CN1081765A

CN1081765A - 用于测定血红蛋白衍生物的免疫方法

Info

Publication number: CN1081765A
Application number: CN93104037A
Authority: CN
Inventors: J·卡尔; L·克尔舍; E·施奈德
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-03-05
Filing date: 1993-03-04
Publication date: 1994-02-09
Also published as: DE59310046D1; NZ247054A; HU9300596D0; IL104902A0; AU3387193A; ES2148190T3; JP2637677B2; CA2090981C; HUT70463A; PT559164E; DE4206932A1; FI930975A0; EP0559164B1; FI930975A; US5541117A; KR930020162A; NO930770L; SI9300108A; AU652092B2; SK14993A3

Abstract

本发明涉及一种用于测定血液样品中特殊的血红蛋白衍生物的含量的方法。具体地说，本发明涉及一种用于测定血红蛋白衍生物(例如糖化血红蛋白) 含量的方法，该方法需要单独测定血红蛋白衍生物，以便测定血液中衍生的血红蛋白的比例。本发明还涉及一种用于这一方法的适合的溶血试剂。

Description

本发明涉及一种用于测定血液样品中一种特殊的血红蛋白衍生物含量的方法。具体讲，本发明涉及一种用于测定一些血红蛋白衍生物，例如糖化（glycated）血红蛋白含量的方法，该方法为了测定血液中血红蛋白的比例需要单独测定总的血红蛋白含量和测定白红蛋白衍生物的含量。

在一个非酶促反应中，被红细胞吸收的少量的葡萄糖键合到珠蛋白的β链的N-末端缬氨酸基上，这取决于血糖水平。形成稳定的糖化血红蛋白衍生物HbA_1c（酮胺形式）的反应分两步进行。首先，经过一个快速的可逆附着形成不稳定的糖化血红蛋白衍生物（希夫碱）的过程，葡萄糖键合到血红蛋白上。其稳定形式是通过一个不可逆的慢重排反应（Amadori重排）形成的。在健康代谢的人体中的HbA_1c对总血红蛋白的比是3-6%。在患糖尿病的病人体中，HbA_1c所占有的比例在早期的四至十二周中与血液葡萄糖浓度水平成比例增加，最高达12%，有时甚至高达20%。特别是对HbA_1c与总血红蛋白含量的相对比例的测量提供了一种监测血糖控制过程的总体参数。

业已有一系列用于测定糖化血红蛋白的方法被人们描述过。通常的方法是基于诸如电泳、等电聚焦、比色测定、离子交换和亲合色谱这类技术。在制造专用的多克隆抗体（美国专利4247533）和单克隆抗体（EP-A-0316306，EP-A-0201187）的技术业已被公开后，又研究出一系列检测HbA_1c的免疫方法。

EP-A-0185870描述了一种用于测定若干蛋白质（包括HbA_1c）的方法。所使用的是能识别专门线性肽抗原决定基的单克隆抗体。为释放出所述抗原决定基定义了一种变性作用，尤其是利用离液序列高的试剂。在温度低于37℃时，这种变性步骤要用一至几小时时间，在温度高于50℃时，要用一分钟。但同时测量样品的总血红蛋白含量这一内容未加描述。

在EP-A-0201187中描述了一种测定HbA_1c的方法，在该方法中，所使用的抗HbA_1c单克隆抗体是通过天然人体HbA_1c免疫接种获得的。该试验是在4-37℃的温度下进行的，因而每一保温步骤最多可能要花72小时。有关测定同一样品中的总血红蛋白和HbA_1c含量的内容未加叙述。

EP-A-0315864中描述了一种用于测定血样中HbA_1c的相对含量的方法。利用硫氰酸盐使血红蛋白变性，并利用外加的氧化剂（最好是铁氰酸盐）将其转化为正铁血红蛋白。总的血红蛋白含量以及HbA_1c含量可在用这种方法处理的血样中加以测定。

在EP-A-0407860中描述了用锂盐（最好是用硫氰酸锂）溶解红细胞并使血红蛋白衍生物变性，HbA_1c含量可以利用免疫法来测定。为了测定总血红蛋白，必须额外地加入一种氧化剂，最好是铁氰酸盐（它可以将血红蛋白转化为正铁血红蛋白）。

后两个方法的缺点是为了把血红蛋白转化为氰基-正铁血红蛋白必须使用氰化物。在Clin.Biochem.15（1982）83-88中描述了有关用十二烷基硫酸钠代替氰化物测定总血红蛋白的内容。然而，在这一参考文献中并没有指出SLS适用于血红蛋白衍生物（特别是HbA_1c）免疫测定中的样品预处理。

在EP-A-0184787中，还描述了用于测定血样中总血红蛋白的无氰化物试剂。该试剂是一种PH值至少为11.3、最好大于13.7的离子表面活性剂。没有提及血红蛋白衍生物的免疫测定。在糖化血红蛋白衍生物的免疫测定过程中很高的PH值是有害的，因为在强碱介质中糖部分可能从血红蛋白上断裂下来。若所使用的抗体是加有酶标记的，则这种酶反应可能被抑制，因为所使用的酶的最佳PH值主要是在6至8之间。高PH值也可能使免疫反应受到抑制。

因此，仍然需要一种用于测定血液中血红蛋白衍生物的免疫测定方法，在该方法中，溶血作用可以在低温，例如在室温下进行，这样，就不需要很长的样品制备保温期，并避免使用对环境有害的试剂（例如氰化物）。此外，为能够测定血液中血红蛋白衍生物与血液中总血红蛋白之比而又无需进一步的溶血制备，在同一溶血产物中同时测定总血红蛋白应该是可能的。本发明的目的是提供这样一种用于测定血液中血红蛋白衍生物的免疫检测方法。

这一目的是利用本发明实现的，其特征在所述权利要求书中有更详细的记载。这一目的基本上是依靠用于测定血样中血红蛋白衍生物的含量的免疫测定方法达到的，该方法的特征在于样品是用含有PH值为5至9.5的离子洗涤剂的溶血剂加以处理，并且所述血红蛋白衍生物是用免疫法在溶血样中测定的。

本发明还涉及一种用于测定血样中血红蛋白衍生物和总血红蛋白含量的方法，该方法包括用含有PH值为5.0-9.5的离子洗涤剂的溶血试剂处理所述血液样品，在溶血样品中用光度法测定总血红蛋白含量，以及在溶血样品中用免疫法测定血红蛋白衍生物。

此外，本发明还涉及一种溶血试剂，该试剂含有PH值为5至9.5的离子洗涤剂，用于免疫法测定血红蛋白衍生物，如果需要的话，还用于测定总的血红蛋白含量的血液样品的样品制备;本发明还涉及一种试验试剂箱，其中包括有溶血试剂。

溶血试剂的作用导致血液样品中存在的红细胞被溶解并将血红蛋白转化为一种特殊的血红蛋白发色团。所形成的血红蛋白发色团通过它的特征吸收可以用于测定总血红蛋白含量并且通过专门的抗原决定基的免疫反应可用来测定血红蛋白衍生物。原则上所有的常规方法都可用于免疫检测法，例如夹层试验、IEMA试验、沉淀或凝集试验以及基于FPIA和CEDIA技术的试验。除干试验之外湿试验也是可行的。

可用于溶血试验的离子洗涤剂是阴离子洗涤剂[最好是十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠（DONS）]，阳离子洗涤剂[最好是十四烷基三甲基胺溴化物（TTAB）或十六烷基三甲基胺溴化物（CTAB）]或两性离子洗涤剂。（最好是Zwittergent 3-14）。加到血液样品中的溶血试剂的量要足以将红细胞溶解，并把血红蛋白转化为将定的血红蛋白发色团以及释放出血红蛋白衍生物的抗原决定基。血液样品中的溶血试剂是按1∶10到1∶400的比例加入的，这样，在得到的混合物中离子洗涤剂的浓度为0.01-5%（按重量计），最好是0.5-1.5%（按重量计）。溶血试剂的PH值在弱酸到弱碱范围内，PH5.0-9.5之间较为可取，最可取是PH7.4。所有常规的缓冲剂都可以用于溶血试剂调节PH值。最好采用HEPES、MES、TRIS或磷酸盐缓冲剂。

溶血试剂还可以含有另外一些试剂，例如用于消除免疫反应干扰的、氧化血红蛋白的、除浑浊的、起稳定作用的或用于保藏的试剂。包括SDS在内的一些洗涤剂可能干扰免疫反应。在极少数情况溶血试剂加入后会出现浑浊和絮凝，这有不同的原因。例如，在低温下SDS的溶解度极低。出乎人意料的是原来这些干扰可以通过加入非离子洗涤剂来避免，较为可取的洗涤剂是聚氧乙烯醚类，如Brij35和58或Triton×100以及聚氧乙烯酯类，如Myrj 52和59或Tween20。非离子洗涤剂通常按照这样的量加到溶血试剂中，即在加样后，在所得混合物中其浓度是0.01-5%（按重量计），而以0.1-0.5%（按重量计）较为可取。

通常使用的另外一种氧化剂是氰铁酸盐，例如六氰基高铁酸盐（Ⅲ），也可以包括在溶血试剂中。但是，在与阳离子洗涤剂结合时，可能会出现沉淀。此外，当使用氰铁酸盐时必须避光。出人意料的是原来当加入防腐剂时，整个反应机制是基于硫羟基（例如methylisothiazolone或Bronidox K）的氧化浸蚀，氰铁酸盐的加入可以完全忽略不计。这些防腐剂在与阳离子洗涤剂结合时产生棕绿色血红蛋白发色团，它的最大吸收在570nm。这一突出的优点首先是这些防腐剂的加入导致将血红蛋白转化为一种特征血红蛋白发色团以及生成溶血试剂的一种良好的防腐剂，其次是溶血作用的终点容易通过颜色由红到棕绿的变化来识别。在溶血试剂中所使用的防腐剂的浓度范围为0.005-0.2%（按重量计），最好是0.01-0.02%（按重量计）。

溶血作用，即借助于溶血试剂将血红蛋白转化为所述特殊的血红蛋白发色团以及为测试血红蛋白衍生物的样品制备，是在低温下，较为可取是在4-37℃，而最好是在室温（20℃）下，在1至10分钟后完成。在大多数情况下对于完成样品制备来说2分钟保温是足够的。

按这种方式制备的血液样品随后按1∶10到1∶100的比例用反应缓冲剂稀释。所有不干扰免疫反应的现有缓冲剂都可用作所述缓冲剂。最好采用浓度为10-200mmol/l的MES或HEPES缓冲剂。反应缓冲剂的PH值最好是从5.0到8.0。若免疫试剂包括一酶反应，则该反应缓冲剂最好具有与适于酶反应的最佳PH值相对应的PH值。此外，反应缓冲剂可以已经含有一些对于血红蛋白衍生物试验所必需的一些试剂，尤其是键合配偶体，最好是高度专一的多克隆抗体和单克隆抗体。

出人意外的是原来在这种情况下再加入一种其他的洗涤剂（最好是非离子洗涤剂，如Brij或Myrj）对于为检测血红蛋白衍生物（如糖化血红蛋白）以及为免疫反应和避免干扰提供样品制备的最佳条件是有利的。这种洗涤剂的加入量使得在所形成的混合物中其浓度为0.01-5%（按重量计），最好是0.5%（按重量计）。

如果除了测定血红蛋白衍生物之外还要测定同一样品中的总的血红蛋白含量，那么要在400-650nm的波长范围测量吸收度，更好的波长范围为500-650nm，最好是在540-570nm，为了测定总的白红蛋白含量最好是在加入所述反应缓冲剂之后。在湿试验情况，是在一比色血中用光度法测定之一波长的吸收度，在干试验情况，可以在把所形成的混合物涂到一个试验载体上之后用反射光度法测定该吸收度。

用于检测总血红蛋白含量的这样的试验载体的结构可以很简单，因为它不必含任何化学物质。装在一透明载体薄片上的吸收垫足以满足简单的要求。为了改进对试验条的处理和评价，还可能包括其他的载体层，例如转移垫或剂量垫。

在加入溶血试剂之后，总血红蛋白含量和血红蛋白衍生物含量也可以在该样品的不同部分加以测定。在这种情况，总的血红蛋白含量是在样品和溶血试剂混合物的一部分中用光度法测定的，如果必要的话，要在适当稀释后进行。将反应缓冲液加到混合物的第二部分中，随后用免疫测定法测定血红蛋白衍生物。

从原则上说，所有现有的免疫方法都适合于测定血红蛋白衍生物，如HbA_1c。如上所述，制备针对血红蛋白衍生物（例如HbA_1c）的多克隆抗体和单克隆抗体是可能的，这些抗体专门键合到血红蛋白衍生物的特性抗原决定基上（US4247533，EP-A-0316306以及EP-A-021187）。

免疫试验变形、标记类型以及检测测量信号的方法是本领域公知的方法。例如酶标记的夹层试验（ELISA）、IEMA试验程序、RIAs、沉淀和絮凝试验以及均匀免疫测定法，如CEDIA

、EMIT或FPIA都是合适的。

在湿法试验中，血红蛋白衍生物的免疫测定最好按照TINIA技术来进行，因为在这种情况分离步骤是不必要的。一种分析物专用抗体以及作为凝集试剂的多半抗原（polyhapten）加到样品中。由载体物质，如清蛋白、葡聚糖或IgG构成多半抗原，一些特定的抗体可以健合的抗原决定基偶合于这些载体物质之上。因为抗体沉淀只有经过多半抗原才能发生，可用浊度测定法或比浊测定法测定的浊度的增加值可以利用减少该样品中的分析物含量来获得。

在反应缓冲剂中最好已经含有血红蛋白衍生物专有抗体。加入反应缓冲剂后，首先用光度法测定所得到的混合物中的总血红蛋白含量。所述沉淀反应是通过加入含有多半抗原的溶液来启动的。在短暂的保温期（通常五分钟就够了）在适当的波长（波长范围在340-600nm，比较可取，最好是在340nm）测量所产生的浊度，并由此测量血红蛋白衍生物的浓度。因为测量总的血红蛋白含量是在500-650nm（最好是在546或570nm）波长范围进行的，所以这两种测量彼此互不干扰，因此可以在相同的反应溶液中在一个比色皿中同时进行。

当制备多半抗原溶液，即多半抗原或糖基化蛋白或多肽的液体盖仑制剂时，人们并清楚原来这种溶液在磷酸缓冲液中是不稳定的，所述的磷酸缓冲液通常是在PH值为7.0-7.5的范围内使用并可导致糖蛋白在长期贮存过程中发生分解。关于糖基化蛋白在磷酸缓冲液中不稳定这一内容，例如在Ahmed等在j.Biol.Chem.261（1986）4899-4894的文章中已被公开。通过使用浓度为5-200mmol/l。最好是20-50mmol/l;PH值为5.0-8.0，最好在6.0-6.5之间的MES缓冲剂并同时加入EDTA或等效的复合试剂（较为可取的浓度范围为1-50mmol/l，最好是0.1-20mmol/l）来达到使糖基化多肽、蛋白质和多半抗原稳定的目的。按照浓度为0.1-2%、最好是1%的条件加入牛血清蛋白（BSA）进一步增强了所述多半抗原溶液的稳定性。这种多半抗原在4℃的温度下可存放12个月以上而不会观察到多半抗原或糖基化蛋白或多肽有明显的不稳定的迹象。在35℃温度下存放3个星期时，信号的降低只是原始吸收信号的15-20%。

以干试验形式对血红蛋白的衍生物进行免疫测定最好是根据IEMA试验技术。在将反应缓冲剂加入溶血血样之后，加入专用的酶标记抗体。在一个优选的实施例中，这种抗体已存在于所述反应缓冲溶液中。在短期保温后，将这种混合物加到试验载体上。游离的酶标记抗体被俘获在抗原决定基的基质，即一些抗原决定基（一些特定的抗体可以键合于其上）可以耦合于其上的试验载体区之上。在另外的一个区，即试验区，血红蛋白衍生物与酶标记抗体的复合物通过使一合适的酶底物转化利用反射光度法加以测定。所述底物可以存在于该试验区或通过使试验区与另外一个含有该底物的区相接触来获得。

以试验箱的形式采购对本发明的方法来说所必要的试剂是适宜的，所述试验箱除去溶血试剂之外还包括至少二个单独的包装形式的其他的溶解形式的或冷冻干燥形式的或涂到一个试验载体上的一些试剂。

本发明借助以下一些例了来加以阐述。

例 1

在一个湿试验中同时测量总的血红蛋白和HbA_1c

这些实验可以在the Boehringer Mannheim GmbH的Hitachi717上进行。在波长546nm处用光度法测量总血红蛋白含量。根据TINIA试验技术在波长340nm处用比浊测量法来完成对HbA_1c的免疫测定。所有的测定和培育都在37℃下进行。

使用以下一些溶液。

溶血试剂：

20mM NaPO₄缓冲液

1.0% SDS

0.1% 叠氮化钠

0.02% 六氰基高铁酸钾（Ⅲ）

0.5% Brij 35

反应缓冲剂：

20mM MES缓冲剂，PH6.0

150mM 氯化钠

3.0% PEG 6000

0.5% Brij 35

0.1% 牛血清蛋白

0.1% 叠氮化钠

10mM EDTA

6mg/ml PAB<HbA_1c>S-IgG（DE）（抗HbA_1c的多克隆羊AB）

100μg/ml MAB<HbA_1c>M-IgG（DE）（抗HbA_1c的单克隆鼠AB）

多半抗原溶液：

20mM MES 缓冲剂，PH6.0

150mM 氯化钠

6.0% PEG 6000

0.5% Brij 35

0.1% 牛血清蛋白

25μg/ml 多半抗原HbA_1c-β-1-4（Cys，MHS）-BSA 18∶1

按100∶1的比例将溶血试剂加到血液样品中并在25℃下保温2分钟。将250微升反应缓冲剂加到5μl溶血样品中，4分钟后在波长546nm处测量总血红蛋白的吸收度（A1）。一分钟后波长340nm处测量吸收度（A2），随后用滴管加入50μl多半抗原溶液，并保温5分钟，接下去在波长340nm处测量浊度（A3）。

为测定HbA_1c的值（克/分升），将吸收度差△A＝A3-K.A2对HbA_1c浓度作图并用图解法加以测量。

K＝体积校正因子＝ (样品体积+反应缓冲剂体积)/(总体积)

由常数因子K乘以A1（K＝血红蛋白发色团的摩尔消光因子×稀释因子）计算总血红蛋白浓度。具有一已知血红蛋白和HbA_1c含量的EDTA全血用作校正标准。为了建立起一条校正曲线，以不同量的溶血试剂稀释EDTA全血。

在图1和图2中以图示方式给出了所述校正曲线。在图1中，以总血红蛋白浓度对A1作图，给出一线性关系。这样，在计算时可以乘以一个常数因子。在图2中，以吸收度差△A＝A3-KA2对HbA_1c含量作图。

在进一步的一些实验中，首先用滴管将多半抗原溶液加到溶血血样中，经过5分钟保温后，通过加入含有专门抗体的反应缓冲剂启动沉淀反应。与以上提到过的首先加抗体、而后再加多半抗原的方式相比较，这种滴加顺序使得HbA_1c测定灵敏度明显降低（图3）。

例 2

用于测定总血红蛋白和HbA_1c的试验条

把300μl溶血试剂加到30μl全血中，在20℃保温10分钟。所述溶血试剂由0.18%SDS溶液（被缓冲保持PH为7）构成。

为了测定总血红蛋白，将32μl溶血血样涂到一个试验条上，该试验条的结构如图4所示。它仅由一个未经处理的玻璃纤维剂量垫（1）、一个未经处理的玻璃纤维转移垫（2）、未经处理的聚酯纤维（3）和一个透明的聚碳酸酯薄片（4）构成。该试验条不含其他的化学药品。利用这一试验程序可以在波长576nm处非常准确地测量血样的总血红蛋白含量。

于是，获得了低于2.5%的偏差系数（表1）。

表1：

总血红蛋白的测定

在每一种情况由10个单独的测量值计算CV。

血红蛋白浓度 CV

[g/dl] [%]

14.1 1.0

17.5 2.5

13.7 1.9

14.7 1.8

为了测定HbA_1c浓度，将1200μl反应缓冲剂加到32μl溶血样品中并保温10分钟。反应缓冲剂由100mM Hepes（PH7.4）、100mM NaCl和0.1% Brij 35（含有MAB-酶共轭体）构成。将32μl的这种混合物涂到试验条上（如在图5中所示）。游离的抗体一酶共轭体被捕获在一抗原决定基基质（11）上。在邻近区域，即在转移垫上，在含有底物的底物垫（13）与转移垫（12）接触后借助于该底物的反应用反射光度法测定HbA_1c抗体一酶复合物（表2）。

表2：

利用一试验条测定HbA_1c浓度

在每一种情况都由10个单独的测量值计算CV。

HbA_IC浓度 CV

[g/dl] [%]

0.8 6.8

1.1 5.4

1.4 6.0

例3：各种离子洗涤剂对测定HbA_1c的影响

这些试验按例1中所述那样进行。溶血剂具有如下组成：

20mM NaPO₄缓冲剂，PH7.2

0.1% 叠氮化钠

0.02% 六氰基高铁酸钾（111）

0.5% Brij 35

表3中所列的离子洗涤剂在其中所述的那些相应的浓缩物中都存在。

在TTAB和CTAB的情况，在溶血剂中不包含六氰基高铁酸钾（111），因为这种盐与这些洗涤剂一起沉淀了。

所述反应缓冲剂以及多半抗原的组成与例1相同。

HbA_1c的含量为3.2g/dl的标准液被用作血液样品。所有被试验的离子洗涤剂都导致细胞的溶解和释放抗原决定部位。阴离子洗涤剂SDS和阳离子洗涤剂TTAB和CTAB证实了它们是最适合的。

例 3

HbA_1c测定

在溶血试剂中各种离子洗涤剂的影响。

在波长340nm处测定吸收度。

例 4

HbA_1c测量的动态测量范围对Brij 35浓度的依赖关系

所述那些试验是按例3中所述条件进行的。在溶血试剂中始终使用1%的SDS。在反应缓冲剂中Brij 35的浓度在表中所述的范围内变化。使用例3中所述的HbA_1c标准作为样品。

通过加入0.1%的Brij 35已经把测量范围从对照的47mA增加到233 mA。Brij 35的较为可取的浓度是0.1-1.0%。

表4

在反应缓冲剂中各种Brij浓度对HbA_1c测量的影响

在波长340nm处测定吸收度。

例 5

在反应缓冲液中各种洗涤剂对HbA_1c的影响

这些试验的进行类似于例4。表5中所述的那些洗涤剂被用在反应缓冲液中。所述动态测量范围的扩展主要靠加入Brij 35、56和58，Myrj 52和59，然而其他的非离子洗涤剂（例如Triton）和两性洗涤剂（例如Zwittergent·3-14）与对照试验相比也显示出很积极的影响。

表5

在反应缓冲剂中洗涤剂的影响

例 6

同时测量具有特殊的棕绿色血红蛋白发色团的总血红蛋白和HbA_1c

所述这些试验是在the Boehringer Mannheim GmbH的Hitaehii717上进行的。在波长570nm处用光度法测定总血红蛋白含量。HbA_1c的免疫测定是根据TINIA试验技术通过在波长340nm处的测定浊度来进行的。所有的测量和保温都是在37℃的温度下进行的。

使用以下溶液：

溶血试剂：

20mM NaPO₄缓冲剂，PH7.4

1.0% 十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）

0.01% methylisothiazolone

0.02% Bronidox K

0.5% Brij 35

10mM EDTA

反应缓冲剂：

20mM MES缓冲剂，PH 6.0

150mM 氯化钠

3.0% PEG 6000

0.5% Brij 35

0.01% methylisothiazolone

0.02% Bronidox

K

1.2mg/ml PAK<HbA_1c>S-IgG（DE）抗HbA_1c的多克隆羊AB）

多半抗原溶液：

20mM MES缓冲剂.PH 6.0

150mM 氯化钠

6.0% PEG 6000

0.5% Brij 35

20μg/ml 聚米抗原

溶血试剂是按100∶1的比例被加入血液样品中并在25℃温度条件下保温2分钟，将250μl反应缓冲液加到1.0μl溶血样品中。4分钟后在波长570nm处测量总血红蛋白吸收度（A1）。一分钟后在波长340nm处测定吸收度（A2），接下去用滴管滴加50μl多半抗原溶液并保温5分钟。而后，在波长340nm处测量所述浊度（A3）。

为了测量HbA_1c的值（单位为g/dl），用吸收度之差△A＝A3-KA₂相对于HbA_1c的浓度作为并用图解法测量。

K＝体积校正因子＝ (样品体积+反应缓冲剂体积)/(总体积)

由常数因子K乘以A1来计算总血红蛋白的浓度（K＝血红蛋白发色团的摩尔消光系数×稀释因子。在图6中给出了特征吸收光谱。具有已知的血红蛋白和HbA_1c含有的EDTA全血用作校正标准。为了完成一条校正曲线要用不同数量的溶血试剂稀释EDTA全血。

在图7和8中以图示法显示所述校正曲线。在图7中，用总血红蛋深度对A1作图。这就产生了一个线性关系。因此，操作者在计算中可以乘以一个常数因子K，在图8中用吸收度差△A＝A3-KA2相对于HbA_1c含量作图。

Claims

1、用于测定血液样品中血红蛋白衍生物含量的方法，其中

(a)该血液样品用含有PH值为5至9.5的离子洗涤剂的溶血试剂进行处理，以及

(b)用免疫法在溶血血液样品中测量血红蛋白衍生物。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述血液样品在温度4至37℃条件下用溶血试剂进行处理最长时间为10分钟。

3、如权利要求1和2之一所述的方法，其中溶血试剂还含有非离子洗涤剂。

4、如权利要求1-3之一所述的方法，其中含有非离子的或两性的洗涤剂的反应缓冲剂被加到溶血样品中，并且在所生成的混合物中用免疫法测定血红蛋白衍生物。

5、如权利要求1-4之一所述的方法，其中血红蛋白衍生物是HbA_1c。

6、用于测定血液样品中血红蛋白衍生物含量和总血红蛋白含量的方法，其中

（a）所述血液样品用含有PH值为5-5.9的离子洗涤剂的溶血试剂进行处理;

（b）在溶血样品中测定总血红蛋白含量，以及

（c）在溶血样品中用免疫法测定血红蛋白衍生物。

7、如权利要求6所述的方法，其中通过测量所述特定的血红蛋白发团的的特征吸收度来测量总血红蛋白含量。

8、如权利要求6和7之一所述的方法，其中所述溶血试剂还含有非离子洗涤剂。

9、如权利要求6-8之一所述的方法，其中含有非离子的或两性的洗涤剂的反应缓冲剂被加到所述溶血样品中并在所生成的混合物中测定总血红蛋白和血红蛋白衍生物。

10、含有PH值为5-5.9的离子洗涤剂的溶血试剂。

11、如权利要求10所述的溶血试剂，其中它还含有非离子洗涤剂。

12、如权利要求10或11之一所述的溶血试剂，其中包括一种适当的氧化剂或防腐剂，其作用机理是基于巯基的氧化腐蚀。

13、如权利要求10-12之一所述的溶血试剂用于所述血红蛋白衍生物的免疫测定或用于同时测定样品中血红蛋白衍生物和总血红蛋白含量。

14、用于免疫测定血红蛋白衍生物的试验箱，包括至少二个单独的包装，其中之一装有如权利要求10-12之一所述的溶血试剂，另一个装有另外一种混合物，该混合物包括有免疫测定血红蛋白衍生物所必须的一些试剂。

15、如权利要求14所述的试验箱，其中对于免疫试验所必须的一些试剂被涂到一试验载体上。

16、稳定糖基化蛋白质、多肽或多半抗原溶液的方法，其中使用PH值5.0-8.0的MES缓冲剂作为缓冲剂并且该溶液含有EDTA。

17、如权利要求16所述的稳定该溶液的方法，其中加有BSA。