CN114555115A - 用结合lgr5和egfr的抗体与拓扑异构酶i抑制剂的组合治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于治疗癌症的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂一起施用。

Description

用结合LGR5和EGFR的抗体与拓扑异构酶I抑制剂的组合治疗 癌症

本发明涉及治疗癌症的手段和方法。本发明尤其涉及一种用结合LGR5和EGFR的抗体与拓扑异构酶抑制剂的组合治疗受试者的癌症的方法。本发明还涉及用于此类方法的组合和用于制造用于治疗胃肠道癌症的药物的组合。

结肠直肠癌(CRC)是世界上第三常见的癌症。虽然CRC方面的一些新疗法已经取得了进展，但许多在临床试验上失败了，并且转移性CRC仍然很大程度上无法治愈。临床上的后期CRC的当前治疗标准包括在癌细胞中阻断必需功能和杀死分裂细胞的化学疗法方案。

累积的证据表明，在治疗诱导的缓解之后的癌症生长和再生长由逃避化学疗法治疗的癌症干细胞群体引起。不受理论的约束，据信这些干细胞的维持被认为由WNT信号传导途径调节。

不受理论的约束，据信CRC中的第二致癌途径被认为引起增强的癌细胞增殖和细胞凋亡逃避-该途径是EGFR(表皮生长因子受体)途径。几种抗-EGFR药物已经证明了对转移性CRC(mCRC)的靶向治疗具有一定水平的疗效。然而，由于CRC的异质性，下游KRAS基因中的致癌突变赋予抗-EGFR疗法的抗性(所有mCRC患者的～40％)，具有野生型KRAS的患者有一半对抗-EGFR疗法具有先天抗性，并且其中癌症对抗-EGFR治疗敏感的大部分患者显示出过后的抗性癌症。

在它的

抗体程序中，Merus已经开发了靶向EGFR和LGR5(含富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体)的多特异性抗体，这是一种WNT信号传导途径中的干细胞标志物。已经使用源自患者的CRC类器官和小鼠PDX模型，分别体内和体外评估了此类多特异性抗体的功效。靶向EGFR和LGR5的多特异性抗体显示抑制肿瘤生长。此类抑制性抗体的功效显示与来自癌症的细胞的LGR5 RNA表达水平相关。

本发明显示，与单独的多特异性抗体或拓扑异构酶抗体的功效相比，包括施用靶向EGFR和LGR5的多特异性抗体与拓扑异构酶I抑制剂的组合的组合疗法出人意料地有效。此类组合疗法可以在CRC患者的治疗诱导的缓解之后抑制肿瘤的转移和/或再生长，并且取得更长时间的缓解。

发明内容

本发明提供了一种用于治疗癌症的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂一起施用。癌症优选地是结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌，优选结肠直肠癌。抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂优选地同时施用于受试者。

在一个方面，抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物在拓扑异构酶I抑制剂之前施用于受试者。

结合EGFR的细胞外部分的可变结构域可包括如图8中所示的VH链MF3755的氨基酸序列；或者如图8中所示的VH链MF3755的氨基酸序列，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地具有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代或它们的组合。结合LGR5的细胞外部分的可变结构域可包括如图8中所示的VH链MF5816的氨基酸序列；或者如图8中所示的VH链MF5816的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地具有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代或它们的组合。抗体优选地包括两个所述可变结构域。

结合LGR5的可变结构域优选地结合位于如图1中所示的人LGR5序列的氨基酸残基21-118内的表位。在一个实施方案中，在人LGR5的位点43、44、46、67、90和91处的氨基酸残基参与所提供的LGR5结合可变结构域与LGR5的结合。LGR5结合可变结构域优选地与LGR5蛋白的结合较少，该LGR5蛋白包含选自43A、44A、46A、67A、90A和91A的氨基酸残基变体中的一个或多个氨基酸残基变体。

结合EGFR的可变结构域优选地结合位于如图2中所示的人EGFR序列的氨基酸残基420-480内的表位。在一个实施方案中，在人EGFR的位点I462、G465、K489、I491、N493和C499处的氨基酸残基参与所提供的EGFR结合可变结构域与EGFR的结合。EGFR结合可变结构域优选地与EGFR蛋白的结合较少，该EGFR蛋白包含选自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A和C499A的氨基酸残基取代中的一个或多个氨基酸残基取代。

如本文所述的提供的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物优选地包含具有如上文所述的表位结合特性的LGR5结合可变结构域、以及具有如上文所述的表位结合特性的EGFR结合可变结构域。

在一个实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱或其衍生物。在另一个优选的实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康或拓扑替康。

抗体优选地是ADCC诱导抗体。在一个实施方案中，抗体是ADCC增强抗体。在一个实施方案中，抗体是无岩藻糖基化的。

本发明还提供了一种用于抑制表达EGFR和LGR5的细胞在允许该细胞增殖的系统中增殖的方法，该方法包括提供具有拓扑异构酶I抑制剂和抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物的系统，该抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。

还提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者同时或相继施用拓扑异构酶I抑制剂和抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，该抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。

癌症优选地是结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌。在一个优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，该抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；以及拓扑异构酶I抑制剂。抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂可在单一制剂中提供。抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂也可以在分开的制剂中提供。当在分开的制剂中提供时，两种药物可以同时或相继施用。

还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，该抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；拓扑异构酶I抑制剂；以及用于在如本文所述的治疗中使用抗体和拓扑异构酶I抑制剂的说明书。

还提供了一种用于治疗受试者的胃肠道癌症的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。

在一个方面，本发明提供了一种抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其用于制造药物，该药物用于治疗受试者的癌症，其中抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。治疗优选地是治疗结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌，优选治疗结肠直肠癌。

本文还提供了一种包含抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物以及拓扑异构酶I抑制剂作为组合制剂的产物，该抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，该组合制剂同时、分开或相继用于治疗受试者的胃肠道癌症。

具体实施方式

为了可更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。在整个具体实施方式中阐述附加定义。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义，并且采用免疫学、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确指出。术语“包括”以及其他形式(诸如“包含”)的使用不是限制性的。

如本文所用，术语“抗体”是指属于蛋白质的免疫球蛋白类别的蛋白质分子，其包含结合抗原上的表位的一个或多个结构域，其中此类结构域来源于抗体的可变区或共享与抗体的可变区的序列同源性。抗体通常由基本结构单元构成，每个结构单元具有两条重链和两条轻链。用于治疗应用的抗体优选尽可能地接近待治疗的受试者的天然抗体(例如，对于人受试者而言，人抗体)。根据本发明的抗体不限于任何特定形式或其产生方法。

“双特异性抗体”是如本文所述的抗体，其中抗体的一个结构域与第一抗原结合，而抗体的第二结构域与第二抗原结合，其中所述第一抗原和第二抗原不相同。术语“双特异性抗体”还包括这样的抗体，其中一个重链可变区/轻链可变区(VH/VL)组合结合抗原上的第一表位，而第二VH/VL组合结合第二表位。该术语进一步包括这样的抗体，其中VH能够特异性识别第一抗原，而与免疫球蛋白可变区中的VH配对的VL能够特异性识别第二抗原。所得的VH/VL对将结合抗原1或抗原2。这种所谓的“二合一抗体”在例如WO 2008/027236、WO2010/108127和Schaefer等人(Cancer Cell 20,472-486,2011年10月)中描述。根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定双特异性形式或其产生方法。

如本文所用，术语“共同轻链”是指双特异性抗体中的两条轻链(或其VL部分)。两条轻链(或其VL部分)可相同或具有一些氨基酸序列差异，而全长抗体的结合特异性不受影响。在添加或不添加术语“重排”的情况下，术语“共同轻链”、“共同VL”、“单个轻链”、“单个VL”均可在本文中互换使用。“共同”还指氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不影响功能结合区形成的突变(缺失、取代、插入和/或添加)。本发明的轻链也可以是本文指定的轻链，其具有0至10个、优选0至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。例如通过引入和测试保守性氨基酸改变、当与重链配对时区域中不会产生或仅部分产生结合特异性的氨基酸改变等来制备或找到不相同但仍然在功能上等同的轻链例如在如本文所用的共同轻链的定义的范围内。根据本发明的术语“全长IgG”或“全长抗体”被定义为包含基本上完整的IgG，但是其不一定具有完整IgG的所有功能。为避免疑义，全长IgG包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定(C)区和可变(V)区，这些区可以被分解为命名为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域。IgG抗体通过Fab部分中包含的可变区结构域与抗原结合，结合后可以通过恒定结构域(主要通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。根据本发明的全长抗体包括其中可存在提供所需特性的突变的IgG分子。全长IgG不应缺失任何区域的大部分。然而，其中一个或多个氨基酸残基缺失但基本上不改变所得IgG分子的结合特性的IgG分子涵盖在术语“全长IgG”内。例如，这类IgG分子优选地在非CDR区中可以具有1至10个氨基酸残基的缺失，其中缺失的氨基酸对于IgG的抗原结合特异性不是必需的。

本文涉及核酸序列或氨基酸序列的“同一性百分比(％)”被定义为在出于最佳比较目的而对序列进行比对后，候选序列中与所选序列中残基相同的残基的百分比。使用默认设置的Vector NTI

11.5.2软件的AlignX应用来测定比较核酸序列的序列同一性百分比，该默认设置采用修改的ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson T.J.(1994))Nuc.Acid Res.22(22):4673-4680)、swgapdnamt打分矩阵、空位开口罚分15和空位延伸罚分6.66。使用默认设置的Vector NTI

11.5.2软件的AlignX应用来比对氨基酸序列，该默认设置采用修改的ClustalW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson T.J.(1994))Nuc.Acid Res.22(22):4673-4680)、blosum62mt2打分矩阵、空位开口罚分10和空位延伸罚分0.1。

由于抗体通常识别抗原的表位，并且这种表位也可存在于其他化合物中，因此如果其他化合物包含相同种类的表位，则根据本发明的“特异性识别”抗原(例如，EGFR或LGR5)的抗体也可识别这类其他化合物。因此，关于抗原和抗体相互作用的术语“特异性识别”不排除抗体与包含相同种类的表位的其他化合物结合。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体与其特异性结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的不连续氨基酸形成(所谓的线性表位和构象表位)。由连续的线性氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠构象形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常可以独特的空间构象包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法是本领域普通技术人员已知的，并且取决于表位的性质，包括本领域技术，例如X-射线晶体学、HDX-MS和2-维核磁共振、肽扫描(pepscan)和丙氨酸扫描(参见例如，Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，第66卷,G.E.Morris编辑，(1996))。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，诸如人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、牛、马、猪等(例如，患有癌症的患者，诸如人类患者)。

如本文所用，术语“治疗”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程或者向受试者施用活性剂或活性剂组合的任何类型的干预或过程，其目的是逆转、缓解、改善、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生化标记的进展、发展、严重性或再发。

如本文所用，“有效治疗”或“阳性治疗应答”是指产生有益效果(例如，改善疾病或病症例如癌症的至少一种症状)的治疗。有益效果可以采取相对于基线有所改善的形式，包括相对于根据该方法开始治疗之前进行的测量或观察有所改善。例如，有益效果可以采取在任何临床阶段减缓、稳定、停止或逆转受试者癌症进展的形式，如通过减少或消除疾病的临床或诊断症状或者癌症的标志物所证明。有效治疗可例如减少肿瘤的大小、减少循环肿瘤细胞的存在、减少或预防肿瘤的转移、减缓或阻止肿瘤生长以及/或者预防或延迟肿瘤再发或复发。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指提供期望的生物、治疗和/或预防结果的试剂或试剂组合的量。该结果可以是疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或者生物系统的任何其他期望的改变。在一些实施方案中，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟肿瘤再发的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。药物或组合物的有效量可：(i)减少癌细胞的数量；(ii)缩小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓，并且可阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生和/或再发；并且/或者(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在一个示例中，“有效量”是EGFR/LGR5抗体和拓扑异构酶I抑制剂的组合的量，该量用以减少癌症(例如，癌细胞数量的减少)；减缓癌症的发展或预防癌症的再生长或复发，其中癌症是胃肠道癌，优选结肠直肠癌。

本发明还提供了一种用于抑制细胞生长的方法，该细胞在允许该细胞生长的系统中表达EGFR并且表达LGR5，该方法包括向系统提供如本文所述的抗体和拓扑异构酶I抑制剂。该系统优选为培养系统。所述方法优选包括在所述系统中培养所述细胞。当与在其他条件相似但存在本发明的抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的情况下产生的细胞数或肿瘤体积/大小相比，该抑制优选地为细胞数、肿瘤体积或肿瘤大小减少至少10％。该抑制优选地为细胞数、肿瘤体积或肿瘤大小减少和/或无进展生存期增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。当与在其他条件相似但存在本发明的抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的情况下产生的管腔数相比，该抑制也可以为与恶性肿瘤或发育异常相关的其他参数，诸如每类器官的管腔数减少至少10％。该抑制优选地为每类器官的管腔数减少和/或无进展生存期增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

为了避免疑惑，如本文所用，提及的细胞生长是指细胞数的变化。生长抑制是指在其他条件均类似、但是存在本发明的抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的条件下，将已经获得的细胞数量的减少。生长增加是指否则可获得的细胞数的增加。细胞的生长通常是指细胞的增殖。该减少是与在其他条件相同下在不存在本发明的抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的情况下相同细胞的生长/增殖进行比较。

本发明还提供了用于治疗患有胃肠道癌症或具有患所述癌症的风险的个体的方法，该方法包括向对其有需要的个体施用本发明的抗体。个体优选为患有癌症的个体。癌症优选为胃肠道癌。在一个优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌。

本发明还提供了一种用于预防在患有癌症、优选地患有胃肠道癌症或处于患有所述癌症的风险的个体中发生的转移或肿瘤复发的方法，该方法包括向对其有需要的个体施用包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体或功能部分、衍生物和/或类似物、以及拓扑异构酶I抑制剂。个体优选地是患有癌症的个体或有肿瘤复发情况的个体、具有复发的放射摄影诊断的个体、或在一段时间的改善或应答后具有癌症复发的体征和症状的个体。癌症优选为胃肠道癌。在一个优选的实施方案中，癌症为结肠直肠癌。

在一个优选的实施方案中，预防转移是预防从胃肠道癌症到非胃肠道癌症的转移，诸如在肺组织或肝组织中的转移。

根据本文所述的方法在“有效方案”(是指EGFR/LGR5抗体和拓扑异构酶I抑制剂的组合)中施用有效量的组合治疗，其中施用顺序、剂量和给药频率足以进行有效的治疗。

如上所述，癌症类型(如CRC)可能与存在的致癌突变有关，如存在于编码磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)或Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)的基因中的那些。PIK3CA和KRAS两者中的突变广泛涉及多种类型的癌症，如结肠直肠癌。转移性CRC中存在的KRAS和PIK3C突变对于不同的种群分别为介于20％和50％之间和最多14.3％，而PIK3CAC420R突变已经在至少九种不同类型的癌症中检测到，包括乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、脑低级别胶质瘤、肺鳞状细胞癌、宫体肿瘤、前列腺腺癌、胃腺癌和卵巢肿瘤(Prevalence ofKRAS,BRAF,PI3K and EGFR mutations among Asian patients with metastaticcolorectal cancer,Phua等人，Oncology Letters,10:2519-25262014；the AACR ProjectGENIE Consortium.AACR Project GENIE:powering precision medicine through aninternational consortium.Cancer Discovery.2017年；7(8):818-831.Dataset Version4；https://www.cancer.gov/research/key-initiatives/ras/ras-central/blog/2017/pik3ca.pdf)。到2019年7月，由英国桑格研究所(UK Sanger Institute)主编的癌症体细胞突变目录(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer(COSMIC))，给出了带有突变PIK3C C420R的18种不同的组织类型的特征(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic，突变ID COSM757)。在PIK3CA C420R的突变中，在蛋白质的氨基酸残基位点420处半胱氨酸已被精氨酸取代，并且在KRAS G12D中，位点12的甘氨酸残基(G)已经突变为KRAS的天冬氨酸(D)。

本发明的一个优点是经历结合LGR5和EGFR的抗体以及拓扑异构酶I抑制剂的组合治疗的具有KRAS和/或PIK3CA突变的受试者在整个给药期间中未表现出体重的显著减少。具体地讲，具有KRAS G12D和/或PIK3CA C420R突变的受试者未表现出统计学上显著的体重减少。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，该受试者在以下基因中具有突变：编码KRAS的基因，优选导致G12D的突变；和/或编码PIK3CA的基因，优选导致C420R的突变。

在用如本文所述的用于治疗的方法或产物治疗的癌症优选地是乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、脑胶质瘤(优选脑低级别胶质瘤)、肺鳞状细胞癌、宫体肿瘤、前列腺腺癌、胃腺癌或卵巢肿瘤。癌症优选地是结肠直肠癌、肺癌、胃肠癌或卵巢癌，优选结肠直肠癌。癌症优选地在编码KRAS的基因中、编码PIK3CA的基因中或它们的组合中具有突变。KRAS突变优选地是导致G12D氨基酸取代的突变。PIK3CA突变优选地是导致C420R氨基酸取代的突变。

本发明的另一优点在于，用结合LGR5和EGFR的抗体以及拓扑异构酶I抑制剂的组合治疗在具有KRAS和/或PIK3CA突变的受试者、尤其是具有KRAS G12D和/或PIK3CA C420R突变的受试者中未记录到明显的毒性迹象。

如本文所用，术语“协同作用”、“治疗协同作用”和“协同效果”是指这样的现象：其中用治疗剂组合(例如，EGFR/LGR5抗体与拓扑异构酶I抑制剂的组合)治疗患者表现出比单独使用该组合的每种单独成分所获得的结果在治疗上更好的结果(参见例如T.H.Corbett等人，1982年，Cancer Treatment Reports,66,1187)。在这种情况下，治疗上更好的结果包括以下中的一种或多种：(a)治疗应答增加，大于组合中相同剂量的单独每种药剂的单独效果或两种药剂的效果之和；(b)组合中一种或多种药剂的剂量减少，但不降低治疗功效；(c)在接受等于或大于组合中相同剂量的每种药剂的单一疗法的治疗益处的同时，不良事件的发生率减少；(d)在接受大于每种药剂的单一疗法的治疗益处的同时，剂量限制性毒性降低；(e)耐药性的诱导延迟或最小化。在异种移植模型中，当通过组合施用以最大耐受剂量使用的组合(其中每种成分的存在剂量通常不超过其各自的最大耐受剂量)实现的肿瘤生长减少大于当单独施用最佳成分时该成分的肿瘤生长减少值时，该组合表现出治疗协同作用。药物组合的协同作用可例如根据Chou-Talalay的组合指数(CI)定理确定(Chou等人，Adv.Enzyme Regul.1984年；22:27-55；Chou,Cancer Res.2010年；70(2):440-446)。

“复发”或“再发(“recurrence”或“resurgence”)”在本文中可互换使用，是指在改善或应答一段时间后癌症恢复或癌症恢复的体征或症状的放射摄影诊断。

拓扑异构酶抑制剂是阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)的作用的化学化合物。拓扑异构酶是通过在正常细胞循环期间催化DNA链的磷酸二酯主链的破裂和再连接来控制DNA结构变化的一种类型的酶。

人拓扑异构酶已成为癌化学疗法治疗的靶标。不受理论的束缚，认为拓扑异构酶抑制剂在细胞的基因组中产生影响细胞中基因组的稳定性的单链断裂和双链断裂。引入这种断裂可能导致细胞凋亡和细胞死亡。

在本发明中，人拓扑异构酶抑制剂优选地是人拓扑异构酶I抑制剂。此类拓扑异构酶抑制剂的非限制性示例是喜树碱(CPT)。长期以来，已知CPT具有抗癌特性。CPT具有相当低的溶解度。发现CPT的衍生物具有更好的活性。CPT衍生物/类似物已经得到批准，并且在当今用于癌化学疗法。合适的人拓扑异构酶I抑制剂的示例是喜树碱、拓扑替康、片螺素D和伊立替康。在一个实施方案中，如本文所使用的“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于拓扑替康、伊立替康、吉马替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱缀合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。

喜树碱的半合成衍生物伊立替康(CPT-11)是一种拓扑异构酶-I抑制剂，其具有抗多种实体瘤的活性，包括结肠直肠癌、肺癌、胃癌和卵巢癌。伊立替康是一种前药，其通过肝羧酸酯酶水解以产生活性代谢物SN-38。SN-38通过葡萄糖醛酸化消除，其依赖于肝UDP葡萄糖醛酸基转移酶家族1、成员A1簇(UGTA1)酶。已经发现基因型UGT1A1*28与SN-38葡萄糖醛酸化减少相关。大约10％的北美人群携带了2个拷贝的UGT1A1*28等位基因(纯合的，UGT1A1*28/*28)，并且更可能在伊立替康治疗后发展出中性粒细胞减少症(DeanL.Irinotecan Therapy and UGT1A1 Genotype.2015[2018年4月4日更新]。In:Pratt V,McLeod H,Rubinstein W等人，编者，Medical Genetics Summaries[互联网].Bethesda(MD):美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(US))；2012年；可得自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK294473/)。可筛选受试者是否存在一个或多个UGT1A1*28等位基因。优选地，施用伊立替康的受试者不携带一个或多个UGT1A1*28等位基因，更优选地，所述受试者的等位基因UGT1A1*28不是纯合的。

在临床中已经使用伊立替康和其他人拓扑异构酶抑制剂相当长的一段时间，并且合适剂量的信息对于本领域普通技术人员来说是可用的。例如，可以70-350mg/m²每周、每两周、每三周施用伊立替康。其他方案每三周在第1天和第8天提供120-150mg/m²。其他计划包括以125mg/m²给药4周，随后间隔两周。每三周以50mg/m²在第1-5天给药，并且在第1周、第2周、第4周和第5周以20mg/m²在第1-5天给药。本文表达的施用是指按指示的时间点，根据受试者的体表面积(单位为m²)的量(单位为mg)。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合表皮生长因子(EGF)受体的细胞外部分的可变结构域、以及结合LGR5的可变结构域。EGFR优选地是人EGFR。LGR5优选地是人LGR5。如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合人表皮生长因子(EGF)受体的细胞外部分的可变结构域、以及结合人LGR5的可变结构域。

表皮生长因子(EGF)受体(EGFR、ErbB1或HER1)是四种受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员，称为Her-或cErbB-1、-2、-3和-4。EGFR也以各种同义词已知，其中最常见的是EGFR。EGFR具有由四个亚结构域构成的细胞外结构域(ECD)，其中两个参与配体结合，并且其中两个参与同源二聚化和异源二聚化。EGFR整合来自各种配体的细胞外信号以产生各种不同的细胞内应答。由EGFR激活的主要信号转导途径由Ras-分裂素活化蛋白激酶(MAPK)有丝分裂信号级联构成。该途径的激活通过将Grb2募集到酪氨酸磷酰化的EGFR来引发。这导致Ras通过Grb2结合的Ras-鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS)激活。此外，PI3-激酶-Akt信号转导途径也通过EGFR激活，但该激活在存在ErbB-3(HER3)共表达的情况下更强。EGFR涉及多种人类上皮恶性肿瘤，值得注意的是乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、头颈癌和脑癌。已经发现激活基因中的突变以及受体及其配体的过表达，产生自分泌激活循环。该RTK因此广泛用作癌症治疗的靶标。已经开发了靶向RTK的小分子抑制剂和针对细胞外配体结合结构域的单克隆抗体(mAb)并且迄今为止已经示出多项临床成功，虽然大部分针对一组选择的患者。人EGFR蛋白和编码其的基因的数据库登录号是基因库NM_005228.3。该登录号主要用于提供鉴定作为靶标的EGFR蛋白质的其它方法，由抗体结合的EGFR蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。词语癌症和肿瘤在本文中使用并且除非另外特别说明，两者通常均指癌症。

在本文提及EGFR时，除非另行指出，否则该提及是指人EGFR。结合EGFR的可变结构域抗原结合位点，结合EGFR及其多种变体，诸如在一些EGFR阳性肿瘤上表达的那些。

术语“LGR”是指被称为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体的蛋白质家族。已知该家族的多个成员参与WNT信号传导途径，值得注意的是LGR4；LGR5和LGR6。

LGR5是含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5。基因或蛋白质的另选名字为含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5；G-蛋白偶联受体HG38；G-蛋白偶联受体49；G-蛋白偶联受体67；GPR67；GPR49；孤儿G蛋白偶联受体HG38；G-蛋白偶联受体49；GPR49；HG38和FEX。结合LGR5的本发明蛋白质或抗体结合人LGR5。由于人和其它哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，本发明的LGR5结合蛋白质或抗体也结合此类直系同源物，但不一定如此。人LGR5蛋白质和编码它的基因的数据库登录号为(NC_000012.12；NT_029419.13；NC_018923.2；NP_001264155.1；NP_001264156.1；NP_003658.1)。所述登录号主要用于提供鉴定作为靶标的LGR5的其它方法，被结合的LGR5蛋白质的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症中发生的那些等。LGR5抗原结合位点结合LGR5及其多种变体，诸如由一些LGR5阳性肿瘤细胞表达的变体。

在本发明的上下文中，如果细胞包含编码LGR5的可检测RNA，则认为该细胞表达LGR5。表达通常还可通过将细胞与结合LGR5的抗体一起温育来检测。然而，一些细胞的蛋白质表达不足以用于这种LGR5抗体测试。在这些情况下，mRNA或其他形式的核酸序列检测是优选的。

在本文给出蛋白质/基因的登陆号或替代的名称的情况下，其主要用于提供鉴定作为靶标的所述蛋白质的其它方法，由抗体结合的靶蛋白的实际序列可有所不同，例如由于编码基因中的突变和/或可变剪接，诸如在一些癌症中发生的那些等。靶蛋白由抗体结合，只要表位存在于蛋白质中并且表位可接触到抗体。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物优选地干扰EGFR的配体与EGFR的结合。如本文所用，术语“干扰结合”是指抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与EGFR的结合和配体与EGF受体的结合发生竞争。抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物可减弱配体结合，当其已经结合到EGF受体时置换配体，或其可例如通过空间位阻，至少部分地阻止配体能够结合到EGF受体。

本发明的EGFR抗体优选地分别抑制EGFR配体诱导的信号传导，如BxPC3细胞(ATCCCRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的配体诱导的生长或A431细胞(ATCCCRL-1555)的配体诱导的细胞死亡所测量的。相比于在中性物质或阴性对照的存在下的配体诱导效应，提及的EGFR抗体可将配体诱导的信号传导减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选地40％、45％、50％、55％、60％、更优选地70％、80％、85％、并且最优选地90％、95％、99％,或100％，如本领域已知的测定中所测量的。EGFR各自可结合多个配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在EGFR配体的存在下，刺激BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长。BxPC3细胞的EGFR配体诱导的生长可通过比较配体不存在或存在的情况下细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导生长的优选的EGFR配体是EGF。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体来测量。在一个优选的实施方案中，EGF的用量为100ng/ml的培养基。EGF优选地是EGF R&D系统，目录号396-HB和236-EG(也参见WO2017/069628；其以引用方式并入本文)。

本发明的EGFR抗体优选地抑制EGFR配体诱导的BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)的生长。相比于由中性物质或阴性对照诱导的配体诱导生长，提及的EGFR抗体可将配体诱导的生长信号传导减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选地40％、45％、50％、55％、60％、更优选地70％、80％、85％、并且最优选地90％、95％、99％，或100％，如本领域已知的测定中所测量的。EGFR各自可结合多个配体并刺激所提及的BxPC3细胞或BxPC3-luc2细胞的生长。在配体的存在下，刺激BxPC3或BxPC3-luc2细胞的生长。BxPC3细胞的EGFR配体诱导的生长可通过比较配体不存在或存在的情况下细胞的生长来测量。用于测量BxPC3或BxPC3-luc2细胞的EGFR配体诱导生长的优选的EGFR配体是EGF。配体诱导的生长优选使用饱和量的配体来测量。在一个优选的实施方案中，EGF的用量为100ng/ml的培养基。EGF优选地是R&D系统的EGF，目录号396-HB和236-EG(也参见WO2017/069628；其以引用方式并入本文)。

优选地通过如上文所述的方法，使用抗体的单特异性单价形式或单特异性二价形式来确定本发明的抗体是否在多特异性形式下抑制信号传导或抑制生长。此种抗体优选地具有受体的结合位点，其信号传导待测定。单特异性单价抗体可以具有与结合特异性不相关的可变结构域，诸如破伤风类毒素特异性。优选的抗体为二价单特异性抗体，其中抗原结合可变结构域由结合EGF-受体家族成员的可变结构域组成。

如本文所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。

结合LGR5的细胞外部分的可变结构域优选地结合位于图1的序列的氨基酸残基21-118内的表位，其中氨基酸残基D43；G44、M46、F67、R90和F91参与抗体与表位的结合。

LGR5可变结构域优选地为其中LGR5中的氨基酸残基取代D43A；G44A、M46A、F67A、R90A和F91A中的一个或多个减少可变结构域与LGR5的结合的可变结构域。

LGR5的细胞外部分上的表位优选地位于图1序列的氨基酸残基21-118内。优选一个表位，其中LGR5可变结构域与LGR5的结合由以下氨基酸残基取代中的一个或多个减少：LGR5中的D43A；G44A、M46A、F67A、R90A和F91A。

本发明还提供了具有结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体，其中LGR5可变结构域结合位于图1的序列的氨基酸残基21-118内的LGR5上的表位。

LGR5上的表位优选为构象表位。表位优选地位于图1的序列的氨基酸残基40-95内。抗体与LGR5的结合优选由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：D43A；G44A、M46A、F67A、R90A和F91A。

不受理论的约束，据信如图1中所示的LGR5的M46、F67、R90和F91接触如本文上文所示的可变结构域的残基，即，结合LGR5表位的可变结构域的抗原结合位点。该氨基酸残基取代D43A和G44A减少抗体的结合可能是由于这些也接触残基的事实，然而，这些氨基酸残基取代还可能诱导LGR5的具有其他接触残基中的一个或多个(即，在46位、67位、90位或91位处)的部分的构象的(轻微)修饰，并且该构象变化使得抗体结合减少。表位的特征在于提及的氨基酸取代。抗体是否结合相同表位可以各种方式来测定。在实施例中描述了优选的方法。该方法利用CHO细胞。CHO细胞在细胞膜上、或在丙氨酸取代突变体上、优选地在包含取代M46A、F67A、R90A或F91A中的一个或多个的突变体上表达LGR5。使测试抗体与CHO细胞接触，并且比较抗体与细胞的结合。测试抗体在其结合LGR5时结合表位，并且在较低程度上结合具有M46A、F67A、R90A或F91A取代的LGR5。优选比较与一组各自包括一个丙氨酸残基取代的突变体的结合。此类结合研究在本领域中是人们所熟知的。通常所述组包括覆盖基本上全部氨基酸残基的单一丙氨酸取代突变体。对于LGR5，该组仅需要覆盖蛋白质的细胞外部分、以及当使用细胞时确保与细胞膜缔合的部分。特定突变体的表达可受损，但这容易由结合不同区域的一个或多个LGT5抗体检测到。如果表达对于这些对照抗体也减少，则对于该特定突变体，膜上的蛋白质的含量和折叠也受损。测试抗体对该组的结合特性容易鉴定测试抗体是否表现出对具有M46A、F67A、R90A或F91A取代的突变体的减少的结合，并因此鉴定测试抗体是否是本发明的抗体。与具有M46A、F67A、R90A或F91A取代的突变体的减少结合还会识别位于图1序列的氨基酸残基21-118内的表位。在一个优选的实施方案中，所述组包括D43A取代突变体；两者的G44A取代突变体。具有MF5816的VH的VH序列的抗体表现出对这些取代突变体的结合减少。

不受任何理论的束缚，据信氨基酸残基I462；G465；K489；I491；N493；和C499(如图2中所示)参与通过包含如上文所示的可变结构域的抗体来结合表位。优选地，通过观察可变结构域与EGFR的减少结合来确定参与结合，其中一个或多个氨基酸残基取代选自I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。

在一个方面，结合人EGFR的细胞外部分上的表位的可变结构域是结合位于如图2中所示的序列的氨基酸残基420-480内的表位的可变结构域。优选地，可变结构域与EGFR的结合由以下氨基酸残基取代中的一种或多种减少：EGFR中的I462A、G465A；K489A；I491A；N493A；和C499A。抗体对人EGFR的结合优选地干扰EGF对受体的结合。EGFR上的表位优选为构象表位。在一个方面，表位位于图2中所示的序列的氨基酸残基420-480内，优选地位于图2中所示的序列的氨基酸残基430-480内；优选地位于图2中所示的序列的氨基酸残基438-469内。

不受理论的约束，据信表位的接触残基，即可变结构域接触人EGFR的位置可能是I462；K489；I491；和N493。氨基酸残基G465和C499可能间接参与抗体与EGFR的结合，可能因为通过取代进入丙氨酸中的突变诱导表位的(轻微)构象改变，从而导致与表位的结合减少。

结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，该重链可变区至少包含如图8中所示的MF3755的VH的CDR3序列，或与如图8中所示的MF3755的VH的CDR3序列在最多三个、优选地最多两个、优选地不超过一个氨基酸上不同的CDR3序列。

结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，该重链可变区至少包含如图8中所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者，具有最多三个、优选地最多两个、优选地最多一个氨基酸取代的如图8中所示的MF3755的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列。

结合人EGFR的可变结构域优选为具有重链可变区的可变结构域，该重链可变区包含如图8中所示的MF3755的VH链的序列；或者如图8中所示的MF3755的VH链的氨基酸序列，其关于MF3755的VH链具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中所述可变结构域的重链可变区至少包含选自下列的EGFR特异性重链可变区的CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示；或者其中所述可变结构域的重链可变区包含与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示。所述可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含以下项的CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示。

所述可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含选自下列的EGFR特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示，或者与选自下列的EGFR特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个、优选地最多一个氨基酸上不同的至少包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示。所述可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含以下项的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3370；MF3755；MF4280或MF4289，如图8中所示。优选的重链可变区为MF3755。另一优选的重链可变区为MF4280。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体，其中EGFR结合可变结构域具有如本文上文所述的CDR3、CDR1、CDR2、和CDR3和/或VH序列，优选地具有结合LGR5的可变结构域，其至少包含选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示，或者与选自下列的VH的CDR3序列在最多三个，优选地最多两个，优选地不超过一个氨基酸上不同的重链CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示。所述可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含以下项的CDR3序列：MF5790；MF5803；MF 5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示。

LGR5可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示，或者与选自下列的LGR5特异性重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列在最多三个、优选地最多两个，优选地最多一个氨基酸上不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示。所述可变结构域优选包含重链可变区，该重链可变区至少包含以下项的CDR1、CDR2和CDR3序列：MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818，如图8中所示。优选的重链可变区为MF5790；MF5803；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。特别优选的重链可变区为MF5790；MF5814；MF5816；和MF5818；优选MF5814、MF5818和MF5816，特别优选重链可变区MF5816。另一优选的重链可变区为MF5818。

已经示出当用于抑制EGFR配体响应性癌症或细胞的生长时，包含具有重链可变区MF3755或其一个或多个CDR的一个或多个可变结构域的抗体具有更好的功效。在双特异性或多特异性抗体的上下文中，包含具有重链可变区MF3755或其一个或多个CDR的可变结构域的抗体臂与包含具有重链可变区MF5818或其一个或多个CDR的可变结构域的臂充分结合。

结合EGFR或LGR5的可变结构域的VH链可相对于图8所示的序列具有一个或多个氨基酸取代。VH链优选地具有图8的EGFR或LGR5 VH的氨基酸序列，其关于图8的VH链序列具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

CDR序列可以相对于图中的CDR序列具有一个或多个氨基酸残基取代。出于优化的目的，优选地为了改善抗体的结合强度或稳定性，例如进行此类一个或多个取代。优化例如通过诱变规程进行，随后优选测试所得抗体的稳定性和/或结合亲和力并优选选择改善的EGFR特异性CDR序列或LGR5特异性CDR序列。根据本发明，技术人员能够生成包含至少一个的改变的CDR序列的抗体变体。例如，可以应用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的示例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，并且用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。

优选地，如本文所述在VH或VL中提及的最多15个、优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个、以及优选地1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代优选地是保守氨基酸取代。如本文所规定的VH或VL中的氨基酸插入、缺失和取代优选地不存在于CDR3区中。提及的氨基酸插入、缺失和取代也优选地不存在于CDR1和CDR2区中。提及的氨基酸插入、缺失和取代也优选地不存在于FR4区中。

提及的最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代优选为保守氨基酸取代，所述插入、缺失、取代或它们的组合优选不在VH链的CDR3区中，优选地不在VH链的CDR1、CDR2或CDR3区中，并且优选地不在FR4区中。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5790的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5790的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5803的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5803的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5814的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5814的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5816的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5816的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5817的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5817的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体优选地包含

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，或者

-VH链MF3755的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合；并且

其中结合LGR5的可变结构域的VH链包含：

-VH链MF5818的氨基酸序列，如图8中所示；或者

-VH链MF5818的氨基酸序列，如图8中所示，该氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，并且优选地具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸插入、缺失、取代或它们的组合。

所公开的氨基酸序列的保留EGFR或LGR5结合的其他变体可以例如从包含重排的人IGKVl-39/IGKJl VL区的噬菌体展示文库(De Kruif等人，Biotechnol Bioeng.2010(106)741-50)、以及如先前(例如，WO2017/069628)所述的将氨基酸取代并入本文公开的EGFR或LGR5 VH区的氨基酸序列中的VH区集合中获得。可选择编码结合EGFR或LGR5的Fab区的噬菌体并通过流式细胞术进行分析，并进行测序以鉴定具有保留抗原结合的氨基酸取代、插入、缺失或添加的变体。

EGFR/LGR5抗体的VH/VL EGFR和LGR5可变结构域的轻链可变区可以相同或不同。

在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的VH/VL EGFR可变结构域的VL区与VH/VLLGR5可变结构域的VL区相似。在某些实施方案中，第一和第二VH/VL可变结构域中的VL区是相同的。

在某些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含共同轻链可变区。在一些实施方案中，一个或两个VH/VL可变结构域的共同轻链可变区包括种系IgVκ1-39可变区V段。在某些实施方案中，一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含κ轻链V段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39是免疫球蛋白可变κ1-39基因的缩写。该基因也称为免疫球蛋白κ可变1-39；IGKV139；IGKV1-39。该基因的外部编号为HGNC:5740；EntrezGene:28930；Ensembl:ENSG00000242371。合适的V区的氨基酸序列在图9中提供。V区可以与五个J区中的一个组合。优选的J区是jk1和jk5，所连接的序列表示为IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5；别称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据IMGT数据库全球网站imgt.org的命名)。在某些实施方案中，一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(如图9中所示)。

在一些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含：包含氨基酸序列QSISSY的LCDR1(如图9中所示)、包含氨基酸序列AAS的LCDR2(如图9中所示)和包含氨基酸序列QQSYSTP的LCDR3(如图9中所示)(即，根据IMGT的IGKV1-39的CDR)。在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含：包含氨基酸序列QSISSY的LCDR1(如图9中所示)、包含氨基酸序列AASLQS的LCDR2(如图9中所示)和包含氨基酸序列QQSYSTP的LCDR3(如图9中所示)。

在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域包含轻链可变区，该轻链可变区包含与如图9中所示的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的同一性或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域包含轻链可变区，该轻链可变区包含与如图9中所示的氨基酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的同一性或100％的同一性的氨基酸序列。

例如，在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的可变轻链相对于如图9中所示的序列可以具有0个至10个、优选0个至5个氨基酸插入、缺失、取代、添加或其组合。在一些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区相对于所示氨基酸序列包含0个至9个、0个至8个、0个至7个、0个至6个、0个至5个、0个至4个、优选0个至3个、优选0个至2个、优选0个至1个且优选0个氨基酸插入、缺失、取代、添加，或它们的组合。

在其他实施方案中，EGFR/LGR5抗体的一个或两个VH/VL可变结构域的轻链可变区包含如图9中所示序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，EGFR/LGR5抗体的两个VH/VL可变结构域包含相同的VL区。在一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体的两个VH/VL可变结构域的VL包含如图9中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体的两个VH/VL可变结构域的VL包含如图9中所示的氨基酸序列。

如本文所述的EGFR/LGR5抗体优选地是具有两个可变结构域的双特异性抗体，如本文所述一个可变结构域结合EGFR并且另一个可变结构域结合LGR5。

在本文公开的方法中使用的EGFR/LGR5双特异性抗体可以以多种形式提供。双特异性抗体的许多不同形式在本领域中是已知的，Kontermann(Drug Discov Today,2015年7月；20(7):838-47；MAbs,2012年3月至4月；4(2):182-97)和Spiess等人(Alternativemolecular formats and therapeutic applications for bispecificantibodies.Mol.Immunol.(2015)http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)(这些文献各自以引用方式并入本文)已经对其进行了综述。例如，不是具有两个VH/VL组合的经典抗体的双特异性抗体形式至少具有包含重链可变区和轻链可变区的可变结构域。该可变结构域可与提供第二结合活性的单链Fv片段、单体、VH和Fab片段连接。

在一些实施方案中，在本文提供的方法中使用的EGFR/LGR5双特异性抗体通常是人IgG亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些实施方案中，抗体是人IgG1亚类。全长IgG抗体是优选的，因为它们具有令人满意的半衰期并且免疫原性低。因此，在某些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体是全长IgG分子。在一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体是全长IgG1分子。

因此，在某些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体包含可结晶片段(Fc)。EGFR/LGR5双特异性抗体的Fc优选地由人恒定区组成。EGFR/LGR5双特异性抗体的恒定区或Fc可包含与天然存在的人抗体的恒定区的一个或多个、优选不超过10个、优选不超过5个氨基酸差异。例如，在某些实施方案中，双特异性抗体的每个Fab臂可进一步包括Fc区，该Fc区包含促进双特异性抗体形成的修饰、增强稳定性的修饰和/或本文所述的其他特征。

双特异性抗体通常由表达编码抗体的核酸的细胞产生。因此，在一些实施方案中，本文公开的双特异性EGFR/LGR5抗体是通过提供包含编码双特异性EGFR/LGR5抗体的重链可变区和轻链可变区以及恒定区的一种或多种核酸的细胞而产生。细胞优选地是动物细胞、更优选哺乳动物细胞、更优选灵长类动物细胞、最优选人类细胞。合适的细胞是能够包含并且优选地产生EGFR/LGR5双特异性抗体的任何细胞。

用于产生抗体的合适细胞在本领域中是已知的，并且包括杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞或PER-C6细胞。各种机构和公司已经开发了用于大规模生产抗体的细胞系，例如用于临床应用。此类细胞系的非限制性示例为CHO细胞、NS0细胞或PER.C6细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞为人细胞。优选地细胞通过腺病毒E1区或其功能等同物转化。此类细胞系的优选示例为PER.C6细胞系或其等同物。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞为CHO细胞或其变体。优选地，变体利用谷氨酰胺合成酶(GS)载体体系表达抗体。在一个优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。

在一些实施方案中，细胞表达组成EGFR/LGR5双特异性抗体的不同轻链和重链。在某些实施方案中，细胞表达两条不同重链和至少一条轻链。在一个优选的实施方案中，细胞表达如本文所述的“共同轻链”以减少不同抗体种类的数量(不同重链和轻链的组合)。例如，使用本领域中已知的用于产生双特异性IgG的方法将各个VH区连同重排的人IGKV1 39/IGKJ1(huVκ1 39)轻链克隆到表达载体中(WO2013/157954；其以引用方式并入本文)。先前证明了huVκ1 39能够与一条以上的重链配对，从而产生具有多种特异性的抗体，进而促进双特异性分子的产生(De Kruif等人，J.Mol.Biol.2009(387)548 58；WO2009/157771)。

表达共同轻链和相等量的两条重链的抗体产生细胞通常产生50％的双特异性抗体和25％的每种单特异性抗体(即具有相同的重链轻链组合)。已经公开了几种方法来支持双特异性抗体的产生而不是各个单特异性抗体的产生。这通常是通过修饰重链的恒定区以使其比同源二聚化更有利于异源二聚化(即，与其他重链/轻链组合的重链二聚化)来实现的。在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含具有相容的异源二聚化结构域的两条不同免疫球蛋白重链。本领域中已经描述了各种相容的异源二聚化结构域。相容的异源二聚化结构域优选地是相容的免疫球蛋白重链CH3异源二聚化结构域。现有技术描述了其中可实现重链的此类异源二聚化的各种方式。

在US 9,248,181和US 9,358,286中公开了一种产生EGFR/LGR5双特异性抗体的优选方法。具体地，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是第一CH3结构域中的氨基酸取代L351K和T366K(EU编号)(“KK变体”重链)以及第二结构域中的氨基酸取代L351D和L368E(“DE变体”重链)，反之亦然。如前所述，DE变体和KK变体优先配对以形成异源二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。几乎不会发生DE变体重链(DEDE同源二聚体)或KK变体重链(KKKK同源二聚体)的同源二聚化，因为相同重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间存在强相斥。

因此，在一个实施方案中，包含结合EGFR的可变结构域的重链/轻链组合包含重链的DE变体。在该实施方案中，包含结合LGR5的可变结构域的重链/轻链组合包含重链的KK变体。

可以使用任何合适的测定法测试候选EGFR/LGR5 IgG双特异性抗体的结合。例如，可以通过流式细胞术(根据先前在WO2017/069628中描述的FACS程序)来评估与CHO细胞上膜表达的EGFR或LGR5的结合。在一个实施方案中，通过根据本领域中已知的标准程序执行的流式细胞术来证明候选EGFR/LGR5双特异性抗体与CHO细胞上的LGR5的结合。与尚未用EGFR和/或LGR5的表达盒转染的CHO细胞比较与CHO细胞的结合。使用用EGFR表达构建体转染的CHO细胞来确定候选双特异性IgG1与EGFR的结合；测定中包括LGR5单特异性抗体和EGFR单特异性抗体以及无关的IgG1同种型对照mAb作为对照(例如，结合LGR5和另一种抗原(诸如破伤风毒素(TT))的抗体)。

可以使用BIAcore T100通过表面等离子共振(SPR)技术来测量候选EGFR/LGR5双特异性抗体的LGR5和EGFR Fab对其靶标的亲和力。简而言之，使用游离胺化学过程(NHS/EDC)将抗人IgG小鼠单克隆抗体(Becton and Dickinson,cat.Nr.555784)偶联到CM5传感器芯片的表面。然后，将bsAb捕获到传感器表面。随后，将重组纯化抗原人EGFR(SinoBiological Inc，目录号11896-H07H)和人LGR5蛋白以测量结合和解离速率的浓度范围在传感器表面上运行。在每个循环后，通过HCl脉冲使传感器表面再生，并再次捕获bsAb。使用如前文在US 2016/0368988中针对CD3所述的BIAevaluation软件，根据获得的传感图确定与人LGR5和EGFR结合的结合速率和解离速率以及亲和力值。

本发明的抗体通常是双特异性全长抗体，优选地人IgG亚类。本发明的抗体优选为人IgG1亚类。本发明的此类抗体具有良好的ADCC特性，如果需要，其可通过本领域已知技术增强，在体内施用给人时具有有利的半衰期，并且现有CH3工程化技术可提供在克隆细胞中共表达时比同源二聚体优先形成异源二聚体的经修饰的重链。

当抗体本身具有低ADCC活性时，通过稍微修饰抗体的恒定区可改善抗体的ADCC活性。改善抗体的ADCC活性的另一种方式是通过酶促干扰糖基化途径从而导致岩藻糖减少。存在多种用于测定抗体或效应细胞在引发ADCC方面的功效的体外方法。这些方法中为铬-51[Cr51]释放测定、铕[Eu]释放测定和硫-35[S35]释放测定。通常，将表达某种表面暴露抗原的标记靶细胞系与对该抗原特异性的抗体一起温育。洗涤后，将表达Fc受体CD16的效应细胞与抗体标记的靶细胞共温育。随后通过闪烁计数器或分光光度计通过释放细胞内标记来测量靶细胞裂解。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以是ADCC增强的。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以是无岩藻糖基化的。当与正常CHO细胞中产生的相同抗体相比时，本发明的双特异性抗体优选在Fc区中包含含量减少的N-键合的碳水化合物结构的岩藻糖基化。

包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域的抗体还可包含一个或多个能够结合一个或多个另外的靶标的附加可变结构域。其他靶标优选为蛋白，优选包含细胞外部分的膜蛋白。具有多于两个可变结构域的抗体是本领域已知的。例如，将附加的可变结构域连接到抗体的恒定部分是可能的。具有三个或更多个可变结构域的抗体优选地是多价多聚体抗体，如PCT/NL2019/050199所述，其以引用方式并入本文。

在一个实施方案中，抗体是包含两个可变结构域的双特异性抗体，其中一个可变结构域结合EGFR的细胞外部分，并且另一个可变结构域结合LGR5的细胞外部分。可变结构域优选地是如本文所述的可变结构域。

为了避免疑惑，如本文所用，提及的细胞生长是指细胞数的变化。生长抑制是指否则可获得的细胞数的减少。生长增加是指否则可获得的细胞数的增加。细胞的生长通常是指细胞的增殖。

如本文所用，膜蛋白为细胞膜蛋白，诸如在细胞的外膜中的蛋白质，该膜将细胞与外部环境隔开。膜蛋白具有细胞外部分。如果膜蛋白包含细胞的细胞膜中的跨膜区，则膜蛋白至少在细胞上。

还提供了一种药物组合物，其包含EGFR/LGR5双特异性抗体、拓扑异构酶I抑制剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指经政府监管机构批准或者在美国药典或另一种公认的药典中列出用于动物、特别是人类，并且包括生理上相容的任何和所有溶剂、盐、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯等。水或盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液可用作载体，特别是用于可注射溶液。可以将用于肠胃外施用的液体组合物配制用于通过注射或连续输注施用。通过注射或输注的施用途径包括膀胱内、肿瘤内、静脉内、腹膜内、肌内、鞘内和皮下。取决于施用途径(例如，静脉内、皮下、关节内等)，可将活性化合物包被在一种材料中以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的作用。

通常将适合向人类患者施用的药物组合物配制用于肠胃外给药，例如在液体载体中施用，或者将适合重构成液体溶液或悬浮液的药物组合物配制用于静脉内施用。可以剂量单位形式配制组合物，以便于施用和剂量均匀性。

还包括固体制剂，其旨在在即将使用前转化为用于口服或肠胃外施用的液体制剂。这类液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。

本文提供的组合物和方法尤其适用于治疗癌症患者，特别是胃肠道癌症。因此，组合物和方法可用于治疗各种恶性肿瘤。

如本文所用，组合施用(共同施用)包括以相同或不同剂型同时施用、分开施用或相继施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。因此，在一些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体可用于治疗受试者的癌症的方法，其中EGFR/LGR5双特异性抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。在其他实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体可在治疗受试者的癌症中使用，其中EGFR/LGR5双特异性抗体可与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。

在其他实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体可用于制造用于治疗受试者的癌症的药物，其中EGFR/LGR5双特异性抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。在其他实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体可用于制造用于治疗受试者的癌症的药物，其中EGFR/LGR5双特异性抗体可与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。一种包含EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂的产品可以是同时、分开或相继用于治疗受试者的癌症的组合制剂。

可以根据合适的剂量、途径(例如，静脉内、腹膜内、肌内、鞘内或皮下)施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。

也可以根据任何合适的计划施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。例如，可以在单一制剂中同时施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。另选地，可以将EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂配制用于分开的施用，其中它们可以同时或相继施用。

例如，在一些实施方案中，可以首先施用EGFR/LGR5双特异性抗体，然后施用拓扑异构酶I抑制剂，反之亦然。对以上治疗方法和用途中的剂量方案进行调整以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。

例如，可施用单次推注，可随时间施用多个分开的剂量，或者可如治疗情况的紧急程度所指示那样按比例减少或增加剂量。在一个实施方案中，在施用拓扑异构酶I抑制剂之前施用EGFR/LGR5双特异性抗体，例如，首先向患者施用EGFR/LGR5双特异性抗体，然后施用拓扑异构酶I抑制剂。在一个实施方案中，在施用EGFR/LGR5双特异性抗体之前施用拓扑异构酶I抑制剂，例如，首先向患者施用拓扑异构酶I抑制剂，然后(例如，一分钟或几分钟、一小时或几小时或者一天或几天之后)施用EGFR/LGR5双特异性抗体。这种同时或相继施用使得EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂同时存在于所治疗的患者体内。EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂二者的同时存在将支持EGFR/LGR5双特异性抗体诱导的癌症治疗和EGFR/LGR5双特异性抗体介导的EGFR/LGR5信号传导抑制。

在另一个实施方案中，同时施用拓扑异构酶I抑制剂和EGFR/LGR5双特异性抗体。

在一个实施方案中，向受试者施用单剂量的拓扑异构酶I抑制剂和单剂量的EGFR/LGR5双特异性抗体。在一些实施方案中，将在治疗过程中重复施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。例如，在某些实施方案中，向有治疗需要的受试者施用多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)剂量的拓扑异构酶I抑制剂和多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)剂量的EGFR/LGR5双特异性抗体。

在一些实施方案中，施用拓扑异构酶I抑制剂和EGFR/LGR5双特异性抗体可每周、每两周或每月进行，在这种方案中，它们可在同一天(例如，同时)施用或一个接一个地(例如，彼此之前或之后一分钟或几分钟、一小时或几小时或者一天或几天)施用。当分开施用时，可以但不必根据相同施用(即，给药)方案来施用EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂。例如，一个治疗周期可包括施用EGFR/LGR5双特异性抗体一次或多次，而可以比EGFR/LGR5双特异性抗体更高或更低的频率施用治疗有效剂量的拓扑异构酶I抑制剂。在某些实施方案中，可在同一天施用拓扑异构酶I抑制剂和EGFR/LGR5双特异性抗体的每次剂量，或者另选地，可在EGFR/LGR5抗体之前或之后1天或数天施用拓扑异构酶I抑制剂。

在一些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的剂量随时间变化。例如，EGFR/LGR5双特异性抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂可最初以高剂量施用并且剂量可随时间降低。在另一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂最初以低剂量施用并且剂量随时间增加。

在另一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的施用量对于每次剂量是恒定的。在另一个实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体和/或拓扑异构酶I抑制剂的量随每次剂量而变化。例如，每种的维持(或后续)剂量可以高于或等于首次施用的负荷剂量。在另一个实施方案中，每种的维持剂量可以低于或等于负荷剂量。临床医生可根据所治疗患者的状况使用优选的剂量。剂量可取决于许多因素，包括疾病的阶段等。基于一种或多种这类因素的存在应施用的具体剂量在本领域技术人员的能力范围内。通常，以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始治疗。然后，少量增加剂量，直到达到该情况下的最佳效果。为了方便起见，如果需要，可将总日剂量分开并在一天中分批施用。也可使用间歇疗法(例如，三周中的一周或四周中的三周)。

在某些实施方案中，以0.1、0.3、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg体重的剂量施用EGFR/LGR5双特异性抗体。在另一个实施方案中，以0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg体重的剂量施用EGFR/LGR5双特异性抗体。

只要监督患者护理的临床医生认为治疗方法有效，即患者对治疗有反应，通常就继续本文所述的治疗方法。指示治疗方法有效的非限制性参数可以包括以下一种或多种：减少肿瘤细胞；抑制肿瘤细胞增殖；消除肿瘤细胞；无进展生存期；通过合适的肿瘤标志物证明存在的适当应答(如果适用)。

关于施用EGFR/LGR5双特异性抗体的频率，本领域普通技术人员将能够确定合适的频率。例如，临床医生可以决定相对不那么频繁地(例如，每两周一次)施用EGFR/LGR5双特异性抗体，并且当患者耐受时逐渐缩短两次剂量之间的时间。关于施用拓扑异构酶I抑制剂的频率，可以以类似的方式确定这些药剂的频率。与根据所要求保护的方法的治疗过程相关的示例性时间长度包括：约一周；两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年；约五年；永久性(例如，持续的维持治疗)。前述持续时间可与一轮或多轮治疗/一个或多个治疗周期相关。

可以使用任何合适的手段来评估本文提供的治疗方法的功效。在一个实施方案中，使用癌细胞数量减少作为客观应答标准来分析联合治疗的临床功效。根据本文公开的方法治疗的患者(例如人)优选地经历至少一种癌症体征的改善。在一些实施方案中，可以发生以下一种或多种：可以减少癌细胞的数量；预防或延迟癌症再发；可以在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。另外，体外测定用以确定T细胞介导的靶细胞裂解。

在另一个实施方案中，治疗方法产生的可比临床受益率(CBR＝CR(完全应答)、PR(部分应答)或SD(稳定疾病)≥6个月)优于EGFR/LGR5双特异性抗体或拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康)单独所达到的临床受益率。

在一些实施方案中，在如本文所述进行治疗后不再可检测到肿瘤细胞。在一些实施方案中，受试者部分或完全缓解。在某些实施方案中，受试者的总生存期、中位生存率和/或无进展生存期增加。

本发明的组合(例如，EGFR/LGR5双特异性抗体与拓扑异构酶I抑制剂组合)也可与因对所治疗的癌症具有特殊可用性而选择的其他熟知的疗法结合使用。当合适时，本发明的组合可另选地与已知的一种或多种药学上可接受的药剂相继使用。

安全有效地施用化学治疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，它们的施用在标准文献中描述。例如，许多化学治疗剂的施用在Physicians'Desk Reference(PDR)(例如，1996版)(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)中描述；该文献的公开内容以引用方式并入本文。

对于本领域技术人员而言将显而易见的是，可以取决于所治疗的疾病以及一种或多种化学治疗剂和/或放射疗法对该疾病的已知效果而改变一种或多种化学治疗剂和/或放射疗法的施用。而且，根据熟练临床医生的知识，可以鉴于所观察到的所施用的治疗剂对患者的效果以及鉴于所观察到的疾病对所施用的治疗剂的应答而改变治疗方案(例如，剂量和施用时间)。

本文还提供了一种试剂盒或产品，其包括以适用于前述方法的治疗有效量包含EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒或产品任选地还可以包括说明书，例如包括施用计划，以允许从业者(例如，医师、护士或患者)向患有癌症的患者施用其中包含的组合物。

在一些实施方案中，试剂盒或产品包括单剂量药物组合物的多个包装，每个包装包括有效量的EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂，用于根据上述提供的方法单次施用。试剂盒或产品中还可包括施用一种或多种药物组合物所必需的仪器或设备。例如，试剂盒或产品可提供一个或多个预填充注射器，这些预填充注射器在同一容器中或在分开的容器中包括单位剂量的EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂以作为分开和不同的组合物施用。

在某些实施方案中，EGFR/LGR5双特异性抗体和拓扑异构酶I抑制剂中的一者或两者以适合根据所附的说明书进行重构并随后施用的固体形式提供。

如本文所述的抗体的功能部分至少包含如本文所述的结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。因此，它包含如本文所述的抗体的抗原结合部分，并且通常包含抗体的可变结构域。功能性部分的可变结构域可以是单链Fv-片段或所谓的单结构域抗体片段。单结构域抗体片段(sdAb)是具有单个单体可变抗体结构域的抗体片段。如同整个抗体，其能够选择性结合特异性抗原。在分子量仅12kDa-15kDa的情况下，单结构域抗体片段比由两条重蛋白链和两条轻链构成的常见抗体(150kDa-160kDa)小得多，并且甚至小于Fab片段(～50kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(～25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链且另一个来自重链)。单结构域抗体本身并不比正常抗体(通常为90kDa-100kDa)小得多。单结构域抗体片段大部分由存在于骆驼科中的重链抗体工程化；这些被称为VHH片段

某些鱼类也具有仅重链的抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，由此可获得被称为VNAR片段的单结构域抗体片段。另一种方法是使来自人类或小鼠的常见免疫球蛋白G(IgG)的二聚体可变结构域分裂成单体。尽管目前大部分对单结构域抗体的研究均基于重链可变结构域，但是来源于轻链的纳米抗体也示出与靶表位特异性结合。抗体部分的此类可变结构域的非限制性示例是VHH、人结构域抗体(dAbs)和Unibodies。优选的抗体部分或衍生物具有抗体的至少两个可变结构域或其等同物。此类可变结构域或其等同物的非限制性示例是F(ab)-片段和单链Fv片段。双特异性抗体的功能部分包含双特异性抗体的抗原结合部分，或所述结合部分的衍生物和/或类似物。如上所述，抗体的结合部分包含于可变结构域中。

在其他实施方案中，组合物或组合或试剂盒或产品包含一种或多种其他活性剂。

本文所述的所有文献和参考文献(包括Genbank条目、专利和公开的专利申请以及网站)均各自以引用方式明确并入本文，其程度如同全文或部分地写在本文献中一样。

出于清楚和简要描述的目的，本文将特征结构描述为相同或独立实施方案的一部分，然而，应该理解，本发明的范围可包括具有所述特征的全部或一些的组合的实施方案。

现在通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅是例示性的，并不旨在限制本发明。虽然已经参考本发明的具体实施方案对本发明进行了详细描述，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。

附图说明

图1人LGR5序列。

图2人EGFR序列。

图3治疗对CRC的M005原位PDX模型中肿瘤体积的影响。(a)在治疗期间的注射频率、给药和注射位点；(b)肿瘤体积随时间的倍数变化；和(c)示出在第6周时每只小鼠的倍数变化的点图。

图4(a)小鼠模型M005中治疗释放之前和之后的肿瘤体积。在9周后停止治疗，并且继续监测同一小鼠的肿瘤体积另外3周。每组下方的数字指示在第12周不是所有小鼠都包括在内的原因；(b)每组随时间推移的体重(模型M005)。

图5(a)在处死时具有转移的小鼠的数量，如目测或通过H&E染色法评估；(b)第12周的残留疾病。

图6(a)小鼠模型M001：在治疗期间的注射频率、给药和注射位点；(b)平均肿瘤体积随时间的变化；(c)示出在第6周时每只小鼠的肿瘤体积的点图。

图7(a)每组随时间推移的体重(模型M001)，组合治疗是是非毒性的；(b)单独用双特异性MF5816xMF3755治疗或用双特异性MF5816xMF3755+伊立替康阻断转移治疗。目测或通过H&E染色法评估组织中的转移。

图8(a)MF5816xMF3755的重链可变区的氨基酸序列，其与共同轻链可变区(诸如人κ轻链IgVκ1 39*01/IGJκ1*01的可变区)一起形成结合LGR5或EGFR的可变结构域。CDR和框架区在图8b中指示。DNA序列在图8c中指示。在该图中进一步公开了结合EGFR和LGR5的附加重链可变区，其适于产生双特异性抗体与拓扑异构酶I抑制剂的组合。

图9氨基酸序列：a)共同轻链氨基酸序列。b)共同轻链可变区DNA序列及翻译(IGKV1-39/jk1)。c)共同轻链恒定区DNA序列及翻译。d)IGKV1-39/jk5共同轻链可变区翻译。e)V-区IGKV1-39A；f)共同轻链的CDR1、CDR2和CDR3。

图10。用于产生双特异性分子的IgG重链。a)CH1区。b)铰链区。c)CH2区。d)包含变体L351K和T366K(KK)的CH3结构域。e)包含变体L351D和L368E(DE)的CH3结构域。

实施例

如本文所用，其中X独立地为数字0-9的“MFXXXX”是指包含可变结构域的Fab，其中VH具有由4位数字标识的氨基酸序列，如图8中所示。除非另外指明，否则可变结构域的轻链可变区通常具有图9b的序列。在实施例中，轻链具有如图9a所示的序列。“MFXXXX VH”是指由4位数字标识的VH的氨基酸序列。MF还包含轻链恒定区和通常与轻链恒定区相互作用的重链恒定区。重链的VH/可变区不同并且通常还具有CH3区，其中重链中的一条具有其CH3结构域的KK突变，另一条具有其CH3结构域的互补DE突变(参见PCT/NL2013/050294(公布为WO2013/157954)和图10d及图10e)。实施例中的双特异性抗体具有一个Fc尾，其带有如图10中所示的一个KK/DE CH3异二聚化结构域、一个CH2结构域和一个CH1结构域、如图9a所示的共同轻链和由MF编号标示的VH。例如，用MF3755 xMF5816表示的双特异性抗体具有上述一般序列以及具有带有MF3755序列的VH的可变结构域和具有带有MF5816序列的VH的可变结构域。

实施例1

细胞系：

Freestyle 293F细胞(目录号p/n51-0029)购自Invitrogen并常规保存在293FreeStyle培养基中。HEK293T(ATCC-CRL-11268)和CHO-K1(DSMZ ACC110)细胞系购自ATCC并且常规保存在补充有L-谷氨酰胺(Gibco)和FBS(Lonza)的DMEM/F12(Gibco)中。

各种重链可变区(VH)的氨基酸和核酸序列如图8中所示。双特异性抗体EGFR/LGR5，MF3755xMF5814；包含重链可变区MF3755和MF5816以及共同轻链，并且包括用于无岩藻糖基化的增强ADCC的修饰，以及如图9a所示的其他LGR5和EGFR组合，它们已经在WO2017/069628(第138页)中证明是有效的。

生成双特异性抗体

通过使用专有CH3工程化技术瞬时共转染编码具有不同VH结构域的IgG的两种质粒来生成双特异性抗体，以确保有效异源二聚化和双特异性抗体的形成。共同轻链也被共转染到同一细胞中，在同一质粒上或者在另一质粒上。在专利申请中(例如，WO2013/157954和WO2013/157953；以引用方式并入本文)，公开了用于由单个细胞产生双特异性抗体的方法和装置，由此提供与形成单特异性抗体相比，有利于形成双特异性抗体的装置。这些方法还可有利地用于本发明。具体地讲，基本上仅产生双特异性全长IgG分子的优选突变是在351位和366位处的氨基酸取代，例如，在第一CH3结构域(“KK-变体”重链)中的L351K和T366K(根据EU编号法进行编号)和在351位和368位处的氨基酸取代，例如第二CH3结构域(“DE-变体”重链)中的L351D和L368E，反之亦然(参见图10d和图10e)。先前在提及的专利申请中展示，带负电的DE-变体重链和带正电的KK-变体重链优先配对以形成异源二聚体(所谓的“DEKK”双特异性分子)。几乎不进行DE-变体重链(DE-DE同源二聚体)或KK-变体重链(KK-KK同源二聚体)的同源二聚化，这是因为相同重链之间的CH3-CH3界面中带电残基之间的强相斥。

将结合上述LGR5的可变结构域的VH基因克隆到编码带正电的CH3结构域的载体中。将结合EGFR的可变结构域的VH基因(诸如WO 2015/130172中公开的那些，该专利以引用方式并入本文))克隆到编码带负电的CH3结构域的载体中。将悬浮生长调节的293FFreestyle细胞在摇动器平台上于T125烧瓶中培养直至密度为3.0x 10e6个细胞/ml。细胞以0.3-0.5x10e6个活细胞/ml的密度接种在24深孔板的每个孔中。细胞用编码不同抗体的两种质粒的混合物瞬时转染，克隆到专有载体体系中。在转染后7天，收集细胞上清液并通过0.22μM过滤器(Sartorius)过滤。将无菌上清液储存在4℃直至纯化抗体。

IgG纯化

使用过滤在过滤板中在无菌条件下进行纯化。首先，将培养基的pH调节至pH 8.0，并且随后在振摇平台上在25℃下以600rpm将含IgG的上清液与蛋白A Sepharose CL-4B珠(50体积/体积％)(Pierce)温育2小时。接着，通过过滤收集所述珠。用pH 7.4的PBS将珠洗涤两次。然后在pH 3.0下用0.1M柠檬酸盐缓冲液将结合的IgG洗脱，并且洗脱液立即使用Tris pH 8.0进行中和。通过使用多屏Ultracel 10多重板(Millipore)离心进行缓冲液交换。最终在PBS pH7.4中收集样品。使用Octet测量IgG浓度。蛋白质样品储存在4℃。

使用Octet量化IgG

为测定纯化的IgG的量，将总人IgG(Sigma Aldrich，目录号I4506)用作标准物，使用蛋白质-A生物传感器(Forte-Bio，根据供应商的建议)通过Octet分析来测定抗体的浓度。

小鼠和制备的细胞用于移植

肿瘤生长7天，然后解聚成单一细胞悬浮液用于注射。对于所有小鼠研究，使用6-8周龄之间的雌性NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj小鼠(Janvier Labs)。

培养条件和制备单个细胞的方法。

来源于结肠直肠癌样品的类器官在37℃和5％CO2下，在100％基底膜提取物(BME，Amsbio)中培养，其中培养基由Advanced DMEM/F12(Invitrogen)构成，其补充有：2mMGlutaMax(Invitrogen)、10mM HEPES(Invitrogen)、1x B27游离视黄酸(Invitrogen)、50ng/mL EGF(Peprotech)、0.1μg/mL Noggin(Peprotech)、Rock抑制剂Y-27632(Sigma-Aldrich)、10nM PGE2(Sigma-Aldrich)、3μm SB202190(Sigma-Aldrich)、10nM胃泌素(Tocris)、1μg/ml R-SPO1(自制)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、1.25mM N-乙酰半胱氨酸Sigma-Aldrich)、0.5μM A83-01(Tocris)。分析前一天，类器官被分解成单个细胞。为此目，首先通过去除培养基从BME中释放类器官，并将BME重新悬浮于细胞回收溶液(BDBiosciences)中，并在冰上温育1小时。随后，将类器官离心(所有离心步骤在4℃下以200g持续5分钟)。将粒料重新悬浮于1mL 50％胰蛋白酶/EDTA溶液(TE)中；50％PBS，并上下移取，并定期目视评估，直至获得单细胞悬液。TE在10mL PBS中稀释并离心。细胞在10mL的PBS中洗涤两次，然后重新悬浮于BME中，并等分成50μL，滴到预热板(37℃)上。将BME液滴静置15分钟，然后按滴添加500μL培养基。12小时后，使用细胞回收溶液从BME中分离细胞。在冰上1小时后，将细胞离心，并在10mL包含0.5％BSA和0.5mM EDTA的PBS(染色缓冲液)中洗涤一次。然后使粒料重新悬浮于染色缓冲液中并计数。

VHIO的干细胞和癌症组已经开发了源自手术切除的原发性肿瘤(结肠和直肠)和肝转移的CRC PDX模型的集合。PDX模型经临床和分子学注释，并且完全代表mCRC的临床流行病学。这些模型可以皮下或原位注射到免疫缺陷小鼠的盲肠壁。原位模型在淋巴结、肝、肺和恶性肿瘤中产生局部和远端转移，在CRC患者中重新产生晚期疾病。

选择具有关键分子特征的一组PDX模型以评估本发明的抗-LGR5/EGFR双特异性抗体的功效(参见表1)。在初始PDX组中选择了几种突变体和野生型模型。已经在这些PDX模型中测量了其他决定簇，例如EGFR或LGR5的相对表达，其也可以确定对EGFR/LGR5抗体产生的应答(表1)。

选择得自三个晚期CRC患者的肝转移的PDX模型(表1)。两个模型是KRAS突变体(分别为M005和M001的G13D和G12D)，其中M005也是APC和PIK3CA 112_112del突变体。

模型M005：对120NOD-SCID小鼠给予1×10⁶个源自M005 PDX模型的肿瘤细胞的原位盲肠壁注射，其中该模型基本上如下所述产生：Puig等人，A Personalized PreclinicalModel to Evaluate the Metastatic Potential of Patient-Derived Colon CancerInitiating Cells,Clin Cancer Res；19(24)，6787-6801(2013)，其全文并入本申请。这些人肿瘤细胞源自CRC肝转移并且含有在KRAS基因(KRAS G13D)和PIK3CA基因(PIK3CA 112_112del)中的突变。参见英国桑格研究所(UK Sanger Institute)，特征为携带突变PIK3CC420R的18种不同的组织类型(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic，突变ID COSM757)。从注射后第15天起，每周使用CT成像监测小鼠并检测盲肠中的原发性肿瘤。在至少80％的动物具有在盲肠中生长的原发性肿瘤之后，开始治疗。排除以下18只小鼠：在外科手术后死亡的小鼠(#5)、没有原发性肿瘤的小鼠(#7)、肿瘤太小或太大的小鼠(分别为#2和#1)、体重低的小鼠(#2)、具有疾病全身症状的小鼠(#1)。

根据图3a对剩余的102只小鼠进行治疗，并且每周用显微CT成像。转移性病灶的频率和大小也通过对肝和肺的组织学评估(苏木精和伊红染色剂(H&E)染色法)来确定。尸检时目测检测到腹膜癌，并且随后通过组织学确认。

模型M001：M001 PDX模型基本上如下所述产生：Puig等人，A PersonalizedPreclinical Model to Evaluate the Metastatic Potential of Patient-DerivedColon Cancer Initiating Cells,Clin Cancer Res；19(24)，6787-6801(2013)，其全文并入本申请；参见英国桑格研究所(UK Sanger Institute)，特征为携带突变PIK3C C420R的18种不同的组织类型(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic，突变ID COSM757)。在第二原位模型中，注射的人肿瘤细胞最初源自具有以下突变的CRC肝转移：KRAS G12D和PIK3CA-C420R。如上类似地注射肿瘤细胞。排除以下18只小鼠：在外科手术后死亡的小鼠(#11)、没有原发性肿瘤的小鼠(#2)、肿瘤太大的小鼠(#2)、体重低的小鼠(#1)、和具有疾病全身症状的小鼠(#2)。给药和治疗方案根据图6a。

在第6周，处死用载体或双特异性EGFR/LGR5治疗的所有小鼠，它们仅包含MF3755和MF5816；还处死用伊立替康或双特异性EGFR/LGR5治疗的大致半数的小鼠，它们包含MF3755和MF5816+伊立替康。

结果：

分析模型M005

用包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5单独治疗的小鼠的平均肿瘤体积低于给予载体的小鼠的平均肿瘤体积，但不与单独用伊立替康治疗的小鼠的平均肿瘤体积一样低。令人惊讶的是，与所有其他组的小鼠相比，接受包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5+伊立替康组合治疗的小鼠具有更低的肿瘤体积(图3b、图3c)。有趣的是，在治疗释放之后，包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5延长了伊立替康的肿瘤生长阻断作用，如在肿瘤体积的倍数变化中所见(图4a)。

在处死时获取来自所有小鼠的原发性肿瘤并分析转移性病灶的频率和大小。图5a示出了在处死时发现具有转移性病灶的小鼠的数量，表明用包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5或伊立替康(单独的或组合的)治疗的小鼠具有比未经治疗的小鼠更少的转移。

还在经受治疗释放(9周)的小鼠中进行组织分析，并在3周的无治疗期后处死。发现较小的肿瘤含有坏死细胞或仅少量肿瘤细胞，而大部分较大的肿瘤具有丰富的肿瘤细胞(图5b)。该分析显示，在治疗释放后3周，经治疗的小鼠的肿瘤体积和盲肠重量是正相关的(皮尔逊(Pearson)相关系数P<0.0001)。

分析模型M001：

用单独包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5治疗的小鼠的平均肿瘤体积与单独用伊立替康治疗的小鼠的平均肿瘤体积非常相似。然而，接受包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5+伊立替康组合治疗的小鼠具有比任何其他组小鼠更低的肿瘤体积(图6b、c)。在接受包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5+伊立替康的组合的小鼠中未观察到毒性(图7a)。

用于在处死时测定转移性病灶的组织学分析表明用包含MF3755和MF5816的双特异性EGFR/LGR5或伊立替康(单独的或组合的)治疗的小鼠具有比未经治疗的小鼠更少的转移(图7b)。

针对抑制肿瘤生长和转移可能的潜力，用包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及化疗药物伊立替康(单独的或组合的)测试两个原位模型M005和M001。在M005中，单独的包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及伊立替康能够延迟原发性肿瘤生长，但两者的组合表明包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及伊立替康促进优异的应答。在治疗释放之后，组合治疗完全消除了全部五只存活小鼠中的原发性肿瘤。对于单独使用伊立替康的疗法，仅消除了14只小鼠中1只的原发性肿瘤。同样地，这表明包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5增强了由化学疗法诱导的完全肿瘤消退。就转移可能性而言，包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5阻断了远端转移的形成，如同伊立替康的作用。在用伊立替康+包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5组合治疗的小鼠中未看到转移。

在模型M001中确认模型M005的结果。单独的包含gMF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及伊立替康在延迟M001中的原发性肿瘤生长方面同样有效，然而，当一起施用时，组合治疗似乎比单独给出任一制剂更有效。

如图6c所示的第6周数据的肿瘤体积的统计分析(ANCOVA)显示治疗显著降低了所有组之间的肿瘤体积，除了在伊立替康组与包含MF3755和MF5816的双特异性抗体组之间的肿瘤体积。(载体对MF3755和MF5816，p＜0.0001；载体对伊立替康，p＜0.0001；载体对伊立替康+MF3755和MF5816，p＜0.0001；MF3755和MF5816对伊立替康，p＜0.6429；MF3755和MF5816对伊立替康+MF3755和MF5816，p＜0.0001；伊立替康+MF3755和MF5816对伊立替康，p＜0.0001。)

在M001中，组合治疗不比单独使用伊立替康毒性更大。就转移可能性而言，包含MF3755和MF5816的EGFR/LGR5阻断了远端转移的形成，如同伊立替康的作用。在用伊立替康+包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5组合治疗的小鼠中未看到转移。

总之，使用两个原位CRC肿瘤模型，已经发现与单独施用这些药物相比，包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及伊立替康的组合治疗在肿瘤消退方面的结果更好。另外，发现转移在包含MF3755和MF5816的双特异性抗体EGFR/LGR5以及伊立替康(单独治疗或组合治疗)中被阻断。

表1|源自CRC患者的肝转移的PDX模型的特性。通过免疫荧光定量测定LGR5、EGFR和核β-连环蛋白。通过基因组分析测定Wnt信号传导的突变状态(APC、RSPO、RNF43、ZNRF3)和致癌(KRAS、PIK3CA、TP53)蛋白。在暗细胞中指示PDX模型(皮下生长)对WNT抑制剂的敏感性。在进一步的实验中未使用PDX模型T108。

Claims (29)

1.一种用于治疗癌症的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物与拓扑异构酶I抑制剂一起施用。

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述癌症是结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述癌症是结肠直肠癌。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物和所述拓扑异构酶I抑制剂同时施用于所述受试者。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物在所述拓扑异构酶I抑制剂之前施用于所述受试者。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述结合EGFR的可变结构域的VH链包含如图8中所示的VH链MF3755的氨基酸序列；或者如图8中所示的VH链MF3755的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地具有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代或它们的组合；并且其中结合LGR5的所述可变结构域的VH链包含如图8所述的VH链MF5816的氨基酸序列；或者如图8中所示的VH链MF5816的氨基酸序列，所述氨基酸序列关于所述VH具有最多15个，优选地具有不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，并且优选地具有不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸修饰，包括插入、缺失、取代或它们的组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中结合LGR5的所述可变结构域结合位于如图1中所示的人LGR5序列的氨基酸残基21-118内的表位。

8.根据权利要求7所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中在人LGR5的位点43、44、46、67、90和91处的氨基酸残基参与所述LGR5结合可变结构域与LGR5的结合。

9.根据权利要求7或8所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述LGR5结合可变结构域与LGR5蛋白的结合较少，所述LGR5蛋白包含选自43A、44A、46A、67A、90A和91A的氨基酸残基变体中的一个或多个氨基酸残基变体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中结合EGFR的所述可变结构域结合位于如图2中所示的人EGFR序列的氨基酸残基420-480内的表位。

11.根据权利要求10所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中在人EGFR的位点I462、G465、K489、I491、N493和C499处的氨基酸残基参与所述EGFR结合可变结构域与EGFR的结合。

12.根据权利要求10或11所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述EGFR结合可变结构域与EGFR蛋白的结合较少，所述EGFR蛋白包含选自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A和C499A的氨基酸残基取代中的一个或多个氨基酸残基取代。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱或其衍生物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是伊立替康或拓扑替康。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述抗体是ADCC增强的。

16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。

17.一种用于抑制表达EGFR和LGR5的细胞在允许所述细胞增殖的系统中增殖的方法，所述方法包括提供具有拓扑异构酶I抑制剂和抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物的所述系统，所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。

18.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者同时或相继施用拓扑异构酶I抑制剂和抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域。

19.根据权利要求18所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌。

20.根据权利要求18所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。

21.一种药物组合物，所述药物组合物包含：抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；以及拓扑异构酶I抑制剂。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；并且拓扑异构酶I抑制剂在单个制剂中提供。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；并且拓扑异构酶I抑制剂在分开制剂中提供。

24.一种试剂盒，所述试剂盒包括：抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域；拓扑异构酶I抑制剂；以及用于在根据权利要求1-16中任一项所述的治疗中使用所述抗体和所述拓扑异构酶I抑制剂的说明书。

25.一种用于治疗受试者的胃肠道癌症的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其中所述抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。

26.一种抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，其用于制造一种药物，所述药物用于治疗受试者的癌症，其中所述抗体与拓扑异构酶I抑制剂同时、分开或相继施用。

27.根据权利要求26所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其用于治疗结肠直肠癌、肺癌、胃肠道癌或卵巢癌。

28.根据权利要求27所述的抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物，其用于治疗结肠直肠癌。

29.一种包含抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物以及拓扑异构酶I抑制剂作为组合制剂的产物，所述抗体或其功能部分、衍生物和/或类似物包含结合EGFR的细胞外部分的可变结构域和结合LGR5的细胞外部分的可变结构域，所述组合制剂同时、分开或相继用于治疗受试者的胃肠道癌症。

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