CN107841510B - 一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因表达调控和基因工程领域，具体说是一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法。在原核基因操作子结构的基础上，通过外源质粒引入核糖核酸内切酶特异性剪切位点和颈环结构的序列，来控制不同片段的稳定性，进而控制片段编码基因的转录水平。本发明能够实现体内不同基因特定比例的可控表达，为成功构建含有特定比例的多亚基复合体及多酶协同的代谢途径工程菌株提供了一个有效的合成生物学方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达调控和基因工程领域，具体说是一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法。
背景技术
随着越来越多的微生物全基因组测序的完成以及对微生物代谢网络的系统认识，通过合成生物学的方法可以将多个基因甚至整套的代谢途径引入到细胞中，构建含多个外源基因的微生物细胞工厂。该方法已被应用在多种物质的生产中，如萜类化合物、聚酮类化合物、生物塑料制品、非核糖体多肽等。通过新的代谢途径的构建不仅可以省略化学合成中间产物的纯化工作，同时可以更简便更节能地实现生物燃料、天然复杂产物的化学中间产物及其衍生物的合成。
不同于传统的以生产蛋白质因子或工业酶为目标的蛋白多肽单基因表达，在代谢途径改造过程中，编码催化代谢途径中关键酶的基因并不需要高度表达，往往需将每个酶的表达量限制在一定范围内，实现多个基因的联合协同表达。尽管目前已有很多成熟的控制基因表达的系统，例如lac启动子系统等，但是能达到代谢工程要求的多基因、多水平的精确调控的系统还很少。一般情况下，协调多基因表达的方法是每个基因表达采用不同强度的诱导型启动子来分别调控。但在实际应用中存在很多问题：首先反应体系需要添加多种诱导剂，在代谢途径中设计的环节较多时，不可避免地会使用到价格昂贵的物质，大大增加了生产成本；第二，较多的诱导剂添加过程会增加反应过程的复杂性，从而降低细胞稳定性；第三，多种诱导剂的添加可能会引起交互作用，限制了多种启动子组合的应用；第四，只能对基因表达实现粗略地表达调控，即开启或关闭，而不能对基因表达水平实现精细调控。
在生物体内发挥功能的酶是多酶复合体，多酶复合体是由一个操纵子的多个基因构成，但如果可以改变协调各基因的表达比例，可能实现人工控制的更高效的多酶复合体，从而发挥更高效的功能。
基于上述代谢途径改造过程中问题，现急需一种简单、方便、精准控制多个基因表达比例的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法，在原核基因操作子结构的基础上，通过外源质粒引入含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构，来控制不同片段的稳定性，进而控制片段编码基因的转录水平。
进一步的说，在原核基因操作子结构的基础上，基于其核糖核酸内切酶特异性剪切mRNA，然后通过在产生片段的3’端引入含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构，从而根据此引入的片段特性，在转录后水平调节其上下游不同基因转录物的稳定性，最终达到各基因表达水平的可控性。
更进一步的说，将多个基因簇以操纵子的形式串联排列，再将含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构引入基因簇的基因间隔区，通过引入颈环结构的折叠能量(ΔG)，进而控制其上下游基因的转录物丰度。
上述，将所需要表达的多个基因以操纵子形式构建，即在启动子下游依次连入多个基因，每个基因都包含自己的核糖体结合位点，在最后一个基因的下游包括一个颈环结构的转录终止子；同时，引入基因序列以质粒或基因组整合的形式在目的细菌中进行转录表达，其中每个基因下游的颈环结构控制其表达水平，即基因的转录水平与其下游基因的颈环结构的折叠能量呈反比。
所述颈环结构内至少含有一个颈环结构、颈环结构下游根部富含AT碱基对的双链RNA，颈环结构与AT碱基对之间含有至少1个非配对的鼓泡。
所述非配对的鼓泡为AT碱基对与颈环结构之间含有1-2个非配对的鼓泡，所述鼓泡由1-5个非配对的碱基形成。
所述颈环结构下游根部的富含3-8个AT碱基对。
一种在原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的碱基序列，碱基序列为颈环结构，颈环结构内至少含有一个颈环结构、颈环结构下游根部富含AT碱基对的双链RNA，颈环结构与AT碱基对之间含有至少1个非配对的鼓泡。
所述非配对的鼓泡为AT碱基对与颈环结构之间含有1-2个非配对的鼓泡，所述鼓泡由1-5个非配对的碱基形成。
所述颈环结构下游根部的富含3-8个AT碱基对。
上述颈环结构严格配对的反向重复序列或包含非配对、非单一颈部结构的复杂的RNA二级结构。颈环结构的折叠能量，折叠能量与剪切后所属基因的转录水平呈负相关，即颈环结构能量越低，其所属基因的转录水平越高。
本发明的积极效果：
通过本发明方法，可以根据需要控制操纵子内部不同基因的转录水平。具体是仅需要引入一个启动子及其诱导系统，即可控制多个基因的转录，克服传统方法需要通过不同强度启动子分别控制不同基因转录的弊端。因此，本发明方法可以更简单、方便、经济、精确的控制多个基因的转录。
本发明是基于革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶特异性剪切mRNA，然后通过在产生片段的3’端引入不同折叠能量的颈环结构来控制不同片段的稳定性，进而控制这些片段编码基因的转录水平，即通过一个启动子表达多个基因，在转录后水平精细控制多个基因的不同表达强度；
其是通过在不同基因/操纵子间引入能量和功能各异的颈环结构来实现基因不同程度表达的控制，即实现不同基因转录水平比例的控制。此方法中茎环结构的应用为合成生物学提供了必要的生物学元件，为可控地人工合成细胞内发挥复杂功能的酶复合体等提供了一种简便方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的双荧光蛋白报告系统(重组质粒pMTC 9)的构建。pthl为启动子，fbfp和mCherry为荧光表达基因，BglⅡ为插入片段酶切位点。
图2A为本发明实施例提供的截断突变和点突变颈环结构设计图
图2B为本发明实施例提供的不同结构颈环设计序列。
核糖核酸内切酶识别剪切位点及颈环结构设计：。WT为野生型颈环。T22-T98为不同程度5’端AT富含区缺失颈环，P88为未配对区3’端碱基A缺失颈环，D28&88为未配对区3’端碱基A和5’端碱基C同时缺失颈环。
图3为本发明实施例提供的荧光定量PCR分析引入设计序列对fbfp和mCherry转录影响图，其中，WT野生颈环，T22-T98为不同程度5’端AT富含区缺失颈环，P88为未配对区3’端碱基A缺失颈环，D28&88为未配对区3’端碱基A和5’端碱基C同时缺失颈环。
图4为本发明实施例提供的Northern blot分析引入设计序列的剪切效率图；其中，第一条带为fbfp和mCherry表达的双顺反子，第二条带为fbfp。WT野生颈环，T22-T98为不同程度5’端AT富含区缺失颈环，P88为未配对区3’端碱基A缺失颈环，D28&88为未配对区3’端碱基A和5’端碱基C同时缺失颈环。
图5为本发明实施例提供的解纤维梭菌中三种不同RNA内切酶与其他物种RNA内切酶的同源性分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
解纤维梭菌：记载在“Clostridium-Cellulolyticum Sp-Nov,a Cellulolytic,Mesophilic Species from Decayed Grass”一文中，同时可市购获得。
厌氧绿色荧光蛋白基因fbfp和pMTC6载体：通过记载在“Targeted geneengineering in Clostridium cellulolyticum H10without methylation”一文中构建获得，或是市购获得。
红色荧光蛋白基因序列通过NCBI数据库获得，并通过金唯智公司进行密码子优化和全序列合成。
下述实施例中所涉及的培养基配方如下：
进行含有质粒的解纤梭菌培养时，需要在DCB-1培养基中加入20μg/ml的红霉素，而在培养含有质粒的大肠杆菌时，需要在LB培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素。
下面对本发明作进一步说明：
本发明采用中温厌氧解纤维梭菌作为模式生物，通过基于厌氧绿色荧光蛋白FbFP和红色荧光蛋白mCherry的双荧光报告系统，评估引入的核糖核酸内切酶剪切位点及颈环结构对荧光蛋白基因表达的影响。
实施例1——构建双荧光蛋白的报告系统
1)细胞的培养
下述所涉及到的菌株和质粒都列于表1中。大肠杆菌DH5α在普通的LB培养基中于37度进行培养。其培养的主要目的是为了方便质粒的构建与复制，能够有更多的质粒用于解纤维梭菌的转化中。
而后通过常规手段将表1中各质粒分别导入大肠杆菌，将含有质粒的大肠杆菌分别培养于加入100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，培养至对数中后期。
解纤维梭菌是一种严格厌氧的纤维素降解菌，细胞培养在亨盖特滚管中恒温至35度，厌氧培养，培养基为DCB-1，以0.0005％刃天青作为含氧指示剂。
而后通过常规手段将表1中各质粒分别导入解纤维梭菌，将含有质粒的解纤维梭菌分别培养于加入20μg/ml红霉素的培养基DCB-1中，培养至对数中后期。
上述各细菌接种与转接采用1ml注射器进行。
表1
2)质粒构建
pMTC6载体中已经包含有FbFP的表达框，而后依据常规手段在其下游插入mCherry基因即可。通过设计的引物(见表2)进行PCR扩增(扩增条件见表3)，获得mCherry基因片段，并且在其基因前面加入与FbFP一样的核糖体结合位点序列(AGGAGG)。然后通过BamH I和EcoR I两种酶进行酶切、连接，转化大肠杆菌DH5α，再通过PCR鉴定和测序的方法获得含有FbFP和mCherry荧光蛋白基因的重组质粒pMTC9(如图1)。
表2
表3
实施例2——核糖核酸内切酶识别剪切位点的确定
1)设计含有核糖核酸内切酶识别剪切位点的颈环结构
颈环结构为一个含有AT富含区及鼓泡的颈环结构，其基因序列为：TATTTAATACTATGACGCATATGTAACCTTAAAGTCCGGACAGTATTTGGTTTGATTAAATTACTCATTCTTGTACTGTCCGGGCTTATGAGTTACAAAGAAAAAAAGAAAAGGATTAAGGTAAGAAC，命名为WT。通过对其进行不同程度的截断突变，分别命名为——T22、T28、T56、T88、T98，合成了5’端AT富含区、鼓泡区、颈环结构删除的一系列序列。将未配对的鼓泡区3’端碱基A删除，构建点突变颈环结构P88。将未配对的鼓泡区3’端碱基A和5’端碱基C同时删除，构建点突变颈环结构D28&88(如图2A所示)。
2)含有上述不同序列的报告系统的构建及转化
将上述设计的序列及其突变序列WT,T22，T28，T56，T88,T98，P88，D28&88，分别通过BglⅡ酶切位点构建入pMTC 9载体中，再分别转化大肠杆菌DH5α；同时设计Control组，将未插入任何序列的双荧光报告系统(即pMTC9)转入大肠杆菌DH5α。通过PCR和测序获得阳性克隆，而后按照现有技术通过质粒提取和MspI甲基化的过程，实现质粒的甲基化，最后通过电转的手段(0.1cm电转杯，750v，25μF，6ms)进行解纤维梭菌的电击转化，通过红霉素(20μg/ml)筛选获得含有不同颈环结构质粒的解纤维梭菌转化子(WT,T22，T28，T56，T88，T98，88A,A&C,Control)。
实施例3——颈环结构功能鉴定
1)荧光定量PCR分析不同序列对fbfp和mCherry转录影响
从实施例2中获得的一系列解纤维梭菌转化子中分别提取的RNA，并进行反转录cDNA后，以RNA聚合酶亚基(Ccel_0312)为内参基因通过
480II(罗氏)进行荧光定量PCR，比较不同转化子中fbfp，mCherry，以及它们之间间隔区IR的转录水平(如图3)。
qRT-PCR结果显示，在未加入任何序列的双荧光蛋白报告系统(Control)中，fbfp，mCherry，以及它们之间间隔区IR三者的转录丰度基本一致，说明fbfp和mCherry属于同一个转录单位。但是当在这两个报告基因之间引入设计的完全序列(WT)时，fbfp和mCherry转录水平发生显著变化：两者的转录水平分别提高21倍和9倍，并高于IR，而且两者的比例由Control组中的1:1变为2.3:1。说明该序列的引入，不仅能够提高基因的转录水平，尤其是上游基因；而且造成了双顺反子fbfp-mCherry mRNA的剪切。
将WT序列进行截短突变时，发现将5’端AT富含区删除(T28)后，fbfp和mCherry的转录水平基本恢复到与Control组一致，说明AT富含区的颈环根部对其功能的发挥至关重要。另一方面，将鼓泡处3’端的碱基A删除(D88)后，对其功能的发挥基本没有影响，但是继续将鼓泡处5’端的碱基C删除(D28&88)后，fbfp和mCherry的转录水平又恢复到与Control组一致，说明鼓泡5’端的非配对碱基影响其功能发挥。
2)Northern blot分析剪切效率
依照常规方式通过RNA电泳、转膜、预杂交、杂交、洗膜、曝光的过程，对插入序列的剪切效率进行分析(图4)。结果显示，在Control系统中只有一条杂交信号带，说明fbfp和mCherry属于同一个转录单位，并且它们未发生任何剪切。当将设计的序列(WT)引入到报告系统后，除了fbfp-mCherry双顺反子mRNA外，还发现单独的fbfp mRNA，而且fbfp mRNA浓度大于fbfp-mCherry mRNA。说明设计序列的引入造成了fbfp-mCherry双顺反子mRNA的剪切。但是当把5’端的AT富含区删除(T28)以后，单独的fbfp mRNA含量急剧减少，说明5’端的AT富含区是RNase重要的识别区域。
由实施例1、2、3可知，实施例中采用绿色和红色两种荧光蛋白进行插入颈环结构功能的鉴定，具有视觉直观性及检测方法的简便性。实施例提供的革兰氏阳性细菌细胞内控制不同基因表达比例的设计策略，不仅能够实现体内不同基因特定比例的可控表达，而且为成功构建含有特定比例的多亚基复合体及多酶协同的代谢途径工程菌株提供了一个有效的合成生物学方法。
上述设计的序列(WT)功能的发挥依赖于革兰氏阳性细菌(G+)RNA内切酶(RNase)。同时，通过BLAST分析发现，的研究对象中温厌氧解纤维梭菌(G+)，存在3个基因，分别编码与3个RNase同源的蛋白质(以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌(G-)中，内切核糖核酸酶是RNaseE。以枯草杆菌中为代表的革兰氏阳性菌(G+)中，存在两种内切酶，一类是RNaseY，一类是RNaseJ2/J2)。因此也不排除在革兰氏阴性菌中含有类似功能的RNA内切酶，或在革兰氏阴性细菌中表达革兰氏细菌来源的RNA内切酶，都可导致上述序列的设计方法(参见图5)因此其也具有在革兰氏阴性细菌中应用的潜力，此方法具有通用性。
Claims (3)
1.一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法，其特征在于：在原核基因操纵子结构的基础上，基于其核糖核酸内切酶特异性剪切mRNA，然后通过在产生片段的3’端引入含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构，从而根据此引入的片段特性，在转录后水平调节其上下游不同基因转录物的稳定性，最终达到各基因表达水平的可控性；
所述含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构基因序列为 SEQ ID NO.1或其突变序列T22、P88；
突变序列T22为5’端AT富含区缺失前22个碱基；
突变序列P88为将未配对的鼓泡区3’端碱基A删除。
2.按权利要求1所述的原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法，其特征在于：将多个基因簇以操纵子的形式串联排列，再将含有核糖核酸内切酶特异性剪切位点的颈环结构引入基因簇的基因间隔区，通过引入颈环结构的折叠能量，进而控制其上下游基因的转录物丰度。
3.一种在原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的多核苷酸，其特征在于：多核苷酸序列为 SEQ ID NO.1或其突变序列T22、P88；
突变序列T22为5’端AT富含区缺失前22个碱基；
突变序列P88为将未配对的鼓泡区3’端碱基A删除。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
| WO2004044202A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Toolgen, Inc. | Method for the gene regulation at both transcription and post-transcription levels |
| WO2010012805A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Total S.A. | Constructs and methods for the production and secretion of polypeptides |
| CN102373204A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 复旦大学附属金山医院 | 一种转录水平基因表达调控的方法及应用 |
| CN104968786A (zh) * | 2012-11-06 | 2015-10-07 | 哈佛学院院长等 | 核糖核酸调节子组合物以及使用方法 |
| CN105658797A (zh) * | 2013-08-16 | 2016-06-08 | Rana医疗有限公司 | 用于调节rna的组合物和方法 |
-
2016
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999049029A1 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
| WO2004044202A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Toolgen, Inc. | Method for the gene regulation at both transcription and post-transcription levels |
| WO2010012805A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Total S.A. | Constructs and methods for the production and secretion of polypeptides |
| CN102373204A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 复旦大学附属金山医院 | 一种转录水平基因表达调控的方法及应用 |
| CN104968786A (zh) * | 2012-11-06 | 2015-10-07 | 哈佛学院院长等 | 核糖核酸调节子组合物以及使用方法 |
| CN105658797A (zh) * | 2013-08-16 | 2016-06-08 | Rana医疗有限公司 | 用于调节rna的组合物和方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Clostridium cellulolyticum cellulase gene cluster, complete sequence，GenBank: M87018.2;Bagnara-Tardif,C. et al.;《Genbank》;20000322;第1-5页 * |
| PNPase autocontrols its expression by degrading a double-stranded structure in the pnp mRNA leader;Anne-Charlotte Jarrige et al.;《The EMBO Journal》;20011231;第20卷(第23期);第6845-6855页 * |
| SV40PolyA顺式活化基因元件中微小茎—环结构的发现和序列研究;马欢;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20110415(第4期);A006-25 * |
| Untranslated regions of mRNAs;Flavio Mignone et al.;《Genome Biology》;20020228;第3卷(第3期);第1-10页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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