CN108025072A

CN108025072A - 制备治疗用蛋白质制剂的方法和由这种方法生产的抗体制剂

Info

Publication number: CN108025072A
Application number: CN201680054397.XA
Authority: CN
Inventors: J.K.格林; B.X.陈; D.P.拉卡斯
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2018-05-11
Also published as: KR20180037056A; IL258311B; WO2017051273A1; HK1255006A1; AU2016329034B2; US20230134160A1; KR20200035496A; RU2018110145A3; CA2999118A1; CA2999118C; JP2017095440A; EP3352790A1; IL258311A; JP6925111B2; MX2018003298A; RU2018110145A; AU2016329034A1

Abstract

本发明涉及制备包含治疗用蛋白质的蛋白质制剂的方法，所述方法包括步骤：提供包含所述蛋白质的溶液；由第一超滤步骤浓缩所述溶液中的所述蛋白质；用包含至少一种第一赋形剂的渗滤缓冲液渗滤所述溶液，由此获得包含所述蛋白质和所述第一赋形剂的保留物；由第二超滤步骤进一步浓缩保留物中的所述蛋白质；和添加至少一种最终赋形剂，由此获得具有所需蛋白质浓度的蛋白质制剂。根据本发明，所述方法进一步包括在第二超滤步骤之前，将第二赋形剂添加到从渗滤步骤获得的保留物中。本发明还涉及通过前述方法生产的抗体制剂。

Description

制备治疗用蛋白质制剂的方法和由这种方法生产的抗体制剂

技术领域

本发明涉及制备包含赋形剂和至少一种治疗用蛋白质的蛋白质制剂的方法。

本发明在准备用作治疗用途的抗体制剂领域中特别重要，并且也涉及由所述方法生产的抗体制剂。

发明背景

本发明更具体地涉及按次序包括以下的方法：

• 提供包含所述蛋白质的溶液；

• 由第一超滤步骤浓缩所述溶液中的所述蛋白质；

• 用包含至少一种第一赋形剂的渗滤缓冲液渗滤如此获得的溶液，由此获得包含所述蛋白质和所述第一赋形剂的保留物（retentate）；

• 由在超滤设备中的第二超滤步骤进一步浓缩保留物中的所述蛋白质；

• 添加至少一种最终赋形剂，由此获得具有所需蛋白质浓度并包含所述第一和最终赋形剂的蛋白质制剂。

通常，用于治疗用抗体的最终蛋白质制剂至少包含在渗滤步骤期间添加的氨基酸，例如组氨酸，和充当稳定剂的糖，例如海藻糖。海藻糖通常在最终添加步骤中与其他赋形剂一起添加。

在应用于治疗用抗体的常规方法中，上述步骤用在由许多纯化步骤纯化的情况下的蛋白质溶液进行，所述许多纯化步骤通常包括病毒保留过滤作为最后的纯化步骤。通过第一超滤步骤从约5至20 g/l的浓度至约40至100 g/l的浓度（取决于蛋白质）浓缩蛋白质溶液（或“产物”）。然后将浓缩产物在渗滤缓冲液例如组氨酸中渗滤。在一些情况下，渗滤缓冲液可以是另一种标准缓冲液，如乙酸盐、三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐。基于最终蛋白质制剂以及由于唐南（Donnan）效应而需要的任何补偿来选择渗滤缓冲液。唐南效应在浓缩产物时发生并导致排除某些带电荷的缓冲种类，例如，组氨酸。因此通常将渗滤缓冲液调整至比对于蛋白质制剂规定的更高的缓冲液浓度和更低的pH。一旦渗滤完成，产物就通过第二超滤步骤浓缩至高于最终蛋白质制剂所需蛋白质浓度的约50％。然后将产物从超滤系统中取出并漂洗系统以回收额外的产物。如果最终浓度比蛋白质制剂中的所需浓度高不止50％，那么可在不过度稀释产物的情况下将所有漂洗液（rinse）加回到产物中以使回收达到最大。然后以浓缩溶液的形式添加赋形剂（糖、表面活性剂、螯合剂等），通常稀释比为约4，这意味着将1单位体积的浓缩赋形剂溶液添加到3个单位体积的产物中。稀释比4基于赋形剂溶液中糖组分的最大溶解度，其通常是限制因素。如有必要，那么然后将产物用制剂缓冲液（formulation buffer）进一步稀释以调整至最终所需浓度。

因此，当期望在最终制剂中获得高度浓缩的蛋白质时，这种常规方法可能不适用，并且当蛋白质具有特别高的粘度时甚至更不适用。

例如，在治疗用抗体制剂具有150 g/l的所需最终浓度的情况下，分子的粘度阻碍浓缩至比所需最终浓度高50％的目标值。

本发明的目的是提供一种制备蛋白质制剂的方法，其可以应用于高粘性和高度浓缩的蛋白质。

本发明的另一个目的是该方法可以在不消极影响制造方法的总得率并且不由于某些赋形剂的过量浪费而招致额外成本的情况下在制造规模上实施。特别地，目的是将糖组分的使用保持在与常规方法类似的水平，所述糖组分是特别昂贵的。

保持蛋白质在该方法的所有步骤中的稳定性并保护蛋白质免于聚集是更进一步的目的。

概述

根据本发明的第一方面，提供了上述类型的方法，其进一步包括在第二超滤步骤之前，将第二赋形剂添加到由渗滤步骤获得的保留物中。

通过将第二赋形剂，特别是海藻糖（或更一般的糖）的添加移动到渗滤后，剩余的赋形剂可以在后来的步骤中以更高的浓度添加，从而产生产物的更低稀释度。这本身又意味着与常规方法的约50％的值相比，可以使最大所需浓度仅仅为高于最终所需浓度的约10％（在一些情况下在5至15％之间）。即使在分子粘度更高的情况下，用标准超滤设备也可获得这个10％的值。这也允许从漂洗液回收产物，并从而允许获得超滤/渗滤方法的90％得率。

同样，在最终浓缩前添加第二赋形剂（糖）保护蛋白质免于聚集。

根据本发明的优选实施方案：

- 所述方法在步骤（e）之后且在步骤（f）之前进一步包括用漂洗缓冲液漂洗超滤设备，由此增强蛋白质的回收；

- 所述漂洗缓冲液包含浓度基本上分别等于蛋白质制剂中第一和第二赋形剂浓度的第一和第二赋形剂；

- 所述第一赋形剂是氨基酸，优选组氨酸；

- 所述蛋白质制剂中的第一赋形剂具有16-24 mM，优选17-23 mM，最优选约20 mM的浓度；

- 所述第二赋形剂是糖，优选二糖；

- 所述最终赋形剂包括表面活性剂，优选聚山梨醇酯80；

- 所述最终赋形剂包括螯合剂，优选EDTA；

- 所述蛋白质制剂具有110-165 g/l的蛋白质浓度；

- 所述蛋白质是抗体。

在第一优选实施方案中：

- 所述抗体是抗-PCSK9（蛋白质原转变酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型（ProproteinConvertase Subtilisin Kexin type 9））抗体；

- 所述抗-PCSK9抗体选自：博科昔单抗（bococizumab）、依伏库单抗（evolocumab）（REPATHA^TM）、阿利库单抗（alirocumab）（PRALUENT^TM）、REGN728、31H4、11F1、12H11、8A1、8A3、3C4、300N、1D05、LGT209、RG7652和LY3015014；

- 所述抗-PCSK9抗体包含重链可变区（VH），所述重链可变区（VH）包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的互补性决定区一CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区（VL），所述轻链可变区（VL）包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或者，所述抗-PCSK9抗体包含具有SEQ ID NO：3、4或5中所示氨基酸序列的VH CDR1，具有SEQ ID NO：6或7中所示氨基酸序列的VH CDR2，VH CDR3具有SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的VH CDR3，具有SEQ IDNO：9中所示氨基酸序列的VL CDR1，具有SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VL CDR3；

- 所述蛋白质制剂具有135-165 g/l，优选142-158 g/l，最优选约150 g/l的蛋白质浓度；

- 所述蛋白质制剂中的第二赋形剂是浓度为67.2-100.8 g/l，优选71.4-96.6 g/l，最优选约84 g/l的海藻糖；

- 所述最终赋形剂包括聚山梨醇酯80，其在蛋白质制剂中的浓度为0.16-0.24 g/l，优选为0.17-0.23 g/l，最优选为约0.2 g/l；

- 所述最终赋形剂包括EDTA，其在蛋白质制剂中的浓度为0.04至0.06 g/l，优选0.0425至0.0575 g/l，最优选约0.05 g/l；

- 所述蛋白质制剂具有5.2-5.8，优选约5.5的pH；

- 所述步骤（a）中提供的溶液具有5-20 g/l的蛋白质浓度；

- 通过第一超滤步骤将所述蛋白质浓缩至80-120 g/l，优选至90-110 g/l，且最优选至约100 g/l；

- 通过第二超滤步骤将所述蛋白质浓缩至143-173 g/l，优选至150-166 g/l，且最优选至约158 g/l；

- 所述渗滤缓冲液中的第一赋形剂的浓度高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度优选为29.75-40.25 mM，最优选约35 mM；

- 所述渗滤缓冲液具有5.1-5.5，优选约5.3的pH；

- 将所述第二赋形剂添加到从渗滤步骤获得的保留物中是通过将第一添加剂溶液添加到保留物中来实现的，所述第一添加剂溶液包含浓度为340-460 g/l，优选380-420 g/l，最优选约400 g/l的第二赋形剂；

- 所述第一添加剂溶液包含第一赋形剂，其浓度低于所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度并高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述第一添加剂溶液中第一赋形剂的浓度为优选25.5-34.5 mM，最优选约30 mM；

- 所述第一添加剂溶液还包含最终赋形剂；

- 所述第一添加剂溶液包含约30 mM组氨酸和约400 g/l海藻糖；

- 将所述第一添加剂溶液添加到保留物中是以约4.15的稀释比进行的，由此将一体积的所述第一添加剂溶液添加到约3.15倍相同体积的保留物中；

- 添加最终赋形剂包括将第二添加剂溶液添加到由第二超滤步骤获得的溶液中的步骤，所述第二添加剂溶液包含浓度低于所述第一添加剂溶液中第二赋形剂的浓度并且高于所述蛋白质制剂中第二赋形剂的浓度的第二赋形剂；

- 所述第二添加剂溶液包含浓度基本上等于所述蛋白质制剂中第一赋形剂浓度的第一赋形剂；

- 所述第二添加剂溶液包含约20 mM组氨酸，约84 g/l海藻糖，约1 g/l EDTA和约4 g/l聚山梨醇酯80；

- 添加第二添加剂溶液以约20的稀释比进行，由此将一体积的第二添加剂溶液添加到约19倍相同体积的从第二超滤步骤获得的溶液中。

在第二优选实施方案中：

- 所述抗体是抗-IL7R抗体；

- 优选地，所述抗-IL-7R抗体包含重链可变区（VH），所述重链可变区（VH）包含SEQ IDNO：13中所示氨基酸序列的互补性决定区一CDR1、CDR2和CDR3（这种CDRs的序列的实例分别为SEQ ID NO.17、18和19）；和轻链可变区（VL），所述轻链可变区（VL）包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3（这种CDRs的序列的实例分别为SEQ ID Nos. 20、21和22）；

- 更优选地，所述抗-IL-7R抗体的VH区包含SEQ ID NO. 13中所示的氨基酸序列，且所述抗-IL-7R抗体的VL区包含SEQ ID NO. 14中所示的氨基酸序列；

- 甚至更优选地，所述抗-IL-7R抗体的重链包含SEQ ID NO. 15中所示的氨基酸序列，且所述抗-IL-17抗体的轻链具有SEQ ID NO. 16中所示的氨基酸序列；

- 所述蛋白质制剂具有110-130 g/l，优选约120 g/l的蛋白质浓度；

- 所述蛋白质制剂中的第二赋形剂是浓度为42-58 g/l，优选约50 g/l的蔗糖；

- 所述最终赋形剂包括聚山梨醇酯80，其在蛋白质制剂中的浓度为0.017-0.023 g/l，优选约0.02 g/l；

- 所述最终赋形剂包括EDTA，其在蛋白质制剂中的浓度为0.42-0.58 g/l，优选约0.5g/l；

- 所述最终赋形剂包括精氨酸，其在蛋白质制剂中的浓度为85-115 mM，优选约100mM；

- 所述蛋白质制剂具有6.5至7.5，优选约7.0的pH；

- 所述步骤（a）中提供的溶液具有2.6-3.4 g/l，优选约3 g/l的蛋白质浓度；

- 通过第一超滤步骤将所述蛋白质浓缩至36-54 g/l，优选至40-50 g/l，且最优选至约45 g/l；

- 通过第二超滤步骤将所述蛋白质浓缩至170-210 g/l，优选至约190 g/l；

- 所述渗滤缓冲液中的第一赋形剂的浓度高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度优选为19-25 mM，最优选约22 mM；

- 所述渗滤缓冲液包含浓度为95-125 mM，优选约110 mM的精氨酸；

- 所述渗滤缓冲液具有6.5-7.5，优选约7.0的pH；

- 将所述第二赋形剂添加到从渗滤步骤获得的保留物中是通过将第一添加剂溶液添加到保留物中来实现的，所述第一添加剂溶液包含浓度为230-320 g/l，优选约275 g/l的第二赋形剂；

- 所述第一添加剂溶液包含第一赋形剂，其浓度基本上等于所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度并且高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述第一添加剂溶液中第一赋形剂的浓度为优选19-25 mM，最优选约22 mM；

- 所述第一添加剂溶液还包含最终赋形剂；

- 所述第一添加剂溶液在约7.0的pH包含约22 mM组氨酸，110 mM精氨酸和约275 g/l蔗糖；

- 将所述第一添加剂溶液添加到保留物中以约5的稀释比进行，由此将一体积的所述第一添加剂溶液添加到约4倍相同体积的保留物中；

- 添加最终赋形剂包括将第二添加剂溶液添加到从第二超滤步骤获得的溶液中的步骤，所述第二添加剂溶液包含EDTA和聚山梨醇酯80；

- 添加第二添加剂溶液以约20的稀释比进行，由此将一体积的所述第二添加剂溶液添加到约19倍相同体积的从第二超滤步骤获得的溶液中。

根据本发明的第二方面，提供了由前述方法生产的抗体制剂。

在优选的实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，和

• 16 mM-24 mM，优选约20 mM的组氨酸缓冲液。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，和

• 67.2 mg/ml-100.8 mg/ml，优选约84 mg/ml的海藻糖。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，和

• 0.16 mg/ml-0.24 mg/ml，优选约0.2 mg/ml聚山梨醇酯。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，

• 16 mM-24 mM，优选约20 mM的组氨酸缓冲液，和

• 67.2 mg/ml-100.8 mg/ml，优选约84 mg/ml的海藻糖。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，

• 16 mM-24 mM，优选约20 mM组氨酸缓冲液，和

• 0.16 mg/ml-0.24 mg/ml，优选约0.2 mg/ml聚山梨醇酯。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体

• 67.2 mg/ml-100.8 mg/ml，优选约84 mg/ml的海藻糖，和

• 0.16 mg/ml-0.24 mg/ml，优选约0.2 mg/ml聚山梨醇酯。

在更优选的实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体，

• 16 mM-24 mM，优选约20 mM的组氨酸缓冲液，

• 67.2 mg/ml-100.8 mg/ml，优选约84 mg/ml海藻糖，和

• 0.16 mg/ml-0.24 mg/ml，优选约0.2 mg/ml聚山梨醇酯。

在一些实施方案中，抗体制剂具有5.2-5.8，优选约5.5的pH。

在另一个优选实施方案中，蛋白质制剂包含：

• 110 g/l-130 g/l，优选约120 g/l的抗-IL-7R抗体；

• 17 mM-23 mM，优选约20 mM的组氨酸；

• 42 g/l-58 g/l，优选约50 g/l的蔗糖；和

• 0.017 g/l-0.023 g/l，优选约0.02 g/l聚山梨醇酯

并具有6.5-7.5，优选约7.0的pH。

在下面的表中描述了在前面提到的SEQ ID NO：1至12：

前面的SEQ ID No.13-16在下表中描述

详述

以下定义将用于本说明书和权利要求书中：

- 术语“蛋白质制剂”指最终产物，其包含所考虑的蛋白质和赋形剂。当提及准备用作治疗用途的蛋白质时，可以使用术语“药物物质”代替“蛋白质制剂”，并且所考虑的蛋白质可以由术语“活性成分”或“产物”表示。“赋形剂”由“蛋白质制剂”的所有组分定义，它们不是“蛋白质”或“活性成分”。赋形剂一般包括蛋白质稳定剂、表面活性剂、例如有助于蛋白质稳定化的氨基酸等……；

- 关于渗滤步骤，术语“保留物”是指保留在膜的保留物侧并含有太大而不能穿过膜的分子如所考虑的蛋白质的溶液。保留物是转移到超滤/渗滤系统的后来部分的溶液。另一种在系统的渗滤部分中的膜的另一侧（透过物（permeate）侧）循环的溶液称为“渗滤缓冲液”（或“基础缓冲液”）；

- 术语“浓缩池”表示从最终的超滤步骤直接获得的溶液；

- 术语“最终赋形剂”表示在最终超滤步骤之后，即在最终浓缩步骤之后添加到“浓缩池”中的赋形剂；

- n为数值的术语“nx掺料”，表示以等于n的稀释比添加到一定体积的含蛋白质溶液中的赋形剂溶液，其意味着一体积的赋形剂溶液添加到n-1倍相同体积的含蛋白质溶液中。例如，4x掺料是根据以下比例添加的溶液：对于3体积含蛋白质溶液，1体积掺料；

- 除非另有说明，与数值有关的术语“大约”、“约”或“基本”意味着在所述值的±5％的范围内；

- 如本文所用的，“粘度”可以是“绝对粘度”或“运动粘度”。“绝对粘度”，有时称为动态或简单粘度，是描述流体对流动阻力的量。“运动粘度”是绝对粘度和流体密度的商。当使用毛细管粘度计来表征流体的有阻力流动时，常常报告运动粘度。当等体积的两种流体放置在相同的毛细管粘度计中并且允许其通过重力流动时，粘性流体流过毛细管花费的时间比较低粘性的流体长。如果一种流体需要200秒来完成其流动，而另一种流体需要400秒，那么第二种流体的粘性就运动粘度规模来说是第一种的2倍。如果两种流体具有相同的密度，那么第二种流体的粘性就绝对粘度规模来说是第一种的2倍。运动粘度的量纲是L²/T，其中L代表长度，且T代表时间。运动粘度的SI单位是m²/s。通常，运动粘度以厘沲，cSt表示，其等于 mm²/s。绝对粘度的量纲是M/L/T，其中M代表质量，且L和T分别代表长度和时间。绝对粘度的SI单位是Pa·s，其等于kg/m/s。绝对粘度通常以单位厘泊，cP表示，其等于毫帕-秒，mPa·s。在本发明的背景下，如果抗体的粘度至少为20 cP，那么认为所述抗体具有高粘度。

为了简明起见，可以遍及说明书使用首字母缩略词“UF”、“DF”和“UF/DF”（或“UFDF”），并且其应理解如下：“UF”意指“超滤”，“DF”意指“渗滤”且“UF/DF”（或“UFDF”）意指“超滤/渗滤”。被定义为制备蛋白质制剂的方法的本发明的方法可以被称为UFDF方法。

现在将通过以下实施例进一步说明本发明，每个实施例都与特定的治疗用单克隆抗体和该单克隆抗体的特定制剂相关。这些实施例仅仅是为了说明起见而提供的，且不应该被解释为限制本发明的范围。

A-实施例1

在说明性实施例1中，所考虑的蛋白质是博科昔单抗，一种靶向PCSK9的单克隆抗体，其特异性结合PCSK9（蛋白质原转变酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型），例如SEQ ID NO：12或Uniprot登录号Q8NBP7。该方法已被设计为在药物物质中实现150 g/l的目标产物浓度，其中药物物质在5.5的pH包含以下赋形剂：

- 浓度为20 mM的组氨酸，

- 浓度为84 g/l的海藻糖，和

- 浓度为0.2 g/l的PS80（聚山梨醇酯80）。

在蛋白质浓度中±8 g/l、赋形剂浓度中±15％和pH值中±0.2的容差的情况下实现上述要求被认为是可以接受的。

就得率而论，需要该方法达到超过90％的产物回收。

已经进行了实验以确定优选的操作模式并确定本发明的方法适合实现上述要求（而常规方法不适合）。这些实验中的一些在说明书的下面部分中给出。

A.1 材料

用于实验的原材料是完全纯化的博科昔单抗溶液，其在使用前已通过MabSelect®柱处理以去除赋形剂组分。MabSelect®纯化后，用乙酸将洗出物调整至pH 5.0，从而导致17.09 g/l的产物浓度。

超滤/渗滤设备

所有实验均使用装配Pellicon® 3（30KDa，C-滤网，88 cm²）再生纤维素膜或Sartocon®（30KDa E-通道200 cm²）再生纤维素膜的GE Crossflow®系统（300 ml储器）进行。跨膜压力（TransMembrane Pressure）（TMP）保持在大约14-22 psi，P_进料小于55 psi。除非另有说明，否则所有漂洗液都是通过将漂洗缓冲液再循环至少15分钟，然后浓缩至系统的最小工作体积产生的。

A.2 实验设计和结果

海藻糖溶解度的测定

完成了初始实验以评价30 mM组氨酸pH 5.35溶液中海藻糖溶解度的范围（从最终规格调整组氨酸浓度和pH以计及随着蛋白质浓度增加组氨酸离子的排除）。为了获得150 g/l的最终药物物质靶，浓缩池的最小浓度将需要为具有6x海藻糖/EDTA/PS80掺料的180 g/l或具有5x海藻糖/EDTA/PS80掺料的187.5 g/l。在提供6x掺料所需的海藻糖浓度（〜500 g/l），在延长的搅拌后，海藻糖在室温（22℃）不溶解（颗粒仍然存在），且必须加热至30℃以溶解。在没有在室温再沉淀的情况下将溶液在15 psi压力下通过0.22 μm Pall Acrodisc®针筒式过滤器过滤。

然而，这种制造方法可能难以按比例扩大，因此海藻糖掺料最大实际浓度可能被限制在5x（〜420 g/l海藻糖）。

因此，在优选的方法中，掺料溶液的海藻糖浓度可以是约400 g/l。

工艺开发

设计第一个实验以测试渗滤溶液中所需的组氨酸浓度，以检查在不同蛋白质浓度（76.6 g/l和114 g/l）在渗滤的溶液中的组氨酸浓度，且以产生用于密度测量的材料。使用载荷量为345 g/m²的200 cm² Sartocon® E-通道膜将原材料浓缩至76.6 g/l，然后用35mM组氨酸，pH 5.26缓冲液进行渗滤。在300 LMH进料流率和22 psi TMP，渗滤通量为17 LMH（升/平方米/小时）。然后将材料进一步浓缩至213 g/l（数据未显示），并分析渗滤的池和最终浓缩的材料两者的样品的组氨酸和海藻糖浓度（参见表1）。

进行第二个实验以确定与在渗滤缓冲液中没有海藻糖的材料相比，含有海藻糖的渗滤的材料是否导致更低的最终浓度。将原材料浓缩至114 g/L并用35 mM组氨酸，pH 5.26缓冲液渗滤。在表2，实验2A中描述的操作条件下，渗滤通量为10 LMH。在<55 psi的进料压力和22 psi的TMP将渗滤的溶液浓缩至184.9 g/L。将浓缩的材料从储器中排出并与35 mM组氨酸，pH 5.26漂洗溶液合并以达到153.7 g/L的浓度。所述池用4x海藻糖赋形剂缓冲液（30 mM组氨酸，400 g/L海藻糖，pH 5.4）掺料以达到114 g/L的最终蛋白质浓度。然后在表2，实验2B中描述的操作条件下将掺料的溶液浓缩至202.4 g/L。由于泵的限制，浓缩步骤在15 LMH进料流率停止。

表1显示所有浓缩的样品中的组氨酸和海藻糖浓度两者均在最终目标规格，20 mM组氨酸和84 g/L海藻糖的10％以内。

该信息提供了75-114 g/L的渗滤浓度的可接受的操作范围，其中最终赋形剂浓度满足浓度规格。

表1. 初始评价赋形剂浓度结果

表2. 初始评价工艺数据

*实际时间未记录或不能找回，它基于对处理的通量和体积的计算。

进行另外的实验以评价浓缩2步骤结束时组氨酸和海藻糖浓度随蛋白质浓度的变化。将原材料浓缩至105.9 g/l并使用200 cm² Sartocon® E-通道膜用35 mM组氨酸，pH5.29缓冲液进行渗滤。在300 LMH的进料流率和22 psi TMP，渗滤通量为12 LMH。渗滤的材料然后用4×海藻糖赋形剂溶液掺料。将掺料的溶液直接添加到储器中并混合15分钟，然后将材料浓缩至172、188和209 g/l最终浓度（参见表3）。如表4所示，随着蛋白质浓度的增加，组氨酸浓度下降，但所有值都在20 mM组氨酸，84 g/L海藻糖的目标浓度的10％以内。

表3. 额外的开发工艺数据

表4. 额外的开发赋形剂浓度结果

样品名称	浓度 (g/L)	组氨酸 (mM)	海藻糖 (g/L)
				渗滤池	109.4	27.81	未测试
浓缩加样	78.6	27.57	94.02
				浓缩1	172	20.15	84.65
浓缩2	188	19.47	84.24
				浓缩3	209	18.11	81.86
掺料缓冲液	N/A	27.83	392.88

将该方法按比例扩大至500 L中试规模（批号12P126J603-MV-B）：工艺细节见表5。使用0.5 m² Millipore® V-滤网膜将517 g Capto Adhere®纯化的材料浓缩至107 g/l，然后用35 mM组氨酸，pH 5.29缓冲液、1000 LMH的进料流率和40 psi的进料压力渗滤。保留物然后用4x海藻糖溶液（30 mM组氨酸，400 g/l海藻糖，pH 5.22）掺料，其考虑到系统滞留体积直接添加到储器中。然后将掺料的材料浓缩至202 g/l，并将浓缩的产物从系统取出。用20 mM组氨酸，84 g/l海藻糖，pH 5.50缓冲液漂洗导轨（skid），并将漂洗液添加到浓缩的材料中。最终合并的溶液的测量的浓度为160 g/l，总得率为97.1％。

表6总结了实验的赋形剂浓度和产物质量结果，其显示最终合并的池水平在上述目标浓度的10％以内，当与过去的最终UF值比较时对如通过SEC测量的产物质量没有任何显著影响。

表5. 中试规模工艺数据

表6. 中试规模赋形剂和产物质量结果

渗滤工艺的评价

不同浓度的蛋白质密度和粘度

图1绘制了（i）20 mM组氨酸，pH 5.5和（ii）20 mM组氨酸，84 g/l海藻糖，pH 5.5中的博科昔单抗的粘度与产物浓度的关系曲线。该图显示，在约175 g/l时，粘度达到30 cP值，这被认为是大规模可行UFDF处理的截止值。

测量（i）20 mM组氨酸，pH 5.5和（ii）20 mM组氨酸，84 g/l海藻糖，pH 5.5溶液中的博科昔单抗的密度并示于图2和图3中。数据显示与组氨酸/海藻糖缓冲液相比，组氨酸缓冲液中的密度稍低，这是如所预期的。

基于以上实验，发现药物物质中的目标浓度可以通过用含有组氨酸而不含海藻糖的DF缓冲液在制造规模实现。

来自实验的结果不仅显示本发明的方法导致可接受的得率、蛋白质和赋形剂终浓度，而且其要求与常规方法相比在赋形剂掺料前较低的蛋白质浓度（158 g/L对188 g/L）。在工艺按比例扩大时，这种较低的蛋白质浓度更容易定期实现。此外，由于通过从渗滤缓冲液中去除海藻糖获得的更好的货物成本分布（cost-of-goods profile），本发明的方法优于常规方法。

已经发现，利用Millipore® C-滤网膜作为Millipore® V-滤网膜的替换物的UFDF工艺始终如一地导致大于175 g/l的浓度，其足以允许添加洗涤池（漂洗），同时仍然保持在20x赋形剂掺料之前所需的超过158 g/l。为了确保该工艺在海藻糖掺料的情况下可行得通，在实验室和中试规模都评价了利用C-滤网膜的工艺。

利用表7中概述的超滤（UF）运行条件，使用Millipore® PLCTK C-滤网盒（cassette）在实验室规模评价该工艺。

对于TFF（切向流过滤）设备，实验室规模工艺采用30-300 LMH的进料流率范围在作为操作限制的可达到的约50-55 psi压力极限进行。300 LMH的上限进料流率（在该情况下大部分工艺将发生）对处理时间具有主要影响，其中降低的进料流导致较低处理通量，这增加了处理泵时间。由于增加的粘度增加了通过保留物通道的压降，所以30 LMH的下限进料流率对于可达到的最终浓度是关键的，因此较低的流率使得能够泵送更粘的溶液。

在于约84 g/l海藻糖的存在下运行的实验室规模工艺期间，在最终保留物池中以30 LMH的进料流率和50 psi的进料压力实现了177 g/l的最终浓度。如表8所示，分别测量来自实验室规模运行的洗涤级分的得率。

表7. 实验室规模运行条件

步骤	溶液	进料压力 (psig)	保留物压力 (psig)	目标
					平衡	10 mM组氨酸, 50 mM NaCl, pH 6.4	20 (± 2)	10 (± 2)	± 0.2 pH单位
浓缩1	VRF产物池	34 (± 6)	16 (± 6)	600-1000 g/m²
					渗滤	35 mM组氨酸 pH 5.3	34 (± 6)	16 (± 6)	> 7 TOV
浓缩2	渗滤池	35 (± 20)	10 (± 10)	超过DS目标20-30%
					缓冲液冲洗	20 mM组氨酸, 84 g/L海藻糖, pH 5.5	30 (± 20)	10 (± 10)	浓度依赖性的

表8. 实验室规模开发实验的结果

*由于材料限制和工艺循环时间，在实验室规模上采用下限加样挑战，并且表示最差情况的得率回收选择。

在图4中可以看到实验室规模的工艺通量分布图，其中垂直线表示降低进料流率以保持具有开放保留物（零psi）的低于〜50 psi进料压力的起点，其中处理通量中的减少由于减少交叉流率而发生。图5显示了最终浓缩过程中的工艺进料通道压降和进料流率。在实验室规模系统中，当进料压力接近〜50 psi时，通过降低进料泵速率手工调节流量。

中试规模确认批次

使用C-滤网膜的UFDF工艺在500 L规模进行以确认可以实现最终浓度目标。该工艺示于表9中，并且在中试工厂中进行的3批的工艺数据示于表10中。

结果表明，该工艺实现了高回收，并且浓度满足中间和最终目标。此外，批次13P120J604的赋形剂浓度在21.2 mM组氨酸，85.4 g/l海藻糖和0.051 g/l EDTA测量，其在±15％的目标规格内。

表9. 用于中试规模制造的UFDF工艺参数

表10. 3个中试规模批次的UFDF工艺数据

批次#	单位	13P120J604	13P120J605	13P120J606
					UF过滤器类型		30kD Millipore C-滤网	30kD Millipore C-滤网	30kD Millipore C-滤网
UF总面积	m2	1,14	1,14	1,14
					加样体积	L	68.9L / 30.56L	81.53L / 26.57L	85.2L / 32.0L
加样浓度	g/L	11.03 g/L / 10.9 g/L	11.04 g/L / 11.22 g/L	8.79 g/L / 11.51 g/L
					UF 蛋白质挑战	g/m2	959	950	982
UF 容量挑战	l/m2	87,2	95	103
					浓缩1开始时间	AM/PM	08:21	08:21	09:08
浓缩1结束时间	AM/PM	11:38	12:07	15:02
					浓缩1透过物体积	L	86,66	97,66	107,16
浓缩1 进料压力	psig	35	35	35
					浓缩1 保留物压力	psig	15	15	15
浓缩1透过物压力	psig	0	0	0
					浓缩1终点保留物体积	L	12,8	10,4	10,2
浓缩1平均通量	L/m2/h	23,1	22,7	15,9
					浓缩1 平均TMP	psig	25	25	25
渗滤开始时间	AM/PM	11:49	12:14	10:05
					渗滤结束时间	AM/PM	14:45	16:22	13:39
渗滤透过物体积	L	109	82,76	103
					置换体积		8,0	8,0	8,0
渗滤进料压力	psig	40	40	40
					渗滤保留物压力	psig	15	15	15
渗滤透过物压力	psig	0	0	0
					渗滤平均通量	L/m2/h	32,6	18,8	25,3
渗滤平均 TMP	psig	27,5	27,5	27,5
					浓缩2开始时间	AM/PM	15:15	16:45	14:02
浓缩2结束时间	AM/PM	15:55	17:27	14:45
					浓缩2进料压力	psig	25 – 55	25 – 55	25 – 55
浓缩2保留物压力	psig	0 - 2	0 - 2	0 – 2
					浓缩2透过物压力	psig	0	0	0
浓缩2透过物体积	L	7,1	7,9	6,8
					浓缩2平均通量	L/m2/h	9,3	9,9	8,3
浓缩2 平均TMP (psig)		20	20	20
					产物池体积	L	6,433	6,337	7,175
产物池浓度	g/L	158,6	157,5	156,6
					回收	%	95	92	99
洗涤池体积	L	833	915	790
					洗涤池浓度	g/L	62,88	63,20	54,28
洗涤池克数	g	52	58	43
					洗涤池比例	g/m2	5,14%	5,79%	3,82%

A.3 结论

上述实验能够在达到药物物质目标的同时显示92-99％的步骤得率。

该实施例证实，根据本发明的UFDF方法适合于制备具有在可接受范围内的pH和所有赋形剂浓度的高度浓缩的（150 g/l）博科昔单抗药物物质。可以用其他蛋白质在相同益处的情况下实现上述，尤其是具有特别高粘度的蛋白质。

B-实施例2

在说明性实施例2中，所考虑的蛋白质是抗体C1GM，特异性结合IL-7R的IL-7R拮抗剂单克隆抗体。该方法已被设计成在药物物质中达到120 g/l的目标产物浓度，其中药物物质在7.0的pH包含以下赋形剂：

- 浓度为20 mM的组氨酸，

- 浓度为100 mM的精氨酸，

- 浓度为50 g/l的蔗糖，

- 浓度为0.02 g/l的PS80（聚山梨醇酯80），和

- 浓度为0.5 g/l的EDTA。

在蛋白质浓度中±10 g/l、赋形剂浓度中±15％和pH值中±0.5的容差的情况下实现上述要求被认为是可以接受的。

就得率而论，需要该方法达到超过85％的产物回收。

用于下述实验的原材料是已通过MabSelect®和Q膜层析处理的完全纯化的溶液。

超滤/渗滤设备

所有实验均使用装配Pellicon 3®（30KDa，C-滤网，88 cm²）再生纤维素膜的GECrossflow系统（300 mL储器）或Quattroflow™泵系统进行。跨膜压力（TransMembranePressure）（TMP）保持在大约14-22 psi，P_进料<55 psi。除非另有说明，否则所有漂洗液都是通过将漂洗缓冲液再循环>15分钟，然后浓缩至系统的最小工作体积产生的。

分析测定

使用Thermo Scientific Nanodrop 2000C™或来自C Technologies Inc.的Solo VPE™进行蛋白质浓度的紫外-可见光分光光度测定法。如通过ARD实验测定的在280 nm的消光系数为1.51 mL*mg^-1*cm^-1。

实验

实验1

原材料用5％的2M NaCl掺料并用2M Tris碱调整至pH 7.0，浓缩至50 g/l，用22 mM组氨酸，110 mM精氨酸pH 7.0渗滤，用5X蔗糖缓冲液（22 mM组氨酸，110 mM精氨酸，275 g/L蔗糖pH 7.0）掺料，并在〜34 LMH的进料流率浓缩至146.9 g/L，如表11中详述的。浓缩的溶液的pH为7.00。UF系统用渗滤溶液以单程模式（无再循环）冲洗，从而导致33 g/L的浓度。总得率约为88％。

表11-用精氨酸缓冲液pH 7.0进行的渗滤和浓缩。

表12-14显示赋形剂、CGE和SEC测定结果。最终浓缩的材料中的组氨酸、精氨酸和蔗糖浓度都在所需值的±10％以内。在UF工艺过程中没有形成新的聚集，也没有任何碎片水平的变化。

表12-精氨酸缓冲液pH 7.0的工艺赋形剂浓度。

样品名称	蛋白质浓度(g/L)	精氨酸(mM)	组氨酸(mM)	蔗糖(g/L)
					渗滤液	50.1	113.7	22.6	N/A
掺料后	38.2	110.0	21.9	55.0
					最终浓缩物	146.9	108.5	19.8	50.0
系统漂洗液	33	111.1	22.1	49.9
					渗滤缓冲液	N/A	116.1	23.6	N/A
5X蔗糖缓冲液	N/A	87.6	15.8	277.6

表13-精氨酸缓冲液pH 7.0实验的nrCGE和rCGE结果

表14-精氨酸缓冲液pH 7.0实验的SEC结果

样品名称	% HMMS	% LMMS	% 单体
				渗滤液	0.6	0.2	99.2
掺料后	0.6	0.2	99.2
				最终浓缩物	0.6	0.2	99.2
系统漂洗液	0.6	0.2	99.2

实验2

重复实验，如表15中所详述的，唯一的区别是计算掺料体积的方式。掺料之前UF系统的总体积是根据依在储器中添加体积加系统滞留体积为转移的总材料均衡（总加样除以渗滤液浓度）计算的。在5X蔗糖掺料后，蛋白质在〜34 LMH进料流率和P_进料<50 psi浓缩至183.6g/L。

表15-用pH 7.0的精氨酸缓冲液进行的渗滤和浓缩。

表16显示最终材料中赋形剂浓度、组氨酸、精氨酸和蔗糖浓度在所需目标值的±10％内。在如何计算掺料体积中的区别看来对最终赋形剂浓度没有任何显著影响。

表16-精氨酸pH 7.0缓冲液的赋形剂浓度

样品名称	蛋白质浓度(g/L)	精氨酸(mM)	组氨酸(mM)	蔗糖(g/L)
					渗滤液	43.71	112.9	21.8	ND
掺料后	36.2	113.1	22.1	55.6
					最终浓缩物	182	106.9	19.4	48.5
5X掺料缓冲液	N/A	102.1	22.2	266.7

实验3

指定最终制剂后第三次重复实验，且结果在表中详述。渗滤后，如实验2中概述的那样计算5X掺料溶液的添加体积。在〜34 LMH进料流率和P_进料<50 psi将蛋白质浓缩至190 g/L。UF系统以单程模式用20 mM组氨酸，100 mM精氨酸，50 g/L蔗糖，pH 7.0漂洗。合并的保留物和漂洗液池中的蛋白质浓度为151 g/L，从而导致约84％的总得率。

表17-用pH 7.0的精氨酸缓冲液进行的渗滤和浓缩。

表18总结了赋形剂浓度，表明组氨酸、精氨酸和蔗糖浓度均在所需值的±10％内。表19和表20表明在UFDF工艺过程中没有形成额外的聚集或碎片。

表18-精氨酸pH 7.0缓冲液的赋形剂浓度

样品	蛋白质浓度(g/L)	组氨酸(mM)	精氨酸(mM)	蔗糖(g/L)
					渗滤液	45.4	22	110.4	N/A
掺料后	37.3	22	110.9	55.5
					浓缩2	190	19.5	102	49.7
系统漂洗液	37.6	20.5	102.2	52.2
					最终抗-IL-7R 材料	151.6	19.9	102.7	48.9
渗滤缓冲液	N/A	22.2	110.3	N/A
					5X掺料缓冲液	N/A	22.2	110.4	274.4
漂洗缓冲液	N/A	20	99.1	51.8

表19-精氨酸pH 7.0缓冲液的nrCGE和rCGE结果

表20-精氨酸pH 7.0缓冲液的SEC结果

样品名称	% 总HMMS	% 总LMMS	% 单体
				抗-IL-7R 标准	0.6	0.2	99.1
抗-IL-7R 渗滤液	0.5	0.3	99.3
				抗-IL-7R 掺料的	0.5	0.3	99.3
抗-IL-7R 浓缩物	0.8	0.3	98.9
				抗-IL-7R 漂洗液	0.5	0.3	99.3
抗-IL-7R 最终	0.7	0.3	99

如上面实验3中所进行的工艺导致所有赋形剂和所考虑的蛋白质的可接受浓度值，并且看来对聚集体或碎片形成没有影响。这个工艺将按比例扩大到中试规模，以确保其如所预期的进行。

中试规模UFDF工艺

使用Millipore® C-滤网再生纤维素膜并使用从500 L规模生物反应器纯化的材料在中试工厂中测试上述开发的UF工艺（实验3）。

在表21中详述的单元运行过程中，起始产物浓度为2.92 g/L的86 L原材料用5％的2 M NaCl掺料，然后浓缩至44.6 g/L。然后将材料用22 mM组氨酸，110 mM精氨酸，pH 7.0以大约150 LMH的进料流率和P_进料<40 psi进行渗滤。8 TOV渗滤后，将保留物用22 mM组氨酸，110 mM精氨酸，275 g/l蔗糖pH 7.0掺料，并再循环10分钟，然后浓缩至191.4 g/L。浓缩过程在30 LMH透过物流率和P_进料<50 psi停止。然后以单程模式用20 mM组氨酸，100 mm组氨酸，50 g/L蔗糖，pH 7.0冲洗导轨。总得率约为87％。整个UF工艺大约需要5个小时才能完成。

通过混合保留物池、漂洗液池和另外的漂洗缓冲液，产生了浓度为135.4 g/L的UF池。通过Millipore® 05/0.2 um Opticap Express SHC以59 L/m²通过量过滤池。将20XEDTA和PS80赋形剂缓冲液掺料到UF池中以生产最终浓度为129.4 g/L的药物物质。

表21-中试规模UF工艺数据

表22中总结了赋形剂浓度，其显示最终池中的组氨酸、精氨酸和蔗糖浓度在目标值的±15％内。在实验室规模工艺开发期间的目标范围设定为所有赋形剂浓度目标值的±10％，但大规模的验收范围设定为±15％以允许在按比例放大过程中的宽容度。

表23和表24总结了来自运行的产物质量结果，其显示没有检测到聚集或碎片中的增加。

表22-中试规模运行赋形剂浓度结果

样品名称	浓度(g/L)	精氨酸(mM)	组氨酸(mM)	蔗糖(g/L)
					渗滤池	44.6	111.4	22.2	N/A
5X掺料的池	32.9	111.2	22.1	46.3
					浓缩2保留物	191.4	105.8	20.1	43.9
最终漂洗池	97.3	101.8	19.9	46.4
					药物物质	135.4	103.9	20.2	43.8
UF缓冲液	N/A	110.6	22.2	N/A
					5X掺料	N/A	112.7	22.5	269.5
漂洗缓冲液	N/A	101.0	20.4	46.9

表23-中试规模运行SEC结果

样品名称	% 总HMMS	% 总LMMS	% 单体
				抗-IL-7R参考	0.6	0.4	99.0
UF加样	0.5	0.4	99.2
				浓缩2 UF保留物	0.7	0.4	98.9
最终漂洗池	0.6	0.3	99.1
				药物物质	0.6	0.3	99.0

表24-中试规模运行nrCGE结果

样品	% IgG	% 碎片	% 其他
				抗-IL-7R参考	96.5	3.1	0.3
UF加样	96.7	3.3	0.0
				渗滤池	97.3	2.7	0.0
浓缩2 UF保留物	96.2	3.4	0.3
				最终漂洗池	97.1	2.9	0.0
药物物质	96.5	3.5	0.0

结论

总之，上述实验证实了用于所考虑的抗-IL-7R抗体的>120 mg/ml药物物质的UFDF方法的成功工艺开发。UFDF工艺包括初始浓度，渗滤，最终浓缩前的蔗糖掺料，然后用剩余的赋形剂掺料。开发的工艺中的pH和所有赋形剂浓度都在可接受的范围内。

序列表

<110> PFIZER INC.

Glynn, Judy K

Chen, Brian X

LaCasse, Daniel P

<120> 制备治疗用蛋白质制剂的方法和由这种方法生产的抗体制剂

<130> PC72213A

<150> 61/222,067

<151> 2015-09-22

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Leu Trp Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

Glu Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu

1 5

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 11

Gln Gln Arg Tyr Ser Leu Trp Arg Thr

1 5

<210> 12

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 14

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe

85 90 95

His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 15

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

<210> 16

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 16

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe

85 90 95

His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 17

Asp Ser Val Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 18

Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 19

Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn

1 5

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 20

Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Gln

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 21

Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 22

Gln Ser Tyr Asp Phe His His Leu Val

1 5

Claims

1.制备包含赋形剂和至少一种治疗用蛋白质的蛋白质制剂的方法，所述方法包括按次序的步骤：

（a）提供包含所述蛋白质的溶液；

（b）由第一超滤步骤浓缩所述溶液中的所述蛋白质；

（c）用包含至少一种第一赋形剂的渗滤缓冲液渗滤如此获得的溶液，由此获得包含所述蛋白质和所述第一赋形剂的保留物；

（d）将第二赋形剂添加到由渗滤步骤获得的保留物中；

（e）由在超滤设备中的第二超滤步骤进一步浓缩保留物中的所述蛋白质；和

（f）添加至少一种最终赋形剂，由此获得具有所需蛋白质浓度并包含所述第一和最终赋形剂的蛋白质制剂。

2.权利要求1的方法，其在步骤（e）之后且在步骤（f）之前进一步包括用漂洗缓冲液漂洗超滤设备，由此增强蛋白质的回收。

3.权利要求2的方法，其中所述漂洗缓冲液包含浓度基本上分别等于蛋白质制剂中第一和第二赋形剂浓度的第一和第二赋形剂。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第一赋形剂是氨基酸，优选组氨酸。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述蛋白质制剂中的第一赋形剂具有16-24 mM，优选17-23 mM，最优选约20 mM的浓度。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述第二赋形剂是糖，优选二糖。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括表面活性剂，优选聚山梨醇酯80。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括螯合剂，优选EDTA。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述蛋白质制剂具有110-165 g/l的蛋白质浓度。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述蛋白质是抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述抗体是抗-PCSK9（蛋白质原转变酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型）抗体。

12.权利要求11的方法，其中所述抗-PCSK9抗体选自：博科昔单抗、依伏库单抗（REPATHA^TM）、阿利库单抗（PRALUENT^TM）、REGN728、31H4、11F1、12H11、8A1、8A3、3C4、300N、1D05、LGT209、RG7652和LY3015014。

13.权利要求11或12的方法，其中所述抗-PCSK9抗体包含重链可变区（VH），所述重链可变区（VH）包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的互补性决定区一CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区（VL），所述轻链可变区（VL）包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。

14.权利要求11或12的方法，其中所述抗-PCSK9抗体包含具有SEQ ID NO：3、4或5中所示氨基酸序列的VH CDR1，具有SEQ ID NO：6或7中所示氨基酸序列的VH CDR2，VH CDR3具有SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的VH CDR3，具有SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的VLCDR1，具有SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VL CDR3。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中所述蛋白质制剂具有135-165 g/l，优选142-158 g/l，最优选约150 g/l的蛋白质浓度。

16.权利要求11-15任一项的方法，其中所述蛋白质制剂中的第二赋形剂是浓度为67.2-100.8 g/l，优选71.4-96.6 g/l，最优选约84 g/l的海藻糖。

17.权利要求11-16任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括聚山梨醇酯80，其在蛋白质制剂中的浓度为0.16-0.24 g/l，优选为0.17-0.23 g/l，最优选为约0.2 g/l。

18.权利要求11-17任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括EDTA，其在蛋白质制剂中的浓度为0.04至0.06 g/l，优选0.0425至0.0575 g/l，最优选约0.05 g/l。

19.权利要求11-18任一项的方法，其中所述蛋白质制剂具有5.2-5.8，优选约5.5的pH。

20.权利要求11-19任一项的方法，其中所述步骤（a）中提供的溶液具有5-20 g/l的蛋白质浓度。

21.权利要求11-20任一项的方法，其中通过第一超滤步骤将所述蛋白质浓缩至80-120g/l，优选至90-110 g/l，且最优选至约100 g/l。

22.权利要求11-21任一项的方法，其中通过第二超滤步骤将所述蛋白质浓缩至143-173 g/l，优选至150-166 g/l，且最优选至约158 g/l。

23.权利要求11-22任一项的方法，其中所述渗滤缓冲液中的第一赋形剂的浓度高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度优选为29.75-40.25 mM，最优选约35 mM。

24.权利要求11-23任一项的方法，其中所述渗滤缓冲液具有5.1-5.5，优选约5.3的pH。

25.权利要求11-24任一项的方法，其中将所述第二赋形剂添加到从渗滤步骤获得的保留物中是通过将第一添加剂溶液添加到保留物中来实现的，所述第一添加剂溶液包含浓度为340-460 g/l，优选380-420 g/l，最优选约400 g/l的第二赋形剂。

26.权利要求25的方法，其中所述第一添加剂溶液包含第一赋形剂，其浓度低于所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度并高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述第一添加剂溶液中第一赋形剂的浓度为优选25.5-34.5 mM，最优选约30 mM。

27.权利要求25或26的方法，其中所述第一添加剂溶液还包含最终赋形剂。

28.权利要求27的方法，其中所述第一添加剂溶液包含约30 mM组氨酸和约400 g/l海藻糖。

29.权利要求25-28任一项的方法，其中将所述第一添加剂溶液添加到保留物中是以约4.15的稀释比进行的，由此将一体积的所述第一添加剂溶液添加到约3.15倍相同体积的保留物中。

30.权利要求25-29任一项的方法，其中添加最终赋形剂包括将第二添加剂溶液添加到由第二超滤步骤获得的溶液中的步骤，所述第二添加剂溶液包含浓度低于所述第一添加剂溶液中第二赋形剂的浓度并且高于所述蛋白质制剂中第二赋形剂的浓度的第二赋形剂。

31.权利要求30的方法，其中所述第二添加剂溶液包含浓度基本上等于所述蛋白质制剂中第一赋形剂浓度的第一赋形剂。

32.权利要求31的方法，其中所述第二添加剂溶液包含约20 mM组氨酸，约84 g/l海藻糖，约1 g/l EDTA和约4 g/l聚山梨醇酯80。

33.权利要求30-32任一项的方法，其中添加第二添加剂溶液以约20的稀释比进行，由此将一体积的第二添加剂溶液添加到约19倍相同体积的从第二超滤步骤获得的溶液中。

34.权利要求10的方法，其中所述抗体是抗-IL-7R抗体。

35.权利要求10的方法，其中所述抗体具有包含SEQ ID NO. 13中所示的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO. 14中所示的氨基酸序列的VL区。

36.权利要求34或35的方法，其中所述蛋白质制剂具有110-130 g/l，优选约120 g/l的蛋白质浓度。

37.权利要求34-36任一项的方法，其中所述蛋白质制剂中的第二赋形剂是浓度为42-58 g/l，优选约50 g/l的蔗糖。

38.权利要求34-37任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括聚山梨醇酯80，其在蛋白质制剂中的浓度为0.017-0.023 g/l，优选约0.02 g/l。

39.权利要求34-38任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括EDTA，其在蛋白质制剂中的浓度为0.42-0.58 g/l，优选约0.5 g/l。

40.权利要求34-39任一项的方法，其中所述最终赋形剂包括精氨酸，其在蛋白质制剂中的浓度为85-115 mM，优选约100 mM。

41.权利要求34-40任一项的方法，其中所述蛋白质制剂具有6.5至7.5，优选约7.0的pH。

42.权利要求34-41任一项的方法，其中所述步骤（a）中提供的溶液具有2.6-3.4 g/l，优选约3 g/l的蛋白质浓度。

43.权利要求34-42任一项的方法，其中通过第一超滤步骤将所述蛋白质浓缩至36-54g/l，优选至40-50 g/l，且最优选至约45 g/l。

44.权利要求34-43任一项的方法，其中通过第二超滤步骤将所述蛋白质浓缩至170-210 g/l，优选至约190 g/l。

45.权利要求34-44任一项的方法，其中所述渗滤缓冲液中的第一赋形剂的浓度高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度优选为19-25mM，最优选约22 mM。

46.权利要求34-45任一项的方法，其中所述渗滤缓冲液包含浓度为95-125 mM，优选约110 mM的精氨酸。

47.权利要求34-46任一项的方法，其中所述渗滤缓冲液具有6.5-7.5，优选约7.0的pH。

48.权利要求34-47任一项的方法，其中将所述第二赋形剂添加到从渗滤步骤获得的保留物中是通过将第一添加剂溶液添加到保留物中来实现的，所述第一添加剂溶液包含浓度为230-320 g/l，优选约275 g/l的第二赋形剂。

49.权利要求48的方法，其中所述第一添加剂溶液包含第一赋形剂，其浓度基本上等于所述渗滤缓冲液中第一赋形剂的浓度并且高于所述蛋白质制剂中第一赋形剂的浓度，所述第一添加剂溶液中第一赋形剂的浓度为优选19-25 mM，最优选约22 mM。

50.权利要求48或49的方法，其中所述第一添加剂溶液还包含最终赋形剂。

51.权利要求50的方法，其中所述第一添加剂溶液在约7.0的pH包含约22 mM组氨酸，110 mM精氨酸和约275 g/l蔗糖。

52.权利要求34-51任一项的方法，其中将所述第一添加剂溶液添加到保留物中以约5的稀释比进行，由此将一体积的所述第一添加剂溶液添加到约4倍相同体积的保留物中。

53.权利要求34-52任一项的方法，其中添加最终赋形剂包括将第二添加剂溶液添加到从第二超滤步骤获得的溶液中的步骤，所述第二添加剂溶液包含EDTA和聚山梨醇酯80。

54.权利要求53的方法，其中添加第二添加剂溶液以约20的稀释比进行，由此将一体积的所述第二添加剂溶液添加到约19倍相同体积的从第二超滤步骤获得的溶液中。

55.由权利要求1-54任一项的方法生产的具有高粘度的抗体制剂。

56.由权利要求11-33任一项的方法生产的具有高粘度的抗体制剂，其中所述蛋白质制剂包含：

• 135 mg/ml-165 mg/ml，优选约150 mg/ml的抗-PCSK9抗体；

• 16 mM-24 mM，优选约20 mM的组氨酸；

• 67.2 mg/ml-100.8 mg/ml，优选约84 mg/ml的海藻糖；和

• 0.16 mg/ml-0.24 mg/ml，优选约0.2 mg/ml聚山梨醇酯

并具有5.2-5.8，优选约5.5的pH。

57.由权利要求34-54任一项的方法生产的具有高粘度的抗体制剂，其中所述蛋白质制剂包含：

• 110 g/l-130 g/l，优选约120 g/l的抗-IL-7R抗体；

• 17 mM-23 mM，优选约20 mM的组氨酸；

• 42 g/l-58 g/l，优选约50 g/l的蔗糖；和

• 0.017 g/l-0.023 g/l，优选约0.02 g/l聚山梨醇酯

并具有6.5-7.5，优选约7.0的pH。