CN110343715A - pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及其多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种pET‑28a‑SUMO‑凝血因子II蛋白抗原及多克隆抗体的制备方法，是利用草鱼凝血因子II特异性引物通过PCR扩增技术合成草鱼凝血因子II基因序列，再克隆到pET‑28a‑SUMO表达载体后导入到大肠杆菌（E.coli Rosetta）中表达，纯化，得到pET‑28a‑SUMO‑凝血因子II蛋白抗原，将该抗原多次免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，用pET‑28a‑SUMO‑凝血因子II蛋白作抗原亲合纯化，得到浓缩的草鱼凝血因子II多克隆抗体。通过本方法能得到满足后续实验需求的浓缩草鱼凝血因子II多克隆抗体，为后续检测草鱼凝血因子II的表达提供重要实验试剂。

Description

pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及其多克隆抗体的制备 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

凝血因子II又称为凝血素，是一种维生素K依赖型凝血蛋白，主要在肝脏中产生。它不仅能够在凝血因子VII和钙离子的作用下转化为凝血酶，而且还能够通过负反馈调控避免因凝血酶过度形成造成血栓症的发生，是平衡促凝血和抗凝血的重要因子。另外，研究表明人凝血因子II基因与不同的细菌和胞外蛋白(如磷脂和凝固酵素)的识别和相互作用存在密切关系，而且病原识别和凝血都在先天性免疫系统中扮演重要角色。因此，分析凝血因子II蛋白的表达对于研究生物体凝血和先天性免疫都具有重要意义。

草鱼作为我国大量养殖的淡水鱼类，是我国居民重要的水产蛋白质来源。但是草鱼病害却一直威胁草鱼的健康养殖，成为限制草鱼大规模养殖的关键瓶颈之一，也是影响草鱼品质的重要因素。对草鱼免疫机制的研究将有助于指导预防草鱼疾病以及开发免疫力和抗逆性强的新品种。然而，作为重要的凝血和先天性免疫调控因子的凝血因子II在草鱼免疫应答过程中的作用及表达规律尚未得到充分地研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及多克隆抗体的制备方法，利用本方法从草鱼凝血因子II基因序列开始构建，能够得到符合后续检测要求的草鱼凝血因子II多克隆抗体，为后续有效检测草鱼在不同条件下凝血因子II的表达调控规律提供了重要实验试剂。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原，其序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明同时提供一种多克隆抗体，该抗体是以SEQ ID NO.4所示的pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔后得到。

本发明还提供上述多克隆抗体的制备方法，该方法步骤如下：

(1)构建如SEQ ID NO.3所示的草鱼凝血因子II基因片段的重组表达载体，将该重组表达载体导入表达大肠杆菌中表达，纯化后获得pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原；

(2)利用该pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，将抗血清纯化，浓缩，即可。

上述步骤(1)中构建过程中扩增草鱼凝血因子II基因片段所使用的引物对序列为SEQ ID NO.1所示的pET-28a-SUMO-FII-F和SEQ ID NO.2所示的pET-28a-SUMO-FII-R。

上述步骤(1)中利用该pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔的过程如下：第一次免疫采用的免疫剂量为0.3mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂。

上述步骤(2)中采血时间为第一次免疫后52天，将抗血清纯化是用pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原亲和纯化。

本发明的有益效果在于：能够得到满足后续实验需求的浓缩草鱼凝血因子II多克隆抗体，为后续检测草鱼凝血因子II的表达提供重要实验试剂。

附图说明

图1是本发明草鱼凝血因子II基因PCR扩增产物电泳图。

图2是本发明草鱼凝血因子II大肠杆菌表达后破菌纯化PAGE凝胶电泳图；

图中，1：0.4mg/mL BSA；2：Marker；3：包涵体10倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；4：包涵体20倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；

表明：PCR扩增得到的草鱼凝血因子II基因序列在构建的大肠杆菌表达体系中充分表达，表达得到的蛋白质产物大小符合预期。

图3是本发明抗原WB和内源WB检测结果；

图中，上图为抗原WB，下图为内源WB。两只日本大耳兔血液纯化得到的多克隆抗体稀释1000倍后分别可检测到1ng和500pg抗原，说明得到的草鱼凝血因子II多克隆抗体浓度正常。

图4是使用本发明得到的草鱼凝血因子II抗体对健康草鱼不同器官或组织进行Western Blot杂交结果图；表明不同组织中凝血因子II的表达存在明显差异。

图5是使用本发明得到的草鱼凝血因子II多克隆抗体对患有出血病的草鱼肝脏中凝血因子II表达情况的Western Blot检测结果；

其中：A、B、C、D、E、F分别表示草鱼感染出血病病毒开始、12个小时、第1阶段、第3阶段、第7阶段和第10阶段，其中第1阶段表示开始发病，第3阶段表示发病进入严重阶段，第7阶段表示发病进入恢复阶段，第10阶段表示已痊愈。

具体实施方式

以下实施是对本发明的进一步说明和解释，而不是对本发明的限制。

实施例1草鱼凝血因子II基因片段的合成

以NCBI网站GenBank数据库中草鱼凝血因子II基因序列(检索号KF937688)，采用Beacon Desiner软件获得潜在引物后，采用Oligo 6.0评估并最终确定目的基因序列扩增引物，而后按照载体同源臂序列、酶切位点和目的基因序列扩增引物的顺序构成最终用于扩增草鱼凝血因子II基因的引物序列(引物由武汉爱博泰克生物科技有限公司合成)，其中酶切位点为NdeI-NotI和Kan+，引物序列如下：

pET-28a-SUMO-FII-F：5′-GAACAGATTGGTGGATCCAATAATAAGGAAGCCTCT-3′，SEQ IDNO.1；

pET-28a-SUMO-FII-R：5′-TGCGGCCGCAAGCTTTCCTCCCACAATTCTGC-3′，SEQ IDNO.2。

采用默克GenElute动物基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取草鱼DNA，以草鱼DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增(PCR反应体系为每50μl反应混合液包含终浓度为10×Buffer 5μl、10nmol引物1μl、10μmol dNTP1.5μl、2.5U Taq酶1μl、50ng草鱼基因组DNA 1.5μl，无菌水补充至50μl；PCR反应条件为95℃预变性5分钟，后接35个循环的常规PCR(94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸30秒)，最后72℃延伸10分钟)，预期大小为714bp。将扩增产物经凝胶回收后进行测序，与预期大小一致，结合参见图1，表明扩增产物即为草鱼凝血因子II基因片段(序列如SEQ ID NO.3所示)。

实施例2重组蛋白pET-28a-SUMO-凝血因子II抗原的获得

将扩增得到的符合预期的草鱼凝血因子II基因片段采用Axygen公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化，按照pET-28a-SUMO表达载体(购自华越洋生物(北京)科技有限公司)说明书将纯化后的草鱼凝血因子II基因片段连接到pET-28a-SUMO表达载体上，经测序确定连接正确后，导入大肠杆菌感受态细胞菌株E.coli Rosetta中，培养至OD₆₀₀为0.5-0.6。然后加入0.8mM IPTG，37℃诱导4小时以实现破菌，采用SDS-PAGE凝胶电泳对目的蛋白进行纯化，得到蛋白浓度和纯度达到免疫要求的pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白(pET-28a-SUMO-blood coagulation factor II蛋白)，大小为50kDa，序列如SEQ ID NO.4所示，与预期结果相符(图2)。

实施例3多克隆抗体的获得

挑选健康的6周大小的实验级日本大耳白兔(由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供)，稳定一周后首次从耳静脉采血10ml作为阴性对照，然后用制得pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白作为抗原多次免疫两只实验级日本大耳白兔：免疫部位为背部4个部位，每个部位注射250μl，第一次免疫采用的免疫剂量为0.3mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用抗原的剂量为0.15mg，使用不完全弗氏佐剂。第一次免疫后第52天，将免疫动物处死，取血，得到抗血清，将抗血清用浓度为3mg/ml的pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原进行抗原亲和纯化，从两只实验级日本大耳白兔抗血清中分别得到浓度为1.24mg/ml和1.71mg/ml的浓缩草鱼凝血因子II抗体，结合参见图3。

实施例4抗体的检测验证

为了验证得到的草鱼凝血因子II多克隆抗体是否能够用于后续WesternBlot实验，我们利用得到的草鱼凝血因子II多克隆抗体检测草鱼凝血因子II在健康草鱼肝、脾、肾、头肾、肠、鳃和肌肉中的表达情况，以及在患有出血病的草鱼肝脏中不同发病时间点的表达情况。每组实验采集了三条草鱼样本。首先从各检测器官或组织分别剪取0.025g组织，用冰预冷PBS清洗组织后加入200μl RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不到组织块；置于冰上10分钟，然后4℃、12000rpm/min离心15分钟，将离心后的上清分装转移至0.5ml离心管中用于后续实验。根据每个样品总蛋白量，按照上样量20μg点样至分离胶浓度为12％的PAGE胶中120V电泳至溴酚蓝到胶底部止。然后将草鱼凝血因子II蛋白(50kD)进行转膜后用丽春红染膜检测蛋白转膜效率，而后用1×TBST缓冲液将丽春红洗净。用1×TBST缓冲液配制5％脱脂奶粉，将膜侵入室温放置90分钟。用1×TBST缓冲液将得到的浓缩草鱼凝血因子II抗体按照750：1的比例稀释，将膜与抗体一起孵育，4℃过夜。孵育结束后，用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤15分钟。然后用1×TBST缓冲液按照6000：1稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，将稀释后的二抗与膜共同孵育90分钟，然后用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤15分钟。最后使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3分钟，用吸水纸吸尽液体后用保鲜膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光3分钟，显影冲洗。健康草鱼不同组织草鱼凝血因子II表达结果如图4所示，表明不同组织中草鱼凝血因子II的表达不同，草鱼ningxue因子II在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾和肌肉中不表达。草鱼凝血因子II在患有出血病的草鱼肝脏中不同发病时间点的表达结果如图5所示，结果表明草鱼肝脏中凝血因子II的表达随出血病的发展逐渐增加，并且在草鱼出血病后期还持续高表达。以上结果验证了通过本发明专利描述的方法能够得到用于草鱼凝血因子II表达检测的浓缩草鱼凝血因子II多克隆抗体。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原及其多克隆抗体的制备方法

<130> 006

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 1

gaacagattg gtggatccaa taataaggaa gcctct 36

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

tgcggccgca agctttcctc ccacaattct gc 32

<210> 3

<211> 714

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

aataataagg aagcctctca gattattcgt gcgaagaggg ccaacactgt ttttgaggag 60

ttaaagcctg gtaatctgga gagagagtgt gtggaagaga tctgtgacca tgaggaagct 120

cgagaagtgt ttgagagagt tgataaaacg gaaatatttt gggcgaaata tttaggctgt 180

gaaggaacaa ccctgtccag aacaccccaa aatattaaca gtttgagaat atgtgcgact 240

acagaggggg actgtttcat aaatattgga gcaaagtatg ctggtaaagt atctgtcacc 300

aagtctggaa aggcatgcca gtactggaaa agcaactttc cccacaagat tgacgaattt 360

aatgtgacac agctgaagct acaggagaac ttctgcagga acccagataa gcacaaagat 420

ggcccttggt gttttaccag agacccgact gtcaggaggg agacctgcaa tgtgccaaaa 480

tgcggtgagg ctgttgttcc tcctccaaaa gctcctttgg acaagtttgt ggaggaaggt 540

ggtggacgag aaagaacaac tctagaccaa aggaaagctt tctttaaccc ccgcagcttt 600

ggcaacggag agctagactg tggagagcgc cccttgtttg agaagatcaa caaagcggac 660

aagaatgaga aggagcttct gatgtcctat actggaagca gaattgtggg agga 714

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 4

Asn Asn Lys Glu Ala Ser Gln Ile Ile Arg Ala Lys Arg Ala Asn Thr

1 5 10 15

Val Phe Glu Glu Leu Lys Pro Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu

20 25 30

Glu Ile Cys Asp His Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Arg Val Asp

35 40 45

Lys Thr Glu Ile Phe Trp Ala Lys Tyr Leu Gly Cys Glu Gly Thr Thr

50 55 60

Leu Ser Arg Thr Pro Gln Asn Ile Asn Ser Leu Arg Ile Cys Ala Thr

65 70 75 80

Thr Glu Gly Asp Cys Phe Ile Asn Ile Gly Ala Lys Tyr Ala Gly Lys

85 90 95

Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Lys Ala Cys Gln Tyr Trp Lys Ser Asn

100 105 110

Phe Pro His Lys Ile Asp Glu Phe Asn Val Thr Gln Leu Lys Leu Gln

115 120 125

Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Lys His Lys Asp Gly Pro Trp Cys

130 135 140

Phe Thr Arg Asp Pro Thr Val Arg Arg Glu Thr Cys Asn Val Pro Lys

145 150 155 160

Cys Gly Glu Ala Val Val Pro Pro Pro Lys Ala Pro Leu Asp Lys Phe

165 170 175

Val Glu Glu Gly Gly Gly Arg Glu Arg Thr Thr Leu Asp Gln Arg Lys

180 185 190

Ala Phe Phe Asn Pro Arg Ser Phe Gly Asn Gly Glu Leu Asp Cys Gly

195 200 205

Glu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Ile Asn Lys Ala Asp Lys Asn Glu Lys

210 215 220

Glu Leu Leu Met Ser Tyr Thr Gly Ser Arg Ile Val Gly Gly

225 230 235

Claims (7)

1.一种pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原，其序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种多克隆抗体，其特征在于，该抗体是以SEQ ID NO.4所示的pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔后得到。

3.制备权利要求2所述的多克隆抗体的方法，其特征在于，该方法步骤如下：

（1）构建如SEQ ID NO.3所示的草鱼凝血因子II基因片段的重组表达载体，将该重组表达载体导入表达大肠杆菌中表达，纯化后获得pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原；

（2）利用该pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔，采血，收集抗血清，将抗血清纯化，浓缩，即可。

4.如权利要求3所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建过程中扩增草鱼凝血因子II基因片段所使用的引物对序列为SEQ ID NO.1所示的pET-28a-SUMO-FII-F和SEQ ID NO.2所示的pET-28a-SUMO-FII-R。

5.如权利要求3所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述利用该pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原免疫实验级日本大耳白兔的过程如下：第一次免疫采用的免疫剂量为0.3 mg，使用完全弗氏佐剂；12天后进行第二次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15 mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15 mg，使用不完全弗氏佐剂；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用草鱼凝血因子II抗原的剂量为0.15 mg，使用不完全弗氏佐剂。

6.如权利要求3所述的一种草鱼凝血因子II多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述采血时间为第一次免疫后52天。

7.如权利要求3所述的一种草鱼凝血因子II多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述将抗血清纯化是用pET-28a-SUMO-凝血因子II蛋白抗原亲和纯化。