CN108137680B

CN108137680B - 结合犬血管内皮生长因子的抗体及其在治疗犬血管生成相关疾病中的用途

Info

Publication number: CN108137680B
Application number: CN201680033115.8A
Authority: CN
Inventors: 张明熙
Original assignee: Yung Shin Pharm Industries Co Ltd
Current assignee: Yung Shin Pharm Industries Co Ltd
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: EP3280732A4; EP3280732B1; TW201718640A; EP3280732C0; US20160289313A1; CN108137680A; US9758575B2; WO2016164405A1; EP3280732A1; JP2018516067A; TWI675042B; JP6811186B2

Abstract

本文公开了能够抑制犬血管内皮生长因子的抗体及其在治疗犬血管生成相关病症，例如增殖性疾病中的用途。

Description

结合犬血管内皮生长因子的抗体及其在治疗犬血管生成相关疾病中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月6日提交的，名称为“结合犬血管内皮生长因子的抗体及其用途”的美国专利申请号14/679,573的申请日的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)参与血管生成。VEGF的抑制影响这一过程并可能限制肿瘤生长和转移能力。贝伐单抗

是重组人源化IgG1单克隆抗体，其与人VEGF-A结合并阻止其与VEGF酪氨酸激酶的相互作用，从而诱导阻断VEGF介导的血管生成。

癌症是犬死亡的主要原因。在2000只狗的尸检(验尸)中，不论年龄大小，所有狗中的23％，以及10岁或10岁以上的狗中有45％的死因是癌症。每年有风险的每十万只动物的年龄调整总体癌症发病率估计值范围为381只狗。这些发病率与人类癌症的发病率相当(Vail等，2000)。

发明内容

本发明至少部分基于抗犬VEGF抗体的开发，其显示体内阻断血管生成和减少癌细胞生长和肿瘤体积的活性。

因此，本发明的一个方面的特征在于分离的抗体(非天然存在的抗体)，其与抗体mAb 57C结合犬血管内皮生长因子(VEGF)中的相同表位或者与抗体mAb57C 竞争结合犬VEGF。抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。备选地或另外地，抗体可以是犬抗体或犬源化抗体。

在一些实施方案中，抗体可以包含：

重链，包含如SEQ ID NO：5所示的重链互补决定区1(HC CDR1)，如SEQ ID NO： 6所示的重链互补决定区2(HC CDR2)和如SEQ ID NO：7所示的重链互补决定区3 (HC CDR3)，和/或

轻链，包含如SEQ ID NO：8所示的轻链互补决定区1(LC CDR1)，如SEQ ID NO： 9所示的轻链互补决定区2(LC CDR2)和如SEQ ID NO：10所示的轻链互补决定区3 (LC CDR3)。

在一些实例中，所述抗体可包含含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区；和/或含有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区。

另一方面，本发明的特征在于共同编码如本文所述的任一抗犬VEGF抗体的核酸或一组核酸。这种核酸或核酸组可以包含在一个载体或一组载体中，所述载体或载体组可以是表达载体。

此外，本发明内容提供了包含本文所述的任何抗犬VEGF抗体或任何核酸/核酸组和药学上可接受的载体(适用于犬受试者)的药物组合物。

本发明内容还提供了用于治疗犬受试者的血管生成相关疾病的方法，包括向有此需要的犬受试者施用有效量的本文所述的任何抗犬VEGF抗体或有效量的编码所述抗体的核酸/核酸组。该方法可以进一步包括向犬受试者施用用于治疗靶血管生成相关疾病的另外的治疗剂，例如用于治疗犬癌症的另一种化疗剂。

需要治疗的犬受试者可以是患有，怀疑患有血管生成相关疾病或有患血管生成相关疾病危险的狗。示例性血管生成相关疾病包括，但不限于增生性疾病，黄斑变性，年龄相关性黄斑变性，糖尿病性视网膜病，视网膜脱离，青光眼，结膜和角膜的翼膜，视神经脊髓炎，角膜新生血管形成，肿瘤性脑膜炎，骨髓纤维化，放射性坏死和瘢痕疙瘩。在一些实施方案中，所述血管生成相关疾病是可以是成胶质细胞瘤，肉瘤，肝细胞癌，炎性乳腺癌胰腺癌，转移性黑素瘤，卵巢癌，高风险成神经细胞瘤，食道癌，胃癌，转移性头部肿瘤，转移性颈部肿瘤，宫颈癌，腹膜癌和鳞状细胞癌等癌症(例如实体瘤)。

本发明的范围还包括：(i)用于治疗如本文所述的任何犬血管生成相关疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含如本文所述的任何抗犬VEGF抗体或编码核酸/ 核酸组和药学上可接受的载体；和(ii)任何抗体或一种或多种编码核酸在制备用于治疗目标犬血管生成相关病症的药物中的用途。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从以下附图和几个实施例的详细描述以及从所附权利要求中，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面，通过参考附图并结合本文给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明的某些方面。

图1包括显示施用抗dVEGF mAb 57C体内减少肿瘤生长的图。A：给予mIgG，抗犬VEGF mAb 57C，未治疗(仅CMT-1肿瘤)后不同时间的肿瘤大小。B：所述治疗后从小鼠获得的肿瘤。C：使用游标卡尺测量的肿瘤体积图。**表示与mIgG对照相比 P<0.01。

图2包括显示施用抗-VEGF mAb 57C体内降低肿瘤生长的图。A：施用mIgG，抗犬VEGF mAb 57C或未治疗(仅CMT-1肿瘤)后不同时间的肿瘤大小。B：所述治疗后从小鼠获得的肿瘤。C：使用游标卡尺测量的肿瘤体积图。*表示与mIgG对照相比 P<0.05；**表示与mIgG对照相比P<0.01。

图3包括显示施用抗-VEGF mAb 57C体内减少肿瘤生长的图。A：显示施用mIgG，抗犬VEGF mAb 57C或未治疗(仅CMT-1肿瘤)后的不同时间肿瘤大小。B：显示所述治疗后从小鼠获得的肿瘤。C：显示使用游标卡尺测量的肿瘤体积的图。**表示与 mIgG对照相比P<0.01；#表示与mIgG对照相比P<0.05(每两周一次)。

具体实施方式

犬类产生发展与血管生成有关的疾病，如癌症，具有与人类中的疾病类似的组织病理学和生物学行为。犬癌转移频繁，化疗和放疗的有效性受到限制。犬恶性乳腺肿瘤在中年动物中相当常见，并且具有类似于女性乳房肿瘤的转移模式。犬乳腺肿瘤 (CMTs)是女性犬中最常见的肿瘤，超过50％的CMT被诊断为恶性(Tien等，2015)。虽然这些肿瘤的发生率在进行预防性卵巢切除的地理区域中减少，但它仍然是兽医学中重要的疾病实体。而且，与人类乳腺癌相比，治疗选择是有限的。

本发明基于开发结合犬血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，其降低了血管生成并显示出体内抗癌活性。因此，本文公开的方法为患有血管生成相关疾病或具有患血管生成相关疾病风险的犬受试者提供了治疗方法。

抗犬VEGF抗体

本文描述了抗犬抗体mAb57C，其抗原结合片段以及其功能等价物和功能变体。这样的抗体与犬VEGF结合，这可减少或阻止VEGF分子与细胞上的VEGF受体相互作用和 /或激活细胞上的VEGF受体。本文所述的任何抗体可用于治疗与血管生成相关的犬疾病，例如癌症。

如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换使用，并且指全长抗体分子，例如IgG，IgA，IgD，IgE和IgM，其抗原结合片段，例如Fab，F(ab')2，Fab'和 Fv以及基因工程抗体分子，例如嵌合抗体，犬源化抗体，scFv(单链抗体)，dAb(结构域抗体；参见Ward等，(1989)Nature，341：544)和双特异性抗体(例如，能够结合VEGF和另一分子)。

本文所述的任何抗犬VEGF抗体可以是通过例如常规重组技术从全长抗体(例如，嵌合，犬源化或单链)衍生的基因工程抗体。

本文所述的抗犬VEGF抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同种抗体群体，“多克隆抗体”是指异种抗体群体。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。

以下提供了mAb 57C的重链和轻链的氨基酸序列和编码核苷酸序列。可变区以粗体字表示；互补决定区(CDR)是粗体和下划线的；而恒定区是斜体字。

重链核苷酸序列(SEQ ID NO:1)

重链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

下表1列出了抗体mAb57C的重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸序列：

表1 mAb57C的CDR序列

在一些实施方案中，本文所述的抗体包含与单克隆抗体57C相同的重链互补决定区1(HC CDR1)，互补决定区2(HC CDR2)，互补决定区3(HC CDR3)。在一些实施方案中，本文的抗体具有与抗犬VEGF抗体57C相同的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含与单克隆抗体57C相同的轻链互补决定区1(LC CDR1)，互补决定区2(LC CDR2)，互补决定区3(LC CDR3)。在一些实施方案中，本文的抗体具有与抗犬VEGF抗体57C相同的轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，本文所述方法中使用的抗体是mAb 57C的功能等价物。这样的功能等价物可以是结合犬VEGF的相同表位的抗体，并且相对于抗体57C，可以表现出至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的中和VEGF 介导信号传导通路的活性。备选地或另外地，mAb 57C的这种功能等价物相对于抗体 57C，可表现出至少20％(例如30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更高多)的降低VEGF介导细胞增殖的活性。

犬VEGF的“表位”是指犬VEGF(例如GenBank登录号NP_001003175，NP_001103972或NP_001103971)上与抗体例如Fab或全长抗体结合的位点。这样的靶位点可以完全由氨基酸组分组成，完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)组成，或者由它们组合组成。重叠表位包括至少一个共同的氨基酸残基，糖基，磷酸基团，硫酸基团或其他分子特征。

如果第一结合抗体结合到第二结合抗体结合的目标化合物上的相同位点，或者结合到与第二结合抗体的结合位点重叠的位点(例如50％、60％、70％、80％、90 ％或100％重叠，例如就氨基酸序列或其他分子特征(例如，糖基，磷酸基团或硫酸基团))，则第一结合抗体和第二结合抗体“结合到相同的表位”。可以通过常规技术确定抗体结合的犬VEGF中的特异性表位。

此外，mAb57C的功能等价物可以是与mAb57C竞争结合靶标犬VEGF的抗体。如果第一结合抗体与其表位的结合减少(例如减少10％、20％、30％、40％、50％、60 ％、70％、80％、90％、100％或更多)了结合其表位的第二结合抗体的量，则第一结合抗体与第二结合抗体“竞争结合”。竞争可以是直接的(例如，第一结合抗体结合与第二结合抗体结合的表位相同或重叠的表位)或间接的(例如，第一结合抗体与其表位结合引起目标化合物的空间变化，降低了第二结合抗体结合至其表位的能力)。抗体是否与mAb 57C竞争结合靶抗原可以通过常规实践来确定，例如竞争性ELISA。

在一些实施方案中，本文所述的抗犬VEGF抗体是mAb 57C的功能变体，其是与mAb57C结构和功能相似的抗体。在一些情况下，抗体mAb57C的功能变体含有与抗体mAb57C 相同的负责抗原结合的区域/残基，例如重链和/或轻链CDR中相同的特异性决定性残基或全部CDR。负责抗原结合的区域/残基可以通过本领域已知的方法从抗体57C的重链/轻链序列(如上所示)的氨基酸序列中鉴定。参见例如www.bioinf.org.uk/abs；, Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)；和Chothia等人,J.Mol.Biol. 227:799-817(1987)。在一些实例中，本文所述的抗犬VEGF抗体包含与mAb 57C相同的重链和轻链CDR。见上面的表1。

在一些实例中，抗犬VEGF抗体57C的功能性变体包含重链和轻链，所述重链包含与抗体57C的相应HC CDR至少75％(例如80％，85％，90％，95％，95％或98％)相同的HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，所述轻链包含与抗体57C的相应LC CDR至少75％(例如80％，85％，90％，95％，95％或98％)的LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。

或者，抗犬VEGF抗体57C的功能等价物包含与抗体57C的HC可变区至少75％(例如80％，85％，90％，95％或98％)相同性的HC可变区和与抗体57C的LC可变区至少 75％(例如80％，85％，90％，95％或98％)相同性的LC可变区。

使用由Karlin和Altschul改进(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993) 的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990)的算法，检测两个氨基酸序列的“百分比相同性”。该算法被引入Altschul等，J.Mol. Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以采用XBLAST程序开展 BLAST蛋白研究，设定分数＝50，字长(wordlength)＝3，从而获得与感兴趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两序列间存在间隙时，可以采用Altschul等，核酸研究 (Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402,1997中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST 和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在一些实施方案中，抗犬VEGF抗体57C的功能变体包含HC可变区和/或LC可变区，所述HC可变区在HC CDR区(HC CDR1，CDR2和/或CDR3)与抗体57C的HC CDR相比，包括至多5个(例如1,2,3,4或5个)氨基酸残基改变，所述LC可变区在LC CDR区(LC CDR1， CDR2和/或CDR3)与抗体57C的LC CDR相比，包括至多5个(例如1,2,3,4或5个)氨基酸残基改变。

在一个实例中，所述mAb 57C的功能变体是犬源化抗体。犬源化抗体包含犬免疫球蛋白(即，受体抗体)，其中负责抗原结合的区域/残基(例如，互补决定区，特别是其中特异性决定残基)替换为来自非犬免疫球蛋白(即供体抗体)。鉴定抗体的重链和轻链中的区域/残基的方法在本领域中是公知的。参见例如Almagro,J.Mol. Recognit.17:132-143(2004)；和Chothia等,J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。在一些情况下，受体抗体框架区内的一个或多个残基也被来自供体抗体的那些残基取代。犬源化抗体也可能含有既不来自受体抗体，也不来自供体抗体的残基。包括这些残基以进一步改进和优化抗体性能。犬免疫球蛋白基因在本领域中是众所周知的。参见例如www.imgt.org/IMGTveterinary/#Dog。

在另一个实例中，本文描述的抗犬VEGF抗体是嵌合抗体，其可以包括来自犬抗体的重链恒定区和轻链恒定区。嵌合抗体具有来自第一物种的可变区或部分可变区和来自第二物种的恒定区。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链两者的可变区模拟衍生自一种哺乳动物物种(例如，非人类哺乳动物)的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种(例如，犬)的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。

制备各种类型的抗体(例如，单克隆和多克隆抗体，其抗原结合片段和基因工程抗体)的方法在本领域中是公知的。参见例如Harlow和Lane，(1988)抗体：实验室手册，冷泉港实验室，纽约。

通常，为了产生针对蛋白质(例如犬VEGF)的抗体，任选地与载体蛋白例如KLH 偶联的蛋白质或其片段可以与佐剂混合并注射到宿主动物中。然后可以通过肽亲和层析纯化所述动物中产生的抗体。常用的宿主动物包括兔子，小鼠，豚鼠和大鼠。可用于增加免疫应答的各种佐剂取决于宿主物种，包括弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物凝胶例如氢氧化铝，CpG，表面活性物质例如溶血卵磷脂，普鲁兰尼克多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)和二硝基苯酚。有用的佐剂包括BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。

多克隆抗体存在于免疫受试者的血清中。单克隆抗体可使用标准的杂交瘤技术来制备(参见,例如,Kohler等(1975)Nature 256,495；Kohler等(1976)Eur.J.Immunol. 6,511；Kohler等(1976)Eur J Immunol 6,292；和Hammerling等(1981)单克隆抗体和T细胞杂交瘤,爱思维尔,N.Y.)。特别地，单克隆抗体可以通过为通过连续培养细胞系来生产抗体分子而提供技术来获得，如Kohler等(1975)Nature 256,495和美国专利号4,376,110；B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4,72；Cole 等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2026，和EBV杂交瘤技术(Cole等(1983) 单克隆抗体和癌症治疗,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)中所描述。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD及其任何亚类。产生本文公开的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高滴度的单克隆抗体的能力使其成为特别有用的生产方法。

抗犬VEGF抗体抗体的抗原结合片段可以通过常规方法制备。例如，F(ab')2 片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，而Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键产生。

可以通过常规重组技术产生基因工程抗体，例如犬源化抗体，嵌合抗体，单链抗体和双特异性抗体。可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术。参见例如Morrison 等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等(1984)Nature 312,604；和Takeda等(1984)Nature 314:452。

抗体也可以通过本领域已知的方法犬源化。例如，可以如下设计犬源化抗体。首先，按照本领域已知的方法(例如，类似于制备人源化抗体的方法)，对亲本非犬抗体的VH和VL的可变区进行三维分子模型分析。参见例如Queen等,Proc.Natl.Acad. Sci.USA,86:10029-10033(1989)。接下来，使用相同的分子模型分析来鉴定预测对于形成正确CDR结构是重要的框架氨基酸残基。同时，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询，从任何抗体基因数据库鉴定具有与亲本非犬抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的犬VH和VL链。然后选择犬VH和VL受体基因。所选择的狗受体基因内的CDR 区可以被来自亲本非犬抗体或其功能性变体的CDR区置换。当需要时，预测在与CDR 区相互作用(参见上面的描述)中重要的亲本链框架区内的残基可用于取代犬受体基因中的相应残基。用于抗体犬源化的其它方法是本领域已知的。参见例如 WO2003060080和WO2013184871，其各自的相关内容通过引用并入本文。

单链抗体可以通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。优选地，柔性连接物结合在两个可变区域之间。或者，可以调整描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778和4,704,692)以产生噬菌体scFv文库，并且可以按照常规程序从文库鉴定VEGF的特异性scFv克隆。可以对阳性克隆进行进一步筛选以鉴定结合VEGF的那些，抑制VEGF受体活性，和/或减少细胞增殖。

在获得靶抗原的特异性抗体后，可通过常规方法确定它们中和由VEGF介导的信号传导通路的能力。例如，VEGF诱导的细胞增殖水平被用作VEGF受体活性的指标。在一些实施方案中，可通过本领域已知的任何方法评估VEGF和/或VEGF受体信号传导，例如监测VEGF受体磷酸化，细胞迁移，细胞增殖，血管形成和/或肿瘤大小。选择与犬VEGF特异性结合并抑制其活性(例如活化VEGF受体)的抗体用于本文公开的方法中。

抗犬VEGF抗体的用途

本文还提供了使用一种或多种如本文所述的抗犬VEGF抗体治疗与血管生成相关的犬疾病(例如癌症)的方法。

如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用于患有血管生成相关疾病，有血管生成相关疾病的症状或有血管生成相关疾病风险的受试者，其目的是治愈，治疗，减轻，缓解，改变，弥补，改进，改善或影响血管生成相关疾病，血管生成相关疾病的症状，或血管生成相关疾病风险。

在一些实施方案中，将本文所述的抗犬VEGF抗体以足以将VEGF介导的信号传导水平降低至少20％(例如30％、40％、40％50％、60％、70％、80％、90％或更多)的量施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，本文所述的抗犬VEGF抗体以足以将细胞增殖减少至少20％(例如30％、40％、50％、60％、50％70％、80％、 90％或更多)的量施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，抗体以有效减少癌细胞数量，减小肿瘤尺寸或防止肿瘤生长的量施用。在本文所述的任何实施方案中，抗犬VEGF抗体可以与另一种化学治疗剂一起施用。

本文所述的抗体可用于治疗犬受试者中的血管生成相关疾病。与血管生成相关的疾病的非限制性实例包括癌症，黄斑变性，年龄相关性黄斑变性，糖尿病性视网膜病，视网膜脱离，青光眼，结膜和角膜的翼膜，视神经脊髓炎，角膜新生血管形成，瘤性脑膜炎，骨髓纤维化，放射性坏死和瘢痕疙瘩。在一些实施方案中，血管生成相关的犬疾病是增殖性疾病，例如癌症(例如实体瘤)。例子包括但不限于成胶质细胞瘤，肉瘤，肝细胞癌，炎性乳腺癌胰腺癌，转移性黑素瘤，卵巢癌，高危神经母细胞瘤，食道癌，胃癌，转移性头肿瘤，转移性颈部肿瘤，宫颈癌，腹膜癌，鳞状细胞癌。

在一些实施方案中，可以通过本文所述的任何抗犬VEGF抗体与适用于治疗犬癌症的另外的化疗剂的组合来治疗犬受试者。犬受试者可以是患有癌症，怀疑患有癌症或处于癌症风险中的狗，例如本文所述或本领域已知的那些。在一些实施方案中，化学治疗剂与抗犬VEGF抗体同时施用。化疗剂的实例包括但不限于放线菌素，全反式视黄酸，阿扎胞苷，硫唑嘌呤，博来霉素，硼替佐米，卡铂，卡培他滨，顺铂，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，阿糖胞苷，柔红霉素，多西紫杉醇，脱氧氟尿苷(Doxifluridine)，阿霉素，表柔比星，埃博霉素，依托泊苷，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，伊达比星，伊马替尼，依立替康，氮芥，巯嘌呤，甲氨喋呤，米托蒽醌，奥沙利铂，紫杉醇，培美曲塞，替尼泊苷，硫鸟嘌呤，拓扑替康，戊柔比星，长春碱，长春新碱，长春地辛和长春瑞滨。另外的化学治疗剂在本领域中是已知的，参见例如PCT公开号2005/012359。

可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法将药物组合物施用于受试者，这取决于待治疗的疾病的类型或疾病的部位。该组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服，肠胃外，吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，颊部，阴道或经由植入的储库。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射长效制剂施用途径，例如使用1个月，3个月或6个月长效制剂注射或生物可降解材料和方法，将其施用于受试者。

本文所述的任何抗犬VEGF抗体可以配制成药物组合物，其还包含一种或多种用于狗的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，配制抗犬VEGF抗体以施用于犬受试者。在一些实施方案中，将抗犬VEGF抗体配制成与另一种化学治疗剂一起施用。“可接受的”是指载体必须与组合物的活性成分(并且优选能够稳定活性成分)相容并且对待治疗的犬受试者无害。合适的载体包括微晶纤维素，甘露糖醇，葡萄糖，脱脂奶粉，聚乙烯吡咯烷酮和淀粉或其组合。

适用于制备刚才提到的药物组合物的药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂可以是本领域已知的冻干制剂或水溶液的形式。它们可以包含缓冲液，如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇； 3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如 TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。如本文所述的药物组合物可以通过将具有期望纯度的抗体与任选的上述药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂混合来配制用于储存。参见例如,《雷明顿:制药的科学和实践》第20版.(2000)Lippincott Williams和Wilkins出版社,K.E.Hoover编。

在一些实例中，所述药物组合物包含包封本文所述的任何抗体的脂质体。这样的脂质体可以通过本领域已知的方法制备。参见例如,Epstein,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556公开了循环时间增强的脂质体。可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱，胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。将脂质体挤出通过限定孔径的过滤器以产生具有期望直径的脂质体。

也可以将活性成分(例如抗犬VEGF抗体)包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这样的技术在《雷明顿,制药的科学和实践》第20版. Mack出版社(2000)。

在其他实例中，药物组合物可以以缓释形式配制。缓释制剂的合适实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，蔗糖乙酸异丁酸酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。

要用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜的过滤来完成。通常将治疗性抗体组合物放入具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

本文所述的药物组合物还可以以单位剂型如片剂，丸剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，溶液剂或悬浮液或栓剂制备，用于口服，肠胃外或直肠给药，或通过吸入或吹入给药。

为了制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药物载体混合，例如常规压片成分如玉米淀粉，乳糖，蔗糖，山梨糖醇，滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸二钙或树胶和其它药物稀释剂例如水，以形成含有本发明化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当将这些预制剂组合物称为均匀时，意思是活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地再分成等效单位剂型，例如片剂，丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物再分成上述类型的单位剂型，其含有0.1至约500mg本发明的活性成分。新型组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其它方式复合以提供提供延长作用的优点的剂型。例如，所述片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者是前者之上的包膜形式。这两种成分可以通过肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗胃中的崩解，并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可以用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括许多聚合酸和聚合酸与诸如虫胶，鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。

合适的表面活性剂特别包括非离子型试剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如Tween^TM 20,40,60,80或85)和其他山梨聚糖(例如Span^TM 20,40,60,80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05-5％的表面活性剂，并且可以在0.1-2.5％之间。应该理解的是，如果需要，可以加入其它成分，例如甘露糖醇或其他药学上可接受的载体。

合适的乳剂可以使用市售脂肪乳剂如Intralipid^TM,Liposyn^TM,Infonutrol^TM,Lipofundin^TM and Lipiphysan^TM来制备。可以将活性成分溶解在预混乳液组合物中，或者可以将其溶解在油(例如大豆油，红花油，棉籽油，芝麻油，玉米油或杏仁油)中，并将其与磷脂(例如卵磷脂，大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合形成乳剂。应该理解，可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张力。合适的乳剂通常含有高达20％的油，例如5-20％。脂肪乳剂可以包含0.1-1.0.im,特别是0.1-0.5.im的脂滴，并且具有pH在5.5-8.0的范围。

乳剂组合物可以是通过将抗犬VEGF抗体与Intralipid^TM或其组分(大豆油，卵磷脂，甘油和水)混合而制备的那些。

用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物通过口服或鼻呼吸途径施用，用于局部或全身作用。在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体来雾化。雾化的溶液可以直接从雾化装置吸入，或者雾化装置可以附着在面罩，帐篷或间歇性正压呼吸机上。溶液，悬浮液或粉末组合物可以以适当方式从递送制剂的装置施用，优选口服或经鼻给药。

为了实践本文公开的方法，可以将有效量的上述药物组合物通过合适的途径施用于需要治疗的犬受试者(例如，患有血管生成相关病症如癌症，怀疑患有血管生成相关病症如癌症，或具有血管生成相关病症如癌症风险的狗)。如本文所述，需要治疗的犬受试者可以是患有，有风险，或怀疑患有血管生成相关疾病的犬。具有血管生成相关疾病的犬受试者可通过常规医学检查来确定。怀疑患有血管生成相关疾病的犬受试者可能显示出疾病的一种或多种症状。这些犬受试者也可以通过常规医学检查来确定。具有与血管生成相关的疾病如癌症风险的犬受试者可以是具有该疾病的一种或多种风险因素的受试者。

本文所用的“有效量”是指单独或与一种或多种其它活性剂组合给予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所认识的，有效量根据所治疗的特定病症，病症的严重程度，包括年龄，身体状况，体型，性别和体重在内的个体狗参数，治疗持续时间，并行治疗的性质(如果有的话)，特定的给药途径和在保健医生的知识和专长之内的类似因素。这些因素对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以用不超过常规的实验来解决。通常优选使用单独组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。

经验考虑，如半衰期，通常将有助于确定剂量。例如，可以使用与犬免疫系统相容的抗体(例如犬源化抗体或完全犬抗体)来延长抗体的半衰期并防止抗体受到宿主免疫系统的攻击。可以在治疗过程中确定和调整给药频率，并且通常但不一定基于细胞增殖的治疗和/或抑制和/或改善和/或减少。或者，抗犬VEGF抗体的持续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。

在一个实例中，在已经给予一次或多次抗犬VEGF抗体施用的犬中，抗犬VEGF 抗体的剂量可以根据经验确定。犬受试者被给予增量剂量的抗体。为了评估抗体的功效，可以跟踪血管生成相关疾病的指标(例如细胞增殖)。

通常，对于本文所述的任何抗体的施用，初始候选剂量可以是约2mg/kg。为了本发明的目的，典型的日剂量可以在约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg 至3mg/kg，至30mg/kg至100mg/kg或更多中任一范围，取决于上述因素。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病症，持续治疗直到出现期望的症状抑制，或直到达到足够的治疗水平以减轻血管生成相关疾病(例如癌症)或其症状。示例性的给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，接着每周维持剂量约1mg/kg的抗体，或者接着维持每隔一周约1mg/kg的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的，取决于医生希望实现的药物代谢动力学衰减的模式。例如，预期每周给药1-4次。在一些实施方案中，给药范围从约3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg，约10μg/mg，约30μg/mg，约100μg/mg，约300μg/mg，约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施方案中，给药频率是每周一次，每2周，每4周，每5周，每6周，每7周，每8周，每9周或每10周一次；或每月一次，每两个月或每三个月或更长时间。这种疗法的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。给药方案(包括使用的抗体)可随时间变化。

为了本发明的目的，抗犬VEGF抗体的适当剂量将取决于所使用的特异性抗体 (或其组合物)，待治疗的过敏性气道病症的类型和严重程度，所述抗体是否施用预防或治疗目的，既往治疗，犬受试者的临床病史和对抗体的反应，以及主治兽医的判断。典型地，兽医将施用抗犬VEGF抗体，直到达到达到所需结果的剂量。抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受试者的生理状况，施用的目的是治疗还是预防，以及熟练医生已知的其他因素。抗体的施用可以在预先选定的时间段内基本上连续，或者可以以一系列间隔的剂量进行，例如在血管生成相关病症产生之前，期间或之后。

可注射组合物可以含有多种载体如植物油，二甲基酰胺，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇和多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注方法施用，由此输注含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可以包括例如5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。可以将肌内制剂(例如抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂)溶解并在药物赋形剂如注射用水，0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中施用。

在一些实施方案中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用抗犬VEGF抗体，例如递送至犬受试者的气道。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括抗体或局部递送导管的各种可植入储存源，诸如输注导管，留置导管或针导管，合成移植物，外膜包膜，分流器和支架或其他可植入装置，位点特异性载体，直接注射或直接应用。参见，例如，PCT公开号WO 00/53211和美国专利号5,981,568。

显而易见的是，表达载体可用于直接表达本文所述的任何抗体(例如抗犬VEGF 抗体)。本文描述的治疗性抗体可以使用基因递送载体递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的。(参见通常,Jolly,癌症基因治疗(1994)1:51；Kimura,人类基因治疗(1994)5:845；Connelly,人类基因治疗(1995)1:185；和Kaplitt,自然遗传学 (1994)6:148)。这种编码序列的表达可以使用内源性哺乳动物或异源启动子和/或增强子来诱导。编码序列的表达可以是组成型的或调节的。

用于递送期望的多核苷酸并在期望的细胞中表达的基于病毒的载体在本领域中是公知的。示例性的基于病毒的载体包括但不限于重组逆转录病毒。(参见例如,PCT 公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；英国授权专利号 2,200,651；和欧洲专利号0 345 242),甲病毒为基础的载体(例如,辛德毕斯病毒载体 (Sindbis virus vectors),塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67； ATCC VR-1247),罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)),和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如,PCT 公开号WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和 WO 95/00655)。还可采用Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中的描述，施用连接至死亡的腺病毒的DNA。

也可以使用非病毒递送载体和方法，包括但不限于连接或不连接杀伤腺病毒的多聚阳离子凝聚的DNA(参见例如,Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)；配体-连接 DNA(参见例如,Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞递送载体细胞(参见例如,美国专利号5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338)和核酸电荷中和或与细胞膜融合。也可以使用裸DNA。示例性的裸 DNA引入方法描述于PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5,580,859.可以作为基因递送载体的脂质体描述于美国专利号5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；和欧洲专利号0524968.其他方法描述在Philip,Mol.Cell. Biol.(1994)14:2411,和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581中。

在此描述的方法中使用的具体的剂量方案，即剂量，时间和重复将取决于具体的犬受试者和该受试者的病史。

用于治疗血管生成相关病症的试剂盒

本发明还提供用于治疗狗的血管生成相关病症(例如增殖性病症(例如癌症)) 的试剂盒。这样的试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器包含本文所述的任何抗犬VEGF抗体，例如本文所述的，例如mAb57C，其功能等价物或其功能变体

在一些实施方案中，试剂盒可以包含根据本文所述任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括根据本文所述的任何方法对抗体施用的描述，以治疗，延迟发作或缓解与异常血管生成相关的疾病。所述试剂盒可以进一步包括基于鉴定个体是否患有目标疾病来选择适于治疗的个体狗的描述。在其他实施方案中，说明书包括向具有疾病风险的个体施用抗犬VEGF抗体的描述。

涉及使用本文所述的抗犬VEGF抗体的说明书通常包括关于所需治疗的剂量，给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量，散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。

在本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明书，但是机器可读说明书(例如，在磁性或光学存储盘上承载的说明书)也是可以接受的。

标签或包装插页指示该组合物用于治疗，延缓发作和/或缓解血管生成相关病症如癌症。说明书可被提供用于实施本文所述任何方法。

本发明的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶，瓶子，罐子，软包装(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)等。也可以考虑与特定装置(例如吸入器，鼻腔给药装置(例如雾化器))或输注装置(例如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的抗犬VEGF抗体。试剂盒可以进一步包含适用于治疗狗癌症的另外的化学治疗剂。

试剂盒可以任选地提供额外的组分，如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方案中，本发明提供了包含上述试剂盒内容物的制品。

通用技术

除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的阐述，例如“分子克隆：实验手册”(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，第二版(Sambrook，等，1989)Cold Spring Harbor出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait，编，1984)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社；“细胞生物学：实验手册”(Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998)学术出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑.1987)；细胞和组织培养的介绍(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；“细胞和组织培养：实验室程序” (Celland Tissue Culture：Laboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley and Sons出版；酶学方法(Methods in Enzymology)(学术出版社公司)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)：用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；最新分子生物学方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel，等编，1987)；PCR：聚合酶链反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis，等编1994)；最新免疫学方案(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等编，1991)；分子生物学的简便方案(ShortProtocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物学(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(P.Fanch，1997)；抗体：实践方法(D.Catty编，IRL出版社， 1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1999)；抗体(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)。

无需进一步详细描述，相信本领域技术人员可以基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本发明的其余部分。本文引用的所有出版物，通过引用并入本文用于参考的目的或主题。

实施例1：与狗VEGF结合的抗体的开发

哺乳动物和大肠杆菌细胞被工程化以表达重组犬VEGF蛋白。在哺乳动物和大肠杆菌宿主细胞中产生的重组蛋白被纯化。使用哺乳动物细胞产生的VEGF作为抗原免疫小鼠。收集来自产生抗犬VEGF抗体的小鼠的脾脏，并使用标准技术与骨髓瘤细胞系融合。使用ELISA筛选融合的杂交瘤细胞两次以鉴定阳性克隆。在第一轮筛选中使用哺乳动物细胞产生的VEGF，并且在第二轮筛选中使用大肠杆菌产生的VEGF来鉴定杂交瘤克隆，所述杂交瘤克隆识别VEGF的肽序列而不是可能存在于哺乳动物细胞中产生的VEGF蛋白上的糖基部分。

将产生抗犬VEGF抗体的阳性杂交瘤克隆接种到小鼠中进行腹水生产。从小鼠腹水中纯化抗体并测试抑制人内皮细胞HUVEC增殖的能力。选择抗体mAb 57C是因为其导致HUVEC细胞增殖的显著抑制。还评估了抗体57C的体内生物学功能。抗体57C 能够抑制狗乳腺肿瘤增殖以及在狗癌症的异种移植动物模型中减少CD31内皮细胞标志物的存在。

从表达抗犬VEGF抗体57C的杂交瘤细胞分离RNA。使用Gene Racer试剂盒(英杰公司，Invitrogen)，将来自细胞的5μg总RNA用于扩增57C单克隆抗体mRNA的5' 末端。使用QIAquick Spin试剂盒(凯杰公司，Qiagen)将扩增的片段进行凝胶纯化，并使用TOPO TA克隆试剂盒(英杰公司)将其克隆到pCR-TOPO载体中。对克隆片段进行测序以获得重链和轻链的核酸序列数据。根据测序结果，使用抗犬VEGF抗体57C 的特异性引物从杂交瘤cDNA中扩增重链和轻链，得到与先前获得的序列相同的序列，进一步证实了核酸序列的准确性。

实施例2：抗犬VEGF mAb 57C在降低肿瘤尺寸和体积中的作用

八周龄的雌性NOD/SCID小鼠用于本文所述的实验中。每只小鼠在左乳房脂肪垫中皮下(s.c.)注射犬乳房肿瘤细胞(CMT-1细胞)(1×10⁶个细胞/小鼠)。为了模拟手术后应用于犬，并评估抗体对原发部位上残余肿瘤细胞生长的影响，在注射 CMT-1细胞后一天给小鼠施用抗体。将小鼠随机分为四组，并在实验期间每周三次皮下注射鼠IgG(mIgG；10mg/kg(n＝5))或两种不同剂量(5mg/kg(n＝6)或10mg/kg (n＝6))的抗犬VEGF抗体57C，或不进行治疗(仅CMT-1肿瘤(n＝5))。初始的CMT-1注射30天后处死小鼠，收集肿瘤并称重。如图1(图1A-1C)所示，与接受 mIgG或不接受治疗的小鼠相比，接受任一剂量的抗犬VEGF抗体57C的小鼠的肿瘤尺寸减小。

在第二个实验中，在8周龄的雌性NOD/SCID小鼠左乳房脂肪垫中皮下(s.c.) 注射CMT-1细胞(1×10⁶个细胞/小鼠)。为了评估抗体对已经形成的肿瘤的作用，使注射的CMT-1细胞生长13天，然后在实验期间每周两次皮下注射mIgG(20mg/kg；n＝ 6)或两种不同剂量(10mg/kg(n＝6)；20mg/kg(n＝6))的抗犬VEGF抗体57C，或不接受治疗(仅CMT-1肿瘤)。初始的CMT-1注射30天后处死小鼠，收集肿瘤并称重。如图2(图2A-2C)所示，与接受mIgG或不接受治疗的小鼠相比，接受任一剂量的抗犬VEGF抗体57C的小鼠的肿瘤尺寸减小，表明抗犬VEGF抗体57C可以与一化学治疗剂联用杀死肿瘤块中的癌细胞。

在第三个实验中，在8周龄的雌性NOD/SCID小鼠左乳房脂肪垫中皮下(s.c.) 注射CMT-1细胞(1×10⁶个细胞/小鼠)。第二天，皮下施用mIgG(10mg/kg(n＝5)) 每周一次，mIgG(10mg/kg；(n＝5))每两周一次，抗犬VEGF抗体57C(10mg/kg (n＝5))每周一次，抗犬VEGF抗体57C(10mg/kg(n＝5))每两周一次，或不接受治疗(仅CMT-1肿瘤)。初始的CMT-1注射后35天处死小鼠，收集肿瘤并称重。如图3(图3A-3C)所示，与接受mIgG或不接受治疗的小鼠相比，每周一次或每两周一次接受抗犬VEGF抗体57C的小鼠的肿瘤尺寸减小。

参考文献：

1.Pavlidis,E.T.&Pavlidis,T.E.贝伐单抗在结直肠癌生长中的作用及其不良反应：综述.World journal of gastroenterology:WJG 19,5051-5060(2013).

2.Trevisan,E.,等脑肿瘤的抗血管生成治疗：贝伐单抗的作用.Neurologicalsciences:official journal of the Italian Neurological Society and of theItalian Society of Clinical Neurophysiology 35,507-514(2014).

3.Keating,G.M.贝伐单抗：对其在晚期癌症中使用的评论.Drugs 74,1891-1925(2014).

4.Vail,D.M.和MacEwen,E.G.伴随动物的自发性肿瘤作为人类癌症的模型.Cancer investigation 18,781-792(2000).

5.MacEwen,E.G.狗和猫的自发性肿瘤：癌症生物学和治疗研究的模型.Cancermetastasis reviews 9,125-136(1990).

6.Gamlem,H.,Nordstoga,K.和Glattre,E.犬肿瘤-介绍性论文.APMIS.Supplementum,5-18(2008).

7.Tien,Y.T.,等KLF4转录因子的下调抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖和迁移.Veterinary journal(2015).

8.Sleeckx,N.,de Rooster,H.,Veldhuis Kroeze,E.J.,Van Ginneken,C.和VanBrantegem,L.犬乳腺肿瘤，概述.Reproduction in domestic animals＝Zuchthygiene46, 1112-1131(2011).

其他实施例

在本说明书中公开的所有特征，可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由出于相同、等同或类似目的的替代特征所替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅仅是通用的一系列等同或类似特征的一个示例。

基于上面的描述中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改，以便适合各种不同的用途和条件。因此，其他实施例也在本权利要求的范围内。

序列表

<110> 永信药品工业股份有限公司

<120> 结合犬血管内皮生长因子的抗体及其在治疗犬疾病中的用途

<130> Y0112.70000WO00

<140> 未指定

<141> 目前的

<150> US 14/679,573

<151> 2015-04-06

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaaaatatcc 120

tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180

ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt tttcctggag gtggtgatcc taaatacaat 240

gagaatttca agggcaaggc cacattcact acagatgcat cctccaacac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag aggaaccttc 360

gggttctatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagccaaa 420

acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 480

gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 540

tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600

actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 660

aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 720

ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 780

aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 840

atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 900

acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 960

cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 1020

gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1080

ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1140

acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1200

cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1260

gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcacctgc 1320

tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1380

ggtaaatga 1389

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Phe Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

130 135 140

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

210 215 220

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

225 230 235 240

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

245 250 255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

260 265 270

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

275 280 285

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

290 295 300

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

305 310 315 320

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys

325 330 335

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

355 360 365

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

370 375 380

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp

405 410 415

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

420 425 430

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

435 440 445

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60

gctgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agtctccatc 120

tcttgcaggt ctagtcagag ccttgaaaac agtaatggaa acacctattt gaactggtac 180

ctccagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca gggtttccaa ccgattttct 240

ggggtcctag acaggttcag tggtagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggattt gggagtttat ttctgcctcc aagttacaca tgtcccctac 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Leu Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Gly Thr Phe Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr

1 5

Claims

1.一种分离的抗体，其与犬血管内皮生长因子(VEGF)结合，其中所述抗体包含：

重链，所述重链包含如SEQ ID NO：5所示的重链互补决定区1（HC CDR1），如SEQ ID NO：6所示的重链互补决定区2（HC CDR2），和如SEQ ID NO：7所示的重链互补决定区3（HCCDR3），和

轻链，所述轻链包含如SEQ ID NO：8所示的轻链互补决定区1（LC CDR1），如SEQ ID NO：9所示的轻链互补决定区2（LC CDR2），和如SEQ ID NO：10所示的轻链互补决定区3（LCCDR3）。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述重链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3. 根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述轻链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

4. 根据权利要求2所述的分离的抗体，其中所述轻链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。

6.一种核酸或一组核酸，其共同编码权利要求1-5中任一项所述的抗体。

7. 根据权利要求6所述的一种核酸或一组核酸，其中所述抗体包含：

（i）重链，所述重链包含如SEQ ID NO：5所示的重链互补决定区1（HC CDR1），如SEQ IDNO：6所示的重链互补决定区2（HC CDR2），和如SEQ ID NO：7所示的重链互补决定区3（HCCDR3），和

（ii）轻链，所述轻链包含如SEQ ID NO：8所示的轻链互补决定区1（LC CDR1），如SEQ IDNO：9所示的轻链互补决定区2（LC CDR2），和如SEQ ID NO：10所示的轻链互补决定区3（LCCDR3）。

8.一种载体或一组载体，其包含权利要求6或7所述的一种核酸或一组核酸。

9.一种药物组合物，其包含（i）权利要求1-5中任一项所述的抗体，权利要求6或7所述的一种核酸或一组核酸，或权利要求8所述的一种载体或一组载体，和（ii）药学上可接受的载体。

10.权利要求1-5中任一项所述的抗体或权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗犬受试者中血管生成相关疾病的药物中的用途，其中，所述血管生成相关疾病选自下组：癌症、黄斑变性，年龄相关性黄斑变性，糖尿病性视网膜病，视网膜脱离，青光眼，结膜和角膜的翼膜，角膜新生血管形成，放射性坏死和瘢痕疙瘩；

其中所述癌症选自下组：胶质细胞瘤，肉瘤，肝细胞癌，炎性乳腺癌胰腺癌，转移性黑素瘤，卵巢癌，高危神经母细胞瘤，食道癌，胃癌，转移性头肿瘤，转移性颈部肿瘤，宫颈癌，腹膜癌，鳞状细胞癌。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述犬受试者患有，疑似患有，或有风险患有所述血管生成相关疾病。

12.根据权利要求10所述的用途，所述药物中还包括另外一种化学治疗剂。