CN107957453A - 发酵茶中Teadenols的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种发酵茶中Teadenols的提取方法，属于分析检测技术领域，其可解决现有的提取发酵茶中的Teadenols的提取周期长且提取不完全的问题。本发明的发酵茶中Teadenols的提取方法，包括：步骤1，一次提取；步骤2，二次提取；步骤3，待测样品检测。本发明的发酵茶中Teadenols的提取方法能快速、有效检测发酵茶中是否含有Teadenols，可应用于茶叶发酵过程中的质量控制，获得含有Teadenol A和Teadenol B的发酵茶，进行功能性深加工产品的研发。

Description

发酵茶中Teadenols的提取方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种发酵茶中Teadenols的提取方法。

背景技术

发酵茶是指以茶叶为原料，经过微生物可控发酵，形成富含茶叶成分、茶叶转化成分和微生物代谢成分的一类茶。

Teadenols是分离自微生物发酵茶的多酚衍生物，由酯型儿茶素——表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)经微生物转化而得，具有较高的有益生物活性，如降低内脏脂肪、促进脂联素分泌等活性。基于Teadenols的生物活性，含有Teadenols的提取物可用于多种疾病的改善和预防，如糖尿病、代谢综合症、高血压、动脉硬化、肥胖等，以及抗癌、食品、调味料、健康补充剂、动物饲料、化妆品等领域开发应用。

Teadenols中包括Teadenol A和Teadenol B，Teadenol A(分子结构如图1所示)和Teadenol B(分子结构如图2所示)互为手性化合物。目前，获取Teadenol A和Teadenol B的前处理方式主要为采用乙醇水溶液浸泡茶叶或茶粉12小时，但这种前处理方法存在处理周期长、提取不完全的缺点。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提出了一种能够对发酵茶中的Teadenols进行快速、完全提取的发酵茶中Teadenols的提取方法。

解决本发明技术问题所采用的技术方案是一种发酵茶中Teadenols的提取方法，包括：

步骤1，一次提取：按预定的料液比，向发酵茶粉中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；再次向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；将三次上清液合并为第一待测样品；

步骤2，二次提取：按预定的料液比，向步骤1中离心分离后的下层沉淀中加入第二提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液浓缩干燥为第二待测样品；

步骤3，待测样品检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测第一待测样品和第二待测样品中的Teadenols。

其中，所述第一提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积比为50％～80％；所述第二提取液为沸水，所述沸水在1标准大气压下的温度大于90℃。

其中，所述预定的料液比为1:(5～30)。

其中，在所述步骤1中，超声提取的时间为10～30分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为10～20分钟。

其中，在所述步骤2中，超声提取的时间为10分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为20分钟。

其中，所述高效液相色谱-质谱联用技术采用AB sciex5600型高效液相色谱-质谱联用仪；

高效液相色谱的检测参数包括：色谱柱采用Megres C18柱，粒径5μm，柱长4.6×250mm，柱温40℃；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件为：0～10min，流动相B保持30％，10～13min，流动相B升至50％，13～24min，流动相B升至100％；流动相的流速为1mL/min，进样量为10μL；

质谱的分析参数包括：采用负离子模式，离子喷雾电压为-4500V，去簇电压为-80V，碰撞能量为-35eV，离子源温度为600℃，吹扫气气压为40psi，雾化器气压为55psi，辅助气气压为55psi，离子扫描范围为100～2000AMU。

本发明的发酵茶中Teadenols的提取方法中，包括一次提取、二次提取和待测样品检测，在一次提取和二次提取中，通过加液、超声提取和离心分离步骤，能够将发酵茶中的Teadenol A和Teadenol B快速、完全的提取出来，有效缩短了现有的发酵茶的前处理方法的周期，同时，提高了Teadenol A和Teadenol B的提取率。

本发明的发酵茶中Teadenols的提取方法能快速、有效检测发酵茶中是否含有Teadenols，可应用于茶叶发酵过程中的质量控制，获得含有Teadenol A和Teadenol B的发酵茶，进行功能性深加工产品的研发。

附图说明

图1为Teadenol A的分子结构；

图2为Teadenol B的分子结构；

图3为本发明的实施例1的发酵茶中Teadenols的提取方法的流程示意图；

图4为Teadenol A的液相色谱图；

图5为Teadenol A的总离子流图；

图6为Teadenol B的液相色谱图；

图7为Teadenol B的总离子流图；

图8为第一待测样品的高效液相色谱-质谱联用的检测结果；

图9为第二待测样品的高效液相色谱-质谱联用的检测结果。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

请参照图3至图9，本实施例提供一种发酵茶中Teadenols的提取方法，包括：

步骤1，一次提取：按预定的料液比，向发酵茶粉中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；再次向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；将三次上清液合并为第一待测样品。

步骤2，二次提取：按预定的料液比，向步骤1中离心分离后的下层沉淀中加入第二提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液浓缩干燥为第二待测样品。

步骤3，待测样品检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测第一待测样品和第二待测样品中的Teadenols。

其中，第一提取液为甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇的体积比为50％～80％；第二提取液为沸水，沸水在1标准大气压下的温度大于90℃。

需要说明的是，沸水对发酵茶中的Teadenol A和Teadenol B的提取率比甲醇水溶液的提取率，但之所以在一次提取中使用甲醇水溶液，是由于沸水在提取Teadenol A和Teadenol B的同时，还会将大量的多糖物质提取出来，不利于样品检测；在二次提取时采用沸水，一是模拟泡茶的过程，二是可以对一次提取时未提取出的Teadenol A和Teadenol B进行提取，以避免残留。可以理解的是，若二次提取采用沸水进行提取，在第二待测样品中未检测出Teadenol A和Teadenol B，则可说明在一次提取时，甲醇水溶液已将发酵茶中的全部Teadenol A和Teadenol B提取出来了。

其中，预定的料液比为1:(5～30)。需要说明的是，本实施例中预定的料液比均指待提取物和加入的提取液的质量比。

其中，在步骤1中，超声提取的时间为10～30分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为10～20分钟。

其中，在步骤2中，超声提取的时间为10分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为20分钟。

当然，在本实施例中，步骤1和步骤2中的料液比、超声提取的时间、离心分离的时间和离心分离的转速等参数并不局限于此，可根据实际情况进行设定，只要能够达到尽可能完全的提取Teadenol A和Teadenol B的目的即可，在此不再赘述。

其中，高效液相色谱-质谱联用技术采用AB sciex5600型高效液相色谱-质谱联用仪。

高效液相色谱的检测参数包括：色谱柱采用Megres C18柱，粒径5μm，柱长4.6×250mm，柱温40℃；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件为：0～10min，流动相B保持30％，10～13min，流动相B升至50％，13～24min，流动相B升至100％；流动相的流速为1mL/min，进样量为10μL。

质谱的分析参数包括：采用负离子模式，离子喷雾电压为-4500V，去簇电压为-80V，碰撞能量为-35eV，离子源温度为600℃，吹扫气气压为40psi，雾化器气压为55psi，辅助气气压为55psi，离子扫描范围为100～2000AMU。

需要说明的是，在利用高效液相色谱-质谱联用技术对发酵茶的提取液中的Teadenol A和Teadenol B进行检测之前，需要先确定Teadenol A和Teadenol B在上述检测条件下的色谱信息，以根据该色谱信息对发酵茶中的Teadenol A和Teadenol B进行检测和成分认定。可以理解的是，本实施例中使用的甲醇为色谱纯，甲酸为色谱级，实验用水为蒸馏水。

以下，以具体实例对本实施例的发酵茶中Teadenols的提取方法进行说明。

实例一：

步骤1，配制标准液。

准确称取Teadenol A和Teadenol B单体适量，用甲醇体积含量为50％的甲醇水溶液溶解，得到1mg/mL的标准液，现配现用。

步骤2，一次提取。

准确称取0.4g发酵茶粉，按料液比1:5，加入甲醇体积含量为50％的甲醇水溶液，超声提取10，转速为9000r/min离心分离10，取上清液；按料液比1:5，向下层沉淀中加入甲醇体积含量为50％的甲醇水溶液，超声提取10min，转速为9000r/min离心分离10min，取上清液；再次向下层沉淀中加入甲醇体积含量为50％的甲醇水溶液，超声提取10min，转速为9000r/min离心分离10min，取上清液；将三次上清液合并为第一待测样品。

步骤3，二次提取。

按料液比1:5，向步骤2中离心分离后的下层沉淀中加入约10mL沸水，超声提取10min，转速为9000r/min离心分离20min，取上清液浓缩干燥为第二待测样品。

步骤4，开启AB sciex5600高效液相色谱-质谱联用仪，设定高效液相色谱和质谱分析条件。

高效液相色谱的检测参数包括：色谱柱采用Megres C18柱，粒径5μm，柱长4.6×250mm，柱温40℃；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件为：0～10min，流动相B保持30％，10～13min，流动相B升至50％，13～24min，流动相B升至100％；流动相的流速为1mL/min，进样量为10μL。

质谱的分析参数包括：采用负离子模式，离子喷雾电压为-4500V，去簇电压为-80V，碰撞能量为-35eV，离子源温度为600℃，吹扫气气压为40psi，雾化器气压为55psi，辅助气气压为55psi，离子扫描范围为100～2000AMU。

步骤5，标准液的检测。

用上述高效液相色谱和质谱分析条件检测Teadenol A和Teadenol B的标准液，记录质谱总离子流图，确定Teadenol A和Teadenol B的保留时间、分子离子峰[M-H]^-1质荷比和[2M-H]^-1质荷比。

从图4和图5中可以看出，Teadenol A的保留时间为15.6min，分子离子峰[M-H]^-1质荷比为275.05，[2M-H]^-1质荷比为551.12；从图6和7中可以看出，Teadenol B的保留时间为18.8min，分子离子峰[M-H]^-1质荷比亦为275.05，[2M-H]^-1质荷比亦为551.12。

需要说明的是，为了评估该检测方法的稳定性，可重复检测3次。

步骤6，将第一待测样品和用甲醇溶解的第二待测样品(约10μg/mL)用0.22μm微孔滤膜过滤，并用上述高效液相色谱和质谱分析条件进行检测，记录质谱总离子流图，以筛查待测样品是否含有Teadenol A和Teadenol B。

采用PEAKVIEW软件处理实验数据，图8中的上图为第一待测样品的液相色谱图，图8中的下图为根据Teadenol A和Teadenol B特征离子的质荷比获取的特征离子流图，可以看出，第一待测样品的特征离子流图中，15.6min的色谱峰为Teadenol A的离子峰，18.8min的色谱峰为Teadenol B离子峰，由此可以说明，发酵茶中含有Teadenol A和Teadenol B。

采用PEAKVIEW软件处理实验数据，图9中的上图为第一待测样品的液相色谱图，图9中的下图为根据Teadenol A和Teadenol B特征离子的质荷比获取的特征离子流图，可以看出，第二待测样品的特征离子流图中，筛查不到[M-H]^-1质荷比275.05的分子离子峰，说明经过一次提取后，发酵茶中的Teadenol A和Teadenol B已被完全提取出来了。

实例二：

本实例的提取步骤与实例一相似，区别在于：提取中采用的料液比为1:30；一次提取中，超声提取时间为30min，离心分离时间为20min，第一提取液为甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇的体积比为80％。

通过上述例子可以看出，本实施例的方法快速有效，经过一次处理得到的第一待测样品中所含的Teadenol A和Teadenol B提取率有所提高，而在第二待测样品基本无Teadenol A和Teadenol B残留。

本实施例的发酵茶中Teadenols的提取方法，包括一次提取、二次提取和待测样品检测，在一次提取和二次提取中，通过加液、超声提取和离心分离步骤，能够将发酵茶中的Teadenol A和Teadenol B快速、完全的提取出来，有效缩短了现有的发酵茶的前处理方法的周期，同时，提高了Teadenol A和Teadenol B的提取率。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，包括：

步骤1，一次提取：按预定的料液比，向发酵茶粉中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；再次向下层沉淀中加入第一提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液；将三次上清液合并为第一待测样品。

步骤2，二次提取：按预定的料液比，向步骤1中离心分离后的下层沉淀中加入第二提取液，经超声提取和离心分离后，取上清液浓缩干燥为第二待测样品；

步骤3，待测样品检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测第一待测样品和第二待测样品中的Teadenols。

2.根据权利要求1所述的发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，所述第一提取液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积比为50％～80％；所述第二提取液为沸水，所述沸水在1标准大气压下的温度大于90℃。

3.根据权利要求1所述的发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，所述预定的料液比为1:(5～30)。

4.根据权利要求1所述的发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，在所述步骤1中，超声提取的时间为10～30分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为10～20分钟。

5.根据权利要求1所述的发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，在所述步骤2中，超声提取的时间为10分钟，离心分离的转速为9000转/分钟，离心分离的时间为20分钟。

6.根据权利要求1所述的发酵茶中Teadenols的提取方法，其特征在于，所述高效液相色谱-质谱联用技术采用AB sciex5600型高效液相色谱-质谱联用仪；

高效液相色谱的检测参数包括：色谱柱采用Megres C18柱，粒径5μm，柱长4.6×250mm，柱温40℃；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件为：0～10min，流动相B保持30％，10～13min，流动相B升至50％，13～24min，流动相B升至100％；流动相的流速为1mL/min，进样量为10μL；

质谱的分析参数包括：采用负离子模式，离子喷雾电压为-4500V，去簇电压为-80V，碰撞能量为-35eV，离子源温度为600℃，吹扫气气压为40psi，雾化器气压为55psi，辅助气气压为55psi，离子扫描范围为100～2000AMU。