CN108503714A

CN108503714A - 一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN108503714A
Application number: CN201810317694.XA
Authority: CN
Inventors: 孙志坚; 康平; 郭子贞; 张铭浩
Original assignee: Zhejiang Branch Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Branch Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2018-09-07
Also published as: US20210101953A1; WO2019196815A1

Abstract

本发明涉及一种抗EpCAM单链抗体偶联基因工程优化的IL‑2的融合蛋白，分子量约为46Kda，单链抗体替代IgG结构，分子结构更小，减少空间位阻，使该蛋白有更加灵活的空间结构，更高的生物活性效价。本发明融合蛋白，具有和EpCAM蛋白的高亲和力和更强的促进T细胞增殖的能力；本发明融合蛋白能交联肿瘤细胞表面EpCAM和T细胞表面的白介素受体，促进免疫细胞和靶分子表达细胞的识别和免疫第一信号传导，引发免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，同时还能激活促进T细胞增殖的白介素受体信号；且具有更加优异的促进淋巴细胞肿瘤浸润能力。本发明融合蛋白可作为新一代生物药物应用于肿瘤疾病的治疗或者作为工具蛋白，用于体外检测。

Description

一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程、药物和生物医学医疗技术领域，具体涉及人白介素(IL-2)与抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)单链抗体的融合蛋白，编码所述融合蛋白的核酸分子，包含融合蛋白的药物组合物和试剂盒，以及融合蛋白在治疗肿瘤疾病中的应用。

背景技术

人白介素2(IL-2)是辅助型T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，主要由活化的Th1细胞产生，在机体免疫系统的正常调控防御机制中发挥着重要的作用，在特异性细胞免疫反应的调节中处于核心位置。IL-2并非直接杀灭肿瘤细胞，而是通过刺激、活化效应细胞，间接发挥抗肿瘤作用。参与肿瘤免疫作用的效应细胞主要有T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞三大类，其中细胞毒性T细胞(CTL细胞)起主要作用。IL-2在体内通过与靶细胞表面的IL-2R结合，触发其下游的信号级联反应，产生IL-2介导的细胞增殖效应，可刺激T细胞生长、分裂和分化为CTL细胞，增强其细胞毒活性；能促进未成熟的CTL细胞增殖和产生溶细胞作用。同时，IL-2还可解除肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)的免疫抑制状态并增强其免疫功能；诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)增殖并促进其活性；促进NK细胞活化、分化和增殖，维持NK细胞长期生长并增强其活性；刺激B淋巴细胞增殖并产生免疫球蛋白；刺激巨噬细胞的细胞毒活性；此外，IL-2还能诱导产生其它细胞因子(如TNF-α、IFN-γ等)或诱导细胞因子受体的表达，从而发挥宿主抗肿瘤免疫作用。

白介素2药物(例如Proleukin)被用于转移肺癌，晚期黑色素瘤，部分淋巴癌和白血病。但是，生理状态下的白介素2是局部高浓度的情况下起到生物学功能。全身性给药的条件下，无法实现有效的局部药效浓度，并且容易导致某些周身性毒副反应，而肿瘤位置的浓度反而也不够高，达不到持续引起药效的浓度，限制了其治疗浓度空间。抗体偶联或者融合的白介素2可以通过特异性靶点，实现局部更高浓度的白介素2，从而降低毒性，提高药效。

人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是最早在结肠癌中发现的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子质量为40kDa，由314个氨基酸残基构成，分子结构包括细胞外结构域(EpEX)、单次跨膜结构域和细胞内结构域(EpICD)，可介导非Ca2+依赖性同源细胞间的黏附。EpCAM广泛表达于上皮来源的正常组织，并在多种上皮源性癌组织中不同程度的过表达，已被多项研究证实促进细胞周期和细胞增殖，并与肿瘤的发生、进展、侵袭及转移等相关。近年来，EpCAM被多项研究证实为循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞的标志物。

目前已有报道的有5个抗体偶联或融合白介素2的药物处于临床试验阶段，例如，EMD273066(tucotuzumab celmoleukin；huKS-IL2)(US 2007/0036752 A1)是抗EpCAM人源化单克隆抗体融合白介素2，从而触发免疫反应。该药目前处于卵巢癌和小细胞肺癌SCLC的I/II期临床开发。EMD 273066是完整的人源化IgG4抗体融合白介素2(IgG4-(EU)-(Lys toAla)-IL-2)，分子量167.5Kda。完整的抗体结构虽然提供了较好的稳定性，但是也产生较大的空间位阻，限制了IL-2更灵活的结合。虽然这种抗体通过在靶向分子周围富集了IL-2的水平，从而激活了周围的免疫细胞。但是由于空间位阻的原因，限制了靶细胞膜表面蛋白和免疫细胞膜表面蛋白的识别和信号传导。事实证明，虽然降低了药物浓度，降低了毒副反应，但是并未显著提升其疗效。传统IL-2药物治疗的注射浓度为100Mio IU/m2，每周注射1次。抗体偶联或融合IL-2每20到28天注射1次，每次注射浓度为67.5–110Mio IU IL-2/m2。

另外，由于实体肿瘤存在药物进入的问题，在肿瘤内部，免疫细胞和大分子药物都存在进入困难的问题，限制了大分子抗体药物和肿瘤免疫细胞的肿瘤杀伤效果。本发明针对这一问题，采用单链抗体代替完整的双重链加轻链的完整抗体结构，分子量从167.5Kda降低到46Kda，增加蛋白药物进入肿瘤内部的效率，通过耦联肿瘤表面的靶向分子和免疫细胞上的IL2R，促进免疫细胞浸润到肿瘤内部。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明采用抗EpCAM单链抗体偶联基因工程优化的白介素2，分子量约为46Kda，加长单链抗体和白介素2之间连接片段，使分子空间结构更加灵活。本发明设计了一组抗EpCAM的单链抗体和IL2融合蛋白分子，验证了该融合蛋白具有很好的生物学功能。更小的分子拉近了靶分子表达细胞和免疫细胞的距离。促进免疫细胞和靶分子表达细胞的识别和信号传导。更小的分子可以实现更高的效价，具有更高的亲和活力。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由白介素2(IL-2)与抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)单链抗体融合连接构成EPIL2。

所述白介素2(IL-2)可选自野生型IL-2或基因工程化的IL-2，优选基因工程化的IL-2；所述野生型IL-2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因工程化的IL-2具有至少3处氨基酸残基取代；参照野生型IL-2的氨基酸序列，所述氨基酸残基取代优选C125S、V69A、I128T、和/或Q74P；更优选的，所述基因工程化的IL-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4、6、或8所示。

所述抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或13所示。

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15或17所示。

本发明提供了一种编码上述融合蛋白的分离的核酸分子，所述核酸分子优选SEQID NO.16或18所示核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含上述分离的核酸分子。

本发明提供了一种细胞，所述细胞包含融合蛋白EPIL2或编码融合蛋白的核酸分子，用于生产融合蛋白；所述细胞选自非人哺乳动物细胞，优选CHO和HEK293细胞。

本发明提供了一种融合蛋白EPIL2和/或编码上述融合蛋白的核酸分子在制备药物组合物或体外诊断试剂盒中的应用；所述药物组合物优选为治疗肿瘤的药物组合物；所述体外诊断试剂盒优选为用于肿瘤免疫药物的药效预测和评价的试剂盒；所述肿瘤优选为结肠癌。

本发明提供了一种药物制剂、药物组合物或试剂盒，所述药物制剂、药物组合物或试剂盒包含本发明所述融合蛋白EPIL2。

本发明提供了一种上述融合蛋白EPIL2与其他治疗肿瘤的药物共同用于制备治疗肿瘤的药物组合物或试剂盒的用途，所述其他治疗肿瘤的药物优选抗PD-1/PD-L1抗体。

本发明提供了一种上述融合蛋白EPIL2在激活T细胞扩增中的用途。

本发明提供了一种上述融合蛋白EPIL2在评价抗PD-1/PD-L1抗体药物作用/疗效中的用途。

本发明提供了一种基因工程化的IL-2，所述基因工程化的IL-2具有至少3处氨基酸残基取代；参照野生型IL-2的氨基酸序列SEQ ID No.2，所述氨基酸残基取代优选C125S、V69A、I128T、和/或Q74P；更优选的，所述基因工程化的IL-2的氨基酸序列如SEQ ID No.6或8所示。

本发明提供了一种编码基因工程化的IL-2的分离的核酸分子，所述核酸分子优选SEQ ID NO.5或7所示核苷酸序列。

本发明提供了一种基因工程化的IL-2和/或编码上述基因工程化的IL-2的核酸分子在制备药物组合物或体外诊断试剂盒中的应用；所述药物组合物优选为治疗肿瘤的药物组合物；所述体外诊断试剂盒优选为用于肿瘤免疫药物的药效预测和评价的试剂盒；所述肿瘤优选为结肠癌。

本发明还提供了一种肿瘤治疗方法，包括向患者施用有效量的融合蛋白EPIL2，或将上述融合蛋白与其他治疗肿瘤疾病的药物联合或顺序向患者施用。

术语及定义

除非特别说明，本申请中所使用的术语和定义均是本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员所知晓。

如本申请中所使用的，术语“肿瘤位点”是指含有或被怀疑含有肿瘤细胞的体内或离体位置。所述肿瘤位点包括固体肿瘤以及接近或邻近肿瘤生长处的位置。

如本申请中所使用的，术语“施用”是指全身性和/或局部施用。术语“全身性施用”是指非局部地施用，从而所施用的物质可能影响整个身体中的若干器官或组织；或者从而所施用的物质可能穿越整个身体中的数个器官或组织而到达靶位点。例如，向受试者的循环系统施用可引起治疗性产物在多于一个组织或器官中从所施用的载体表达，或者可引起治疗性产物在特异性位点处由所施用的载体表达，例如，这是由于天然的趋向性或由于与组织特异性启动子元件的可操作连接。本领域技术人员将理解，所述全身性施用涵盖各种形式的施用，这包括但不限于：肠胃外施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经皮施用、肿瘤内施用、口服等。

术语“局部施用”是指在特异性位点处或其周围施用。本领域技术人员将理解，局部施用涵盖各种形式的施用，例如直接注射到特定位点处或注射到其周围(例如肿瘤内施用)。

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指达到治疗目的疾病或病况(例如肿瘤/癌症，例如用于使肿瘤消退或减小肿瘤的大小)所需的本发明的干扰素，或者本发明试剂盒中组分的量。可以通过实践、按照常规的方式来关于特定的目的而确定所述有效量。特别地，所述治疗有效量可以是达到下述目的所需的量：减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即减缓或停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即减缓或停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长；和/或缓解与癌症相关的一种或多种症状。

术语“抗体”涵盖例如，单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗体片段(其显示出所需的生物学或免疫学活性)。在本申请中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与抗体可互换地使用。所述抗体可特异性地靶向肿瘤抗原，例如表面肿瘤抗原，例如EGFR，CD4，CD8、Neu等。

本发明所述“肿瘤”可选自肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、黑素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪瘤、睾丸癌以及恶性纤维组织细胞瘤。

本发明所述“肿瘤细胞”可选自肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、外周神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、黑素瘤、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、肾癌、胆管癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪瘤、睾丸癌以及恶性纤维组织细胞瘤的癌症产生的细胞。

本发明所述“应用”或“用途”，既可表示以疾病治疗和疾病治疗方案检测为目的的应用，也可表示非治疗目的的应用，例如，科学研究等。

本发明的有益效果：

1)本发明设计的抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白可以通过特异性靶点，把白介素2的分子功能汇集到病理部位(例如，肿瘤)实现局部更高浓度的白激素2，从而降低毒性，提高药效。

2)本发明设计的抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白相比huKS-IL2具有更小的分子结构，拉近了靶分子表达细胞和免疫细胞的距离。促进免疫细胞和靶分子表达细胞的识别和信号传导。更小的分子可以实现更高的效价，具有更高的亲和活力。

3)与EpCAM/CD3-双特意性抗体(例如，MT110，又名Solitomab)对比，本发明融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407在拉近T细胞和EpCAM表达细胞(例如，肿瘤细胞)的同时，给T细胞IL-2的生长信号。试验证明，EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407可以建立免疫细胞和EpCAM表达细胞(例如，肿瘤细胞)的交联，并且比MT110具有更强的促进T细胞增殖的效果。

4)由于本发明融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407的分子穿透性更佳，在类器官微肿瘤模型淋巴细胞浸润检测试验中，可显著增加T细胞进入肿瘤微球的能力，增强肿瘤淋巴细胞的浸润，具有明显优于huKS-IL2或MT110促进淋巴细胞肿瘤浸润的性能。

附图说明

图1.融合蛋白的构建和鉴定：A.蛋白表达载体pTT5结构示意图；B.融合蛋白酶切电泳鉴定；C.融合蛋白HP-SEC纯度分析图谱；D.融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色图。

图2.融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407结合细胞水平EpCAM定性染色。

图3.融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407与EpCAM蛋白结合能力酶联免疫定量检测：左图为实验原理示意图，右图为检测曲线。

图4.融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407刺激外周血淋巴细胞T细胞增殖。

图5.外周血淋巴细胞CD8+T细胞增殖CSFE染色。

图6.融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407刺激CTLL-2细胞增殖。

图7.融合蛋白EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407对IL-2R下游STAT1和STAT3磷酸化的激活作用。

图8.融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407促进免疫细胞浸润能力的检测。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白的构建

抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白EPIL2自N端至C端顺序包含:1)IL-2或IL-2突变体；2)连接子；3)抗EpCAM单链抗体。IL-2或IL-2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、4、6和8所示；连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；抗EpCAM单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO.11、13所示。

抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白DNA序列采用全序列基因合成的方式合成目标DNA序列(SEQ ID NO.16和18)，合成序列后接入T载体，用HindIII和NheI双酶切pTT5质粒载体和装有目标序列的pEASY-T1阳性克隆。回收载体长片段和从T载体上切下的目标片段，用连接酶连接成目标克隆，用HindIII和NheI双酶切双酶切鉴定阳性克隆(图1B)。

具体步骤如下：目标基因片段设计完成后，交由商业化基因合成公司完成目标基因片段合成并通过T载体(pEASY-T1Cloning Vector，全式金，货号CT101)用M13正向引物和M13反向引物PCR鉴定。阳性克隆进一步通过M13正向引物测序。

取经过测序鉴定的克隆质粒2ug，和2ug pTT5质粒，加入5ul缓冲液1.1(品牌：NEB，货号#B7201S)加入HindIII(品牌：NEB，货号#R0104)和NheI(品牌：NEB，货号#R0131)限制性内切酶各2ul加入双蒸水到50ul体积。放在37℃水浴锅中孵育2小时，加入5ul电泳上样缓冲液，加入1.2％琼脂糖凝胶中，电泳分离酶切片段，回收pTT5的大片段和T载体中的目标载体片段。

按照1:3的摩尔比例混合后加入连接酶和连接酶缓冲液，室温放置5分钟后插在冰上备用。从超低温(-70℃)冰箱中取出感受态细胞(Trans1-T1)，在冰表面上化冻后，加入连接产物，轻轻混匀，放冰上30分钟，在42℃热激活30秒后，插冰上冷却2分钟后，加入250ul室温LB培养基，200rpm，37℃培养1小时。

取200ul菌液均匀涂抹在准备好的平板上。倒置于37℃培养箱中培养12-16小时，挑选克隆到10微升无菌水中，涡旋混匀，取1微升混合液于25微升PCR体系中，用M13正向引物和M13反向引物鉴定阳性克隆。PCR程序为:94℃10分钟，循环30次(94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒)，72摄氏度10分钟。

阳性克隆接种到LB培养基中，37℃，120rpm，培养16小时后，抽提质粒，取0.5ug质粒，用HindIII和NheI双酶切后跑琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1B)。

高纯度质粒采用低内毒素质粒大提试剂盒(品牌：Qiagen货号：#12362)。纯化方法按照生产商提供的步骤方案。简要过程如下：阳性克隆的表达菌株用LP液体培养基培养37℃，200rpm转速，过夜培养后，6000g离心15分钟，收获菌株沉淀。按照试剂盒说明书加入裂解缓冲液，中和缓冲液，离心后收集上清。上清液加入柱子，加入清洗缓冲液后，加入洗脱缓冲液洗脱质粒DNA，通过异丙醇沉淀，15000g离心30分钟收集沉淀，乙醇清洗后晾干，加入纯水溶解DNA，定量后冻存或者转染细胞。

实施例2：抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白的表达和纯化

低内毒素的大提质粒通过脂质体法转染HEK293细胞，具体步骤为：在20ml DMEM(+10％FBS+抗生素)培养基中接种6x10⁶个HEK293细胞。细胞在37℃，175rpm，5％CO2的条件下培养3天。取细胞计数，当细胞密度约2-3x10⁶细胞/毫升时，用新鲜的DMEM(+10％FBS，无抗生素)培养基稀释处理细胞密度到1x106细胞/毫升，每瓶细胞液体积为20mL，然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2-4小时后可以进行转染。在无菌试管中，500微升DMEM稀释20微克质粒，在另一个试管中，加入50ul脂质体lipofectamine 2000(品牌：invitrogen货号：#11668-027)，室温静置5分钟后，混匀质粒和脂质体，混匀后室温静置20分钟。加入细胞培养瓶中，继续培养4小时。离心收集细胞，加入20ml新鲜的DMEM(+10％FBS，+抗生素)培养基。继续培养，放大体系至5升，后继续培养5-7天，期间随时检测细胞密度和细胞活力。收获HEK293细胞培养液5L，10000rpm,4度低温离心10分钟。收集上清液，0.22um囊式滤器过滤。

在AKTA Purifier 100纯化系统上平衡层析柱，使用XK26/20层析柱，柱体积为30ml，使用GE Healthcare Ni-Sepharose层析介质。平衡缓冲液为50mM NaH2PO4-300mMNaCl pH＝7.4.平衡10CV。过滤后收集的细胞上清液在AKTA Purifier100纯化系统上进行上样纯化，上样流速为20ml/min。上样完成后，使用平衡缓冲液再次进行清洗平衡，清洗层析柱10CV。使用AKTA Buffer配置功能，使用50mM NaH2PO4-300mM NaCl-5mM imidazole pH＝7.4进行Wash，清除杂蛋白及DNA污染物。分别使用50mM NaH2PO4-300mM NaCl-50mMimidazole pH＝7.4，50mM NaH2PO4-300mM NaCl-100mM imidazole pH＝7.4，50mMNaH2PO4-300mM NaCl-200mM imidazole pH＝7.4，50mM NaH2PO4-300mM NaCl-500mMimidazole pH＝7.4等不同的咪唑浓度buffer进行洗脱，收集相应洗脱得到的蛋白纯化峰。收集纯化得到的蛋白分别取样进行后续SDS-PAGE分析及SEC-HPLC纯度分析。并使用超滤系统将目标蛋白buffer置换至PBS-pH＝7.4buffer。纯化后层析柱的再生按以下流程进行：a.加入5倍柱体积的去离子水洗柱一次。b.加入3倍柱体积的2％SDS洗柱一次。c.加入1倍柱体积的25％、50％、75％乙醇各洗柱一次。d.加入5倍柱体积的100％乙醇洗柱一次。e.加入1倍柱体积的75％、50％、25％乙醇各洗柱一次。f.加入2倍柱体积的去离子水洗柱一次。g.随后把His-tag Purification层析柱存放在20％乙醇中，4℃保存。

获得抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白EPIL2-2303301(SEQ ID NO.15)和EPIL2-2303407(SEQ ID NO.17)

实施例3：抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白的亲和活性检测

1、定性验证融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407结合细胞水平EpCAM的能力：

skov3细胞被用来染色，检验EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407对其上EpCAM蛋白的亲和能力。skov3细胞在24孔板中贴壁生长24小时，用4％PFA(多聚甲醛)固定10分钟，加入5％BSA阻断非特异抗原，加入抗人IL-2的一抗孵育1小时后，PBST清洗3次后加入二抗，孵育1小时后，加入DAB(二氨基联苯胺)显色，PBS清洗后在明场显微镜下拍照。可见EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407可以形成很强的细胞染色，定性证明其在细胞水平结合EpCAM的能力(图2)。

2、融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407与EpCAM蛋白结合能力酶联免疫定量检测：

1)酶标板包被：重组人EpCAM蛋白(生产商：Sino biologics；货号10694-H08H)用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释成1ug/ml，在96孔高吸附酶标板(生产商：Corning；货号#3590)加入100ul，37℃放置1小时，用PBS缓冲液清洗三遍，加入100ul含有1％BSA的磷酸盐缓冲液封闭1小时，加入梯度稀释的huKS-IL2、MT110、EPIL-2-2303301、EPIL-2-2303407和人IgG(阴性对照)。25℃放置1小时，加入200ulPBST缓冲液(磷酸盐缓冲液加入0.05％吐温-20)清洗3次。

2)IL-2水平检测：采用IL-2ELISA商品化试剂盒(生产商：Biolegend；货号431801)，简要步骤为加入抗人IL-2的一抗，孵育1小时后加入辣根过氧化物酶标记的二抗后通过TMB显色获得化学发光信号。

3)数据处理：标准曲线采用试剂盒所带的IL-2标准品获得，计算结合EpCAM的蛋白量相当的IL-2信号水平，代表该蛋白结合EpCAM的水平。数据表明，EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407具有小的蛋白分子量和高水平的亲和活力。MT110本身不具有IL-2，所以在次检测中无法被识别(图3)。

实施例4：抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白的生物学活性验证

1、外周血淋巴细胞的分离：

外周血来自健康捐赠者提供。抽取20ml健康捐赠者静脉血于肝素抗凝采血管中。新鲜采集的20ml外周血中，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS)，轻轻混匀后，取9ml加入有装有5ml淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque PLUS)的15ml离心管中，注意沿着离心管壁轻轻加入，避免震荡，形成下层淋巴细胞分离液，上层血液细胞的二像分层，离心2000rpm，30分钟，取淋巴细胞层。加入2倍体积的RPMI1640培养基(2mM L-glutamine，5％FBS)，400g离心5分钟，丢弃上清，再重复洗涤2遍后，细胞用RPMI1640培养基(加10％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)，细胞计数，调整浓度到1×106细胞/毫升，共计获得18.6×106外周血淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以冻存或者立即开展后续实验。

2、外周血淋巴细胞T细胞增殖实验

在6孔板中，每孔加入1ml，1ug/ml的抗CD3单抗(克隆：OKT3，生产商：eBioscience货号:14-0037-82)，轻轻震荡，覆盖住底部，放置于37℃培养箱中孵育1小时后，加入2mlPBS，洗2次后备用。用淋巴细胞培养基(RPMI1640培养基添加10％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)重悬新鲜分离的PBMC或者冻存的PBMC，加入之前处理好预热的6孔细胞培养板中，放置于37摄氏度孵育2小时。收集悬浮细胞，离心收集细胞，用淋巴细胞培养基重悬，细胞密度调整到2x105细胞/毫升，在96孔细胞培养板中，每个孔加入终浓度为1ng/ml的BSA，rhIL-2(重组人IL-2，生产商：Peprotech，货号：200-02)，huKS-IL2(生产商：Creative Biolabs，货号ACFP-SH034),MT110(生产商：Creative Biolabs，货号TAB-889),EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407。细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中。培养4-7天。拍照观察PBMC中T细胞扩增的克隆团的数量和大小。

本实验旨在验证IL-2-抗EpCAM单链抗体融合蛋白EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407是否具有IL-2的细胞生物学活性。对比重组人IL-2，huKS-IL2，MT110，EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407促进T细胞增殖的能力强弱。

如图4所示，EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407能促进外周血淋巴细胞的扩增。促进外周血淋巴细胞扩增的能力比重组人白介素2、huKS-IL2或者MT110更强的活性。从T细胞扩增克隆的大小和数量可以看出，在EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407处理的外周血淋巴细胞中，T细胞的扩增克隆团更多更大，代表T细胞扩增速度更快。而对照组，因为T细胞的克隆团都非常小，扩增不明显。对比的重组人白介素2(rhIL2)，huKS-IL2或者MT110处理的外周血淋巴细胞中有T细胞扩增的克隆团，但是比EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407处理的外周血淋巴细胞中的克隆团数量少而且体积小。该试验数据表明，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407具有很强的促进T淋巴细胞扩增的能力。

3、外周血淋巴细胞CD8+T细胞增殖CSFE染色实验

随着T细胞的有丝分裂而扩增，CFSE染色的颜色逐渐分散，CSFE信号降低的程度，反映了T细胞的扩增活力。如前步骤所描述，分离的人外周血淋巴细胞(PBMC)，用含有2％FBS(胎牛血清)的PBS清洗3次。用含有2.5uM CSFE的PBS重悬细胞，在37摄氏度孵育10分钟。加入2％FBS终止染色，用含有2％FBS清洗2次。细胞重悬于淋巴细胞培养基(RPMI1640培养基添加10％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)。加入包被有OKT3抗体的细胞培养板中，在对应的细胞孔中，加入终浓度为1ng/ml的BSA，rhIL-2(重组人IL-2，生产商：Peprotech，货号：200-02)，huKS-IL2(生产商：Creative Biolabs，货号ACFP-SH034),MT110(生产商：Creative Biolabs，货号TAB-889)，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407。细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中。培养6天。在培养6天后，细胞被收集，固定后用抗CD8-APC标记荧光抗体标记CD8+T细胞。FACS用GRN通道检测CFSE的绿色信号。分析CD8+T细胞中，CFSE稀释的程度，代表CD8+T细胞的增殖情况。

如图5所示，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407促进CD8+T细胞扩增，在CFSE染色试验中，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407比重组人白介素2、huKS-IL2或者MT110具有更强的活性。

4、CTLL-2细胞增殖实验

CTLL-2(ATCC货号TIB-214)培养在RPMI1640淋巴细胞培养基中(RPMI1640添加10％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)，待细胞处于高密度，生长旺盛状态，用1640培养液将细胞洗3次，用RPMI1640淋巴细胞培养基配成2×10⁵/ml的细胞悬液。向96孔细胞培养板内加入50微升细胞悬液。在对应的细胞孔中，加入50ul浓度均为100ng/ml的IgG，rhIL-2(重组人IL-2，生产商：Peprotech，货号：200-02)，huKS-IL2(生产商：Creative Biolabs，货号ACFP-SH034),MT110(生产商：Creative Biolabs，货号TAB-889)，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407。细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中。培养3天。每天测定一次细胞活力。取出96孔板，在当天的孔中加入50ul CellTiter-(Promega,Cat.No.G7571)细胞裂解液。振荡混匀5-10分钟后，在读板机(BMG Omega)中用化学发光程序(luminescence)测量化学发光水平。细胞增殖曲线横轴表示时间(天)，纵轴表示对应的细胞活力。

如图6所示，EPIL-2-2303301和EPIL-2-2303407促进CTLL-2细胞扩增，在CTLL-2细胞增殖试验中，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407比重组人白介素2、huKS-IL2或者MT110具有更强的活性。

实施例5：抗EpCAM单链抗体与IL-2的融合蛋白的体内体外应用方案

1、IL-2/STAT1/3信号通路实验

IL-2通过和细胞表面的IL-2Rα(CD25)，IL-2β结合，激活STAT蛋白的磷酸化。在本发明中，CTLL-2细胞用以验证huKS-IL2、EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407对IL-2R下游STAT1和STAT3磷酸化的激活作用。

CTLL-2(ATCC货号TIB-214)培养在RPMI1640淋巴细胞培养基中(RPMI1640添加10％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)，待细胞处于高密度，生长旺盛状态。离心收集CTLL-2细胞，400g离心3分钟，弃上清，加入PBS，清洗计数，转移1x107个细胞到新的离心管中，400g离心3分钟，收集细胞沉淀，用低血清RPMI1640淋巴细胞培养基(RPMI1640添加0.5％FBS，2mM L-glutamine，1x双抗)重悬细胞，转移到细胞培养瓶中，放在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4小时后，重新收集细胞，用4.2ml无血清RPMI1640淋巴细胞培养基(RPMI1640，2mML-glutamine，1x双抗)重悬细胞。转移1ml细胞悬液到新的离心管中，分别加入1ng/ml的牛血清白蛋白(BSA，低内毒素，生产商：Sigma，货号A1933)，MT110(生产商：CreativeBiolabs，货号TAB-889),1ng/ml重组人白介素2(重组人IL-2，生产商：Peprotech，货号：200-02)，1ng/ml huKS-IL2，1ng/ml EPIL-2-2303301或1ng/ml EPIL-2-2303407，37℃处理20分钟。离心收集细胞，加入100ul RIPA裂解液(50mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS)，12000g 4℃离心10分钟，将上清转移到新的离心管中，得细胞裂解总蛋白产物。测定蛋白浓度后，在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。转膜到PVDF膜上后，用抗体检验磷酸化STAT3，磷酸化STAT1和GAPDH。磷酸化STAT3抗体(生产商：CST，货号：#9145)，磷酸化STAT3抗体(生产商：CST，货号：#9351)，GAPDH抗体(生产商：CST，货号：#5174)

如图7所示，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407激活IL2R下游信号信号通路。EPIL-2-2303301或1ng/ml EPIL-2-2303407激活STAT1和STAT3磷酸化，比较重组人白介素2、huKS-IL2或者MT110,MT110和对照无活性，重组人白介素2、huKS-IL2有一定活性，但是活性低于EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407。

2、淋巴细胞浸润能力检测

肿瘤组织在体内是一个整体，在其中包括肿瘤上皮细胞，肿瘤相关纤维细胞，免疫细胞等组成。肿瘤会产生免疫原性，诱发免疫系统识别并攻击肿瘤细胞，这是肿瘤免疫治疗的原理。但是肿瘤密集的组织结构，往往阻止了免疫细胞进入其核心区域，或者形成抑制免疫系统的微环境。因此，增强免疫细胞进入肿瘤内部，是提高肿瘤免疫治疗类药物有效性的关键因素。

本发明用肿瘤类器官模型(organoids)来模拟肿瘤体内的组织结构，类器官模型是一种3D干细胞培养技术，可以模拟肿瘤的组织结构。在本发明中，一种结肠癌类器官被用于模拟体内肿瘤，来评价生物活性试剂对免疫细胞浸润的作用。此处所指的“生物活性试剂”是指huKS-IL2，MT110，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407。

具体方案如下：结肠癌肿瘤类器官培养自手术切除的结肠癌肿瘤组织。新鲜肿瘤标本被剪切成糜状，用胶原酶4(75U/mL)和中性蛋白酶2(125ug/ml)37摄氏度酶解30分钟。去除大块组织，4摄氏度，上清200g离心3分钟。收集细胞沉淀，加入生长因子减少的基质胶，滴入48孔细胞培养板(25微升/孔)，37摄氏度孵育37分钟后，上层加入结肠癌类器官培养基(Advanced DMEM/F12培养基中添加10mM HEPES缓冲液，2mM谷氨酰胺，B27细胞培养添加剂，10nM胃泌素，1mM N-乙酰半胱氨酸，50ng/ml表皮生长因子，100ng/ml Noggin，10％R-spondin-1条件培养基，50％Wnt-3A条件培养基)。在含有5％二氧化碳的37摄氏度细胞培养箱中，每2天补充一次培养液，类器官生长到7-20天后，肿瘤类器官被从培养皿中用玻璃移液管小心吸出，放置于淋巴细胞基础培养基(RPMR-1640+10％胎牛血清+青霉素链霉素双抗)的96孔U型低吸附培养板中。新鲜分离的人外周血淋巴细胞(PBMC)用CFSE染色(方法参见前文)，按照每孔1x105细胞加入CFSE染色的淋巴细胞。在孔中加入终浓度为1ng/ml的huKS-IL2，MT110，EPIL-2-2303301或EPIL-2-2303407，放置于37摄氏度放置4小时。4小时后，结肠癌类器官被小心从孔中取出，放置于新的24孔平底培养皿中。用明场和绿色荧光显微镜观察绿色信号。类器官中的绿色细胞代表浸润入肿瘤的免疫细胞的量。

如图8所示，EPIL-2-2303301，EPIL-2-2303407比huKS-IL2或MT110具有更强的促进免疫细胞浸润的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江科途医学科技有限公司

<120> 一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用

<130> CP11801053C

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> wt-IL-2-mature form 核苷酸序列

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ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300

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<212> PRT

<213> wt-IL-2-mature form氨基酸序列

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acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

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agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

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<212> PRT

<213> wt-IL-2-with signal peptide氨基酸序列

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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

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Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

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Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

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Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

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<210> 5

<211> 462

<212> DNA

<213> IL-2突变体I编码核酸序列T433A（C125S）、T266C（V69A）、T443C(I128T）

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<211> 153

<212> PRT

<213> IL-2突变体I氨基酸序列T433A（C125S）、T266C（V69A）、T443C(I128T）

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Ser Gln Ser Thr Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 7

<211> 462

<212> DNA

<213> IL-2突变体II编码核酸序列T433A（C125S）、T266C（V69A）、A281C(Q74P) 、T443C(I128T）

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acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

gaagaactca aacctctgga ggaagcgcta aatttagctc caagcaaaaa ctttcactta 300

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

tggattacct ttagtcaaag caccatctca acactgactt ga 462

<210> 8

<211> 153

<212> PRT

<213> IL-2突变体II氨基酸序列T433A（C125S）、T266C（V69A）、A281C(Q74P)、T443C(I128T）

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> (G4S)4linker

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 3-1 VL-VH 氨基酸序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

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<212> DNA

<213> 3-1 VL-VH nuclear sequence

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tacaatgaga ggttcagggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcctc gagcacagcc 240

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<212> PRT

<213> 4-7 VL-VH 氨基酸序列

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

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Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr

130 135 140

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145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys His His His His His

245 250 255

His

<210> 14

<211> 774

<212> DNA

<213> 4-7 VL-VH nuclear sequence

<400> 14

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ctgtcctgca aggcttctgg ctacaccttc acaaactatg gtttaagctg ggtgaagcag 120

aggcctggac aggtccttga gtggattgga gaggtttatc ctagaattgg taatgcttac 180

tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcg 240

tccatggagc tccgcagcct gacctctgag gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg 300

ggatcctacg atactaacta cgactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct caggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggttctgag 420

ctcgtgatga cccagactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 480

tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 540

ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 600

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 660

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtac 720

acgttcggag gggggaccaa gcttgagatc aaacatcatc accatcatca ttag 774

<210> 15

<211> 421

<212> PRT

<213> EPIL-2-2303301(IL-2-3-1 VL-VH)

<400> 15

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Ala Leu Asn Leu Ala Pro Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Ser Gln Ser Thr Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

165 170 175

Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

180 185 190

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu

195 200 205

Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp

210 215 220

Leu Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg Phe Arg Gly

225 230 235 240

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln

245 250 255

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

260 265 270

Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

275 280 285

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ser Pro Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser

325 330 335

Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn

340 345 350

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser

355 360 365

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

370 375 380

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn

385 390 395 400

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys His

405 410 415

His His His His His

420

<210> 16

<211> 1266

<212> DNA

<213> EPIL-2-2303301 nuclear sequence

<400> 16

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120

ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180

acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

gaagaactca aacctctgga ggaagcgcta aatttagctc caagcaaaaa ctttcactta 300

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

tggattacct ttagtcaaag caccatctca acactgactg gtggtggtgg ttctggcggc 480

ggcggctccg gtggtggtgg ttctggcggc ggcggctccg aggtgcagct gctcgagcag 540

tctggagctg agctggtgaa acctggggcc tcagtgaaga tatcctgcaa ggcttctgga 600

tacgccttca ctaactactg gctaggttgg gtaaagcaga ggcctggaca tggacttgag 660

tggattggag atcttttccc tggaagtggt aatactcact acaatgagag gttcaggggc 720

aaagccacac tgactgcaga caaatcctcg agcacagcct ttatgcagct cagtagcctg 780

acatctgagg actctgctgt ctatttctgt gcaagattga ggaactggga cgaggctatg 840

gactactggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag gtggtggtgg ttctggcggc 900

ggcggctccg gtggtggtgg ttctgagctc gtcatgaccc agtctccatc ttatcttgct 960

gcatctcctg gagaaaccat tactattaat tgcagggcaa gtaagagcat tagcaaatat 1020

ttagcctggt atcaagagaa acctgggaaa actaataagc ttcttatcta ctctggatcc 1080

actttgcaat ctggaattcc atcaaggttc agtggcagtg gatctggtac agatttcact 1140

ctcaccatca gtagcctgga gcctgaagat tttgcaatgt attactgtca acagcataat 1200

gaatatccgt acacgttcgg aggggggacc aagcttgaga tcaaacatca tcaccatcat 1260

cattag 1266

<210> 17

<211> 430

<212> PRT

<213> EPIL-2-2303407(IL-2-4-7 VL-VH)

<400> 17

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Ala Leu Asn Leu Ala Pro Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Ser Gln Ser Thr Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

165 170 175

Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

180 185 190

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu

195 200 205

Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu

210 215 220

Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

225 230 235 240

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu

245 250 255

Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

260 265 270

Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

275 280 285

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

290 295 300

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro

305 310 315 320

Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg

325 330 335

Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp

340 345 350

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val

355 360 365

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

370 375 380

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu

385 390 395 400

Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly

405 410 415

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys His His His His His His

420 425 430

<210> 18

<211> 1293

<212> DNA

<213> EPIL-2-2303407 nuclear sequence

<400> 18

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120

ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180

acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

gaagaactca aacctctgga ggaagcgcta aatttagctc caagcaaaaa ctttcactta 300

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

tggattacct ttagtcaaag caccatctca acactgactg gtggtggtgg ttctggcggc 480

ggcggctccg gtggtggtgg ttctggcggc ggcggctccg aggtgcagct gctcgagcag 540

tctggagctg agctggcgag gcctggggct tcagtgaagc tgtcctgcaa ggcttctggc 600

tacaccttca caaactatgg tttaagctgg gtgaagcaga ggcctggaca ggtccttgag 660

tggattggag aggtttatcc tagaattggt aatgcttact acaatgagaa gttcaagggc 720

aaggccacac tgactgcaga caaatcctcc agcacagcgt ccatggagct ccgcagcctg 780

acctctgagg actctgcggt ctatttctgt gcaagacggg gatcctacga tactaactac 840

gactggtact tcgatgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggtggt 900

ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggttctgagc tcgtgatgac ccagactcca 960

ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc 1020

cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct 1080

ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg gggtcccaga caggttcagt 1140

ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg 1200

ggagtttatt tctgctctca aagtacacat gttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 1260

cttgagatca aacatcatca ccatcatcat tag 1293

<210> 19

<211> 4365

<212> DNA

<213> 蛋白表达载体pTT5序列

<400> 19

gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300

tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360

gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420

ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480

tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540

ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600

gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660

catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720

tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780

acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840

cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900

ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960

tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020

gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080

acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140

acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acggatctct agcgaattcc ctctagaggg 1200

cccgtttctg ctagcaagct tgctagcggc cgctcgaggc cggcaaggcc ggatcccccg 1260

acctcgacct ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 1320

ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttggtcga gatccctcgg 1380

agatctctag ctagaggatc gatccccgcc ccggacgaac taaacctgac tacgacatct 1440

ctgccccttc ttcgcggggc agtgcatgta atcccttcag ttggttggta caacttgcca 1500

actgaaccct aaacgggtag catatgcttc ccgggtagta gtatatacta tccagactaa 1560

ccctaattca atagcatatg ttacccaacg ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt 1620

aaaagggtcc taaggaacag cgatgtaggt gggcgggcca agataggggc gcgattgctg 1680

cgatctggag gacaaattac acacacttgc gcctgagcgc caagcacagg gttgttggtc 1740

ctcatattca cgaggtcgct gagagcacgg tgggctaatg ttgccatggg tagcatatac 1800

tacccaaata tctggatagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagc ataggctatc 1860

ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc 1920

ctaatttata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 1980

ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc 2040

ctaatagaga ttagggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc atatactacc 2100

caaatatctg gatagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2160

tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2220

tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa 2280

tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa 2340

tctgtatccg ggtagcatat gctatcctca tgataagctg tcaaacatga gaattaattc 2400

ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2460

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2520

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2580

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2640

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2700

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2760

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2820

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2880

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 2940

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3000

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3060

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3120

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3180

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3240

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3300

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3360

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3420

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3480

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3540

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3600

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3660

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3720

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3780

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3840

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3900

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 3960

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4020

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4080

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4140

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4200

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4260

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 4320

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccg 4365

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由白介素2(IL-2)与抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)单链抗体融合连接构成EPIL2。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述白介素2(IL-2)可选自野生型IL-2或基因工程化的IL-2，优选基因工程化的IL-2；所述野生型IL-2的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述基因工程化的IL-2具有至少3处氨基酸残基取代；参照野生型IL-2的氨基酸序列，所述氨基酸残基取代优选C125S、V69A、I128T、和/或Q74P；更优选的，所述基因工程化的IL-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4、6、或8所示。

3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述抗人上皮细胞黏附分子(EpCAM)单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或13所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15或17所示。

5.编码权利要求1-4任一项所述融合蛋白的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子优选SEQ ID NO.16或18所示核苷酸序列。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述核酸分子。

7.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-4任一项所述融合蛋白EPIL2或编码融合蛋白的核酸分子，用于生产融合蛋白；所述细胞选自非人哺乳动物细胞，优选HEK293和CHO细胞。

8.权利要求1-4任一项所述融合蛋白和/或权利要求5所述核酸分子在制备药物组合物或体外诊断试剂盒中的应用，所述药物组合物优选为治疗肿瘤的药物组合物；所述体外诊断试剂盒优选为用于肿瘤免疫药物的药效预测和评价的试剂盒；所述肿瘤优选为结肠癌。

9.一种药物制剂、药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物制剂、药物组合物或试剂盒包含权利要求1-4任一项所述融合蛋白EPIL2。

10.权利要求1-4任一项所述融合蛋白EPIL2与其他治疗肿瘤的药物共同用于制备治疗肿瘤的药物组合物或试剂盒的用途，所述其他治疗肿瘤的药物优选抗PD-1/PD-L1抗体。

11.权利要求1-4任一项所述融合蛋白EPIL2在激活T细胞扩增中的用途。

12.权利要求1-4任一项所述融合蛋白EPIL2在评价抗PD-1/PD-L1抗体药物作用/疗效中的用途。

13.一种基因工程化的IL-2，其特征在于，所述基因工程化的IL-2具有至少3处氨基酸残基取代；参照野生型IL-2的氨基酸序列SEQ ID No.2，所述氨基酸残基取代优选C125S、V69A、I128T、和/或Q74P；更优选的，所述基因工程化的IL-2的氨基酸序列如SEQ ID No.6或8所示。

14.编码权利要求13所述基因工程化的IL-2的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子优选SEQ ID NO.5或7所示核苷酸序列。