CN107850765B - 光束成形和光层显微技术的方法和组合件 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供光束成形的组合件和方法，其适用于快速产生具有减小的厚度的光束或光层，以及提供光层显微技术的组合件，其确保检测步骤期间的增大的平行化，而不劣化轴向分辨率。该目的通过光束成形组合件来实现，其包括修改装置(8)，其配置为将不是衍射受限的光束(7)转换为不是衍射受限的修改的光束(10)，修改的光束沿着垂直于不是衍射受限的修改的光束的传播方向的直线具有N个主极大，其中N≥2。还公开了不是衍射受限的修改的光束的光束成形的对应方法和光层显微技术的组合件，其包含所主张的光束成形组合件。
Description
技术领域
本发明涉及光束成形组合件，其包括产生准直辐射的装置，该组合件在空间域中的准直辐射的光束路径中包含产生非衍射受限光束的衍射装置，并且在频率域中包含转换非衍射受限光束的修改装置。本发明还涉及光束成形的方法和光层显微技术的组合件，该组合件包括样品台；包括照明装置，该照明装置包含根据本发明的光束成形组合件，以产生照明样品带并激发荧光辐射的光层；并且包括检测装置，该检测装置包含检测荧光辐射的传感器、将由样品发射的荧光辐射成像至传感器上的成像光学单元、以及与光层垂直的检测轴线。
背景技术
根据选择性平面照明显微技术(SPIM)，即光层显微技术(light sheetmicroscopy)，设计显微镜以检查样品，在该显微镜中，照明光束路径和检测光束路径基本上彼此垂直布置，并且用该显微镜在成像或检测镜头的焦平面中(即，垂直于该镜头的光轴)以光层(light sheet)照明样品。作为以光层照明的结果，荧光辐射在以光层照明的样品带中产生。为此目的，样品可以包含适合于荧光的附加染料。与三维样品在不同深度的单独平面中被逐点扫描并且该过程中获得的像信息随后组合以形成样品的三维成像的共焦激光扫描显微技术(LSM)相比，SPIM技术基于宽场显微技术并且以穿过样品的单独平面的光学截面为基础使样品能够表现为虚像。
SPIM技术的优势特别在于，捕获像信息的较高速度，漂白生物样品的较低风险，以及还有到样品中的扩展的穿透深度。
光层显微技术的主要应用之一是成像大小为几百微米到几毫米的中等大小的生物体。所述生物体通常嵌入琼脂糖中，其进而位于玻璃毛细管中。玻璃毛细管被从上方或从下方引入到充满水的样品室中，并且将样品从毛细管中挤出少许。琼脂糖中的样品由光层照明，并且荧光通过与光层垂直且因此还与光层光学布置垂直定位的检测镜头成像至相机上，如例如在Huisken等人的“Selective plane illumination microscopy techniquesin developmental biology，Development 136，1963(2009)”或在WO 2004/053558 A1中所解释。
该光层显微技术的方法具有三个主要缺点。首先，待检查样品相对较大：常规样品源自发育生物学。另外，由于样品制备和样品室的尺寸，光层相对较厚并且可实现的轴向分辨率因此受限。此外，样品制备是复杂的，并且不符合细胞上荧光显微技术中以惯例方式的标准样品制备和标准样品安装。
为了部分避免这些限制，近年来已实现新颖的光层显微技术装备，其中照明镜头和检测镜头彼此垂直，并且从上方以α1等于α2等于45°的角指向样品。这种SPIM装备例如公开于WO 2012/110488 A2和WO 2012/122027 A2中。
图1a示意性图解这种直立45°SPIM构造。样品P1位于其中，在皮氏培养皿P2的底部。皮氏培养皿填充有液体P3，例如水，并且两个SPIM镜头，即照明镜头P4和检测镜头P5，浸入液体P3。这种组合件提供轴向方向上较高分辨率的优点，因为可产生较薄的光层P6。由于较高的分辨率，还可以检查较小的样品。在该情况下，样品制备变得相当简单。然而，仍非常不利的是：样品制备和样品安装件仍不对应于细胞上荧光显微技术中为惯例的标准样品制备和标准样品安装件。因此，皮氏培养皿必须相对较大，以使两个SPIM镜头可以浸入位于皮氏培养皿中的液体，而不会使所述镜头打到培养皿的边缘。在生物学的许多领域中的标准的多孔板不能用于该方法，因为镜头不能浸入所述板的非常小的孔中。而且，该方法具有以下缺点：例如，高通量筛选不是轻易可能的，因为当样品改变时，必须清洁镜头，从而避免不同样品的污染。
这些问题通过如图1b所图解的所谓的逆45°SPIM构造来避免。在该情况下，尽管45°构造得到维持，两个SPIM镜头，即照明镜头P4和检测镜头P5，现在不再从上方指向样品，而是穿过样品安装件的透明底部从下方来照明样品并且检测荧光。这种组合件公开于本申请人名义下的DE 10 2013 107 297 A1和DE 10 2013 107 298 A1中。因此，所有典型的样品安装件，例如多孔板、皮氏培养皿和物体载具，可以被使用，并且样品在高通量筛选期间的污染不再可能。
这里描述的光层显微技术的两个变型共同具有以下事实：光层通过两个SPIM镜头之一产生，并且荧光通过两个SPIM镜头中的第二个检测。在该情况下，检测镜头的像平面位于光层中，使得照明的区域清晰成像至检测器上。
光层显微技术需要对应光束的产生并模型化为所谓的光层，从而能够通过所述光层照明样品，所述光层理想地具有长的长度以及很小的厚度。
为了在光层显微技术的组合件中以光层照明样品，可以使用非衍射受限光束，即例如Bessel光束、分段Bessel光束或Mathieu光束。Bessel光束、分段Bessel光束或Mathieu光束的横向光束剖面图解于图2a-2c中。
如图2a所示，Bessel光束具有的中心极大(maximum)窄于相当的Gaussian光束的焦点。中心极大由多个环环绕。在传播方向上，Bessel光束总是沿整个光束长度具有相同的光束剖面。其不改变其光束剖面，尤其是就其在y方向上的范围而言，该范围在下文称作厚度。因此，原则上，可以产生任意长度的光束，中心极大在其形状和形成方面没有变化。仅环的数量随增加的光束长度而增加。
如图2b所示且例如由Fahrbach等人在“Self-reconstructing sectioned Besselbeams offer submicro optical sectioning for large fields of view in LSM，OptExpr，21，11425，2013”中所描述的分段Bessel光束，其与Bessel光束密切相关。分段Bessel光束与Bessel光束的不同在于，闭合的环变为半环。次级极大沿环开口形成在轴线上。原则上，分段Bessel光束具有与Bessel光束相同的特性。然而，显著更薄的扫描光层可以用后者来产生。
如图2c所示且例如由Gutierrez-Vega等人在Experimental demonstration ofoptical Mathieu beams，Opt Comm，195，35，2001”中以及在DE 10 2012 013 163 A1和WO2014/005682 A2中所描述的Mathieu光束，其同样具有原则上与Bessel光束相同的特性，类似于分段Bessel光束的光束剖面，但是Mathieu光束没有沿y轴的次级极大。中心极大由半圆次级极大环绕，其强度沿光轴向外减小。
尽管图2c显示了具有长度100μm的Mathieu光束的横向剖面，即xy剖面，图2d和2d′图解了相同的Mathieu光束在传播方向上(即在xz剖面中)的光束剖面。中心极大具有大约0.550μm的厚度。
这些光束通常可以通过以由激光源产生的准直光束照明光学元件来产生，例如：
对于Bessel光束，其横向光束剖面(xy强度分布)图解于图2a中，环形孔径、轴锥镜或SLM适合作为均匀光束的光束路径中的光学元件。
以环形孔径产生Bessel光束(如Durnin等人在“Diffraction-Free Beams，PhysRev Lett，58，1499，1987”中所描述)是最简单且最便宜的可能性。具有高光束质量的光束可以非常简单地产生。然而，环形孔径的仅百分之几的功率传输是极低的，因此该方法优选不用于在商业产品中产生Bessel光束。
使用轴锥镜(即，由诸如玻璃的透明材料构成的旋转对称锥形体)来产生Bessel光束例如由Arimoto等人在“Imaging properties of axicon in a scanning opticalsystem，Appl Opt，31，6653，1992”中描述。与环形孔径相比，功率传输大约为100％。在轴锥镜的情况下，原则上简单地通过增加轴锥镜的直径可能产生任意长度的光束。
其他可能性是使用空间光调制器(SLM)来产生Bessel光束，如例如由Bowman等人在Efficient generation of Bessel beam arrays by SLM，Eur Phys J Spec Top，199，159，2011”中所描述。为此目的，轴锥镜的相位图案表现在SLM上。最大可实现光束长度由SLM的像素的大小和数量确定。尽管SLM为产生Bessel光束的最昂贵且最复杂的可能性，但SLM提供最大可变性。因此可以在限制内设定任意光束长度和厚度。多个平行光束还可以使用该变型以简单方式来产生。
为了产生分段Bessel光束，其横向光束剖面(xy强度分布)图解于图2b中，两个相对段可通过光阑从Bessel光束的环形光谱中截出。如在Bessel光束的产生中，分段Bessel光束也可以使用SLM或轴锥镜产生。
Mathieu光束的产生比Bessel光束的产生更复杂。为此目的，同样，环形孔径、轴锥镜或SLM适合作为均匀光束的光束路径中的光学元件。图2c图解了Mathieu光束的横向光束剖面(xy强度分布)，图2d显示其在传播方向上(即在xz剖面中)的光束剖面，其中在图2d中，来自图2c的平面的位置由白虚线指示。图2d′显示图2d的放大局部，如在其中由白色虚线矩形所指示。这种Mathieu光束在光瞳平面中的强度光谱图解于图2e中。
为了使用环形孔径产生Mathieu光束，环形孔径必须以椭圆的Gaussian光束来照明。椭圆的Gaussian光束的厚度影响Mathieu光束的中心极大的厚度和次级极大的弯曲程度。光束长度由环厚度限定。环形孔径的缺点再次在于差的功率传输。
Mathieu光束还可使用空间光调制器(SLM)来产生。在最复杂且最昂贵的方法中，SLM用于该目的。第一SLM改变入射强度分布，使得入射强度分布适合用于产生Mathieu光束。借助于第二SLM，然后适配所述强度分布的相位，使得最终出现Mathieu光束。为此目的必须在SLM上编码的相位图案可以使用Gerchberg-Saxton算法来计算。或者，代替两个SLM，可使用一个具有对应像素数的SLM，如由Jesacher等人在“Near-perfect hologramreconstruction with a spatial light modulator，Opt Expr，16，2597，2008”中所解释。同时，具有全高清(full HD)分辨率的SLM变得可用。这些SLM现在用于双通中。强度将在SLM显示器的第一半部上调制，并且相位在第二半部中调制。
因为强度和相位二者必须适配于Mathieu光束的产生，使用仅一个SLM产生光束仅在让步的情况下是可能的。这例如借助于调制的闪耀光栅方法是可能的，调制的闪耀光栅方法由Davis等人在Encoding amplitude information onto phase-only filters，ApplOpt，38，5004，1999”中描述，其中非期望光简单地衍射为不同级，并且通过相同的SLM使进入正确级的光带有正确的相位。该方法的缺点是功率传输在＜50％的范围中。
产生Mathieu光束的其他可能性在于使用轴锥镜。
Mathieu光束在光瞳中或关于其的共轭平面中的光谱，如图2e中图解的，可以采用以下来计算：
I(vx，vy)＝exp[-(vr-vrc)2/d2]s·exp(-vy 2/w2) (1)
其中
其中vx和vy表示光瞳中的坐标，环宽度为d的环状光谱的直径vrc，清晰度参数s＞0，并且Mathieu光束的厚度参数为w。光谱从零直至最大强度的上升的梯度由“清晰度参数”s表示：清晰度参数s越大，所述上升越陡。对于w→∞，Mathieu光束转变为Bessel光束。
在板的中心具有为π的相位跃变的双向相位板由Friedrich等人在“STED-SPIMstimulated emission depletion improves sheet Illumination microscopyresolution，Bio Phys J，100，L43，2011”中使用，以将Gaussian光层转换为具有零的光层。代替相位板，可将等效的相位函数表现在SLM上，以执行对应的光束成形，如Vasilyeu等人在“Generating superpositions of higher-order Bessel beams，Opt Expr，17，23389，2009”中显示的。
Bessel光束的相干叠加由Kettunen等人在“Propagation-invariant spotarrays，Opt Lett，1247，23，1998”中描述。叠加通过借助于算法计算可引入光瞳的相位元件来实现。如果Bessel光束的光谱成像至光瞳中，相位元件产生在样品中叠加的多个Bessel光束。相位元件类似于具有相位值0和π的星状光栅。将以下指定为条件：单独Bessel光束之间的距离必须大，因为否则可能出现非期望的干涉效应。
为了产生光层，上文描述的这些非衍射受限光束通常被扫描。与Bessel光束和分段Bessel光束相比，在扫描的Mathieu光束的情况下，样品上的负载最少。
作为光束的次级极大结果，光层的加宽在扫描期间发生。这针对Bessel光束和Mathieu光束图解于图3a和3b中。如果具有100μm的长度的Mathieu光束被扫描，例如，其中心极大具有0.550μm的厚度，那么产生的光层具有2.5μm的厚度。这在样品的产生的像中以减小的轴向分辨率和低对比度的形式变得明显。
Fahrbach等人在“Propagation stability of self-reconstructing Besselbeams enables contrast-enhanced imaging，Nat Comm，3，632，2012”中介绍了一种方法，其中借助于狭缝光阑，可在用扫描的Bessel光束的光层显微镜镜中执行共焦检测。在该情况下，间隙宽度设定为使得仅中心极大成像至检测器上，并且次级极大被抑制。产生的像具有对应于Bessel光束的中心极大的厚度的轴向分辨率。
共焦检测可近似地以Mathieu光束来执行，与Bessel光束相比，这里表现出更高的样品保存。
如果扫描的Mathieu光束结合共焦检测用于光层显微镜中，那么仅光束的中心极大通过狭缝光阑来检测。较高的平行化，即为了检测器上的检测而同时暴露或激活的较高数量的像素，可以通过加宽间隙来实现。这直接具有以下结果：轴向分辨率减小，因为然后同样检测到较宽的次级极大。
发明内容
因此，本发明的目标是描述适合于产生具有小厚度的光层的光束成形的组合件和方法，以及描述光层显微技术的组合件，其确保检测期间的高平行化，而不会因此不利地影响轴向分辨率。
该目标通过如权利要求1中所主张或权利要求5中所主张的光束成形组合件，通过如权利要求11中所主张的光束成形的方法，以及通过如权利要求13中所主张的光层显微技术的组合件来实现。
光束成形组合件包括产生准直辐射的装置，其包含产生准直辐射的光源，或其包含产生非准直辐射的光源，以及在光源下游的、将辐射准直的装置。这种产生准直辐射的装置因此产生以限定方式对齐的准直光。
在所述准直辐射的光束路径中，光束成形组合件还包含衍射装置，其布置在空间域中且配置为使得其通过入射至衍射装置的准直辐射的衍射产生非衍射受限光束。
另外，由产生准直辐射的装置发射的准直辐射的光束路径包含将非衍射受限光束傅里叶变换且映射到频域中的光学聚集函数。所述聚集函数同样通过衍射装置或者通过聚集光学单元的布置来实现，所述聚集光学单元包含至少一个光学元件且设置在衍射装置的下游。所述聚集光学单元或所述聚集光学单元的一个元件或多个元件因此用于将非衍射受限光束映射到频域中，其中所述映射可通过傅里叶变换数学地描述。多个傅里叶变换和逆傅里叶变换的序列也是可能的，以对应地使光束成形并阻止非期望效应。
修改装置在频域中布置在衍射装置的下游，例如，换言之，在聚集光学单元的光瞳中，非衍射受限光束，或者更确切地说是非衍射受限光束的光谱例如通过镜头映射在该频域中。所述修改装置配置为将非衍射受限光束转换为修改的非衍射受限光束。
最后，光束成形组合件包含将修改的非衍射受限光束的光谱从频域逆傅里叶变换的另外的光学聚集函数。该聚集函数也可进而通过修改装置本身或通过设置在修改装置下游且包含至少一个聚集光学元件的另外的聚集光学单元来实施。借助于所述聚集光学单元，修改的非衍射受限光束通过修改的非衍射受限光束的光谱的逆傅里叶变换从频域变换回来，并在此时则可进一步优化或供所述光束的使用。
根据本发明，那么，沿着垂直于修改的非衍射受限光束的传播方向的直线，修改的非衍射受限光束包含N个主极大，其中N为大于或等于2的自然数。因此，如果考虑修改的非衍射受限光束的区域中的xy平面，即垂直于修改的非衍射受限光束的沿着z方向行进的传播方向的平面，那么至少两个主极大沿着直线，优选沿着x轴在其中出现。在该情况下，主极大限定为沿着xy平面内的所有位置的最大辐射强度出现的位置。如果有多个具有相等最大辐射强度的位置，那么出现多个主极大。与主极大相比，次级极大限定为这样的位置，在所述位置，辐射强度包含与其最接近环境相比较的局部极大，但是具有比主极大低的辐射强度。
因为与次级极大相比较，主极大具有在垂直于(主极大沿其形成的)直线的方向上的较小的范围，即优选在y方向上的较小的范围，因此可采用高轴向分辨率，同时使用用于产生光层的修改的非衍射受限光束的多个极大，该光层例如意在用于照明装置中的样品或光层显微技术的方法中。这种光束成形组合件因此适合于非常快速地产生非常小厚度的光层。
这尤其在图8c-d与图8a以及与图2a和2b进行比较时变得清楚，图8c-d显示通过不同相位函数修改的Mathieu光束的xy平面中的强度分布，图8a显示未修改的Mathieu光束的强度分布，图2a和2b显示Bessel光束和分段Bessel光束的两个另外的未修改的非衍射受限光束的强度分布。
考虑关于这种光束例如分别在未修改的非衍射受限光束的情况下的光束的主极大或光束的主极大和邻近次级极大的扫描期间、或在修改的衍射受限光束的情况下的光束的多个主极大的扫描期间的行为的图3a和3b，使用修改的非衍射限制光束的多个主极大用于轴向分辨率的益处在可见像中变得清楚。换言之，如果为了较高的平行化且因此为了较高检查速度，旨在使用非衍射限制光束的多个主极大来产生光层，则非衍射受限光束的在先修改使得多个主极大沿着垂直于光束的传播方向的直线产生，这提供了以这种光层照明的样品的结构的轴向分辨率的相当大的优势。
在该情况下，分辨率或分辨能力表示精细结构的可识别性，即例如在两个点物体之间仍可察觉的最小距离。在以通过根据本发明修改的非衍射受限光束产生的光层对样品的检查中，在通过使用修改的非衍射受限光束的多个主极大的高检查速度的情况下，使得直接邻近的结构仍能够被感知为不同结构的能力因此显著高于使用未修改的非衍射受限光束的主极大和对应的邻近第二主极大的情况。
在一个有利的实施例中，根据本发明的光束成形组合件的衍射装置包含环形孔径、轴锥镜或空间光调制器(SLM)。衍射装置首先用于产生非衍射受限光束。如上所述，这可以使用环形孔径或轴锥镜以简单方式来实现。相比之下，包含空间光调制器的衍射装置构成成本更高的解决方案。然而，使用空间光调制器提供产生最佳非衍射受限光束以及其“进一步处理”的显著更进一步的可能性。空间光调制器可以履行多个光学元件的功能，即空间光调制器可以插入光的光束路径中来代替所述元件或甚至代替所述光学元件之中的不同元件的组合。
此外，光束成形组合件是有利的，其包括包含相位元件的修改装置，用于产生修改的非衍射受限光束的相位函数编码进该相位元件中，该修改的非衍射受限光束沿着垂直于修改的非衍射受限光束的传播方向的直线具有N个主极大。优选地，所述相位元件通过相位板或空间光调制器形成。
尽管相位板构成修改装置的简单的、但是不是非常可变的可能性，空间光调制器提供全面的适配可能性。关于该方面，在使用空间光调制器的情况下，例如，入射至空间光调制器中的光的至少一个相位变化可以通过控制单元而变化，其中控制单元配置为至少关于相位调制的设定来改变空间光调制器。除了控制空间光调制器，这种控制单元当然还可以附加地配置为控制产生光层的组合件的其他元件、或光束成形组合件并入其中的上级装置的元件。
作为为纯相位元件的功能的替代，包含在修改装置中或形成修改装置的空间光调制器还可形成为复值空间光调制器，即可以改变入射光的相位和强度或振幅二者的空间光调制器。
在根据本发明的光束成形组合件的一个特定实施例中，修改装置配置为将非衍射受限光束转换为修改的非衍射受限光束，其沿着垂直于修改的非衍射受限光束的传播方向的直线具有N个主极大，其中N在该特定实施例中代表大于或等于100的自然数。然而，取决于为例如使用的光调制器或检测器的像素的数量的配置所提供的可能性，还可选择显著更大的N，例如大于或等于500的N，或大于或等于1000的N。非衍射受限光束在修改装置的位置处以光谱形式出现，即在频域中。在根据本发明的光束成形组合件的该特定实施例中，然后覆盖半个光瞳的光阑还布置在频域中，例如在光瞳中。在这种具有非常大N(即非常大数量的主极大)的组合件中，产生光层不需要扫描修改的非衍射受限光束，因为光束截面在x方向上不具有结构化，但是同时在x方向上延伸非常大的区域。
替代的光束成形组合件包括产生准直辐射的装置，因此配置为产生准直辐射的装置，其中这种装置包含产生准直辐射的光源或产生非准直的准直辐射的光源，以及光源下游的、使辐射准直的装置。替代的光束成形组合件在准直辐射的光束路径中还包含衍射和修改装置，其布置在空间域中且优选包括空间光调制器(SLM)。所述衍射和修改装置配置为产生修改的非衍射受限光束，而没有产生非衍射受限光束的中间步骤，以及配置为将其傅里叶变换到频域中。
另外，所述替代的光束成形组合件在光束路径中包含将修改的非衍射受限光束从频域逆傅里叶变换的聚集函数，其同样通过衍射和修改装置或通过聚集光学单元来实施，聚集光学单元设置在衍射和修改装置的下游且包含至少一个聚集光学元件。
根据本发明，然后，在所述替代的光束成形组合件中，同样地，修改的非衍射受限光束(衍射和修改装置配置为产生所述修改的非衍射受限光束)沿着垂直于修改的非衍射受限光束的传播方向的直线包含N个主极大，其中N为大于或等于2的自然数。
有利地，产生光层的两个替代例中的根据本发明的组合件还包含扫描修改的非衍射受限光束的扫描仪，因此产生具有期望宽度的光层。在与一直线平行的方向上扫描光束，沿着所述直线布置N个主极大，并且所述直线垂直于传播方向。大体上，因此沿着x方向扫描修改的非衍射受限光束。
如果非常大数量的主极大被采用并且覆盖半个光瞳的光阑包含在频域中的话，则这种扫描仪不是必要的，。
光束成形组合件中的非衍射受限光束可以例如为Bessel光束、分段Bessel光束或Mathieu光束。Mathieu光束尤其已展现对于在修改之前产生光层有利的强度分布，通过一修改再次有利地影响该强度分布，使得其在与主极大所沿之布置的直线垂直且与传播方向垂直的方向上的范围再次减小，在该修改中，数量为N的主极大沿与传播方向垂直的直线产生。
包括激光模块(其继而包含激光源)的产生准直辐射的装置是根据本发明的光束成形组合件的一个特别有利且频繁使用的变型。激光辐射用于照明的许多应用中，如果期望准直辐射用于该目的的话。
如果光束成形组合件包含照明衍射装置的器件，其将来自产生准直辐射的装置的光束成形以使得实现衍射装置的均匀照明，则是有利的。在一个实施例中，照明器件包含透镜元件，其相应地扩展从产生准直辐射的装置发射的光束。在该情况下，使用两个透镜元件是优选的。然而，还可使用可模拟透镜元件的效应的光学元件来代替透镜元件。
如果光束成形组合件包含在修改装置的频域中或修改装置的上游的另外的频域中、或者在衍射和修改装置的频域中过滤非期望光的光阑，则是进一步有利的。这例如允许过滤出非期望的零级。
根据本发明的光束成形的方法，尤其是产生用于显微技术的光层的方法，包含以下步骤：
-通过衍射装置在准直辐射的光束路径中产生非衍射受限光束。
-通过傅里叶变换将非衍射受限光束变换到频域中。这可为光瞳或对应共轭的平面。非衍射受限光束的强度分布，即其光谱，在频域中确定，即在光瞳中或对应共轭的平面中确定。
-修改的非衍射受限光束在频域中的强度分布通过形成N个复值函数的和来确定，所述N个复值函数由非衍射受限光束的强度分布乘以楔的相位函数构成。楔的相位函数在此在各个被加数中增加。
-将修改的非衍射受限光束在频域中的相位函数确定为修改的非衍射受限光束在频域中的强度分布的自变数(argument)。
-修改的非衍射受限光束通过将相位函数编码进位于频域中的修改装置来产生。
优选地，扫描修改的非衍射受限光束，以产生对应宽度的光层。修改的非衍射受限光束的扫描因此在大多数情况下是期望的。然而，如果产生具有非常大数量N的主极大的修改的非衍射受限光束，并且此外光瞳或对应共轭的平面的一侧的一半被覆盖，则扫描过程是不必要的，这是因为因此产生的修改的非衍射受限光束则不具有在x方向上的结构化，但是在y方向上仍对应地较薄。对于N大于或等于100，尤其是对于N大于或等于500，通常是这种情况。
修改的非衍射受限光束的厚度可以通过未修改的非衍射受限光束的厚度的对应设定来影响。
光层显微技术的组合件包括布置样品的样品平面。所述样品平面可以通过安放或安放且固定样品的样品台来实施。然而，样品平面还可通过样品室或安装件来确定，在该样品室或安装件中，样品通过固定例如在所述样品室的开口中或在安装件中而保持在固定位置，并且因此限定样品平面。配置为使得通过例如样品台、样品室或其他类型的样品安装件的装备，位于样品平面中的样品可以被照明，而没有遮蔽产生在样品的中心部分，以及使得由样品发射的辐射同样可以被检测，而没有遮挡。样品平面因此布置为使得没有遮挡出现在光层显微技术的组合件的光学路径中。这通过选择适当的光学透明材料用于样品台、样品室或样品安装件，或至少用于其位于光学路径中或接近光学路径的那些部件，或者通过样品台、样品室或样品安装件中的对应开口来实现，例如使得样品、物体载具或样品容器被直接照明且由样品发射的辐射是直接可检测的。样品平面可进一步以可移动的方式配置，使得其在空间中的位置在空间中的至少一个方向上，优选在两个或三个方向上是可变的，这可例如通过样品台、样品室或样品安装件的移动来实现。样品可以被制备为支持以对应光照明时的来自样品的荧光辐射，并且样品可位于透明容器中或在物体载具上，例如在一个透明板上或在两个透明板之间，诸如两个玻璃板。
为了产生光层，照明装置包含上述光束成形组合件。在该情况下，照明装置布置为使得以产生的光层照明样品平面中布置的样品带，并且在那里激发荧光辐射。如果用于照明样品平面中的样品的光层非平行地通到样品平面，则是有利的。
作为这种装备的结果在样品中出现的带(所述带被照明)非常窄。其典型地具有0.2μm至10μm的厚度，尤其是0.4μm至1.5μm的厚度。
最后，光层显微技术的组合件包括检测装置，其具有传感器，即具有能够检测由样品发射的荧光辐射的检测器或检测器件。对于荧光辐射的空间解析检测而言，这里优选的是区域传感器，或否则是空间解析检测器件。
另外，检测装置包含成像光学单元，其将由样品发射的荧光辐射成像至传感器的检测平面中。在该情况下，检测平面是其中成像的信号以一形式成为可用的平面，在该形式中，成像的信号意图由传感器检测。
检测装置包括检测轴线。所述检测轴线与光层一起形成70°至110°的角度范围、优选80°至100°的角度范围的角。其中检测装置包含垂直于光层的检测轴线的组合件是特别优选的。
有利地，光层显微技术的组合件配置为实施样品和光层之间的相对移动。这使得样品中照明的带能够移动。
在光层显微技术的组合件的一个有利配置中，其检测装置包含用于使得能够进行共焦检测的光阑。
光层显微技术的组合件中的这种共焦检测的光阑可以形成为传感器上的“滚动快门”。
在该情况下，“滚动快门”指示使用CMOS或SCMOS技术(即使用互补金属氧化物半导体技术或使用科学的CMOS技术)的“有源像素”图像传感器的读出过程。与CCD传感器相比，这些传感器的像素被逐行或逐列激活并读取，使得区域传感器的相应光敏部分仅通过在图像曝光内快速通过传感器的窄传感器带形成。
附图说明
现在基于示例性实施例解释本发明。
在附图中：
图1a显示根据现有技术的45°配置中的直立光层显微镜，图1b显示根据现有技术的45°配置中的逆光层显微镜，如上所述。
图2a显示Bessel光束的xy强度剖面，图2b显示分段Bessel光束的xy强度剖面，图2c显示Mathieu光束的xy强度剖面，图2d显示所述Mathieu光束在传播方向上，即xz平面中的光束剖面，图2d′显示图2d的放大的局部，以及图2e显示这种Mathieu光束在光瞳平面中的强度光谱。
图3a和3b显示根据现有技术用于光层产生的扫描的Bessel光束的和扫描的Mathieu光束的xy平面中的强度的示意图。
图4显示根据本发明的光束成形组合件的第一示例性实施例。
图5显示根据本发明的光束成形组合件的第二示例性实施例。
图6显示根据本发明的光束成形组合件的第三示例性实施例。
图7显示根据本发明的光束成形组合件的第四示例性实施例。
图8a显示Mathieu光束的xy光束剖面，图8b至8d显示分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束的xy光束剖面，图8e显示用于具有一个主极大的未修改的Mathieu光束的光瞳中的不变相位函数，图8f至8h显示光瞳中的相位函数，借助于其产生来自图8b至8d的分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束，图8i显示Mathieu光束的光谱，即其在光瞳中的强度，以及图8k至8m显示来自图8b至8d的分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束的光谱。
图9显示根据本发明的光层显微技术的组合件的第一示例性实施例。
图10显示根据本发明的光层显微技术的组合件的第二示例性实施例。
图11显示根据本发明的光层显微技术的组合件的第三示例性实施例。
具体实施方式
图4图解根据本发明的光束成形组合件的第一示例性实施例。激光模块1发射Gaussian激光光束2。所述激光光束2由照明衍射装置的器件3扩展，所述器件包括透镜3.1和3.2，使得整个衍射装置4被照明，该衍射装置在该示例性实施例中包含空间光调制器(SLM)4.1。Gaussian激光光束2通过空间光调制器4.1转换为Mathieu光束7。聚集光学单元5的部分，在该情况中的包含在其中的透镜5.1产生傅里叶变换，使得可以在光阑平面6中看见Mathieu光束7的光谱。借助于光阑6，执行过滤以抑制非期望光，例如空间光调制器(SLM)4.1的零级。透镜5.2和5.3将过滤的光谱成像至修改装置8上，其中修改装置8布置在频域中且包含第二空间光调制器(SLM)8.1。借助于修改装置8，即在此借助于第二空间光调制器8.1(其中编码了产生沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Mathieu光束的相位函数)，Mathieu光束7或更确切地说是Mathieu光束7的光谱转换为具有对应的N个主极大的修改的Mathieu光束10的光谱。通过另外的聚集光学单元，在此通过透镜9，在SLM 8.1的频域中产生的修改的Mathieu光束的光谱转换为具有N个主极大的修改的Mathieu光束10。那么，修改的Mathieu光束10此时可以供应用于其用途。
图5显示根据本发明的光束成形组合件的第二示例性实施例。激光模块1发射Gaussian激光光束2。所述激光光束2由透镜3.1和3.2扩展，以因此在衍射和修改装置的整个区域上均匀照明衍射和修改装置，衍射和修改装置包含空间光调制器(SLM)4.4。通过空间光调制器(SLM)4.4，Gaussian激光光束2在光阑6的位置转换为沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Mathieu光束的光谱。在该情况下，因此，将一函数编码进SLM中，使得沿x方向具有N个主极大(N≥2)的Mathieu光束的产生和修改可以同时实现。借助于光阑6，执行过滤以抑制非期望光，例如SLM的零级。通过包含透镜9的聚集光学单元，将修改的Mathieu光束的光谱转换为修改的Mathieu光束10。
图6显示根据本发明的光束成形组合件的第三示例性实施例。如已经在第一示例性实施例中所描述的，激光模块1发射Gaussian激光光束2。所述激光光束2由照明衍射装置的器件3扩展，所述器件包括透镜3.1和3.2，使得整个衍射装置4被照明，该衍射装置在该示例性实施例中包含空间光调制器(SLM)4.1。Gaussian激光光束2通过空间光调制器4.1转换为Mathieu光束7。聚集光学单元5的部分，在该情况中的包含在其中的透镜5.1产生傅里叶变换，使得可以在光阑平面6中看见Mathieu光束7的光谱。借助于光阑6，执行过滤以抑制非期望光，例如空间光调制器(SLM)4.1的零级。透镜5.2和5.3将过滤的光谱成像至修改装置8上，其中修改装置8布置在频域中。在第三示例性实施例中，所述修改装置现在包含相位板8.3。借助于所述相位板8.3，Mathieu光束7的光谱转换为沿x方向具有N个主极大的修改的Mathieu光束10的光谱。通过另外的聚集光学单元，在此为透镜9，通过相位板8.3在频域中产生的修改的Mathieu光束的光谱转换为沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Mathieu光束10。那么，修改的Mathieu光束10此时继而可以供应用于其用途。
图7显示根据本发明的光束成形组合件的第四示例性实施例。在此，同样地，激光模块1发射Gaussian激光光束2。所述激光光束2由透镜3.1和3.2扩展，使得空间光调制器(SLM)4.8的第一半部4.2由该扩展的激光光束2照明。借助于SLM的该第一半部4.2，Gaussian激光光束2转换为Mathieu光束7。在该示例性实施例中包含弯曲的反射镜5.4的聚集光学单元5，产生Mathieu光束7的傅里叶变换，使得Mathieu光束7的光谱在进入空间光调制器(SLM)4.8的第二半部8.2时可以被看见。SLM的第二半部8.2将Mathieu光束7的光谱转换为沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Mathieu光束10的光谱。通过聚集光学单元9，将修改的Mathieu光束10的光谱转换为沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Mathieu光束10。
图8a显示未修改的Mathieu光束7的xy光束剖面，对于其，如图8e中图解的，也没有变化相位值被编码进光瞳中。图8i显示未修改的Mathieu光束7的光谱，即其在光瞳中的强度。
与其相比较，图8b至8d显示分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束的xy光束剖面。图8f至8h分别图解光瞳中的相位函数，借助于其，产生来自图8b至8d的分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束。在该情况下，取决于xy平面中的位置，相位值在0和π之间变化，其中在各个情况中，平行于y方向行进的带具有相等的相位值，并且平行于y方向行进的邻近带继而在带内具有相等相位值，该相位值与所述带的相邻带的相位值不同。随着主极大的数量增加，这些具有相等相位值的带变得越来越窄。
图8k至8m显示来自图8b至8d的分别具有2、3和50个主极大的修改的Mathieu光束各自的光谱。
因此，为了实现较高的平行化，而不减小轴向分辨率，可以借助于编码进修改装置中的相对简单的相位掩模来修改Mathieu光束7。在具有2个主极大的修改的Mathieu光束的情况下，两个主极大具有与未修改的Mathieu光束的中心主极大相同的厚度，即它们在y方向上的范围具有与未修改的Mathieu光束的中心主极大相同的大小。在多于两个极大的情况下，其厚度也增加。原则上，可产生期望的许多主极大。然而，因为主极大的厚度增加，轴向分辨率变得较差，如果这种修改的Mathieu光束用于例如照明光层显微技术中的样品的话。这不能通过共焦间隙检测来避开。代替间隙检测，在此适当的是求助于用对应算法的结构化照明，以因此获得高轴向分段(sectioning)。
将具有2个主极大的修改的Mathieu光束的相位函数确定为如下：
其中，H(υx)为赫维赛德单位阶跃函数。
该相位图案构成一例外，因为与下面描述的方法相比，其不需适配于光束，而是可以用于任意Mathieu光束。
将具有任意数量(多于两个)的主极大的修改的Mathieu光束的相位函数确定为如下：
1、产生具有期望特性(尤其是关于其厚度)的未修改的Mathieu光束。
2、确定未修改的Mathieu光束的在光瞳中或对应的共轭平面中的强度分布IMathieu。
3、使用以下计算修改的Mathieu光束在光瞳中的光谱：
Imodified＝IMathieu (3)
其中，Imodified指示修改的Mathieu光束的强度分布，
指示光瞳中或对应的共轭平面中的相位，υx和υy指示频率坐标，N指示沿垂直于修改的Mathieu光束的传播方向的直线布置的主极大的数量，因此确定光层的宽度。N越大，光层越宽，存在越多的主极大。Δtilt指示样品中N个主极大之间的距离的大小。如果单独主极大之间的距离非常小，则发生分配给相应的主极大的部分光束的干涉。通过参数Δtilt，在Mathieu光束的邻近主极大之间的距离被适配。在此必须适配Δtilt直到发现最优的光束剖面。
适配Mathieu光束的厚度w(见等式(1))，以减小第二主极大的强度和数量。将w选择为越小，检测方向上的第二主极大越少，同时光层变得越厚，即光层在垂直于光层的传播方向行进的方向y上的范围变得越大。
如果使用空间光调制器(SLM)，那么除了相位函数，还可使用光谱，即光瞳中或共轭平面中的强度分布Imodified。然而，在该情况下，除了相位外，还必须通过空间光调制器来对应地使强度和振幅成形，即必须将对应的相位和振幅值编码进SLM中。
图9显示根据本发明的光层显微技术的组合件的第一示例性实施例。该示例性实施例中的照明装置在此使用如例如在图4中所描述的光束成形组合件。光束成形因此尤其通过两个空间光调制器来实现。如果修改的Mathieu光束然后对应地成形，则修改的Mathieu光束10的光谱通过另外的聚集光学单元9的透镜9.1和9.2成像至xy扫描仪11上。在该情况下，这种扫描仪也可归于光束成形组合件。透镜12.1和管透镜12.2的组合经由偏转反射镜13将修改的Mathieu光束10的光谱再次成像至照明物镜14的光瞳中。然后以这种扫描的修改的Mathieu光束照明位于样品平面中(该情况中在样品台18上)的填充水的物体载具17上的样品15的带。由修改的Mathieu光束在样品15的照明的带中激发的荧光由检测物镜转送到检测装置19中，检测装置19包含传感器。借助于检测装置19，将图像记录并转送至计算机。
图10图解根据本发明的光层显微技术的组合件的第二示例性实施例。该示例性实施例中的照明装置使用如例如在图6中所描述的光束成形组合件。在该情况下，光束借助于空间光调制器和相位板来实现。透镜12.1和管透镜12.2的组合借助于偏转反射镜13将修改的Mathieu光束10的光谱再次成像至照明物镜14的光瞳中。然后以这种扫描的修改的Mathieu光束10照明位于样品平面中(该情况中在样品台18上)的填充水的物体载具17上的样品15的带。该示例性实施例中的检测装置在装备和程序方面对应于图9中的示例性实施例中的检测装置。
最后，图11显示根据本发明的光层显微技术的组合件的第三示例性实施例。不对应于图4至7中描述的示例性实施例的光束成形组合件用于该光层显微技术的组合件。
激光模块1发射Gaussian激光光束2。所述激光光束2由透镜3扩展。由扩展的激光光束2照明的衍射装置4包含轴锥镜4.3。Gaussian激光光束2通过轴锥镜4.3转换为Bessel光束7.1。聚集光学单元5包含用于实现Bessel光束7.1的傅里叶变换的透镜，使得可在光阑平面中可见Bessel光束7.1。借助于光阑6，执行过滤以抑制非期望光，例如零级。聚集光学单元5的另外的透镜将Bessel光束的过滤的光谱成像至相位板8，8.3上，其将Bessel光束7.1转换为沿x方向具有N个主极大(N≥2)的修改的Bessel光束10.1。修改的Bessel光束10.1的光谱借助于包含在另外的聚集光学单元9中的透镜9.1和9.2成像至xy扫描仪11上。透镜12.1和管透镜12.2的组合借助于偏转反射镜13将修改的Mathieu光束10.1的光谱再次成像至照明物镜14的光瞳中。然后以扫描的修改的Mathieu光束10.1照明位于样品平面18中的物体载具17上的样品15的带。由修改的Mathieu光束10.1在样品15的带中激发的荧光由检测物镜转送到检测装置19中，检测装置19包含区域传感器20。所述区域传感器20尤其用于记录图像并转送图像至计算机。
本发明的如上文所提及且在各种示例性实施例中解释的特征在此可以不仅用于举例示出的组合中，而且用于其他组合中或自身而被使用，而不超出本发明的范围。
关于这些特征，涉及装置特征的描述近似地适用于对应的方法，而方法特征对应地代表上述装置的功能特征。
尽管在示例性实施例中描述了Mathieu光束的使用，但是在此呈现的装置和在此呈现的方法不限于Mathieu光束。装置和方法可同样在没有限制的情况下应用于Bessel光束和分段Bessel光束或其他非衍射受限光束。然而，与Bessel光束和分段Bessel光束相比较，优选使用Mathieu光束，因为Mathieu光束的光束特性，例如其在xy平面中的有利的光束剖面，其在y方向上具有快速减小的强度分布并且因此原则上特别适合于通过Mathieu光束的该输出光束剖面的修改来产生小厚度的光层。
Claims (15)
1.光束成形组合件，包括：
-产生(1)准直辐射的装置，
-在所述准直辐射(2)的光束路径中还包含：
-衍射装置(4，4.1，4.2，4.3)，在所述准直辐射的光束路径中布置在空间域中，配置为产生非衍射受限光束(7，7.1)，以及
-聚集光学单元，所述聚集光学单元设置在所述衍射装置(4，4.1，4.2，4.3)的下游且包含至少一个聚集光学元件(5.1，5.2，5.3，5.4)，其中所述聚集光学单元配置为实施傅里叶变换且将所述非衍射受限光束的光谱映射到频域中，
-修改装置(8，8.1，8.2，8.3)，布置在所述频域中，配置为将所述非衍射受限光束(7，7.1)转换为修改的非衍射受限光束(10，10.1)，
-将所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)从所述频域逆傅里叶变换的另外的光学聚集函数，该聚集函数同样通过所述修改装置(8，8.1，8.2)或通过另外的聚集光学单元(9)来实现，所述另外的聚集光学单元设置在所述修改装置(8，8.1，8.2，8.3)的下游且包含至少一个聚集光学元件(9.1，9.2)，
其特征在于，所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)沿仅一条直线包含N个主极大，其中N≥2，所述直线垂直于所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)的传播方向，其中所述N个主极大具有相等的最大辐射强度。
2.如权利要求1所述的光束成形组合件，其特征在于，所述衍射装置(4)包含环形孔径，轴锥镜(4.3)或空间光调制器(SLM)(4.1，4.2)。
3.如权利要求1所述的光束成形组合件，其特征在于，所述修改装置(8)包含相位元件(8.1，8.2，8.3)，产生修改的非衍射受限光束(10，10.1)的相位函数编码进该相位元件中，该修改的非衍射受限光束沿垂直于所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)的传播方向的直线具有N个主极大，其中，所述相位元件(8，8.1，8.2，8.3)优选通过相位板(8.3)或空间光调制器(SLM)(8.1，8.2)形成。
4.如权利要求1至3中任一项所述的光束成形组合件，其中，所述修改装置(8)配置为将所述非衍射受限光束(7，7.1)转换为修改的非衍射受限光束(10，10.1)，该修改的非衍射受限光束沿垂直于所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)的传播方向直线具有N个主极大，其中N≥100，其特征在于覆盖半个光瞳的光阑，所述光阑同样布置在所述频域中。
5.光束成形组合件，包括：
-产生(1)准直辐射的装置，
-在所述准直辐射(2)的光束路径中还包含：
-衍射和修改装置(4.4)，优选是空间光调制器(SLM)，布置在空间域中，配置为产生修改的非衍射受限光束(10，10.1)和将其傅里叶变换到频域中，
-将所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)从所述频域逆傅里叶变换的聚集函数，该聚集函数同样通过所述衍射和修改装置(4.4)或通过聚集光学单元来实现，所述聚集光学单元设置在所述衍射和修改装置(4.4)的下游且包含至少一个聚集光学元件(9)，
其特征在于，所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)沿仅一条直线包含N个主极大，其中N≥2，所述直线垂直于所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)的传播方向，其中所述N个主极大具有相等的最大辐射强度。
6.如权利要求1至3中任一项或权利要求5所述的光束成形组合件，其中，所述组合件还包含扫描仪(11)，用于扫描所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)。
7.如权利要求1至3中任一项或权利要求5所述的光束成形组合件，其中，所述非衍射受限光束(7，7.1)为Bessel光束、分段Bessel光束或Mathieu光束。
8.如权利要求1至3中任一项或权利要求5所述的光束成形组合件，其中，产生(1)准直辐射的所述装置包括激光模块，其包含激光源。
9.如权利要求1至3中任一项或权利要求5所述的光束成形组合件，其特征在于照明所述衍射装置的器件(3，3.1，3.2)。
10.如权利要求1至3中任一项或权利要求5所述的光束成形组合件，其特征在于在修改装置(8，8.1，8.2，8.3)的所述频域中或上游的另外的频域中、或者在衍射和修改装置(4.4)的频域中过滤非期望光的光阑。
11.光束成形的方法，尤其是产生用于光层显微技术的光层的方法，该方法包含以下步骤：
-在准直辐射(2)的光束路径中通过衍射装置(4，4.1，4.2，4.3)产生非衍射受限光束(7，7.1)，
-将所述非衍射受限光束(7，7.1)傅里叶变换变换到频域中，并确定强度分布，
-通过考虑沿仅一条直线的N个主极大及其间隔计算修改的非衍射受限光束(10，10.1)在所述频域中的光谱来确定所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)在所述频域中的强度分布，其中N≥2，所述直线垂直于所述修改的非衍射受限光束(10，10.1)的传播方向，其中所述N个主极大具有相等的最大辐射强度，
-确定修改的非衍射受限光束(10，10.1)在所述频域中的相位函数，
-通过使用位于所述频域中的修改装置(8，8.1，8.2，8.3)中的所述相位函数来产生修改的非衍射受限光束(10，10.1)。
12.如权利要求11所述的光束成形的方法，其中所述产生的修改的非衍射受限光束(10，10.1)被扫描。
13.光层显微技术的组合件，包括：
-布置样品(15)的样品平面(18)，
-照明装置，包含如权利要求1-10中任一项所述的光束成形组合件，用于照明所述样品(15)的带，以及用于在所述样品(15)的所述带中激发荧光辐射，以及
-检测装置(19)，包括检测所述荧光辐射的传感器(20)，包括将由所述样品(15)的带的荧光辐射成像至所述传感器(20)上的成像光学单元，以及包括检测轴线，其与所述光层一起形成70°至110°的角度范围中的角，尤其包括与所述光层垂直的检测轴线。
14.如权利要求13所述的光层显微技术的组合件，所述光层显微技术的组合件的检测装置包含用于共焦检测的光阑。
15.如权利要求14所述的光层显微技术的组合件，其中所述光阑形成为所述传感器(20)上的滚动快门。
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