CN108107140A - 肾上腺素中间体中杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及肾上腺素中间体中杂质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法进行测定，具体检测方法如下：配制缓冲液、稀释剂、流动相A流动相B、样品液；运用高效液相色谱仪对制备的样品液中肾上腺素中间体中杂质进行检测，条件如下：流速：1.5～2.0mL/min；柱温：45～55℃；进样量：10～30μL；检测波长：200～220nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱洗脱程序：0～5分钟，流动相A：B为95：5～90：10；5～20分钟，流动相A：B为50:50；25～30分钟，流动相A：B为95：5～90：10。本发明提供的检测方法可以有效的分离出肾上腺素中间体中的杂质峰，该方法极大的提高了肾上腺素中间体杂质的检测灵敏度，可简单、快速、稳定的检测出肾上腺素中间体杂质。

Description

肾上腺素中间体中杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及肾上腺素中间体中杂质的检测方法。

背景技术

肾上腺素中间体是肾上腺素合成过程中的中间体，肾上腺素中间体中杂质的多少直接影响肾上腺素中杂质的多少，从而影响肾上腺素的质量，因此控制好肾上腺素中间体的杂质对肾上腺素整体的合成起到关键作用。根据工艺摸索，肾上腺素中间体中杂质主要控制3个，分别为儿茶酚、氯乙酰儿茶酚及肾上腺素酮盐酸盐，控制上述杂质含量在0.5％的范围下能够持续和稳定的得到合格的肾上腺素。目前尚未发现有关肾上腺素中间体有关杂质的文献报道。

因此，亟需开发一种合理的色谱检测方法，制定出简单、灵敏的肾上腺素中间体中杂质的检测方法，以便后续能够持续稳定的得到合格的肾上腺素。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种肾上腺素中间体中杂质的检测方法，该方法简便，步骤少，测试结果准确，能快速的检测出杂质的含量，方法稳定可靠。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种肾上腺素中间体中杂质的检测方法，具体检测步骤为：

1)缓冲液的配制：取4.0～6.0g磷酸二氢钾和2.4～2.8g辛烷磺酸钠溶于1000ml水中，用磷酸调pH值为2.9～3.1，得缓冲液，待用；

2)稀释剂的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比87:13混合后得到稀释剂，待用；

3)流动相A的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比95：5混合后得到稀释剂，待用；

4)流动相B的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比55：45混合后得到稀释剂，待用；

5)样品液的制备：称取肾上腺素中间体样品，用稀释剂配制成浓度为0.2～0.4mg/mL的肾上腺素中间体样品液，待用；

6)检测：运用高效液相色谱仪对步骤5)制备的样品液中肾上腺素中间体中杂质进行检测，工作条件如下：

流速：1.5～2.0mL/min；

柱温：45～55℃；

进样量：10～30μL；

检测波长：200～220nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，100mm*4.6mm*3μm；

色谱柱洗脱程序：在0到5分钟内，流动相A：B为95：5～90：10；在5分钟到20分钟，流动相A：B为50:50；在25分钟到30分钟，流动相A：B为95：5～90：10。

进一步地，所述肾上腺素中间体样品液中含有肾上腺素中间体、儿茶酚、氯乙酰儿茶酚和肾上腺素酮盐酸盐。

进一步地，所述缓冲液的配制：取5.0g磷酸二氢钾和2.6g辛烷磺酸钠溶于1000ml水中，用磷酸调pH值为3.0，得缓冲液。

进一步地，所述肾上腺素中间体样品液浓度为0.3mg/mL。

进一步地，所述高效液相色谱仪的工作条件如下：

流速：2.0mL/min；

柱温：50℃；

进样量：20μL；

检测波长：210nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，100mm*4.6mm*3μm；

色谱柱洗脱程序：在0到5分钟内，流动相A：B为95：5；在5分钟到20分钟，流动相A：B为50:50；在25分钟到30分钟，流动相A：B为95：5。

采用高效液相色谱仪进行测试，可以实现肾上腺素中间体中杂质和肾上腺素中间体的合理分离，目标物之间互不干扰，实现一次处理出全部结果，精度高，检测限低。

通过设置缓冲液的pH和不同比例的流动相，可实现肾上腺素中间体与杂质之间的准确分离。

通过选择在210nm处，实现三个杂质的最大吸收波长，检测限可达到20ppm。

本发明的检测方法中流动相中缓冲盐组成比例以及pH对试验结果中对肾上腺素中间体、杂质之间的分离度有很大影响，通过进一步研究发现，经过调节适当的缓冲盐pH值，再通过不同比例的缓冲盐比例组成进行梯度洗脱，可达到肾上腺素中间体、杂质之间的准确分离，最后确认缓冲盐组成中磷酸二氢钾为4.0～6.0g，辛烷磺酸钠为2.4～2.8g，pH值调节至2.9～3.1。在0到5分钟内，流动相比例为水比乙腈为95：5～90：10，在5分钟到20分钟，水和乙腈比例调整到50:50，然后将洗脱剂比例调回95：5～90：10，此条件下进行梯度洗脱，对儿茶酚、氯乙酰儿茶酚及肾上腺素酮盐酸盐的分离度均大于3，符合要求。并且本方法对肾上腺素中间体杂质的定量限可达到100ppm，具有较高的灵敏度，可以高质量严格控制肾上腺素中间体杂质。

本发明的检测方法中检测波长和进样量对检测结果中肾上腺素中间体杂质的灵敏度有很大影响，通过研究发现，经过二极管阵列扫描，发现肾上腺素中间体杂质在205～215nm处均有较大吸收，其中210nm处三种基因毒性杂质均有最大吸收波长，最终确认检测波长为210nm，进样量为20μL，在该条件下，杂质的检测限能够达到20ppm。

本发明的有益效果

本发明提供一种肾上腺素中间体中杂质的检测方法，可以有效的分离肾上腺素中间体主成分峰与杂质峰，同时可以有效分离杂质之间的峰，该方法极大的提高了有关物质的检测稳定性，从而可以简单、快速、稳定的检测肾上腺素中间体有关物质，从而有效的保证肾上腺素的质量稳定性，避免了肾上腺素工业化生产的不稳定性。该方法简便，步骤少，测试结果准确，能快速的检测出杂质的含量，方法稳定可靠；信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

通过高效液相色谱法检测肾上腺素中间体有关物质，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，这种色谱柱在液相色谱中较为常用，加入适当比例的乙腈，可以保护色谱柱的稳定性和使用寿命，提高了色谱柱的耐用性。

所测化合物线性范围为30～300ng/mL，相关系数R²≥0.999，检出限为10ng/mL，RSD≤2.1％。方法简便、快速、准确，稳定可靠，各项技术指标均满足检测需要。

本发明提供的操作方法简单，可操作性强，精密度高，重现性好，有效保证数据的准确性，成本低，适合工业应用。

附图说明

图1是优选实施例1检测得到的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。

以下实施例中高效液相的流动相中乙腈为色谱纯乙腈。实施例中无特殊说明，实施例中的温度为设定温度，允许温度误差为±3℃。

本检测方法为药物分析领域的外标法，以下实验过程和试验方法中的操作方式，没有进行详细说明的，均采用标准操作流程，例如溶液配制，系统适用性试验的操作方法。

实施例1：肾上腺素中间体中杂质的检测方法

(1)色谱条件

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(100mm*4.6mm*3μm)

流动相：

缓冲液：5.0g磷酸二氢钾和2.6g辛烷磺酸钠到1000ml水中，用磷酸调pH至3.0

流动相A：缓冲液-乙腈(体积比95：5)

流动相B：缓冲液-乙腈(体积比55：45)

稀释剂：缓冲液-乙腈(体积比87：13)

按照下表1进行梯度洗脱；

表1：梯度洗脱程序的条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	95	5
5	95	5
			20	50	50
25	95	5
			30	95	5

柱温：50℃；

流动相的流速2.0mL/min；

检测波长：210nm。

(2)样品配制

样品溶液配制：用缓冲液和乙腈体积比为87:13的稀释剂将待测的肾上腺素中间体配制成含肾上腺素中间体约为0.3mg/mL的溶液，按照原料药重量进行精密称定配制待检测的肾上腺素中间体溶液，一般肾上腺素中间体浓度在0.2～0.4mg/mL。

(3)检测方法

精密量取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图1所示。

(4)计算

按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比计，计算样品溶液中杂质含量。

(5)实验结果

杂质确定：

根据肾上腺素中间体中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以确定肾上腺素中间体中的杂质峰1、2和3是杂质，具体杂质名称如表2所示。

表2：杂质信息表

杂质名称	化学名
		杂质1	儿茶酚
杂质2	氯乙酰儿茶酚
		杂质3	肾上腺素酮盐酸盐

色谱图结果：

按照上述色谱条件得到，杂质的色谱峰具有如图1所示的色谱图。

分析结果：

对图1色谱图中的杂质峰进行分析，结果见表3。

表3：实施例1HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表3可以看出，在该色谱系统可以肾上腺素中间体杂质有效检出，三个肾上腺素中间体杂质之间保留时间差别明显，可以有效分离，三个肾上腺素中间体杂质和肾上腺素中间体以及肾上腺素中间体中的其他杂质也能有效的分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

实施例2：肾上腺素中间体中杂质的检测方法

具体参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

流动相的流速1.5mL/min。

实验结果：

杂质确定：

根据肾上腺素中间体中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以确定肾上腺素中间体中的杂质峰1、2和3是杂质，具体杂质名称如实施例1中的表2所示。

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表4，检测结果表明肾上腺素中间体和杂质分离良好。

表4：实施例2HPLC色谱图中肾上腺素中间体杂质的分析结果

从表4可以看出，在该色谱系统可以肾上腺素中间体杂质有效检出，三个肾上腺素中间体杂质之间保留时间差别明显，可以有效分离，三个肾上腺素中间体杂质和肾上腺素中间体以及肾上腺素中间体中的其他杂质也能有效的分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

实施例3：肾上腺素中间体中杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

按照下表5进行梯度洗脱；

表5：梯度洗脱程序的条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	90	10
5	95	5
			20	50	50
25	95	5
			30	95	5

实验结果

杂质确定：

根据肾上腺素中间体中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以确定肾上腺素中间体中的杂质峰1、2和3是杂质，具体杂质名称如实施例1中表2所示。

分析结果：

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表6，检测结果表明肾上腺素中间体和杂质分离良好。

表6：实施例3HPLC色谱图中肾上腺素中间体杂质的分析结果

从表6可以看出，在该色谱系统可以肾上腺素中间体杂质有效检出，三个肾上腺素中间体杂质之间保留时间差别明显，可以有效分离，三个肾上腺素中间体杂质和肾上腺素中间体以及肾上腺素中间体中的其他杂质也能有效的分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

实施例4：肾上腺素中间体中杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

流动相：

缓冲液：5.0g磷酸二氢钾和2.6g辛烷磺酸钠到1000ml水中，用磷酸调pH至3.1

流动相A：缓冲液-乙腈(95：5)

流动相B：缓冲液-乙腈(55：45)

稀释剂：缓冲液-乙腈(87：13)

实验结果

杂质确定：

根据肾上腺素中间体中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以确定肾上腺素中间体中的杂质峰1、2和3是杂质，具体杂质名称如实施例1中表2所示。

分析结果：

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表7，检测结果表明肾上腺素中间体和杂质分离良好。

表7：实施例4HPLC色谱图中肾上腺素中间体杂质的分析结果

从表7可以看出，在该色谱系统可以肾上腺素中间体杂质有效检出，三个肾上腺素中间体杂质之间保留时间差别明显，可以有效分离，三个肾上腺素中间体杂质和肾上腺素中间体以及肾上腺素中间体中的其他杂质也能有效的分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

实施例5：肾上腺素中间体中杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行检测，与实施例1不同之处在于：

流动相：

缓冲液：5.0g磷酸二氢钾和2.6g辛烷磺酸钠到1000ml水中，用磷酸调pH至2.8

流动相A：缓冲液-乙腈(95：5)

流动相B：缓冲液-乙腈(55：45)

稀释剂：缓冲液-乙腈(87：13)

实验结果

杂质确定：

根据肾上腺素中间体中有关物质现状及杂质对照品的比较分析，可以确定肾上腺素中间体中的杂质峰1、2和3是杂质，具体杂质名称如实施例1中表2所示。

分析结果：

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表8，检测结果表明肾上腺素中间体和杂质分离良好。

表8：实施例5HPLC色谱图中肾上腺素中间体杂质的分析结果

从表8可以看出，在该色谱系统可以肾上腺素中间体杂质有效检出，三个肾上腺素中间体杂质之间保留时间差别明显，可以有效分离，三个肾上腺素中间体杂质和肾上腺素中间体以及肾上腺素中间体中的其他杂质也能有效的分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的肾上腺素中间体杂质说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测肾上腺素中间体中的杂质。

通过实施例1～5的检测方法发现，经过设置不同比例的流动相中缓冲盐组成比例以及pH对试验结果中对肾上腺素中间体、杂质之间的分离度有很大影响，通过进一步研究发现，经过调节适当的缓冲盐pH值，再通过不同比例的缓冲盐比例组成进行梯度洗脱，可达到肾上腺素中间体、杂质之间的准确分离，最后确认缓冲盐组成中磷酸二氢钾为4.0～6.0g，辛烷磺酸钠为2.4～2.8g，pH值调节至2.9～3.1。在0到5分钟内，流动相比例为水比乙腈为95：5～90：10，在5分钟到20分钟，水和乙腈比例调整到50:50，然后将洗脱剂比例调回95：5～90：10，此条件下进行梯度洗脱，对儿茶酚、氯乙酰儿茶酚及肾上腺素酮盐酸盐的分离度均大于3，符合要求。并且本方法对肾上腺素中间体杂质的定量限可达到100ppm，具有较高的灵敏度，可以高质量严格控制肾上腺素中间体杂质。

本发明的检测方法中检测波长和进样量对检测结果中肾上腺素中间体杂质的灵敏度有很大影响，通过研究发现，经过二极管阵列扫描，发现肾上腺素中间体杂质在205～215nm处均有较大吸收，其中210nm处三种基因毒性杂质均有最大吸收波长，最终确认检测波长为210nm，进样量为20μL，在该条件下，杂质的检测限能够达到20ppm。

方法学考察：

按照本领域常规试验方式对该检测方法进行方法学考察，主要考察该检测方法的检测限、确定对三种肾上腺素杂质的含量测定线性区间、制备杂质定量标准曲线，检验方法的重复性和溶液稳定性。

检测线考察：分别称取三种杂质标准品适量，用稀释剂溶解并稀释成适当浓度，取溶液检测，根据检测图谱中各峰信噪比，再对溶液进行稀释，当信噪比为3时具有检测限，信噪比为10时具有定量限。

线性考察：分别称取儿茶酚、氯乙酰儿茶酚、肾上腺素酮盐酸盐标准品适量，溶解并稀释成30ng/mL～300ng/mL的6个不同溶液，按照色谱条件各个溶液进样3针，记录色谱图。

重复性考察：分别称取肾上腺素中间体适量，配制成含肾上腺素中间体0.3mg/mL的溶液，同法配制6份，按照色谱条件各个溶液进样1针，记录色谱图。

溶液稳定性考察：取重复性溶液分别在0、2、4、8、12、18、24小时，按照色谱条件进样，记录色谱图。

具体结果见下表9。

表9：方法学考察结果

由上述表9可知，本发明实施例1～5的检测方法，可以用于控制肾上腺素中间体中的杂质儿茶酚、氯乙酰儿茶酚、肾上腺素酮盐酸盐。

对于杂质儿茶酚检测限为10ng/mL；定量限为30ng/mL；重复性RSD为2.1％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于杂质氯乙酰儿茶酚检测限为10ng/mL；定量限为30ng/mL，；重复性RSD为1.9％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于杂质肾上腺素酮盐酸盐检测限为10ng/mL；定量限为30ng/mL；重复性RSD为2.1％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

本发明提供的肾上腺素中间体杂质的检测方法，可以有效的分离肾上腺素中间体主成分峰与各杂质峰，该方法极大的提高了肾上腺素中间体杂质的检测灵敏度，从而可以简单、快速、稳定的检测肾上腺素中间体杂质，以便有效的控制肾上腺素中间体的质量，避免了有害杂质未检出可能带来的工艺风险。该方法对三种杂质的检测限为10ng/mL，相当于20ppm；定量限为30ng/mL，相当于100ppm；重复性RSD均小于等于3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定，适于应用于原料药质量控制。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为被包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种肾上腺素中间体中杂质的检测方法，其特征在于，具体检测步骤为：

1)缓冲液的配制：取4.0～6.0g磷酸二氢钾和2.4～2.8g辛烷磺酸钠溶于1000ml水中，用磷酸调pH值为2.9～3.1，得缓冲液，待用；

2)稀释剂的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比87:13混合后得到稀释剂，待用；

3)流动相A的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比95：5混合后得到稀释剂，待用；

4)流动相B的配制：将步骤1)所得缓冲液与乙腈按体积比55：45混合后得到稀释剂，待用；

5)样品液的制备：称取肾上腺素中间体样品，用稀释剂配制成浓度为0.2～0.4mg/mL的肾上腺素中间体样品液，待用；

6)检测：运用高效液相色谱仪对步骤5)制备的样品液中肾上腺素中间体中杂质进行检测，工作条件如下：

流速：1.5～2.0mL/min；

柱温：45～55℃；

进样量：10～30μL；

检测波长：200～220nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，100mm*4.6mm*3μm；

色谱柱洗脱程序：在0到5分钟内，流动相A：B为95：5～90：10；在5分钟到20分钟，流动相A：B为50:50；在25分钟到30分钟，流动相A：B为95：5～90：10。

2.根据权利要求1所述的肾上腺素中间体中杂质的检测方法，其特征在于，所述肾上腺素中间体样品液中含有肾上腺素中间体、儿茶酚、氯乙酰儿茶酚和肾上腺素酮盐酸盐。

3.根据权利要求1所述的肾上腺素中间体中杂质的检测方法，其特征在于，所述缓冲液的配制：取5.0g磷酸二氢钾和2.6g辛烷磺酸钠溶于1000ml水中，用磷酸调pH值为3.0，得缓冲液。

4.根据权利要求1所述的肾上腺素中间体中杂质的检测方法，其特征在于，所述肾上腺素中间体样品液浓度为0.3mg/mL。

5.根据权利要求1所述的肾上腺素中间体中杂质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的工作条件如下：

流速：2.0mL/min；

柱温：50℃；

进样量：20μL；

检测波长：210nm；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，100mm*4.6mm*3μm；

色谱柱洗脱程序：在0到5分钟内，流动相A：B为95：5；在5分钟到20分钟，流动相A：B为50:50；在25分钟到30分钟，流动相A：B为95：5。