、投与時間及び経路、全般的な健康及び同時に投与される他の薬物を含め、多くの要因に依存する。
「有効用量」は、所望の効果を実現するか又は少なくとも部分的に実現するのに十分な治療剤の量である。「治療有効用量」は、疾患に罹患している患者の疾患及びその合併症、徴候及び症状を根治するか又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量である。この使用に有効な量又は用量は、治療しようとする疾患（対象疾患）、送達される抗体コンストラクト、治療の状況及び目的、疾患の重症度、前回の療法、患者の病歴及び治療剤に対する奏効、投与経路、患者のサイズ（体重、体表）及び／又は状態（年齢及び全般的な健康）及び患者自身の免疫系の全体的状態に依存することになる。最適な治療効果を得るため、適切な用量が主治医の判断に基づいて調整され得る。
本発明の抗体コンストラクトの治療有効量は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、無疾患症状期間の頻度若しくは持続時間の増加又は疾患に起因する機能障害若しくは能力障害の予防をもたらす。ＣＬＤＮ１８．２発現腫瘍の治療では、本発明の抗体コンストラクトの治療有効量は、好ましくは、未治療の患者と比べて腫瘍細胞成長を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％阻害する。化合物が腫瘍成長を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測指標となる動物モデルでも評価され得る。
更なる実施形態において、本発明は、本発明の抗体コンストラクト、本発明の方法によって作製される抗体コンストラクト、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。本発明との関連において、用語「キット」は、収容箱、容器又は他のものに一緒に包装された２つ以上の構成要素 － その１つは、本発明の抗体コンストラクト、医薬組成物、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞に対応する － を意味する。従って、キットは、単一ユニットとして販売することのできる、ある種の目的を達成するのに十分な製品及び／又は用具の組として記載され得る。
本発明のキットの更なる構成要素は、免疫チェックポイント経路のタンパク質（ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４など）又は共刺激免疫チェックポイント受容体（４－１ＢＢなど）に結合する薬剤、好ましくは抗体又は抗体コンストラクトであることが想定される。こうした薬剤は、本明細書において上記に更に詳細に記載される。一実施形態によれば、キットは、本発明の抗体コンストラクトと、ＰＤ－１に結合する抗体又は抗体コンストラクトとを含む。本目的上有用な抗ＰＤ－１結合タンパク質は、例えば、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０１３２０５号明細書に詳細に記載される。特定の実施形態において、キットは、構成要素の同時及び／又は逐次投与を可能にする。
キットは、投与に適切な投薬量の本発明の抗体コンストラクト又は医薬組成物（上記を参照されたい）を入れる任意の適切な形状、サイズ及び材料（好ましくは防水性、例えばプラスチック又はガラス）の１つ以上の容器（バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグなど）を含み得る。キットには、更に、使用指図（例えば、小冊子又は取扱説明書の形式）、シリンジ、ポンプ、注入器など、本発明の抗体コンストラクト又は医薬組成物の投与手段、本発明の抗体コンストラクトの再構成手段及び／又は本発明の抗体コンストラクトの希釈手段が入っていてもよい。
本発明は、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットには、乾燥／凍結乾燥した抗体コンストラクト又は医薬組成物を含む第１の容器及び水性製剤を含む第２の容器が入っていてもよい。本発明の特定の実施形態では、単一チャンバ及び複数チャンバを備えたプレフィルドシリンジが入ったキットが提供される。
本発明は、以下の項目に関する。
項目１．標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２（好ましくは配列番号１を有する）に結合する第１のドメインと、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む抗体コンストラクト。
項目２．第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループ（ループ１）に結合し、ループは、好ましくは、配列番号２を有する、項目１に係る抗体コンストラクト。
項目３．項目１又は２に係る抗体コンストラクトであって、
・標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインと、
・Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２のドメインと
を含み、
第１のドメインは、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと同じＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する、抗体コンストラクト。
項目４．抗体コンストラクトは、標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合するドメインであって、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域；
ｃ）配列番号１２７に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるとおりのＶＬ領域；又は
ｄ）配列番号１３９に示されるとおりのＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるとおりのＶＬ領域
を含むドメインを含む抗体又は抗体コンストラクトと結合に関して競合する、項目１～３のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目５．抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号２２に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号２４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号２３に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合しない、項目１～４のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目６．抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１４に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体及び／又はアミノ酸配列、配列番号１５を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合し、任意選択で、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２０及び２１に示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上の１つ以上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体にも結合するが、配列番号１８に示されるとおりのアミノ酸配列を有する標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２突然変異体に結合しない、項目１～５のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目７．抗体コンストラクトの第１のドメインは、標的細胞の表面上のヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、ここで、ヒトＣＬＤＮ１８．２の５６位のＧｌｕ（Ｅ）は、第１のドメインの結合に必須であり、ヒトＣＬＤＮ１８．２の４２位のＡｌａ（Ａ）及び／又は４５位のＡｓｎ（Ｎ）は、第１のドメインの結合に必須でない、項目１～６のいずれか１つに係る抗体コンストラクト；及び／又は
項目８．抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号２６６に示されるとおりのアミノ酸配列を含むが、配列番号２６５に示されるとおりのアミノ酸配列を含まず、任意選択で配列番号２６７に示されるとおりのアミノ酸配列も含まないＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する、項目１～７のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目９．第２のドメインは、ヒトＣＤ３ε及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３εに結合する、項目１～８のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目１０．項目１～９のいずれか１つに係る抗体コンストラクトであって、
ａ）抗体コンストラクト、第１のドメイン及び／又は第２のドメインは、ヒト又はヒト化であり、
ｂ）抗体コンストラクトは、単鎖抗体コンストラクトであり、
ｃ）第１のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
ｄ）第２のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
ｅ）第１のドメイン及び第２のドメインは、リンカー、好ましくはペプチドリンカー、より好ましくはグリシン／セリンリンカーによって接続されており、及び／又は
ｆ）抗体コンストラクトは、Ｆｃベースのドメインなど、延長された血清半減期をもたらすドメインを含む、抗体コンストラクト。
項目１１．第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及び／又はＣＬＤＮ９に結合しないか又は有意に結合しない、項目１～１０のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目１２ 項目１～１１のいずれか１つに係る抗体コンストラクトであって、
ａ）ＣＬＤＮ１８．２（例えば、ｈｕ ＣＬＤＮ１８．２）に対する第１のドメインの親和性は、好ましくは、スキャッチャードアッセイなどの細胞ベースのアッセイで測定したとき、≦１００ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ又は≦２０ｎＭであり；
ｂ）ＣＤ３（例えば、ｈｕ ＣＤ３、例えばｈｕ ＣＤ３ε）に対する第２のドメインの親和性は、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定したとき、≦１００ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ又は≦１０ｎＭであり；及び／又は
ｃ）抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２陽性標的細胞（ＳＮＵ－６０１、ＳＮＵ－６２０又はＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞など）及びエフェクター細胞としての刺激したエンリッチ（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は刺激されていない（ヒト）末梢血単核球による細胞傷害性アッセイで測定したとき、≦５００ｐＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２８０ｐＭ、≦２６０ｐＭ、≦２５０ｐＭ、≦２４０ｐＭ、≦２２０ｐＭ、≦２００ｐＭ、≦１８０ｐＭ、≦１６０ｐＭ、≦１５０ｐＭ、≦１４０ｐＭ、≦１２０ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１５ｐＭ、≦１０ｐＭ又は≦５ｐＭである、抗体コンストラクト。
項目１３．第１のドメインは、
ａ）配列番号１２１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３；及び
ｂ）配列番号１３３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、並びに配列番号１３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、項目１～１２のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目１４．第１のドメインは、配列番号１２７又は配列番号１３９に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む、項目１～１３のいずれか１つに係る抗体コンストラクト。
項目１５．第１のドメインは、配列番号１２８又は配列番号１４０に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む、項目１～１４の１つに係る抗体コンストラクト。
項目１６．第１のドメインは、配列番号１２７＋１２８又は配列番号１３９＋１４０に示されるとおりのアミノ酸配列を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、項目１～１５の１つに係る抗体コンストラクト。
項目１７．第１のドメインは、配列番号１２９又は配列番号１４１に示されるとおりのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１～１６の１つに係る抗体コンストラクト。
項目１８．配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４３及び配列番号１４４に示されるものの群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか又はそれからなる、項目１～１７の１つに係る抗体コンストラクト。
項目１９．項目１～１８のいずれか１つに定義されるとおりの抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
項目２０．項目１９に定義されるとおりのポリヌクレオチドを含むベクター。
項目２１．項目１９に定義されるとおりのポリヌクレオチド又は項目２０に定義されるとおりのベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
項目２２．項目１～１８のいずれか１つに定義されるとおりの抗体コンストラクトを作製する方法であって、前記抗体コンストラクトの発現を許容する条件下において、項目２１に定義されるとおりの宿主細胞を培養することと、作製された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法。
項目２３．項目１～１８のいずれか１つに定義されるとおりの抗体コンストラクト又は項目２２の方法によって作製されるとおりの抗体コンストラクトを含む医薬組成物。
項目２４．疾患、好ましくは新生物、より好ましくはＣＬＤＮ１８．２陽性新生物の予防、治療又は改善における使用のための、項目１～１８のいずれか１つに係る抗体コンストラクト又は項目２２の方法によって作製される抗体コンストラクト。
項目２５．疾患又は新生物は、消化管がん、卵巣がん及び肺がんからなる群から選択される、項目２４に係る抗体コンストラクト。
項目２６．消化管がんは、胃がん、食道がん、胃食道がん、膵がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、項目２５に係る抗体コンストラクト。
項目２７．項目１～１８のいずれか１つに定義されるとおりの抗体コンストラクト、項目２２の方法によって作製される抗体コンストラクト、項目１９に定義されるとおりのポリヌクレオチド、項目２０に定義されるとおりのベクター及び／又は項目２１に定義されるとおりの宿主細胞を含むキット。
項目２８．免疫チェックポイント経路のタンパク質（ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４など）又は共刺激免疫チェックポイント受容体（４－１ＢＢなど）に結合する薬剤、好ましくは抗体又は抗体コンストラクトを更に含む、項目２３の医薬組成物又は項目２７のキット。
項目２９．治療用途、好ましくは疾患、好ましくは新生物、より好ましくはＣＬＤＮ１８．２陽性新生物の予防、治療又は改善における使用のための、項目２３又は２８の医薬組成物又は項目２７又は２８のキット。
ヒトＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２アミノ酸配列のアラインメントである。第１及び第２の細胞外ドメイン（＝細胞外ループ）並びにＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２との間で異なるアミノ酸位置を強調表示する。細胞外ループ１の範囲内では、ＣＬＤＮ１８．２とＣＬＤＮ１８．１とは、８つの位置で異なる。実施例１も参照されたい。 実施例２のエピトープマッピング解析のために作成したＣＬＤＮ１８．２コンストラクト（キメラ／点突然変異）を示す。また、ヒトＣＬＤＮ１８．１ループ１とヒトＣＬＤＮ１８．２ループ１との間の配列アラインメントも示し、これらの２つの分子で異なる８つの位置Ｐ１～Ｐ８を強調表示する。実施例１も参照されたい。 エピトープマッピング解析の結果である（実施例２を参照されたい）。この図は、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞並びにｈｕ ＣＬＤＮ１８．１、ｈｕ ＣＬＤＮ１８．２、ｈｕ ＣＬＤＮ６及びｈｕ ＣＬＤＮ９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を示す（左側）。右側では、この図は、３個の異なるキメラｈｕＣＬＤＮ１８．２コンストラクトをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ループ２全体（ＥＣＬ２、Ｅ２）のアミノ酸配列をヒトＣＬＤＮ９由来の配列と交換し、領域Ｅ２Ａ及びＥ２ＢをヒトＣＬＤＮ６の対応配列と交換した。抗体／抗体コンストラクトは、全て５μｇ／ｍｌの濃度で試験した。 エピトープマッピング解析の結果である（実施例２を参照されたい）。この図は、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞並びにｈｕ ＣＬＤＮ１８．１、ｈｕ ＣＬＤＮ１８．２、ｈｕ ＣＬＤＮ６及びｈｕ ＣＬＤＮ９をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。更に、この図は、指示される位置Ｐ１～Ｐ８に１、２又は３つの点突然変異を有する１１個の異なるｈｕ ＣＬＤＮ１８．２コンストラクトをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（更なる詳細については、実施例１も参照されたい）並びに４個の異なるキメラｈｕ ＣＬＤＮ１８．２コンストラクトをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。ループ２全体（ＥＣＬ２、Ｅ２）のアミノ酸配列をヒトＣＬＤＮ９由来の配列と交換し、領域Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｄ及びＥ１ＣをヒトＣＬＤＮ６の対応配列と交換した（更なる詳細については、実施例１も参照されたい）。単一特異抗体は、全て５μｇ／ｍｌの濃度で試験する一方、ＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２二特異性抗体コンストラクトは、２０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。第１行：インハウスα－ｈｕ ＣＬＤＮ－１８．１第２行：インハウスα－ｈｕ ＣＬＤＮ－１８．２第３行：α－ｈｕ ＣＬＤＮ－６（Ｒ＆Ｄ；ＭＡＢ３６５６）第４行：α－ｈｕ ＣＬＤＮ－９（ＡＢＩＮ１７２０９１７）第５行：ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ第６行：ＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ第７行：ＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ第８行：ＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ 実施例５に記載されるＦＡＣＳアッセイの結果である。 実施例６に記載されるＦＡＣＳアッセイの結果である。 実施例７．４に記載されるＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイの結果である。試験した６つの細胞株全てにおいて（５つは、天然の発現体である細胞株及びｈｕ ＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞）、本発明の抗体コンストラクト（ＣＬ－１及びＣＬ－２）は、異なるＣＬＤＮ１８．２エピトープ（ＣＬ－３及びＣＬ－４）に結合する対照コンストラクトと比較して有意に高いＥＣ５０値を示した。 実施例７．４に記載されるＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイの結果である。試験した６つの細胞株全てにおいて（５つは、天然の発現体である細胞株及びｈｕ ＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞）、本発明の抗体コンストラクト（ＣＬ－１及びＣＬ－２）は、異なるＣＬＤＮ１８．２エピトープ（ＣＬ－３及びＣＬ－４）に結合する対照コンストラクトと比較して有意に高いＥＣ５０値を示した。 ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの抗腫瘍活性（平均腫瘍容積と平均値の標準誤差（ＳＥＭ））である。実施例１３を参照されたい。 ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの抗腫瘍形成活性（平均腫瘍容積と平均値の標準誤差（ＳＥＭ））である。実施例１４を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の言及が含まれる。従って、例えば、「試薬」への言及には、かかる種々の試薬の１つ以上が含まれ、「方法」への言及には、本明細書に記載される方法に修正又は置換され得る当業者に公知の均等なステップ及び方法への言及が含まれる。
特に指示されない限り、一連の要素の前にある用語「少なくとも」は、その一連の中にある全ての要素に言及しているものと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、又はルーチンに過ぎない実験を用いてそれを確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明に包含されることが意図される。
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの箇所で使用されるにしても、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素のあらゆる他の組み合わせ」の意味を含む。
用語「約」又は「近似的に」は、本明細書で使用されるとき、所与の値又は範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内及び最も好ましくは±５％以内を意味する。これには具体的な値も含まれ、例えば「約５０」は、値「５０」を含む。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特に要求されない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などの変化形は、記載されている完全体又はステップ又は完全体若しくはステップ群を含むが、任意の他の完全体又はステップ又は完全体若しくはステップ群を除外しないことを含意するものと理解されるであろう。本明細書において使用されるとき、用語「含んでいる」は、用語「含有している」、又は「包含している」、又は時に本明細書において使用されるときに用語「有している」を代わりに用いることができる。
本明細書において使用されるとき、「～からなる」は、クレーム要素に指定されていないいかなる要素、ステップ又は成分も除外する。本明細書において使用されるとき、「～から本質的になる」は、クレームの基本的な新規の特徴に事実上影響を与えない材料又はステップを除外しない。
本明細書における各例において、用語「含む」、「～から本質的になる」及び「～からなる」のいずれも他の２つの用語の一方に置き換えられ得る。
上述の説明及び以下の例は、例示的構成を提供するが、しかし、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、技法、プロトコル、材料、試薬、物質等に限定されず、従って異なり得ることが理解されなければならない。本明細書で使用される用語は、詳細な実施形態を説明することを目的としているに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。本発明の態様は、独立クレームに提供される。本発明の一部の任意選択の特徴は、従属クレームに提供される。
以上であれ以下であれ、本明細書の本文全体を通じて引用される全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者仕様書、説明書等を含む）は、本明細書によって全体として参照により援用される。本明細書のいかなる事項も、先行発明であるという理由でかかる開示に本発明が先行する資格がないことを認めるものとして解釈されてはならない。参照によって援用される資料が本明細書と矛盾するか又は整合性がない限り、いかなるかかる資料にも本明細書が優先するものとする。
例示目的で提供されるに過ぎない以下の実施例から、本発明及びその利点の更なる理解が得られるであろう。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定することを意図されず、且つそのように解釈されてはならない。
実施例１
ＣＬＤＮ１８．２突然変異を発現するＣＨＯ細胞の作成
エピトープマッピングを目的として、ＣＬＤＮ１８．２のＥ１（細胞外ループ１；ＥＣＬ１、配列番号２）を４つのサブドメイン（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｃ及びＥ１Ｄ）に分け、Ｅ２（細胞外ループ２；ＥＣＬ２、配列番号３）を２つのサブドメイン（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）に分けた。ヒトＣＬＤＮ１８．２のそれぞれのエピトープ領域（ループ／ドメイン又はサブドメイン）（Ｅ１、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｃ、Ｅ１Ｄ、Ｅ２、Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）のアミノ酸配列をヒトＣＬＤＮ６の対応配列と交換し、但し、２つは、例外とし（図１及び図２を参照されたい）：Ｅ２は、ヒトＣＬＤＮ９由来の配列と交換し；及び突然変異Ｅ１Ｃを有するコンストラクト（ＣＬＤＮ１８．２ Ｅ１Ｃを対応ＣＬＤＮ６領域と交換）では、ＣＬＤＮ１８．２のＥ２もヒトＣＬＤＮ９由来の配列と交換した。後者は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＬＤＮ６－キメラの発現の検出手段としての役割を果たした。ＣＨＯ細胞における全てのキメラコンストラクトの発現をＦＡＣＳ分析で確認した（下記を参照されたい）。Ｅ１及びＥ１Ａキメラコンストラクトについて発現の証拠がなかったため、これらのコンストラクトは、エピトープマッピング解析に使用しなかった。従って、以下のコンストラクトが作成され、エピトープマッピングに使用した。
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ１Ｂ（ＣＬＤＮ６）→配列番号２２
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ１Ｃ（ＣＬＤＮ６）－Ｅ２（ＣＬＤＮ９）→配列番号２３
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ１Ｄ（ＣＬＤＮ６）→配列番号２４
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ２（ＣＬＤＮ９）→配列番号２５
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ２Ａ（ＣＬＤＮ６）→配列番号２６
ＣＬＤＮ１８．２－Ｅ２Ｂ（ＣＬＤＮ６）→配列番号２７
ヒトＣＬＤＮ１８．２－ＥＣＬ２及びヒトＣＬＤＮ１８．１－ＥＣＬ２のアミノ酸配列は、同一であるが、細胞外ループ１内において、ＣＬＤＮ１８．２とＣＬＤＮ１８．１とは、８つの位置（２９、３７、４２、４５、４７、５６、６５及び６９）が異なる。従って、追加的なＣＬＤＮ１８．２突然変異体を作成し、ＣＨＯ細胞で発現させ、ここでは、これらの８つのＣＬＤＮ１８．２位置「Ｐ１」～「Ｐ８」を個別に、或いは２又は３つの位置をまとめて、そのそれぞれのＣＬＤＮ１８．１対応物に交換した。従って、以下のコンストラクトが作成された。
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ１－ＣＬＤＮ１８．１（Ｑ２９Ｍ突然変異）→配列番号１１
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ２－ＣＬＤＮ１８．１（Ｎ３７Ｄ突然変異）→配列番号１２
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ１／Ｐ２－ＣＬＤＮ１８．１（Ｑ２９Ｍ／Ｎ３７Ｄ突然変異）→配列番号１３
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ３－ＣＬＤＮ１８．１（Ａ４２Ｓ突然変異）→配列番号１４
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ４－ＣＬＤＮ１８．１（Ｎ４５Ｑ突然変異）→配列番号１５
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ５－ＣＬＤＮ１８．１（Ｑ４７Ｅ突然変異）→配列番号１６
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ３／Ｐ４／Ｐ５－ＣＬＤＮ１８．１（Ａ４２Ｓ／Ｎ４５Ｑ／Ｑ４７Ｅ突然変異）→配列番号１７
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ６－ＣＬＤＮ１８．１（Ｅ５６Ｑ突然変異）→配列番号１８
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ７－ＣＬＤＮ１８．１（Ｇ６５Ｐ突然変異）→配列番号１９
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ８－ＣＬＤＮ１８．１（Ｌ６９Ｉ突然変異）→配列番号２０
ＣＬＤＮ１８．２－Ｐ７／Ｐ８－ＣＬＤＮ１８．１（Ｇ６５Ｐ／Ｌ６９Ｉ突然変異）→配列番号２１
上記のコンストラクトを発現するＣＨＯ細胞並びに対照としてのｈｕ－ＣＬＤＮ１８．２、ｈｕ－ＣＬＤＮ１８．１、ｈｕ－ＣＬＤＮ６及びｈｕ－ＣＬＤＮ９（配列番号１、４、９及び１０）を発現するＣＨＯ細胞を作成するため、それぞれのコード配列をｐＥＦ－ＤＨＦＲと称されるプラスミド（ｐＥＦ－ＤＨＦＲについては、Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１）１４１－１５０に記載されている）にクローニングした。クローニング手順は、全て標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））に従って行った。各コンストラクトについて、Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，５３７－５６６により記載されるとおり、対応するプラスミドを真核生物発現のためのＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
ＣＨＯ細胞上での上記のコンストラクトの発現は、それぞれＣＬＤＮ１８．２（インハウスモノクローナル抗ｈｕ ＣＬＤＮ１８．２抗体）、ＣＬＤＮ１８．１（インハウスモノクローナル抗ｈｕ ＣＬＤＮ１８．１抗体）、ＣＬＤＮ６（Ｒ＆Ｄマウス抗ヒトＣＬＤＮ６モノクローナル抗体ＭＡＢ３６５６）及びＣＬＤＮ９（ラット抗ヒトＣＬＤＮ９モノクローナル抗体ＡＢＩＮ１７２０９１７）に対する抗体を５μｇ／ｍｌの濃度で使用して、ＦＡＣＳアッセイで確認した。陰性対照として、細胞を最初の抗体の代わりにアイソタイプ対照抗体（ＢＤ ５５３４５４／Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ００４１／Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ００６１）とインキュベートした。結合したモノクローナル抗体を二次抗マウス／抗ラット／抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－γ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １１５－１１６－０７１／１１２－１１６－０７１／１０９－１１６－０９８）で検出した。試料は、フローサイトメトリーによって測定した。
実施例２
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクトのエピトープマッピング
実施例１に記載されるコンストラクトをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を２０μｇ／ｍｌの濃度の精製ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトで染色した。結合した抗体コンストラクトを抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－γ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；１：１００）で検出した。抗体は、全てＰＢＳ／２％ＦＣＳで希釈した。陰性対照として、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳとインキュベートし、続いて抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－γ－ＰＥとインキュベートした。試料は、フローサイトメトリーによって測定した。
エピトープマッピング解析の結果を図３及び図４に示す。特定のＣＬＤＮ１８．２キメラ又は突然変異を発現する細胞についてＦＡＣＳシグナルの喪失が観察されると、それぞれのＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、そのＣＬＤＮ１８．２キメラ又は突然変異分子において交換されたエピトープ（ループ／ドメイン／サブドメイン）又は特定のアミノ酸に結合すると見なされる。換言すれば、そのエピトープ領域又はアミノ酸は、分析されたＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの結合に必要である。それぞれの標的が正しく発現することの実証に使用した対照抗体に加えて、以下のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトをエピトープマッピング解析で特別に試験した。
ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ（配列番号１３２）
ＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ（配列番号１４４）
ＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ（配列番号１４９）
ＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ（配列番号１５４）
ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃは、本発明に係る抗体コンストラクトである一方、ＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃは、国際公開第２０１４／０７５７８８号パンフレットのそれぞれ配列番号８＋１５及び配列番号６＋１１として開示される抗ＣＬＤＮ１８．２ ＶＨ及びＶＬ領域を有する。
図４に示されるとおり、ＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトは、ＣＬＤＮ１８．２へのその特異的結合に明らかに位置Ｐ３（Ａ４２）、Ｐ４（Ｎ４５）及びＰ６（Ｅ５６）が必要である。位置Ｐ４は、Ｅ１Ｂと称されるサブドメイン内にあり、位置Ｐ６は、Ｅ１Ｃと称されるサブドメイン内にある。結果的に及び同様に、これらのサブドメインをＣＬＤＮ６対応配列と交換すると、ＦＡＣＳシグナルの喪失につながる。これらの３つの位置がＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃによるＣＬＤＮ１８．２への結合に関連性があるという観察は、既発表の結果を裏付ける。ＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃと称される抗体コンストラクトは、極めて類似した結合パターンを有する（図４を参照されたい）。
対照的に、抗体コンストラクトＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃの両方は、ＣＬＤＮ１８．２へのその特異的結合に明らかに位置Ｐ６（Ｅ５６）が必要である。しかしながら、他の位置、詳細にはＰ３及びＰ４の交換は、ＣＬＤＮ１８．２へのＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ又はＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃの結合に何ら影響がないように見える。この観察と一致して、サブドメインＥ１Ｃ（これには位置Ｐ６がある）をＣＬＤＮ６対応配列に交換すると、ＦＡＣＳシグナルの喪失につながる － しかし、Ｅ１Ｂ又はＥ１Ｄを交換しても喪失はない －。従って、図４に示すエピトープマッピング結果は、ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃがＣＬＤＮ１８．２内の同じエピトープに結合し、このエピトープがＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃのものと異なることを示している。
実施例３
Ｂｉａｃｏｒｅに基づくヒト及びカニクイザルＣＤ３及びＦｃＲｎに対する親和性の決定
組換えヒト／マカクＣＤ３－ＥＣＤ（ＥＣＤ＝細胞外ドメイン）融合タンパク質をニワトリアルブミンと共に使用してＢｉａｃｏｒｅ分析実験を実施し、本発明の抗体コンストラクトの標的結合を決定した。
詳細には、製造者のマニュアルに従って酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５を使用して約６００～８００ＲＵのそれぞれの組換え抗原をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトを以下の濃度の希釈系列でロードした：ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に希釈した５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１３ｎＭ。流速は、３分間３０μｌ／分とし、次に再びＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液を３０μｌ／ｍｌの流速で８分～２０分間加えた。１０ｍＭグリシン １０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ１．５溶液を使用してチップの再生処理を実施した。データセットは、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアを使用して分析した。一般に、２つの独立した実験を実施した。
本発明に係るＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ヒトＣＤ３に対してナノモル濃度範囲の高い親和性を示した。マカクＣＤ３への結合は、均衡し、これも同様の範囲の親和性を示した。親和性値及び親和性ギャップ計算値を表２に示す。
Figure 0007577435000002
同様に、ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ、ＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ、ＣＬ－３×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－４×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃと称されるコンストラクトについて、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより、ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎへの均衡した結合が確認された。
実施例４
標的抗原陽性細胞上のヒト及びマカクＣＬＤＮ１８．２に対する親和性のスキャッチャードベース分析
ヒト又はマカクＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの親和性をスキャッチャード分析によって決定した。この分析のため、一価検出系を用いてそれぞれの細胞株に対するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの一価結合を正確に決定する飽和結合実験を実施した。
ヒトＣＬＤＮ１８．２を組換え発現するＣＨＯ細胞株の２×１０４細胞を、それぞれの抗体コンストラクトの１００～２００ｎＭから始まる５０μｌの希釈系列（１：２で１２の希釈物）と共に（飽和に達するまで）それぞれインキュベートし、続いて撹拌下に４℃で１６時間インキュベートし、１回の残留物洗浄ステップを行った。次に、細胞を更に１時間、３０μｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（商標）Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）溶液と共にインキュベートした。１回の洗浄ステップ後、細胞を３．５％ホルムアルデヒド含有１５０μｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、更に１５分間インキュベートし、遠心し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳソフトウェアで分析した。データは、各々トリプリケートを用いた２つの独立した実験セットから生成した。それぞれの１部位特異的結合評価を計算して最大結合（Ｂｍａｘ）を推定した。それぞれのＫＤを反映して最大半量結合時における抗体コンストラクトの濃度を決定した。トリプリケート測定の値が双曲線として及びＳ字形曲線としてプロットされ、最小結合から最適結合までの適切な濃度範囲が示された。
表３に示す値は、抗体コンストラクト毎に２つの独立した実験から得られた。細胞ベースのスキャッチャード分析により、本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する親和性がナノモル濃度であり、且つ － ヒト及びマカク細胞外ドメインの配列同一性に起因して － １のカニクイザル／ヒト種間親和性ギャップを呈することが確認された。
Figure 0007577435000003
同じ条件下で実施した別個のスキャッチャードアッセイにおいて、同じ条件下でＣＬ－２×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃについて１１．１３±２．７２のヒトＣＬＤＮ１８．２に対する細胞ベースの親和性が測定された。
実施例５
ＣＬＤＮ１８．２及びヒト／カニクイザルＣＤ３発現細胞への結合の確認
ヒトＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ３並びにカニクイザルＣＤ３への結合を確認するため、以下を使用して本発明の抗体コンストラクトをフローサイトメトリーにより試験した。
・ヒトＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、
・ＣＤ３発現ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ－ａｌｌ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ４８３）、及び
・カニクイザルＣＤ３発現Ｔ細胞株ＬｎＰｘ４１１９
フローサイトメトリーのため、それぞれの細胞株の２００，０００細胞を５μｇ／ｍｌの濃度の精製抗体コンストラクトと共に４℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、Ｆｃドメインを有する結合した抗体コンストラクトをヤギ抗ヒトＦｃ－γ－ＰＥ（１：１００）によって４℃で３０分間検出した。ｈｉｓタグを有する抗体コンストラクトをＣＤ３結合部分に特異的なインハウスマウス抗体によって検出し、続いてヤギ抗マウスＦｃ－γ－ＰＥ（１：１００）によって４℃で３０分間検出した。試料は、フローサイトメトリーによって測定した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した。
結果は、図５に示す。本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ヒトＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を染色した。ＣＤ３を発現するヒト及びカニクイザルＴ細胞株も抗体コンストラクトによって認識された。非トランスフェクトＣＨＯ細胞の染色はなく、及び陰性対照の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトによるＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞の染色はなかった。
実施例６
ヒトＣＬＤＮ１８．２パラログへの結合がないことの確認
ヒトＣＬＤＮ１８．２パラログのＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９をＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。本例で使用されるとおりのパラログの配列は、配列番号４～１０に示される。ＦＡＣＳ分析でそれぞれのパラログに特異的な抗体によってタンパク質発現が確認された。
ＣＬＤＮ１：ラット－抗ヒト（５μｇ／ｍｌ最終）ストック：１００μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４６１８
ＣＬＤＮ２：インハウスマウスＡｂ（１：１００～２００）
ＣＬＤＮ３：マウス－抗ヒト（５μｇ／ｍｌ最終）ストック：５００μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４６２０
ＣＬＤＮ４：マウス－抗ヒト（５μｇ／ｍｌ最終）ストック：５００μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４２１９
ＣＬＤＮ６：マウス－抗ヒト（５μｇ／ｍｌ最終）ストック：５００μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ３６５６
ＣＬＤＮ９：ラット－抗ヒト（５μｇ／ｍｌ最終）ストック：２ｍｇ／ｍｌ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ、ＡＢＩＮ１７２０９１７
ＣＬＤＮ１８．１：インハウスモノクローナルマウスＡｂ（５μｇ／ｍｌ最終）
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を４℃で６０分間にわたって５μｇ／ｍｌの濃度のそれぞれの抗体（上記を参照されたい）、続いてそれぞれのＰＥコンジュゲート抗体ヤギ－抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ－γ断片ＰＥコンジュゲート（１：１００）、Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－１１６－０７１又はヤギ－抗ラットＩｇＧ、Ｆｃ－γ断片ＰＥコンジュゲート（１：１００）Ｊａｃｋｓｏｎ、１１２－１１６－０７１と共にインキュベートした。
実施例５に記載されるとおりフローサイトメトリーアッセイを実施した。結果は、図６に示す。この分析により、本アッセイで試験した本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、ヒトＣＬＤＮ１８．２パラログと交差反応しないことが確認された。
実施例７
細胞傷害活性
エフェクターＴ細胞をＣＬＤＮ１８．２発現標的細胞に対してリダイレクトする本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力について、種々のインビトロ細胞傷害性アッセイで分析した。
・刺激したヒトＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対してリダイレクトするＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力を４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイで測定した。
・マカクＴ細胞株をヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞に対してリダイレクトするＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力を４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイで測定した。
・刺激されていないヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞をヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞にリダイレクトするＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力を（ヒトＣＬＤＮ１８．１トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した陰性対照と併せて）４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイで測定した。
・刺激されていないヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞をＳＮＵ－６０１又はＳＮＵ－６２０などのＣＬＤＮ１８．２陽性ヒト胃がん株に対してリダイレクトするＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの効力を４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイで測定した。
実施例７．１
刺激ヒトＴ細胞によるクロム遊離アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞をエンリッチした刺激Ｔ細胞を以下のとおり入手する：ペトリ皿（１４５ｍｍ直径）を１μｇ／ｍｌの最終濃度の市販の抗ＣＤ３特異抗体（ＯＫＴ３、オルソクローン）によって３７℃で１時間コーティングする。ＰＢＳによる１回の洗浄ステップによって未結合のタンパク質を除去する。３～５×１０７個のヒトＰＢＭＣを、プレコートしたペトリ皿にある安定化グルタミン／１０％ＦＣＳ／２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２含有の１２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０に加え、２日間刺激する。３日目、細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄する。２０Ｕ／ｍｌの最終濃度となるようにＩＬ－２を加え、細胞を上記と同じ細胞培養培地で再び１日培養する。Ｄｙｎａｌビーズを製造者のプロトコルに従って使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の枯渇によりＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をエンリッチする。
ヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ標的細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩの最終容積１００μｌ中１１．１ＭＢｑ ５１Ｃｒによって３７℃で６０分間標識する。続いて、標識した標的細胞を５ｍｌ ＲＰＭＩで３回洗浄し、次に細胞傷害性アッセイで使用する。アッセイは、９６ウェルプレートにおいて１０：１のＥ：Ｔ比で総容積２００μｌの補足ＲＰＭＩで実施する。０．０１～１μｇ／ｍｌの出発濃度の精製抗体コンストラクト及びその３倍希釈物を使用する。アッセイのインキュベーション時間は、１８時間である。細胞傷害性は、最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘの添加）と自発的溶解（エフェクター細胞なし）との差に関する上清中に遊離したクロムの相対値として決定される。測定は、全てクアドルプリケートで行う。上清中のクロム活性の測定は、ガンマカウンターで実施する。結果の分析は、適切なソフトウェアで行う。細胞傷害活性の比較には、分析プログラムによってシグモイド用量反応曲線から計算されたＥＣ５０値を使用する。
実施例７．２
刺激されていないヒトＰＢＭＣによるＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞の単離
エンリッチしたリンパ球調製物（バフィーコート）からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。ＰＢＭＣは、採血当日に調製した。Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心及び大量のダルベッコＰＢＳでの洗浄後、残った赤血球を赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、１００μＭ ＥＤＴＡ）とインキュベートすることによりＰＢＭＣから除去した。１００×ｇでＰＢＭＣを遠心すると、上清を介して血小板が除去された。残ったリンパ球は、主にＢリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞及び単球を含む。ＰＢＭＣは、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中３７℃／５％ＣＯ２で培養下に保った。
ＣＤ１４＋及びＣＤ５６＋細胞の枯渇
ＣＤ１４＋細胞の枯渇には、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、＃１３０－０５０－２０１）を使用した。ＮＫ細胞の枯渇には、ヒトＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ、＃１３０－０５０－４０１）を使用した。ＰＢＭＣをカウントし、室温で１０分間、３００×ｇで遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットをＭＡＣＳ単離緩衝液（８０μｌ／１０７細胞；ＰＢＳ、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＣＤ１４マイクロビーズ及びＣＤ５６マイクロビーズ（２０μｌ／１０７細胞）を加え、４～８℃で１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳ単離緩衝液（１～２ｍｌ／１０７細胞）で細胞を洗浄した。遠心後（上記を参照されたい）、上清を廃棄し、細胞をＭＡＣＳ単離緩衝液（５００μｌ／１０８細胞）に再懸濁した。次に、ＣＤ１４／ＣＤ５６陰性細胞をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０４２－４０１）を使用して単離した。ＣＤ１４＋／ＣＤ５６＋細胞のないＰＢＭＣを必要になるまでインキュベーターにおいてＲＰＭＩ完全培地（即ち１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、１０ｍＭヘペス緩衝液、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０）中３７℃で培養した。
標的細胞標識
フローサイトメトリーアッセイで細胞溶解を分析するため、蛍光膜色素ＤｉＯＣ１８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して標的細胞（ヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞など）を標識し、それをエフェクター細胞と区別した。簡潔に言えば、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯを含有するＰＢＳ（５μｌ／１０６細胞）中に１０６細胞／ｍｌに調整した。３７℃で３分間インキュベートした後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、細胞数を１．２５×１０５細胞／ｍｌに調整した。０．５％（ｖ／ｖ）等張性エオシンＧ溶液を用いて細胞の生存を決定した。
フローサイトメトリーベースの分析
このアッセイは、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの段階希釈物の存在下で標的細胞（ヒトＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞など）の溶解を定量化するように設計した。等容積のＤｉＯ標識標的細胞及びエフェクター細胞（即ちＣＤ１４＋細胞のないＰＢＭＣ）を混合し、１０：１のＥ：Ｔ細胞比を得た。１６０μｌのこの懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクトした。分析しようとするＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの段階希釈物４０μｌ（及び場合により、無関係の標的抗原を認識する抗ＣＤ３（Ｉ２Ｃ）ベースの二特異性抗体コンストラクトなど、陰性対照抗体コンストラクト）又は更なる陰性対照としてのＲＰＭＩ完全培地を加えた。７％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて抗体コンストラクト媒介性細胞傷害性反応を４８時間続行した。次に、細胞を新しい９６ウェルプレートに移し、１μｇ／ｍｌの最終濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加えることにより、標的細胞膜の完全性の喪失をモニタした。ＰＩは、通常、生細胞から排除される膜不透過性色素である一方、死細胞は、それを取り込み、蛍光発光により同定可能になる。
試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ機器のフローサイトメトリーによって測定し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアによって分析した（両方ともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）。標的細胞は、ＤｉＯ陽性細胞として同定された。ＰＩ陰性標的細胞は、生存標的細胞に分類した。細胞傷害パーセンテージを以下の式に従って計算した。
Figure 0007577435000004
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、細胞傷害パーセンテージを対応する抗体コンストラクト濃度に対してプロットした。ヒル勾配を一定としたシグモイド用量反応曲線の評価のため、用量反応曲線を４パラメータロジスティック回帰モデルで分析し、ＥＣ５０値を計算した。
実施例７．３
刺激されていないヒトＰＢＭＣを標的細胞に対してリダイレクトする効力
ＦＡＣＳベースの４８時間細胞傷害性アッセイにおいて、刺激されていないヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４陰性／ＣＤ５６陰性）をエフェクター細胞として使用し、且つ標的細胞として１０：１のＥ：Ｔ比において、
（１）ヒトＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、
（２）ヒトＣＬＤＮ１８．１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、及び
（３）天然の発現体である細胞株ＳＮＵ－６０１及びＳＮＵ－６２０
を使用して、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの細胞傷害活性を分析した。
アッセイは、上記の実施例７．２に記載のとおり行った。細胞傷害性アッセイの結果は、表４に示す。
Figure 0007577435000005
このアッセイは、本発明の抗体コンストラクトが、ＣＬＤＮ１８．２パラログＣＬＤＮ１８．１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して有意な望ましくない細胞傷害活性を呈しない（灰色で強調表示した行）ことを実証している。「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓ」と称されるコンストラクトの場合、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＨＯのＥＣ５０値とＣＬＤＮ１８．１－ＣＨＯのＥＣ５０値との間の倍数は、ほぼ４，０００である。更に、「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ」と称されるコンストラクトの場合、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＨＯのＥＣ５０値とＣＬＤＮ１８．１－ＣＨＯのＥＣ５０値との間の倍数は、ほぼ２０，０００である。
通常、ＥＣ５０値は、標的発現率が低い標的細胞と比較して、細胞表面上で高いＣＬＤＮ１８．２レベルを発現する標的細胞を使用するときほど低くなると予想される。従って、通常、ＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用すると、天然の発現体を使用する場合と比較してＥＣ５０値が低くなる傾向があることが観察される － 及び本アッセイで実証される －。
実施例７．４
ヒトＰＢＭＣを天然発現体の標的細胞に対してリダイレクトする効力
本発明のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの細胞傷害活性を、ＣＬＤＮ１８．２標的内の異なるエピトープに結合する他のＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクト（ＣＬ－３及びＣＬ－４、実施例２を参照されたい）と比較した。内因性レベルのＣＬＤＮ１８．２を安定に発現するがん細胞株（ＧＳＵ、ＮＵＧＣ、ＩＭ９５、ＳＮＵ６２０、ＳＮＵ６０１）及びＣＬＤＮ１８．２陰性対照細胞株ＡＧＳをルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）で安定に標識した。更に、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するようにＣＨＯ細胞を安定にトランスフェクトした。２つのヒトＴ細胞ドナーをエフェクター細胞の供給源として使用した。細胞傷害性アッセイのＥ：Ｔ比は、１０：１であった。抗体コンストラクトの１：３系列タイトレーションは、３０ｎＭの濃度から開始した。このアッセイを３７℃で４８時間インキュベートした。Ｌｕｃ標識細胞についてルシフェラーゼアッセイシステムＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞について発光細胞生存アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、細胞傷害性の読み取りを実施した。
抗ＣＬＤＮ１８．２ ＶＨ及びＶＬ領域の配列を除き、抗体コンストラクトＣＬ３及びＣＬ－４は、本実施例の細胞傷害性アッセイで分析した本発明の抗体コンストラクトであると同定された。２つの抗体コンストラクトＣＬ－３及びＣＬ－４のＶＨ及びＶＬ領域は、国際公開第２０１４／０７５７８８号パンフレットのそれぞれ配列番号８＋１５及び配列番号６＋１１として開示されている。本明細書に開示されるとおりの配列番号１４５＋１４６及び配列番号１５０＋１５１も参照されたい。
以下の表５及び図７に結果を示す。標的細胞とは無関係に、本発明の抗体コンストラクト（ここでは、ＣＬ－１、ＣＬ－２）は、異なるＣＬＤＮ１８．２エピトープに結合する抗体コンストラクト（ＣＬ－３、ＣＬ－４）と比べて有意に高い細胞傷害能を有することが示された。本発明の抗体コンストラクトは、２桁ピコモル濃度範囲のＥＣ５０値を示すが、比較コンストラクトは、３桁～最高５桁ピコモル濃度範囲のＥＣ５０値を示す。いずれのコンストラクトも、標的陰性細胞株に対していかなる活性も示さなかった（データは示さず）。
Figure 0007577435000006
これらの観察が、対照コンストラクト（ここでは、ＣＬ－３）と比較したときの本発明の抗体コンストラクト（ここでは、ＣＬ－１、ＣＬ－２）の有意に高い親和性に起因したことを除外するため、ｈｕ Ｃｌｄｎ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で細胞ベースの親和性アッセイを実施した。３つの試験したコンストラクトＣＬ－１、ＣＬ－２及びＣＬ－３の親和性は、ほぼ同様の範囲内にあったことが示された。これは、本発明の抗体コンストラクトについて実証された好ましいエピトープ／活性関係が、単に対照コンストラクトの親和性が低く、従って低い細胞傷害活性を呈することに起因するのではないことを意味する。むしろ、効力は、本抗体コンストラクトによって認識されるＣＬＤＮ１８．２内の特定のエピトープに起因するように見える。
実施例７．５
マカクＴ細胞をＣＬＤＮ１８．２発現ＣＨＯ細胞にリダイレクトする効力
４８時間ＦＡＣＳベース細胞傷害性アッセイにおいて、ヒトＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を標的細胞として使用し、且つマカクＴ細胞株４１１９ＬｎＰｘ（Ｋｎａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９５：３２５６－６１（２０００））をエフェクター細胞の供給源として使用して、１０：１のＥ：Ｔ比でＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの細胞傷害活性を分析した。ヒトＣＬＤＮ１８．２とカニクイザルＣＬＤＮ１８．２とは、細胞外ドメインに同一のアミノ酸配列を共有することに留意されたい。トランスフェクトＣＨＯ細胞の標的細胞標識及び細胞傷害活性のフローサイトメトリーベースの分析を上記の実施例７．２に記載のとおり実施した。
結果を表６に示す。細胞株４１１９ＬｎＰｘからのマカクＴ細胞は、本発明に係るＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによってＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトＣＨＯ細胞を効率的に死滅させるように誘導された。抗体コンストラクトは、このアッセイで強力に１桁～２桁ピコモル濃度のＥＣ５０値を示したことから、それは、マカク系で極めて高活性であることが裏付けられた。
Figure 0007577435000007
実施例８
（ｉ）３回の凍結／融解サイクル後及び（ｉｉ）３７℃で７日間のインキュベーション後の単量体から二量体への変換
ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３単量体抗体コンストラクトを種々のストレス条件に供し、続いて高性能ＳＥＣにより、当初単量体であったのが二量体抗体コンストラクトに変換された抗体コンストラクトのパーセンテージを決定した。
（ｉ）２５μｇの単量体抗体コンストラクトを汎用製剤化緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、次に－８０℃で３０分間凍結し、続いて室温で３０分間融解した。３回の凍結／融解サイクル後、二量体含有率をＨＰ－ＳＥＣによって決定した。
（ｉｉ）２５μｇの単量体抗体コンストラクトを汎用製剤化緩衝液で２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、続いて３７℃で７日間インキュベートした。二量体含有率をＨＰ－ＳＥＣによって決定した。
高性能（ＨＰ）シリカベースサイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムをオートサンプラーが装備されたＦＰＬＣに接続した。カラム平衡化及びランニング緩衝液は、ｐＨ６．６に調整した１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４からなった。平衡化したカラムに抗体コンストラクト溶液（２５μｇタンパク質）を適用し、７ＭＰａの最大圧力下において０．７５ｍｌ／分の流速で溶出を行った。ラン全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍ光学的吸収率でモニタした。分析は、ソフトウェアラン評価シートに記録された２１０ｎｍシグナルのピーク積分により行った。二量体ピークの面積を単量体＋二量体ピークの総面積で除すことにより、二量体含有率を計算した。
結果は、以下の表７に示す。分析したＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトは、３回の凍結／融解サイクル後に０．０％の二量体パーセンテージを示し、３７℃で７日間のインキュベーション後に≦２％の二量体パーセンテージを示した。
Figure 0007577435000008
実施例９
熱安定性
抗体凝集温度を以下のとおり決定した：２５０μｇ／ｍｌの濃度の４０μｌの抗体コンストラクト溶液を使い捨てキュベットに移し、動的光散乱装置に置いた。定期的に半径測定値を取得しながら試料を０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃に加熱した。ＤＬＳ装置と共に配布されるソフトウェアパッケージにより、タンパク質の融解及び凝集の指標である半径の増加を用いて抗体コンストラクトの凝集温度を計算した。
抗体コンストラクトＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃは、≧５１℃、より具体的には５１．７℃の有益な凝集温度を有することが示された。別のアッセイでは、ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓと称される分子の凝集温度が≧４５℃、より具体的には４９．７℃の値であることが示された。
実施例１０
２．５ｍｇ／ｍｌの単量体抗体コンストラクト濃度における濁度
２５０μｇ／ｍｌの濃度の精製抗体コンストラクト溶液１ｍｌをスピン濃縮ユニットによって２５００μｇ／ｍｌに濃縮した。５℃で１６時間貯蔵した後、汎用製剤化緩衝液に対するＯＤ３４０ｎｍ光学的吸収測定によって溶液の濁度を決定した。
抗体コンストラクトＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃは、≦０．０２１の極めて好ましい濁度を有することが示された一方、ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓは、≦０．０２９の極めて好ましい濁度を有することが示された。３回の凍結／融解サイクル後の同様の濁度測定の結果、ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃについて０．０２１の濁度となった。
実施例１１
高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質均一性
本発明の抗体コンストラクトのタンパク質均一性を高分解能陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）によって分析した。
１つのアッセイでは、５０μｇの抗体コンストラクト単量体を５０ｍｌ結合緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で希釈し、４０ｍｌのこの溶液をＦＰＬＣ装置に接続した１ｍｌ ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆカラム（ＹＭＣ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。試料結合後、更なる結合緩衝液による洗浄ステップを行った。タンパク質溶出のため、緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％オクタン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を使用した５０％パーセント緩衝液Ｂに至る線形増加塩勾配を１０カラム容積で適用した。ラン全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍ光学的吸収率でモニタした。分析は、ソフトウェアラン評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分により行った。このアッセイでは、「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓ」と称される分子（配列番号１３１）の均一性が８２．５％の値であることが示された。
別のアッセイでは、Ｂｉｏ ＳＣＸ分析的ＣＩＥＸカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＵＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続し、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６、０．０５％ナトリウムアジドからなる緩衝液Ａ（結合緩衝液）と平衡化させた。１０μｇの抗体コンストラクト単量体をカラムに適用し、カラムマトリックスに結合させた。試料結合後、更なる結合緩衝液Ｂによる洗浄ステップを行った。タンパク質溶出のため、５０ｍＭ ＭＥＳ、１０００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．６、０．０５％ナトリウムアジドからなる緩衝液Ｂを使用した５０％パーセント緩衝液Ｂに至る線形増加塩勾配を適用した。ラン全体を２８０ｎｍ光学的吸収率でモニタした。分析は、ソフトウェアラン評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分により行った。このアッセイでは、「ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ」と称される分子（配列番号１３２）が９７．６％（主ピークの曲線下面積（＝ＡＵＣ））の均一性を有することが示された。
実施例１２
ＨＩＣブチルによって測定したときの表面疎水性
抗体コンストラクトＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ及びＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓの表面疎水性をフロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で試験した。
５０μｇの単量体抗体コンストラクトを汎用製剤化緩衝液で５００μｌの最終容積に希釈し（１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリジンＨＣｌ、４％トレハロース、ｐＨ７．０）、Ａｅｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣシステムに接続した１ｍｌブチルセファロースＦＦカラムに適用した。ラン全体を２８０、２５４及び２１０ｎｍ光学的吸収率でモニタした。分析は、Ａｅｋｔａ Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアラン評価シートに記録された２８０ｎｍシグナルのピーク積分により行った。タンパク質シグナルの上昇及び下降の面積及び速度を比較し、それによって抗体コンストラクトとマトリックスの相互作用強度の指標とすることにより、溶出挙動を評価した。
抗体コンストラクトは、良好な溶出挙動を有し、それは、迅速で完全であった。
実施例１３
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＧＳＵ－ｌｕｃ進行期胃がんモデルにおけるＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの有効性評価
１日目に５×１０６個のＧＳＵ－ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）細胞を皮下注射した雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのモデルにおいて、配列番号１３２を有するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクト（ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ）の抗腫瘍活性を試験した。８日目に２×１０７個のエフェクター細胞（インビトロ拡大培養して活性化させたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞）を腹腔内注射した。治療は、１２、１９及び２６日目に行った（Ｑ７Ｄ×３）。２つの対照群、１つがＴ細胞なし（群１）、もう１つがＴ細胞あり（群２）は、０．１ｍｌ／投与の媒体（２５ｍＭ Ｌ－リジン、０．００２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム中、ｐＨ７．０）で静脈内ボーラス注射によって処置した。抗体コンストラクトは、０．１ｍｌの最終容積で１ｍｇ／ｋｇ／投与の濃度で静脈内ボーラス注射によって投与した（群３）。各群のマウスの数は、５匹（群１）、１０匹（群２）及び１０匹（群３）であった。
試験中、腫瘍をノギスによって測定し、進行を腫瘍容積（ＴＶ）の群間比較によって評価した。ｘ日目における腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、腫瘍容積をＴ／Ｃ（％）＝１００×（分析群の中央値ＴＶ）／（対照群の中央値ＴＶ）として計算することにより決定し、計算値を表８に示す。
Figure 0007577435000009
結果を更に図８に示す。本進行期腫瘍分析においてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルで有意な腫瘍成長阻害が示された。更に、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによる処置は、マウスの体重に何ら効果を及ぼさなかった（データは示さず）。
実施例１４
雌無胸腺ヌードマウスのＳＮＵ６２０－ｌｕｃ腫瘍形成異種移植モデルにおけるＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの抗腫瘍活性の評価
１日目に５０％マトリゲル中のＳＮＵ６２０－ｌｕｃ（５×１０６個の標的細胞）／ＰＢＭＣ（２．５×１０６個のエフェクター細胞）混合物を皮下注射した雌無胸腺ヌードマウスのモデルにおいて、配列番号１３２を有するＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクト（ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃ）の抗腫瘍活性を試験した。群１～４の治療は、３、１０及び１７日目に行った（Ｑ７Ｄ）。腫瘍／ＰＢＭＣ混合物の投与を受けた対照群（群１）は、０．１ｍｌ／投与の媒体（２５ｍＭ Ｌ－リジン、０．００２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム中、ｐＨ７．０）で静脈内ボーラス注射によって処置した。抗体コンストラクトは、１ｍｇ／ｋｇ／投与（群２）、０．１ｍｇ／ｋｇ／投与（群３）及び０．０１ｍｇ／ｋｇ／投与（群４）の濃度で０．１ｍｌの容積の静脈内ボーラス注射として投与した。各群のマウスの数は、１０匹であった。
試験中、腫瘍をノギスによって測定し、進行を腫瘍容積（ＴＶ）の群間比較によって評価した。ｘ日目における腫瘍成長阻害Ｔ／Ｃ［％］は、腫瘍容積をＴ／Ｃ（％）＝１００×（分析群の中央値ＴＶ）／（対照群の中央値ＴＶ）として計算することにより決定し、計算値を表９に示す。
Figure 0007577435000010
結果を更に図９に示す。ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトの全ての試験濃度で無胸腺ヌードマウスモデルにおいて有意な腫瘍成長阻害が示された。更に、ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトによる処置は、マウスの体重に何ら効果を及ぼさなかった（データは示さず）。
実施例１５
カニクイザル探索的毒性試験
ＣＬＤＮ１８．２×ＣＤ３抗体コンストラクトＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－６Ｈｉｓ（配列番号１３１）で静脈内投与による探索的ＮＨＰ忍容性試験を実施した。２５μｇ／ｋｇ／日（ヒトＥＣ９０の約２０倍）の出発用量が良好に忍容された後、全身曝露を実現した。１２５μｇ／ｋｇ／日（ヒトＥＣ９０の約１２０倍）の用量漸増の結果、ＣＬＤＮ１８．２を標的とするＴ細胞会合抗体コンストラクトから予想される臨床的効果並びに病理組織学的効果が得られた。
実施例１６
インビトロ併用療法試験
ＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃによる治療は、ヒトＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞上のＰＤ－１の上方制御につながる（データは示さず）。この治療は、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の上方制御にもつながり得る。ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように、ＣＬＤＮ１８．２陽性であるＧＳＵ及びＮＵＧ－Ｃ４胃がん細胞株をエンジニアリングした。配列番号３６０に示されるとおりの重鎖アミノ酸配列と、配列番号３６１に示されるとおりの軽鎖アミノ酸配列とを有する抗ＰＤ－１抗体の非存在下又は存在下で細胞をＣＬ－１×Ｉ２Ｃ－ｓｃＦｃとインキュベートし、且つ活性化ヒトＴ細胞とインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に細胞傷害性を評価した。結果は、以下の表１０に示す。
Figure 0007577435000011
このアッセイは、抗ＰＤ－１抗体を加えると本発明のＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクトの有効性が高まることを実証する。
実施例１７
マウスにおける併用療法試験
ヒト／マウスキメラＣＤ３εノックインマウスモデルを使用して、本明細書に記載されるとおりの二特異性抗体コンストラクトの有効性を潜在的に亢進させるための抗体／抗体コンストラクトの治療的併用を評価した。二特異性単鎖抗ヒトＣＤ３（「Ｉ２Ｃ」ｓｃＦｖ）×抗マウスＣＬＤＮ１８．２（ｓｃＦｖ）－ｓｃＦｃサロゲート抗体コンストラクトを作成した。この分子は、インビトロでマウスＣＬＤＮ１８．２発現細胞に対して強力な活性を実証した。次に、この分子について、遺伝子修飾された免疫コンピテントマウスモデル（ヒト／マウスキメラＣＤ３εノックイン）において、ＣＬＤＮ１８．２陽性皮下移植腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０ ｍｕＣＬＤＮ１８．２同系モデル）に対する抗マウスＰＤ－１抗体、抗マウスＣＴＬＡ４抗体及び抗マウス４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）抗体と併用したその抗腫瘍活性を試験した。この試験デザインに従い、１０日目、約５０～１００ｍｍ３の腫瘍容積を有するマウスを無作為化した。各群には１０匹のマウスを含めた。１１及び１８日目にＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクト（１５０μｇ／ｋｇ）又は対照（抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ、１５０μｇ／ｋｇ）二特異性抗体コンストラクトを投与（ｉ．ｖ．）し、１１、１４、１７及び２０日目に抗体（抗ＰＤ－１ １００μｇ；抗４－１ＢＢ １５０μｇ；抗ＣＴＬＡ４ ３００μｇ；対照として抗体アイソタイプ）を投与した。１０、１３、１７、２０及び２５日目に腫瘍容積を測定した（最終摘出、全群）。
３つ全ての抗体が二特異性コンストラクトの有効性を亢進させた。アゴニスト抗４－１ＢＢモノクローナル抗体は、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍に対して単一薬剤活性を示さなかった。具体的には、２５日目の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は、以下のとおり決定された。
対照二特異性抗体コンストラクト＋抗体アイソタイプ→０％（標準）
対照二特異性抗体コンストラクト＋抗４－１ＢＢ ａｂ→有意差なし
対照二特異性抗体コンストラクト＋抗ＣＴＬＡ－４ ａｂ→２１％
ＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクト＋抗体アイソタイプ→３６％
対照二特異性抗体コンストラクト＋抗ＰＤ－１ ａｂ→５７％
ＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクト＋抗ＣＴＬＡ－４ ａｂ→７６％
ＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクト＋抗４－１ＢＢ ａｂ→７７％
ＣＤ３×ＣＬＤＮ１８．２抗体コンストラクト＋抗ＰＤ－１ ａｂ→７９％

Claims (19)

  1. ・標的細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する第１のドメインと、
    ・Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３に結合する第２のドメインと
    を含む抗体コンストラクトであって、
    前記第１のドメインが、
    配列番号１２１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域、並びに配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域
    を含む、抗体コンストラクト。
  2. 前記第１のドメインが、配列番号１２７または配列番号１３９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む、請求項１に記載の抗体コンストラクト。
  3. 前記第１のドメインが、配列番号１２８または配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体コンストラクト。
  4. 前記第１のドメインが、配列番号１２７に示されるＶＨ領域及び配列番号１２８に示されるＶＬ領域、又は配列番号１３９に示されるＶＨ領域及び配列番号１４０に示されるＶＬ領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  5. 前記第１のドメインが、配列番号１２９または配列番号１４１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  6. 前記第１のドメインが、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１４３、および配列番号１４４に示されるアミノ酸配列の群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、またはから成る、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  7. 前記第２のドメインは、ヒトＣＤ３ε、及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３εに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  8. ａ）前記抗体コンストラクトは、単鎖抗体コンストラクトであり、
    ｂ）前記第１のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
    ｃ）前記第２のドメインは、ｓｃＦｖのフォーマットであり、
    ｄ）前記第１のドメイン及び前記第２のドメインは、リンカーを介して接続されており、及び／又は
    ｅ）前記抗体コンストラクトは、延長された血清半減期をもたらすドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  9. 前記第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．１、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及び／又はＣＬＤＮ９に結合しないか又は有意に結合しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. 請求項１０に記載のポリヌクレオチド又は請求項１１に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
  13. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトを作製する方法であって、前記抗体コンストラクトの発現を許容する条件下において、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することと、前記作製された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法。
  14. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトを含む医薬組成物。
  15. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体コンストラクトを含む、疾患の予防、治療又は改善のための医薬組成物。
  16. 前記疾患が、新生物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記疾患又は新生物は、消化管がん、卵巣がん及び肺がんからなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記消化管がんは、胃がん、食道がん、胃食道がん、膵がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター及び／又は請求項１２に記載の宿主細胞を含む、キット。
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